DE1928051C3

DE1928051C3 - Verfahren zur Reinigung von L-Asparaginase

Info

Publication number: DE1928051C3
Application number: DE1928051A
Authority: DE
Inventors: Tsuneo Kagawa; Masahiro Kohagura; Kazuo Mochizuki; Masao Machida Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1968-06-15
Filing date: 1969-06-02
Publication date: 1974-12-19
Also published as: DE1928051A1; US3607654A; FR2010963A1; DE1928051B2; CA931092A; GB1208227A

Description

Tabelle

Aktivitätsverlust der Entaktivierungsfaktoren durch saure Denaturierung und Schutz der L-Asparaginase

durch das Substrat L-Asparagin

	Beibehaltene	Substrat nicht	c)	Substrat
	Aktivität der	zugesetzt	zugesetzt
	L-Asparaginase	0	0
pH-Wert	C	0	0
	16	30
	62	104
9,0 (keine Behandlung)	72	100
5,0	41	81
4,0	4	25
3.5
3,0
2,5
2,0

Die vorstehende Tabelle gibt die Meßergebnisse wieder, wobei eine rohe wäßrige i.-Asparaginase-Flüssigkeit, welche die Entaktivierungsfaktoren enthielt, auf die in der Tabelle angegebenen pH-Werte sowohl in Anwesenheit von 10 ²M-i.-Asparagin als auch in Abwesenheit von !--Asparagin (Substrat) eingestellt wurde und anschließend der pH-Wert unmittelbar auf 5,5, den optimalen pH-Wert für die Wirkung der Entaktivierungsfaktoren, eingestellt wurde. Man ließ die Lösung 7wei Stunden bei 37° C reagieren, worauf die restliche Aktivität der !.-Asparaginase in der Reaktionsflüssigkeit gemessen wurde.

Die beibehaltene Aktivität ist in Prozent, bezogen auf die enzymatische Aktivität der ursprünglichen Flüssigkeit^.probe, die als 100 angenommen wurde, ausgedrückt. Wie aus der Tabelle ersichtlich, bleiben die Entaktivierungsfaktoren bei einem pH-Wert von 4,0 oder höher erhalten, und die i.-Asparaginase verliert ihre Aktivität vollständig nach einer zweistündigen Reaktion bei 37° C bei einem pH-Wert von 5,5 in ähnlicher Weise wie für den Fall, daß keine Behandlung durchgeführt wird. Im Gegensatz dazu verlieren die Entaktivierungsfaktoren ihre Aktivität bei einem pH-Wert von 3,5 oder darunter, und die von den Entaktivierungsfaktoren herrührende Entaktivierung der i.-Asparaginase kann praktisch vollständig verhindert werden. Jedoch verursacht eine Behandlung bei einem pH-Wert von 3,5 oder darunter eine unerwünschte Denaturierung der L-Asparaginase selbst, und der Verlust der Aktivität durch Denaturierung ist bei einem pH-Wert von 2,0 beträchtlich. Jedoch wird dieser Aktivitätsverlust der L-Asparaginase auf Grund der Säurebehandlung erheblich verringert, wenn erfindungsgemäß das Substrat i.-Asparagtn zu der Lösung zugegeben wird. Eine Säurebehandlung in Anwesenheit des Substrats ermöglicht also die Entfernung der Entaktivierungsfaktoren, während gleichzeitig die L-Asparaginase-Aktivität aufrechterhalten wird.

Wie oben erörtert, ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren, daß die Entaktivierungsfaktoren ihre Aktivität praktisch vollständig verlieren, indem der pH-Wert der rohe L-Asparaginase enthaltenden Enzymflüssigkeit in Anwesenheit des Substrats L-Asparagin auf einen Wert von 2,5 bis 4,0 eingestellt wird.

Es kann eine Reaktionszeit von einigen Minuten bis einigen Stunden angewandt werden, ohne daß

ein merklicher Unterschied beobachtet wird. Jedoch ist eine Behandlung über einen kurzen Zeitraum hinsichtlich der Wirkung auf die L-Asparaginase bevorzugt. Auch wird die Behandlungstemperatur niedrig gehalten, wobei bei 0 bis 10⁰C hinsichtlich des Akti-

vitätsverlustes der Entaktivierungsfaktoren keine Unterschiede beobachtet werden.

Die zu der Lösung zuzugebende Substratmenge (L-Asparaginmenge) hängt von der Konzentration des Enzyms ab, es ist jedoch ausreichend, eine Kon-

zentration von 10 ·* Mol oder höher in den üblichen Fällen zuzugeben. Verschiedene Mineralsäuren und organische Säuren werden zur Einstellung der pH-Werte verwendet, jedoch wurde gefunden, daß Chlorwasserstoffsäure das geeignetste pH-Wert-Einstellungsmittel ist.

Vorzugsweise wird die pH-Wert-Einstellung gemäß der Erfindung in einem frühen Stadium während des Verfahrens, beispielsweise in der rohen Enzymextraktflüssigkeit, durchgeführt.

Durch die Arbeitsweise der Erfindung, wodurch die Entaktivierungsfaktoren ihre Wirksamkeit vollständig verlieren, wird es möglich, die Reinheit des Präparaies in nachfolgenden Arbeitsstufen, beispielsweise bei den üblicherweise in verschiedenen Reinigungsverfahren für Enzympräparate verwendeten Maßnahmen, wie Ionenaustauscherchromatographie, und anderen chromatographischen Verfahren unter Anwendung von Adsorptionsmitteln in einfacher Weise zu erhöhen. Auf diese Weise werden hochreine i.-Asparaginase-Präparate in guten Ausbeuten erhalten, die als Pharmazeutika verwendbar sind.

Hinsichtlich der Zusammensetzung des verwendeten Fermentationsmediums und der angewandten Kultivierungsmethode können in Fermentationsver-

fahren übliche Maßnahmen zur Erzielung der !.-Asparaginase enthaltenden Zellen von Serratia marcescens angewendet werden. Sowohl ein synthetisches als auch ein natürliches Nährmedium ist zur Kultivierung der eingesetzten Mikroorganismen-

Stämme geeignet, solange es die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum der ve*wcndeten Stämme enthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt, und dazu gehören Stoffe wie beispielsweise eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbin-

düngen u. dgl., die von den verwendeten Mikroorganismen in entsprechenden Mengen gebraucht werden. Als Kohlenstoffquelle seien beispielsweise Kohlehydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate und Melasse oder irgend-

eine andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie beispielsweise organische Säuren, z. B. Essigsäure oder Milchsäure, genannt. Diese Stoffe können entweder einzeln oder in Gemischen von zwei oder mehreren eingesetzt werden.

Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen, wie z. B. Harnstoff, Ammoniaklösungen oder Ammoniumsalze, z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat

und Ammoniumphosphat oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie beispielsweise Matsquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolysate, Casein-

aminosäure, gelöste Fischsubstanz und Reiskleie- erhielt eine rohe Enzymextraktflüssigkeit mit einer

extrakt, verwendet werden. Diese Stoffe können spezifischen L-Asparaginase-Aktivität von 0,12 (die

ebenfalls entweder einzeln oder in Gemischen von Einheit der L-Asparaginase-Aktivität ist eine intcr-

zwei oder mehreren verwendet werden. nationale Einheit, welche die Aktivität des Enzyms

Zu anorganischen Verbindungen, die dem Kultur- ί durch die Anzahl der μΜοΙε des in einer Minute

medium zugesetzt werden können, gehören z. B. zersetzten Substrats angibt).

Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumhydro- Nachdem das Substrat L-Asparagin zu der Exgenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisen- traktflüssigkeit zu einer Konzentration von 10 ² Mol sulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natrium- zugegeben worden war, wurde verdünnte Chlorchlorid und Zinksulfat. io wasserstoffsäure in die Lösung von 0° C eingetropft,

Die Kultivierung der Mikroorganismen vom um den pH-Wert auf 3,4 einzustellen. Man ließ die

Stamme Serratia marcescens wird unter aeroben Be- erhaltene Lösung fünf Minuten stehen, und anschlie-

dingungcn, z. B. durch aerobes Schütteln der Kultur ßend wurden die gebildeten Niederschläge abzentri-

oder unter Rühren und Belüften einer Submerskultur, fugiert und die überstehende Flüssigkeit gewonnen,

bei einer Temperatur von etwa 25 bis 42° C und 15 wobei eine Enzymlösung mit einer spezifischen Ak-

einem pH-Wert von etwa 4,0 bis 8,5 durchgeführt. tivitätvon 1,0 erhalten wurde.

Nach etwa ein- bis zweitägiger Kultivierung unter Die Wirksamkeit der Entaktivierungsfaktoren der diesen Bedingungen haben sich L-Asparaginase ent- erhaltenen Enzymlösung war zum Zeitpunkt der Gehaltende Zellen in der erhaltene!. Kulturflüssigkeit winnung vollständig verlorengegangen, jedoch wurde angereichert. 20 kein Aktivitätsverlust der i.-Asparaginase beobach-

Nach beendeter Kultivierung können die Zellen in tet, selbst wenn man die Lösung mit einem pH-Wert

üblicher Weise aufgespalten werden, und es kann von 5,5 stehenließ. 4 1 dieser Lösung (mit einer

daraus eine rohe Enzymextraktflüssigkeit gewonnen Gesamtaktivität von 4500 Einheiten) wurden auf

werden. Die weitere Behandlung wird dann gemäß einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und unter Zu-

der Erfindung durchgeführt. Das folgende Beispiel 25 gäbe von Carboxymethylcellulose gerührt, wobei die

dient der Erläuterung der Erfindung. Falls nicht Aktivität vollständig adsorbiert wurde. Die auf diese

anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben Weise an Carboxymethylcellulose adsorbierte Aktivi-

in der Beschreibung auf das Gewicht pro Liter tat wurde mit 4 1 der oben angegebenen Pufferlösung

Wasser. (jedoch vom pH 9,0) eluiert, und man erhielt eine

30 L-Asparaginaselösung mit einer Gesamtaktivität von

Beispiel 3200 Einheiten und einer spezifischen Aktivität von

2,5. Dieses Enzym wurde durch Chromatographie

Serratia marcescens ATTC 60 wurde unter Be- mit Diäthylaminoäthylcellulose, anschließender Re-

lüften und Rühren kultiviert, bis eine ausreichende Chromatographie mit Diäthylaminoäthylcellulose und

Menge Zellen erhalten wurde. Die erhaltenen Zellen 35 Chromatographie mit einem Polyacrylamid-Gel

wurden in einer 0,01-m-Tris-(hydroxymethylamino- unter Erzielung einer spezifischen Aktivität von 20

methan)-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung mit weitergereinigt, und dabei wurde ein Enzympräparat

einem pH-Wert von 8,5 suspendiert, einer lOminüti- mit einer spezifischen Aktivität von 120 in einer

gen Behandlung in einem Ultraschallgenerator Ausbeute 25% erhalten. Das Präparat heilte eine

(10 kHz) unterworfen und dann abzentrifugiert. Die 40 künstlich hervorgerufene Leukämie bei einer Dosie-

überstehende Flüssigkeit wurde gesammelt, und man rung von einigen ng vollständig aus.

Claims

men vorgereinigte L-Asparaginase von Serratia marcescens ATCC 60 durch Absorption an Diäthyl- Patentansprüche: aminoäthylcellulose bei einem pH-Wert von 8,6 und anschließende Elution bei dem gleichen pH-Wert zu 5 reinigen. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil,

1. Verfahren zur Reinigung von L-Asparagiiisse daß dabei der größte Teil der L-Asparaginase entdurch Entfernen der die L-Asparaginase entakti- aktiviert oder inaktiviert wird. Außerdem ist der bei vierenden. Faktoren aus einem diese Faktoren diesem Verfahren nach der Behandlung mit MnCl₂ und die L-Asparaginase enthaltenden wäßrigen und Hitze erhaltene Zentriffugations-fXberstand bei Zellextralct eines L-Asparaginase erzeugenden io längerer Dialyse und Kühlung nicht b-.·■ "ndig, da er Mikroorganismus von Serratia marcescens, da- eine nicht dialysierbare Komponente c -lält, welche durch gekennzeichnet, daß man dem die i.-Asparaginase inaktiviert

Extrakt L-Asparagin zusetzt und den pH-Wert Es besteht daher seit langem ein Bedürfnis nach

des Extrakts auf etwa 2,5 bis 4,0 einstellt und einem wirksamen, wirtschaftlich und technisch leicht

den hierdurch entstandenen Niederschlag ver- 15 durchführbaren Verfahren zum Entfernen der die

wirft. L-Asparaginase entaktivierenden Faktoren aus einem

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- diese Faktoren und die i.-Asparaginase enthaltenden kennzeichnet, daß man den pH-Wert des Extrakts wäßrigen Zellextrakt eines L-Asparaginase erzeugenauf etwa 3,0 bis 3,5 einstellt den Mikroorganismus von Serratia marcescens, das

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ao die Nachteile des vorstehend geschilderten Vergekennzeichnet, daß man dem Extrakt etwa fahrens nicht aufweist und bei dem insbesondere die 10 ²MoI L-Asparagin zusetzt. Aktivität der L-Asparaginase nicht beeinträchtigt

wird.

Es hat sich nun gezeigt, daß diese Aufgabe dass durch gelöst werden kann, daß man aus den rohen Extrakten von Zellen von Serratia marcescens bei einem bestimmten pH-Wert in Gegenwart eines bestimmten Substrats die unerwünschten, i.-Aspara-

ginase entaktivierenden Faktoren ausfällt und dena-

30 turiert

Die Erfindung geht von dem bekannten Verfahren

zur Reinigung von L-Asparaginase durch Entfernen

der die L-Asparaginase entaktivierenden Faktoren

aus einem diese Faktoren und die 1.-Asparaginase

35 enthaltenden wäßrigen Zellextrakt eines i.-Aspara-

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung ginase erzeugenden Mikroorganismus von Serratia von L-Asparaginase durch Entfernen der die L-As- marcescens aus und ist dadurch gekennzeichnet, daß paraginase entaktivierenden Faktoren aus einem man dem Extrakt i.-Asparagin zusetzt und den pH-diese Faktoren und die L-Asparaginase enthaltenden Wert des Extrakts auf etwa 2,5 bis 4,0 einstellt utd wäßrigen Zellextrakt eines L-Asparaginase erzeugen- 40 den hierdurch entstandenen Niederschlag verwirft,
den Mikroorganismus von Serratia marcescens. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es

L-Asparaginase ist ein Enzym, das L-Asparagin erstmals möglich, großtechnisch und wirtschaftlich zu i.-Asparaginsäure und Ammoniak hydrolysiert. die auf fermentativem Wege gebildete i.-Aspara-Obwohl i.-Asparaginase im Tier- und Pflanzenreich ginase von Serratia marcescens wirksam zu reinigen, weit verbreitet ist, konnten viele ihrer Eigenschaften 45 ohne daß dabei ihre Aktivität beeinträchtigt wird, bisher noch nicht aufgeklärt werden. In jüngster Zeit Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es insist L-Asparaginase sowohl in der Wissenschaft als besondere möglich, die spezifische Aktivität des auch in der Technik in den Vordergrund gerückt, da rohen Enzyms in einer einzigen Reinigungsstufe befestgestellt wurde, daß das Enzym eine Antitumor- trächtlich zu erhöhen, ohne dabei eine Desaktivieaktivität und insbesondere eine hohe Aktivität gegen- 50 rung des Enzyms in Kauf nehmen zu müssen. Gleichüber leukämtschen Zellen aufweist. zeitig wird bei dieser einzigen Reinigungsstufe der

Die technische Gewinnung des Enzyms L-Aspara- größte Teil der inaktivierenden Faktoren aus dem ginase, die für die Verwendung desselben in Arznei- rohen Enzymextrakt entfernt, was nach dem bisher mitteln erforderlich ist, ist jedoch auf große Schwie- bekannten Verfahren sehr aufwendig war. Nach dem rigkeiten gestoßen, die darauf zurückzuführen sind, 55 erfindungsgemäßen Verfahren gelingt nämlich bedaß es einerseits schwierig ist, L-Asparaginase erzeu- reits auf einer frühen Reinigungsstufe die einfache gende Mikroorganismen in technischem Maßstab zu und wirksame Entfernung der Entaktivierungsfakkultivieren und daß andererseits aber auch die Reini- toren, während der bei den bekannten Verfahren gung der auf dies« Weise erzeugten L-Asparaginase nach der Behandlung mit MnCl., und Hitze erhaltene von Serratia marcescens nach dem bisher bekannten 60 Zentrifugations-Überstand bei fängerer Dialyse und Verfahren technisch sehr aufwendig ist und zu großen Kühlung infolge anwesender Entaktivierungsfaktoren Aktivitätsverlusten des Enzyms führt. instabil ist.

So ist aus »Biochemical and Biophysical Research In der folgenden Tabelle ist der Aktivitätsverlust

Communications«, Bd. 28, Nr. 2, S. 160 bis 165 der die L-Asparaginase entaktivierenden Faktoren (1967), bereits ein Verfahren bekannt, mit dessen 65 durch saure Denaturierung als Folge der Einstellung Hilfe es möglich ist, eine zunächst durch Anwendung bestimmter pH-Wertbereiche und die Schutzwirkung von MnCl₂ und Hitze (55° C, 5 Minuten) und an- des Substrats L-Asparagin auf L-Asparaginase gegen schließend noch durch weitere Reinigungsmaßnah- saure Denaturierung wiedergegeben.