DE2122298A1 - Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase - Google Patents

Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase

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Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. R Weickmann, 2122298
Dipl.-Ing. H. Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke ΗΜΪ Dxpl.-Ing.'R A. Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
int.Nr. 1749 g München 27, den
MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 4S392I/22
BOEHRINGER MAiWHEIM' GMBH "' Maimheim-Waldhof, Sandhofer Str. 112-132
Verfahren zur Gewinnung von Creatinin-amidohydrolase
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Gewinnung des Enzyms Creatinin-amidohydrolase und gegebenenfalls Creatin-amidinohydrolase aus Mikroorganismen.
In der klinischen Chemie, besonders für die Punktionsdiagnostik der Niere, spielt die Bestimmung der Zv/ischen- und Endprodukte des Eiweißstoffwechsels eine wichtige Rolle. Hierzu zählen auch Creatinin und Oreatin. Die Bestimmung von kreatinin wurde daher schon wiederholt beschrieben. Die meisten der bekannten Methoden basieren auf der nichtenzymatischen Jaffe-Reaktion, die jedoch den Nachteil hat, unspezifisch zu sein.
Weiter wurde bereits eine spezifische mikrobiologische Bestimmungsraethode mit isolierten Bakterien beschrieben, wobei gewaschene Zellsuspensionen zur Creatinin-Messung verwendet wurden und die Bildung von Harnstoff und Ammoniak als Maß der Enzymwirkung herangezogen wurde. Lösliche, zum Creatininabbau befähigte Enzymextrakte konnten dabei jedoch nicht erhalten werden. Voraussetzung für die Schaffung eii.er spezifischen Creatinin-Bestimraung mit Hilfe von Enzymen war
209848/0909
jedoch- die Auffindung von geeigneten, löslichen Enzymen, welche spezifische und meßbare Umsetzungen des Creatinins katalysieren können.
Roche, Laeombe und Girard (BBA £, 210, 1950) charakterisierten in zwei Pseudomonas-Arten Oreatinase, Creatininase und eine ßlycocyaminase als spezifische Enzyme, die aus ihren Substraten aus der Guanidinogruppe Harnstoff in Freiheit setzten. Weiter wurde von Akamatsu und Mitarbeiter (Enzymologia, Jj>, Seiten 122, 158, 173, 1951) in Erdbakterien ein als Creatinmutase bezeichnetes Enzym, welches die Gleichgewichtseinstellung zwischen Greatinin und Creatiii bewirken soll. Hierbei v/ird folgender Abbauweg des Creatinins vermutet:
Creatinin ' ' i - Creatin ————·» Harnstoff und Sarcoein -> Glycin ———$> KE„
Nunmehr ist es gelungen, den hier vermuteten Weg des Creatinin-Abbaus zu bestätigen und erstmals zwei ihizjme in Mikroorganismen aufzufinden und in hoher Reinheit zu isolieren, welche an diesem Abbaxiweg entscheidend betei-
" ligt sind.
Gegenstand der Erfindung ist die Isolierung und Reinigung dieser Enzyme.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase und gegebenenfalls Creatin-ainidinohydroiaso aus Mikroorganismen besteht darin, daß ein in einem creatininhaltigen Medium gezüchteter Mikroorganismus auf ge schlosse;}], aus der wasserlöslichen Aufschlußfraktion nach an sich bekannten, bei pH-Werten über 7,0 durchgeführten beiochonisehen ReI-nigungs- bzw. Fraktionierungsniethoden unter-Anwendung eines Testes, bei dem aus zugesetztem Creatinin gebildetes Creatin
209848/0SQi
_ 3 —
■in an sich bekannter Weise "bestimmt wird, die Creatininamidohydrolase gereinigt und anschließend gegebenenfalls vorhandene Creatin-ainidinohydrolase von der so gewonnenen Creatinin-amidohydrolase durch Austauscherchromatographie abgetrennt wird.
Durch die beiden erfindungsgemäß erhältlichen Enzyme werden folgende Reaktionen katalysiert:
a) areatinin + H9O ^rmldohzdrolasex Creatin
b) Creatin + H2O C^atin-amidinohdrolase > Sarcosin +
Harnstoff
Da es sich bei Gleichung (a) um eine Gleichgewichtsreaktion unter Wasseraufnahme oder -abgabe handelt, wurde das hier wirksame Enzym als Creatinin-amidohydrolase bezeichnet.
Als Ausgangsinaterial für die Gewinnung der beiden neuen Enzyme eignen sich Mikroorganismen allgemein, in denen die gewünschten Enzyme adaptativ angereichert sind, was gewöhnlich dadurch geschieht, daß in Gegenwart oder unter Zusatz von Cr.eatinin gezüchtet wird.
Aus den so gewonnenen Mikroorganismen wird durch Aufschluß die wasserlösliche Fraktion gewonnen. Als Aufschlußmethoden eignen sich die üblichen Methoden je nach der Festigkeit oder Widerstandsfähigkeit der Zellhaut des verwendeten Mikroorganismus. Besonders geeignet erwiesen sich die Hochdruckdispersion sowie der Ultraschallaufschluß. V/eitere Beispiele für geeignete Aufschlußmethoden sind Desintegrationsmühlen, z.B. nach Balutini und Schloßmann und auf· ähnlicher Basin arbeitende Aufschlußmethoden. Auch chemische oder enz.ymatische Aufschlußmethoden sind anwendbar.
BAD ORIGINAL
209848/090 9
Aus der so erhaltenen wasserlöslichen Fraktion läßt sich die Creatinin-amidohydrolase anreichern,indem man ihre Eigenschaft, Creatinin in Creatin zu überführen, ausnützt. Gebildetes Creatin läßt sich nach bekannten Methoden bestimmen, beispielsweise durch Zusatz von ATP und Messung von so gebildetem ADP in üblicher Weise. Es ist jedoch erforderlich, bei pH-Werten über 7 zu arbeiten und die jeweils angewendeten Reinigungsmethoden nach ihrer Anwendbarkeit bei diesen pH-Werten auszuwählen.
Eine weitere Methode, den Fortschritt des Anreicherungsverfahrens zu verfolgen,besteht darin, mit Creatin-amidinohydrolase das gebildete Creatin zu spalten unter Bildung von Sarcosin und Harnstoff und dann den Harnstoff in üblicher Vfeise, beispielsweise mittels der bekannten Reaktion unter Verwendung- von Urease zu bestimmen.
Das Ausmaß der durchgeführten Reinigung hängt vom beabsichtigten Verwendungszweck des Enzyms bzw. der Enzyme ab. Falls ein zur enzymatischen Creatinin-Bestimmung geeignetes Präparat gewünscht ist, genügt bereits ein einziger Reinigungsschritt. Geeignete Reinigungsschritte sind beispielsweise Polyanionenbehandlung, Fraktionierung mit organischen Lösungsmitteln oder Chromatographie. Unter Anwendung der oben erwähnten Bestimmungsmethoden ist es hierbei auf einfache Weise möglich, jeweils den Verbleib der gewünschten Enzyme festzustellen und diese in einem einzigen Schritt in erheblichem Maße anzureichern.
Da bei einer längeren Lagerung der geernteten und eingefrorenen Mikroorganismen eine Aktivitätsabnahme der 'gewünschten. Enzyme zu befürchten ist, werden vorzugsweise die Zellen nach der Ernte möglichst rasch weiter aufgearbeitet. Zwei für das Verfahren der Erfindung bevorzugte Mikroorganismen sind in der gleichzeitig unter der internen Hr. 1767 eingereichten Anmeldung P . "beschrieben.
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Es handelt sich um Alcaligenes spec. WS 51400 aus der Familie Achromo baetericeae und Penicillin WS 90 001 (Weihenstephan).
Da Creatinin-amidohydrolase und auch Creatin-amidinohydrolase bei pH-Werten von 6 und darunter schnell an Aktivität verlieren,bei pH-Werten um 8,0 die größte Stabilität aufweisen, erfolgt der Aufschluß vorzugsweise zweckmäßig mit alkalischem Puffer. Vorzugsweise wird 0,1M Kaliumphosphatpuffer pH 8,0 verwendet. Die Wahl des Puffers und der Pufferkonzentration sollte zweckmäßig je nach dem vorgesehenen weiteren Anreicherungsschritt so erfolgen, daß in dem für den Aufschluß verwendeten Puffer auch die weitere Anreicherung durchgeführt werden kann. Bei Aufschluß in der Hochdruckdispersion, üblicherweise bei etwa 700 bis 800 atü, kann die weitere Reinigung bei Anwendung einer Polyanionenbehandlung ohne vorherige Abtrennung der Zellrückstände durchgeführt werden. Geeignete Polyanionen sind beispielsweise Protaminsulfat oder wasserlösliches Polyäthylenimin. Bevorzugt wird ein Zusatz von wasserlöslichem Polyäthylenimin, beispielsweise in Form einer 1Obigen Lösung von pH Bei einer Lösung dieser Konzentration sind etwa 5$ Zusatz, bezogen auf Aufschlußvolumen, erforderlich, bis kein weiterer Niederschlag mehr auftritt. Der Niederschlag wird durch physikalische Mittel, beispielsweise Filtrieren oder Zentrifugieren, abgetrennt. Die gewünschten Enzyme verbleiben im Überstand.
Anstelle einer Polyanionenfällung erwies sich auch eine Fällung mit organischem Lösungsmittel als vorteilhaft. Vorzugsweise wird hierbei Isopropanol verwendet. In diesem Fall werden die Zellrückstände nach dem Aufschluß zuerst entfernt und dann wird bei Zimmertemperatur das organische Lösungsmittel zugesetzt. Die Isopropanol-Fraktionierung wird vorzugsweise so durchgeführt, daß bei 2-50C pro Liter Aufschlußlösung 800 ml 90$iges Isopropanol zugesetzt und.
209848/090·
der Niederschlag abgetrennt wird. Der erhaltene wird erneut mit 500 ml Isopropanol je Liter versetzt und der Niederschlag, der die beiden gewünschten Enzyme enthält, abgetrennt.
Besonders bevorzugt ist eine kombinierte Anwendung der beiden oben erwähnten Methoden, nämlich Polyanionehfällung tind anschließend Fraktionierung mit organischem lösungsmittel.
Sowohl die mit einem einzigen Anreicherungsschritt als auch mit den beiden kombinierten Schritten erhaltenen Produkte sind bereits zur Verwendung in einer spezifischen Creatinin-Bestimmung geeignet. Die Enzyme Greatinin-amidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase fallen hierbei jedoch stets gemeinsam an,.Falls eine Trennung der Enzyme gewünscht wird, -werden die so erhaltenen Präparate anschließend durch Austauscherchromatographie getrennt. Als besonders geeigneter Austauscher erwies sich dabei ein schwach basischer Ionenaustauscher wie DBAE-Sephadex oder DEAE-Gellulose.
Bei Verwendung von DEAE-Sephadex werden die Enzyme bei geringer Ionenkonzentration, vorzugsweise etwa 0,01 bis 0,05M, auf dem Austauscher adsorbiert. Anschließend wird der Austauscher mit einer Ionenkonzentration von etwa 0,1M gewaschen, wobei nicht-aktive Begleitproteine entfernt werden. Creatinin-amidohydrolase läßt sich mit 0,2M Pufferlösung eluieren. Die Creatin-amidinohydrolase verbleibt hierbei noch am Austauscher. Sie läßt sich ebenfalls durch Steigerung der lonenkonzentration auf 0,5M, beispielsweise durch Verwendung von 0,2M Kaliuraphosphatpuffer, pH 8,0, mit einem Gehalt von 0,3M NaCl oder KCl oder einem ähnlichen Salz, eluieren.
Die oben beschriebene bevorzugte Ausführungsforia des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Korabination einer Isopropanol-
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Fraktionierung und einer Austauscherchromatographie führt zu einer etwa 100- "bis 150-fachen Anreicherung der Enzyme und ergibt ein Creatinin-amidohydrolase-Präparat mit einer spezifischen Aktivität über 200 U/mg* Die Creatin-amidinohydrolase wird hierbei etwa 100-fach angereichert, wobei ein Präparat mit einer Aktivität von 3 U/mg erhalten wird.
Gemäß "einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine sehr einfache leinreinigung der gewünschten Enzyme ohne Trennung erhalten werden, indem im Bateh-Verfahren so viel Austauscher zugesetzt wird, Ms beide Enzyme adsorbiert sind. Der Austauscher wird dann abgetrennt und, wie oben beschrieben, gewaschen und anschließend eluiert.
Eine weitere Möglichkeit zur Reinigung und Anreicherung der beiden Enzyme besteht in der Salzfällung bzw. SaIafraktionierung, beispielsweise unter Verwendung von Arnrconiumsulf at. Bei der Verwendung von· Ammoniumsulf at fällt Creatinin-amidohydrolase bei einer Konzentration von 2,2M, die Creatin-amidinohydrolase bzw.das Gemisch beider Enzyme bei einer Konzentration von 2,7M.
Die Salzfällung eignet sich auch zur Gewinnung der Enzyme aus ihren Lösungen, wie sie beispielsweise bei der Elution des Austauschers erhalten werden. Durch Dialyse bei 40C. zweckmäßig gegen verdünnten Puffer, beispielsweise 0,0?M Di äthanolamin-Puffer, pH 8,0, können die Enzyme von Salzen und anderen niedrig-molekularen Begleitstoffen befreit werden.
Die so erhaltenen Präparate können in eingefrorenem Zustand monatelang ohne Aktivitätsverlust gelagert werden.
BAD ORIGINAL 209848/0909
Falls die Creatinin-amidohydrolase allein ,gewünscht wird, '"be steht eine weitere Reinigungs- und Anreicherungsmethode auch in einem Hitzeschritt bei 600C. Eine derartige Erhitzung während 5 Minuten führt zu keiner merklichen Verringerung der Creatinin-amidohydrolase-Aktivität. Im Gegensatz dabei verliert die Creatin-amidinohydrolase unter diesen Bedingungen ihre Aktivität.
Die erfindungsgemäß erhältlichen neuen Enzyme können für wissenschaftliche Zwecke sowie '.zur spezifischen Bestimmung des Oreatinins und Creatins verwendet werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
B e.-i spiel 1
a) Isolierung hochgereinigter Creatinin-amidohydrolase
Aus einem in Gegenwart von Creatinin gezüchteten Kulturansat i Alcaligenes spec. WS 51400 werden die Zellen (1 kg Trockengewicht) abgetrennt, mit 0,1M Kaliumphosphatpuffer pH 8,0 auf 20 1 aufgenommen und ohne Kühlung in der Hochdruckdispersion bei ca. 800 atü aufgeschlossen.· Der Extrakt wird mit 5 Vol.-# einer 10$igen Polyäthylenimin-Lpsung (MoI.-Gewicht ca. 1800) von pH 8,0 (ca. 1 1) versetzt. Nach Zugabe von KCl(O,01M Endmolarität) und NH.C1 (0,1M Endmolarität) werden pro Liter Extrakt innerhalb von 10 Minuten 0,8 "Volumen 90^iges wäßriges Isopropanol zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
Der reichliche Niederschlag wird abzentrifugiert. Dem Überstand werden pro Liter weitere 0,45 Volumen 9Ö$iges Isopropanol zugegeben.
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Der so. gebildete Niederschlag, welcher Creatinin-amidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase enthält, wird abgetrennt und in 400 ml 0,02M Kaliuraphosphatpuffer pH 8,0 aufgenommen. Ein ungelöster Rückstand wird abgetrennt und der Überstand auf eine mit dem gleichen Puffer äquilibrierte DEAE-Sephadex-Säule (3»5 cm χ 1 m) gegeben. Nach dem Aufziehen wird die Säule mit 1 Vol. 0,1M Kaliumphosphatpuffer pH 8,0 gewaschen und dann mit 0,2M Kaliumphosphatpuffer pH 8,0 eluiert. Die Creatinin-amidohydrolase-haltigen Fraktionen werden vereinigt, bei pH 8,0 mit Ammoniumsulfat auf 2,2M eingestellt, das ausgefallene Enzym abzentrifugiert und in 0,02M Diäthanolaminpuffer pH 8,0 auf 100 ml gelöst und 4 Stunden bei +40C gegen gleichen Puffer dialysiert. Man erhält so in einer Gesamtausbeute von 64$ ein Präparat mit einer spezifischen Aktivität von 303 U/mg. Die nachstehende Tabelle zeigt zusammenfassend die in den einzelnen Stufen dieses Verfahrens erhaltenen Aktivitäten und Ausbeuten.
Schritt
U (250O)
Protein U/mg Ausbeute
in er · $>
Dispersions- ' ~ aufSchluß 2,8 χ 105
Polyäthylen- ,-
imin-Überstand 2,6 χ 10·5 1»Isopropanolzu-
sata(überstand) 2,16 χ 10 2.Isopropanolzu-
satz(Niederschi.)1,97 x 10
DEAE-Seph.-Chrom.
DEAE-Sep
(Eluate)
98,6
66,2
2,8
3,9
1,8 χ 10
32,6 6,6
6,9 28,5
0,59 303
100 93 77 71
64
Bei Aufschluß mit Hilfe von Ultraschall anstelle der Hoch-
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- ίο -
druckdispersion konnte der Gehalt an Creatinin-amidohydrolase bei etwa gleicher spezifischer Aktivität auf das 2,5-fache, bezogen auf eingesetzte Mikroorganismen, Trockengewicht erhöht .werden.
Die wie oben beschrieben erhaltene Creatinin-amidohydrolase weist eine Gleichgewichtskonstante /Creatlli/ . K = 1j27
(370O; pH 8,0) auf.
/Creatinin7
Die Michaelis-Konstante für Creatinin als Substrat K^ = 3,3 x 10~2 M (370C; pH 8s0)
Beispiel 2
Trennung von Greatinin-amidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase „____>_
Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben vorgegangen; jedoch. wird nach der Elution der Creatinin-amidohydrolase von der Austauschersäule die Creatin-amidinohydrolase mit 0,"2M KaIiuiaphosphatpuffer pH 8,0, enthaltend 0,3M NaCl, eluiert. Die Einzelheiten zeigt die nachstehende Tabelle.
Trennung von Creatinin-amidohydrolase und Creatinamidinohydrolase an DEAE-Sephadex-Anionenaustauscher
Schritt
Protein
in mg
Creatinin-amidohydrolase
U/mg
Creatinamidinohydroläse U U/mg
nach Isopropanolschritt
175
860
4,9
44 0,25
DEAE-Sephadex-
Waschwasser		 90 1 _ • 27 0 3*0
0,2OM pH 8,0
(Eluate)		 29 787 0,13 0
0,50M pH 8,0
(Eluate)		 13, 7 1,8 41'
2098 48/OSQS
-■1t·.*-
B e i s ρ i e 1 3
Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben vorgegangen, jedoch wird die DEAE-Sephadex-Chromatographie durch ein DEAE-Batehverfahren ersetzt.·
Ausgehend von 100 g Alcaligenes spec.WS 5HD0 werden 100 ml des in 0,02M Kaliumphosphatpuffer pH 8,0 gelösten zweiten Isopropanol-Niederschlags mit so viel DEAD-Sephadex versetzt, bis im Überstand etwa je 5% der Enzyme verbleiben (etwa 20 g feucht abgepreßter Austauscher). Der Austauscher wird abfiltriert, mit ca. 100 ml 0,08M Kaliumphosphatpuffer pH 8,0 gewaschen und zur gemeinsamen Elution der beiden Enzyme mit Ί00 ml 0,2M Kaliumphosphatpuffer pH 8,0, enthaltend 0,3M KOl, 15 Minuten bei +40C gerührt und anschließend filtriert. Im Eluat finden sich beide Enzyme. Durch Fällung mit Ammoniumsulfat kann ein Präparat mit 31»5 Ü/mg Creatininamidohydrolase und 1,1 ü/mg Creatin-amidinohydrolase zeigt die nachstehende Tabelle.
Isolierung eines angereicherten Enzymgeisches von Creatinin-amidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase aus 100 g(Trockengewicht) Alcaligenes spec.WS 5HO0
Schritt Protein Creatinin-amido- Creatin-amidi-
in g hydrolase nohydrolase U U/mg U U/mg
Aufschluß 26,1 2,4 x 1O4- 0,92 6 χ 102 0,023
2.Isopropanol-
zusatz(Hieder- . ' „
schlag) 1,43 1,98 χ 104 13,9 3,8 χ 1(Γ 0,265 DEAE-Sephadex
Eluat 0,5M-- A
pH 8,0 -.- 0,370 1,16 χ 104 31,5 4,1 χ 1(Γ 1,1
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Beispiel 4
7.. g (Trockengewicht) eines in Gegenwart von Creatinin gewachsenen Alcaligenes spec.WS 51400 wurden geerntet und bei pH 8,0 mit Ultraschall aufgeschlossen. Die erhaltene Suspension wurde wie in Beispiel 1 beschrieben mit 0,8 Volumen Isopropanol versetzt, 30 Minuten bei ßaumtemperatur gerührt und zentrifugiert. Der Überstand wird mit weiteren 0,45 Volumen Isopropanol versetzt und erneut zentrifugiert. Der Niederschlag wird wie in Beispiel 1 beschrieben aufgenommen und über eine DEAE-Sephadex-Säule chromato-
graphiert, wobei lediglich die Creatinin-amidohydrolase eluiert wird. Die nachstehende Tabelle zeigt die Einzelheiten dieses Verfahrens. Das erhaltene Präparat war zur Creatinin-Bestimmung geeignet.
Schritt
U (250C)
Protein in g U/ mg Ausbeute ,#
Ultraschall-'
Aufschluß
2. Isopropanolzusatz (Niederschlag)
1,5 x ΙΟ
,2 χ 10-
DEAE-Sephadex-
Eluat 0,7 x
1,780
0,85 100
0,119 . 10,1 0,028
80
47
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Bei den in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Versuchen wurde aus Creatinin in Gegenwart von Creatinin- amidohydrolase gebildetes Creatin bestimmt durch Zusatz von Adenosintriphosphat (AiDP), welches in Gegenwart von Creatinphosphokinase (CPK) in Oreatinphosphat und Adenosindiphosphat (ADP) überführt wird. Gebildetes ATP wird mit Pyruvat-Kinase (PK) und Lactatdehydrogenase (LDH) sowie Phosphoenolpyruvat (PEP) unter NADH-Verbrauch in ATP überführt und der Verbrauch an NADH optisch gemessen. Diese bekannten Schritte lassen sich wie folgt darstellen:
(1) Creatin + ATP Creatinphosphat + ADP
(2) ADP + PEP -££—^ Pyruvat + ATP
(3) Pyruvat + NADH + H+ Lactat + NAD+
Die Creatin-amidinohydrolase-Bestimmung wurde unter Messung des aus Creatinin gebildeten Harnstoffs durchgeführt, wobei letzterer nach dem Urease-Verfahren unter Spaltung gemessen wurde.
Die Michaelis-Konstante für Creatin wurde wie folgt bestimmt: KM = 5 x 10""2 M (250C; pH 7,6).
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Claims (6)

  1. - 14 Patentansprüche
    ΐ. Verfahren zur Gewinnung von Creatinin-amidohydrolase und gegebenenfalls Creatin-ainidinohydrolase, dadurch gekennzeichnet, daß ein in einem Creatinin-haltigen Medium gezüchteter Mikroorganismus aufgeschlossen, aus der wasserlöslichen AufSchlußfraktion nach an sich bekannten, "bei pH-Werten über 7,0 durchgeführten biochemischen Reinigungs- bzw. Fraktionierungsmethoden .unter Anwendung eines Testes, bei dem aus zugesetztem Creatiriin gebildetes Creatin in an sich bekannter Weise bestimmt wird, die Creatinin-amidohydrolase gereinigt und anschließend ggf. die Creatin—amidinohydrolase von so gewonnener Creatinin-amidohydrolase durch Austauscherchromatographie abgetrennt wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein mechanischer Aufschluß durchgeführt wird, insbesondere unter Anwendung von Hochdruckdispersion, Ultraschalloder Desintegrationsmühle.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Polyanionenfraktionierung durchgeführt wird.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Polyäthylenimin-Pällung bei einer Pufferkonzentration von etwa 0,1M durchgeführt wird.
  5. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine zweistufige Fällung mit Isopropanol durchgeführt wird.
  6. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme an einen schwach basischen Ionenaustauscher bei einer lonenkonzentration unter
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    -•15-.-
    0,1M adsorbiert^ der Austauscher mit etwa 0,1M Puffer gewaschen und die Creatinin-amidohydrolase und Creatinämidinohydrolase mit einer IonenJconzentration von 0,2M bzw. 0,5M "eluiert werden*
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EP0402929A1 (de) * 1989-06-16 1990-12-19 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha DNA-Fragment, das ein für Kreatininamidohydrolase kodierendes Gen enthält

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