DE2167034B2 - Creatinin-amidohydrolase - Google Patents

Creatinin-amidohydrolase

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Description

bei pH 8,0 und 37° C katalysiert und für Creatinin als Substrat bei diesen Bedingungen die Km 3,3 χ 10~2 M aufweist
2. Creatinin-amidohydrolase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Mikroorganismen stammt.
3. Creatinin-amidohydrolase nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Alcaligenes spec. WS 51 400 oder Penicillum WS 90 001 stammt.
Weiter wurde bereits eine spezifische mikrobiologische Bestimmungsmethode mit isolierten Bakterien beschrieben, wobei gewaschene Zellsuspensionen zur Creatinin-Messung verwendet wurden und die Bildung von Harnstoff und Ammoniak als Maß der Enzymwirkung herangezogen wurde. Lösliche, zum Creatininabbau befähigte Enzymextrakte konnten dabei jedoch nicht erhalten werden. Voraussetzung für die Schaffung einer spezifischen Creatinin-Bestimmung mit Hilfe von
ι» Enzymen war jedoch die Auffindung eines geeigneten, löslichen Enzyms, welches spezifische und meßbare Umsetzungen des Creatinins katalysieren kann.
Roche, Lacombe und Girard (BBA 6, 210, 1950) charakterisierten in zwei Pseudomonas-Arten Creatina-
ii se, Creatininase und eine Glycocyaminase als spezifische Enzyme, die aus ihren Substraten aus der Guanidinogruppe Harnstoff in Freiheit setzten. Weiter wurde von Akamatsu und Mitarbeiter (Enzymologia, 15, Seiten 122, 158, 173, 1951) in Erdbakterien ein als Creatinmutase bezeichnetes Enzym postuliert, welches die Gleichgewichtseinstellung zwischen Creatinin und Creatin bewirken soll. Hierbei wird folgender Abbauweg des Creatinins vermutet:
_'"> Creatinin
und
Die Erfindung betrifft das
Enzym Creatinin-amidohydrolase
In der klinischen Chemie, besonders für die Funktionsdiagnostik der Niere, spielt die I immung der Zwischen- und Endprodukte des Eiweißstoffwechsels eine wichtige Rolle. Hierzu zählen auch Creatinin und Creatin. Die Bestimmung von Creatinin wurde daher schon wiederholt beschrieben. Die meisten der bekannten Methoden basieren auf der nichtenzymatischen Jaffe-Reaktion, die jedoch den Nachteil hat, unspezifisch zu sein.
Creatin > Harnstoff
Sarcosin * Glycin
NH.,
Nunmehr ist es gelungen, den hier vermuteten Weg des Creatinin-Abbaus zu bestätigen und erstmals zwei lösliche Enzyme in Mikroorganismen aufzufinden und in hoher Reinheit zu isolieren, welche an diesem Abbauweg entscheidend beteiligt sind.
Gegenstand der Erfindung ist eines dieser Enzyme, nämlich Creatinin-amidohydrolase mit den in den Patentansprüchen definierten Eigenschaften.
Durch das erfindungsgemäße Enzym wird folgende Reaktion katalysiert:
Creatinin-amidohydrolase Creatinin + H2O C'realin
Da es sich um eine Gleichgewichtsreaktion unter Wasseraufnahme oder -abgabe handelt, wird das Enzym als Creatinin-amidohydrolase bezeichnet.
Als Ausgangsmaterial für die Gewinnung des neuen Enzyms eignen sich Mikroorganismen allgemein, in denen das gewünschte Enzym adaptativ angereichert ist, was gewöhnlich dadurch geschieht, daß in Gegen wart oder unter Zusatz von Creatinin gezüchtet wird.
Aus den so gewonnenen Mikroorganismen wird durch Aufschluß die wasserlösliche Fraktion gewonnen. Aus der so erhaltenen wasserlöslichen Fraktion läßt sich die Creatinin-amidohydrolase anreichern, indem man ihre Eigenschaft, Creatinin in Creatin zu überführen, ausnützt.
Die Reinigung und Gewinnung des Enzyms ist eingehend in der Stammanmeldung P 21 22 298.0-41 beschrieben.
Zwei für die Gewinnung des Enzyms der Erfindung besonders geeignete Mikroorganismen sind Alcaligenes spec. WS 51 400 aus der Familie Achromo bactericeae und Penicillum WS 90 001.
Creatinin-amidohydrolase verliert bei pH-Werten von 6 und darunter schnell an Aktivität und weist bei pH-Werten um 8,0 die größte Stabilität auf.
Die Salzfällung, beispielsweise unter Verwendung von Ammoniumsulfat, eignet sich zur Gewinnung des Enzyms aus seinen Lösungen. Bei der Verwendung von Ammoniumsulfat iilll Creatinin-amidohydrolase bei einer Konzentration von 2,2-M. Durch Dialyse bei 4°C, zweckmäßig gegen verdünnten Puffer, beispielsweise 0,02-M Diäthanolamin-Puffer, pH 8,0, kann das Enzym von Salzen und anderen niedrigmolekularen Begleitstoffen befreit werden.
Die so erhaltenen Präparate können in eingefrorenem Zustand monatelang ohne Aktivitätsverlust gelagert werden.
Das neue Enzym kann für wissenschaftliche Zwecke sowie zur spezifischen Bestimmung des Creatinins verwendet werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1
Isolierung hochgereinigter Creatinin-amidohydrolase
Aus einem in Gegenwart von Creatinin gezüchteten Kulturansatz Alcaligenes spec. WS 51 400 werden die Zellen (1 kg Trockengewicht) abgetrennt, mit 0,1-M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, auf 20 1 aufgenommen und ohne Kühlung in der Hochdruckdispersion bei ca. 800 atü aufgeschlossen. Der Extrakt wird mit 5 Vol.-% einer 10%igen Polyäthylenimin-Lösung (Mol-Gewicht ca. 1800) von pH 8,0 (ca. 1 1) versetzt Nach Zugabe von KCl (0,01-M Endmolarität) und NH4Cl (0,1-M Endmolarität) werden pro Liter Extrakt innerhalb von 10 Minuten 0,8 Volumen 90%iges wäßriges Isopropanol zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
Der reichliche Niederschlag wird abzentrifugiert Dem Überstand werden pro Liter weitere 0,45 Volumen 90%iges Isopropanol zugegeben.
Der so gebildete Niederschlag, welcher Creatininamidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase enthält, wird abgetrennt und in 400 ml 0,02-M Kaliumphosphatpuffer, pH 8.0, aufgenommen. Ein angelöster Rückstand wird abgetrennt und der Überstand auf eine mit dem gleichen Puffer äquilibrierte DEAE-Sephadex-Säule (3,5 cm χ 1 m) gegeben. Nach dem Aufziehen wird die Säule mit 1 Volumen 0,1-M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, gewaschen und dann mit 0,2-M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, eluierL Die Creatinin-amidohydrolase-haltigen Fraktionen werden vereinigt, bei pH 8,0 mit Ammoniumsulfat auf 2£-M eingestellt, das ausgefallene Enzym abzentrifugiert und in 0,02-M Diäthanolaminpuffer, pH 8,0, auf 100 ml gelöst und 4 Stunden bei +40C gegen gleichen Puffer dialysierL Man erhält so in einer Gesamtausbeute von 64% ein Präparat mit einer spezifischen Aktivität von 303 U/mg. Die nachstehende Tabelle zeigt zusammenfassend die in den einzelnen Stufen dieses Verfahrens erhaltenen Aktivitäten und Ausbeuten.
Schrill U Protein in g U/mg Ausbeute
(25 C) (%)
Dispersionsaufschluß 2,8 XlO5 9i,6 2,8 100
ι Polyäthylenimin-Überstand 2,6 XlO5 66,2 3,9 93
ί£ 1. Isopropanolzusatz (Überstand) 2,16XIO5 32,6 6,6 77
S 2. Isopropanolzusalz (Niederschlag) 1,97XlO5 6,9 28,5 71
• DEAE-Sephadex-Chrom. (Eluatc) 1,8 XlO5 0,59 303 64
Bei Aufschluß mit Hilfe von Ultraschall a nstplle Ηργ Beispiel 2
Hochdruckdispersion konnte der C-ohalt an Creatininamidohydrolase bei etwa gleicher spezifischer Aktivität auf das 2,5fache, bezogen auf eingesetzte Mikroorganismen, Trockengewicht erhöht werden.
Die wie oben beschrieben erhaltene Creatinin-amidohydrolase weist eine Gleichgewichtskonstante
[C'reatin]
[Creatinin]
K = 1,27
(37°C;pH8,O)auf.
Die Michaelis-Konstante für Creatinin als Substrat KM = 3,3 χ 10 2M (370C; pH 8,0).
7 g (Trockengewicht) eines in Gegenwart von Creatinin gewachsenen Alcaligenes spec. WS 51400 wurden geerntet und bei pH 8,0 mit Ultraschall aufgeschlossen. Die erhaltene Suspension wurde wie in Beispiel 1 beschrieben mit 0,8 Volumen Isopropanol versetzt, 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und zentrifugiert. Der Überstand wird mit weiteren 0,45 Volumen Isopropanol versetzt und erneut zentrifugiert. Der Niederschlag wird wie in Beispiel 1 beschrieben aufgenommen und über eine DEAE-Sephadex-Säule chromatogrpphiert, wobei lediglich die Creatinin-amidohydrolase eluiert wird. Die nachstehende Tabelle zeigt die Einzelheiten dieses Verfahrens. Das erhaltene Präparat war zur Creatinin-Bestimmung geeignet.
Schrill
(25 C) Protein in g
U/mg
Ausbeute
Ultraschallaufschiuß 1,5 x 10' 1,780 0,85 100
2. Isopropanolzusatz (Niederschlag) 1,2X10' 0,119 10,1 80
DEAE-Sephadex-FJuat 0,7 x 10' 0,028 25 47
Dei den in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Versuchen wurde aus Creatinin in Gegenwart von Creatinin-amidohvdrolase gebildetes Creatin bestimmt durch Zusatz von Adenosintriphosphat (ATP), welches in Gegenwart von Creatinphosphokinase (CPK) in Creatinphosphat und Adenosindiphosphat (ADP) über-
6
führt wird. Gebildetes ATP wird mit Pyruvat-Kinase überführt und der Verbrauch an NADH optisch (PK) unter Lactatdehydrogenase (LDH) sowie Phos- gemessen. Diese bekannten Schritte lassen sich wie folgt phoenolpyruvat (PEP) unter NADH-Verbrauch in ATP darstellen:
CPK
Creatin + ATP ► Creatinphosphat + ADP (1)
PK
ADP + PEP » Pyruvat + ATP (2)
LDH
Pyruvat + NADH + H+ » Lactat + NAD+ H)

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Lösliche Creatinin-amidohydrolase, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Reaktion
Creatinin + H2O ^=^ Creatin
mit der Gleichgewichtskonstante
[Creatin]
[Creatinin]
: K = 1,27
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