DE2167034A1 - Creatinin-amidohydrolase - Google Patents

Creatinin-amidohydrolase

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Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. H. Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke
Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
int. Nr. 1749-11 8 MÜNCHEN 86, DEN
POSTFACH 860 820
MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22
BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
Sandhofer straße 112-132, 6800 Mannheim-Waldhof
Cre atinin-amidohydrolas e
Ausscheidung aus Patent (Patentanmeldung P 21 22 298.0)
Die Erfindung betrifft das Enyzm Creatinin-amidohydrolase.
In der klinischen Chemie, besonders für die Funktionsdiagnostik der Niere, spielt die Bestimmung der Zwischen- und Endprodukte des Eiweißstoffwechsels eine wichtige Rolle. Hierzu zählen auch Creatinin und Creatin. Die Bestimmung von Creatinin wurde daher schon wiederholt beschrieben. Die meisten der bekannten Methoden basieren auf der nichtenzymatischen Jaffe-Reaktion, die jedoch den Nachteil hat, unspezifisch zu sein.
709838/0002
-I '
Weiter wurde bereits eine spezifische mikrobiologische Bestimmungsmethode mit isolierten Bakterien beschrieben, wobei gewaschene Zellsuspensionen zur Creatinin-Messung verwendet wurden und die Bildung von Harnstoff und Ammoniak als Maß der Enzymwirkung herangezogen wurde. Lösliche, zum Creatininabbau befähigte Enzymextrakte konnten dabei jedoch nicht erhalten werden. Voraussetzung für die Schaffung einer spezifischen Creatinin-Bestimmung mit Hilfe von Enzymen war jedoch die Auffindung eines geeigneten, löslichen Enzyms, welches spezifische und meßbare Umsetzungen des Creatinins katalysieren kann.
Roche, Lacombe und Girard (BBA £, 210, 1950) charakterisierten in zwei Pseudomonas-Arten Creatinase, Creatininase und eine Glycocyaminase als spezifische Enzyme, die aus ihren S3bstraten aus der Guanidinogruppe Harnstoff in Freiheit setzten. Weiter wurde von Akamatsu und Mitarbeiter (Enzymologia, J_5, Seiten 122, 158, 173, 1951) in Erdbakterien ein als Creatinmutase bezeichnetes Enzym postuliert, welches die Gleichgewichtseinstellung zwischen Creatinin und Creatin bewirken soll. Hierbei wird folgender Abbauweg des Creatinins vermutet:
Creatinin •s Creatin ^ Harnstoff und
Sarcosin ^ Glycin ^ NH3
Nunmehr ist es gelungen, den hier vermuteten Weg des Creatinin-Abbaus zu bestätigen und erstmals zwei lösliche Enzyme in Mikroorganismen aufzufinden und in hoher Reinheit zu isolieren, welche an diesem Abbauweg entscheidend beteiligt sind.
Gegenstand der Erfindung ist eines dieser Enzyme, nämlich Creatinin-amidohydrolase mit den in den Patentansprüchen definierten Eigenschaften.
Durch das erfindungsgemäße Enzym wird folgende Reaktion kataly-
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-H '
siert:
Creatinin + H3O Creatinin-amidohydrolase v Creatin
Da es sich um eine Gleichgewichtsreaktion unter Wasseraufnahme oder -abgabe handelt, wird das Enzym als Creatinin-amidohydrolase bezeichnet.
Als Ausgangsmaterial für die Gewinnung des neuen Enzyms eignen sich Mikroorganismen allgemein, in denen das gewünschte Enzym adaptativ angereichert ist, was .gewöhnlich dadurch geschieht, daß in Gegenwart oder unter Zusatz von Creatinin gezüchtet wird.
Aus den so gewonnenen Mikroorganismen wird durch Aufschluß die wasserlösliche Fraktion'gewonnen. Aus der so erhaltenen wasserlöslichen Fraktion läßt sich die Creatinin-amidohydrolase anreichern, indem man ihre Eigenschaft, Creatinin in Creatin zu überführen, ausnützt.
Die Reinigung und Gewinnung des Enzyms ist eingehend in der DT-OS 21 22 298 beschrieben.
Zwei für die Gewinnung des Enzyms der Erfindung besonders geeignete Mikroorganismen sind Alcaligenes spec. WS 51400 aus der Familie Achromo bactericeae und Penicillum WS 90 001.
Creatinin-amidohydrolase verliert bei pH-Werten von 6 und darunter schnell an Aktivität und weist bei pH-Werten um 8,0 die größte Stabilität auf.
Die oben beschriebene bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Kombination einer Isopropanol-Fraktionierung und einer Austauscherehromatographie führt zu einer etwa 100- bis 150-fachen Anreicherung der Enzyme und ergibt
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ein Creatinin-amidohydrolase-Präparat mit einer spezifischen Aktivität über 200 U/mg.
Die Salzfällung, beispielsweise unter Verwendung von Ammoniumsulfat, eignet sich zur Gewinnung des Enzyms aus seinen Lösungen. Bei der Verwendung von Ammoniumsulfat fällt Creatininamidohydrolase bei einer Konzentration von 2,2 M. Durch Dialyse bei 4 C, zweckmäßig gegen verdünnten Puffer, beispielsweise 0,02 M Diäthanolamin-Puffer, pH 8,0, kann das Enzym von Salzen und anderen niedrigmolekularen Begleitstoffen befreit werden.
Die so erhaltenen Präparate können in eingefrorenem Zustand monatelang ohne Aktivitätsverlust gelagert werden.
Das neue Enzym kann für wissenschaftliche Zwecke sowie zur spezifischen Bestimmung des Creatinins verwendet werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1 Isolierung hochgereinigter Creatinin-amidohydrolase
Aus einem in Gegenwart von Creatinin gezüchteten Kulturansatz Alealigenes spec. WS 51400 werden die Zellen (1 kg Trockengewicht) abgetrennt, mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, auf 20 1 aufgenommen und ohne Kühlung in der Hochdruckdispersion bei ca. 800 atü aufgeschlossen. Der Extrakt wird mit 5 Vol.-% einer 10 %-igen Polyäthylenimin-Lösung (Mol-Gewicht ca. 1800) von. pH 8,0 (ca. 1 1) versetzt. Nach Zugabe von KCl (0,01 M Endmolarität) und NH.C1 (0,1 M Endmolarität) werden pro Liter Extrakt innerhalb von 10 Minuten 0,8 Volumen 90 %-iges wäßriges Isopropanol zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
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Der reichliche Niederschlag wird abzentrifugiert. Dem Überstand werden pro Liter weitere 0,45 Volumen 90 %-iges Isopropanol zugegeben.
Der so gebildete Niederschlag, welcher Creatinin-amidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase enthält, wird abgetrennt und in 400 ml 0,02 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, aufgenommen. Ein ungelöster Rückstand wird abgetrennt und der Überstand auf eine mit dem gleichen Puffer äquilibrierte DEAE-Sephadex-Säule (3,5 cm χ 1 m) gegeben. Nach dem Aufziehen wird die Säule mit 1 Volumen 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, gewaschen und dann mit 0,2 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, eluiert. Die Creatinin-amidohydrolase-haltigen Fraktionen werden vereinigt, bei pH 8,0 mit Ammoniumsulfat auf 2,2 M eingestellt, das ausgefallene Enzym abzentrifugiert und in 0,02 M Diäthanolaminpuffer, pH 8,0, auf 100 ml gelöst und 4 Stunden bei +40C gegen gleichen Puffer dialysiert. Man erhält so in einer Gesamtausbeute von 64 % ein Präparat mit einer spezifischen Aktivität von 303 U/mg. Die nachstehende Tabelle zeigt zusammenfassend die in den einzelnen Stufen dieses Verfahrens erhaltenen Aktivitäten und Ausbeuten,
Schritt U (25°C) Protein
in g		 U/mg Ausbeute
%
Dispersionsauf
schluß		 2,8 χ 105 98,6 2,8 100
Polyäthylenimin-
überstand		 2,6 χ 105 66,2 3,9 93
1.Isopropanolzu-
satz (Überstand)		 2,16 χ 105 32,6 6,6 77
2.Isopropanolzu-
sa£z (Niederschi.)		 1,97 χ 105 6,9 28,5 71
DEAE-Sephadex- 1,8 χ 105 0,59 303 64
Chrom.(Eluate)
Bei Aufschluß mit Hilfe von Ultraschall anstelle der Hochdruckdispersion konnte der Gehalt an Creatinin-amidohydrolase bei
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- Sr-
etwa gleicher spezifischer Aktivität auf das 2,5-fache, bezogen auf eingesetzte Mikroorganismen, Trockengewicht erhöht werden.
Die wie oben beschrieben erhaltene Creatinin-amidohydrolase weist eine Gleichgewichtskonstante/7 : K = 1/27 (37°C? pH 8,0) auf.
Die Michaelis-Kons tan te für Creatinin als Substrat K., = 3,3 χ 10 M (37°C; pH 8,0).
Beispiel 2
7 g (Trockengewicht) eines in Gegenwart von Creatinin gewachsenen Alcaligenes spec. WS 51400 wurden geerntet und bei pH 8,0 mit Ultraschall aufgeschlossen. Die erhaltene Suspension wurde wie in Beispiel 1 beschrieben mit 0,8 Volumen Isopropanol versetzt, 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und zentrifugiert. Der überstand wird mit weiteren 0,45 Volumen Isopropanol versetzt und erneut zentrifugiert. Der Niederschlag wird wie in Beispiel 1 beschrieben aufgenommen und über eine DEAE-Sephadex-Säule chromatographiert, wobei lediglich die Creatinin-amidohydrolase eluiert wird. Die nachstehende Tabelle zeigt die Einzelheiten dieses Verfahrens. Das erhaltene Präparat war zur Creatinin-Bestimmung geeignet.
Schritt U (25C 3O Protein
in g		 r78O U/mg Ausbeute %
Ultraschallaufschluß 1, 5 χ 103 1 ,119 0,85 100
2.Xsopropanolzusatz
(Niederschlag)		 1/ 2 χ 103 o ,028 10,1 80
DEAE-Sephadex-Eluat 0, 7 χ 103 ο 25 47
Bei den in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Versuchen wurde aus Creatinin in Gegenwart von Creatinin-amidohydrolase
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gebildetes Creatin bestimmt durch Zusatz von Adenosintriphosphat (ATP), welches in Gegenwart von Creatinphosphokinase (CPK) in Creatinphosphat und Adenosindiphosphat (ADP) überführt wird. Gebildetes ATP wird mit Pyruvat-Kinase (PK) und Lactatdehydrogenase (LDH) sowie Phosphoenolpyruvat (PEP) unter NADH-Verbrauch in ATP überführt und der Verbrauch an NADH optisch gemessen.
Diese bekannten Schritte lassen sich wie folgt darstellen:
(1) Creatin + ATP ^=-^ > Creatinphosphat + ADP
PTC
(2) ADP + PEP — ^ Pyruvat + ATP
* (3) Pyruvat + NADH + H+ Lactat + NAD+
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Claims (3)

Patentansprüche
1. Lösliche Creatinin-amidohydrolase, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Reaktion
Creatinin + H2O — Creatin
mit der Gleichgewichtskonstante/l7 : K = 1/27
bei pH 8,0 und 37°C katalysiert und für Creatinin als Substrat bei diesen Bedingungen die IL 3,3 χ 10 M aufweist.
2. Creatinin-amidohydrolase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Mikroorganismen stammt.
3. Creatinin-amidohydrolase nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Alcaligenes spec. WS 51400 oder Penicillum WS 90 001 stammt.
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