DE2206636B2

DE2206636B2 - Reaktive Matrix zur Trennung von in einem Medium vorliegenden Enzymen und Verwendung derselben zur affinitätschromatographischen Trennung von Enzymen

Info

Publication number: DE2206636B2
Application number: DE19722206636
Authority: DE
Inventors: Peter Duncan Goodearl Formby Lancashire Dean
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1971-02-11
Filing date: 1972-02-11
Publication date: 1980-09-04
Also published as: DE2206636C3; SE403292B; DE2206636A1

Description

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Zur Trennung von Reinigung von Rohgemischen, die Enzyme zusammen mit anderen organischen Materialien enthalten, ist die Affinitätschromatographie bekannt, bei deren Durchführung ein Substrat für eines der Enzyme verwendet wird, das an ein unlösliches polymeres Trägermaterial, wie beispielsweise Zellulose, gebunden ist, worauf das enzymenthaltende Gemisch mit dem Substrat in Berührung gebracht wird. Das Enzym wird dabei vorübergehend an das Substrat gebunden, während das Trägermaterial von Verunreinigungen freigewaschen und nachfolgend zur Gewinnung des Enzyms behandelt wird. Diesem Verfahren haftet jedoch der Nachteil an, daß nur ein einziges Enzym gleichzeitig aus dem Gemisch entfernt werden kann. Die Trennung von komplexen Gemischen, die eine Vielzahl von Enzymen enthalten, ist nach dieser Methode mühsam und zeitraubend.

Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, ein System zu schaffen, mit dessen Hilfe es möglich ist, in einfacher Weise auch komplexe Gemische von Enzymen zu trennen.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung durch die Matrix gemäß dem Patentanspruch gelöst.

Aus »Immunochemistry, Pergamon Press 1965, Bd. 2, S. 293, 320 bis 322«^ ist es bekannt, Purine, Pyrimidine, Nucleoside Und Nttdeotide an unlösliche Trägermaterialien zu binden und mit Hilfe dieser reaktiven Matrizes durch Doppelstrang-Komplexbildung Komplementär-Nucleinsäuren und deren Derivate aus Lösungen zu binden und zu fraktionieren. Ferner ist es aus dieser Literaturstelle bekannt, Enzyme an unlösliche Trägermaterialien chemisch zu binden, es wird jedoch betont, daß Daten über die Effektivität derartiger gebundener Enzyme und deren Anwendung zu Synthese- oder Abbauzwecken nicht vorliegen.

Demgegenüber werden erfindungsgemäß keine Enzyme, sondern Coenzyme an unlösliche Trägermaterialien chemisch gebunden und mit Hilfe der dabei erhaltenen Matrizes ganze Gruppen von Apoenzymen, für welche das betreffende Coenzym die prosthetische Gruppe zur Entfaltung der Enzymwirkung darstellt, Auslösungen von Enzymgemischen selektiv gebunden und fraktioniert Unvorhersehbar war dabei auch die erfolgreiche Fraktionierung der an das Coenzym gebundenen Apoenzyme unter Berücksichtigung der bekannten Tatsache, das sterische Hinderungen, elektrostatische Wechselwirkungen und DiffusionseinflUsse bei der Bindung und Eluierung derartiger Enzyme eine wesentliche Rolle spielen.

Die Bindung zwischen einem Enzym und seinem Coenzym ist gewöhnlich sehr schwach im Vergleich zu einer kovalenten Bindung, dennoch in überraschender Weise ausreichend, um die Trennung unter Einsatz der erfindungsgemäßen Matrizes zu ermöglichen. Ein wesentliches Merkmal der Erfindung besteht darin, daß sie es ermöglicht, die Stärke der Enzym-Coenzym- Bindung zu ändern, beispielsweise durch Kontaktieren der reaktiven Matrix mit den daran sitzenden Enzymen mit einer Lösung kleiner Moleküle, wie eines Substrats oder eines Inhibitors für eines oder mehrere der Enzyme oder sogar Kaliumchlorid, so daß die Enzyme in einer gewünschten Reihenfolge eluiert werden können. Es wurde ferner gefunden, daß es zweckmäßig ist, die Enzymmischung mit der reaktiven Matrix in Gegenwart eines Substrats für wenigstens eines der zu trennenden Enzyme zu kontaktieren. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Enzymmischung, die in einer Lösung eines geeigneten Puffersalzes, wie eines anorganischen Phosphats, gelöst ist, mit der reaktiven Matrix kontaktiert, worauf die Matrix mit einer Lösung des Puffers gewaschen wird, der eine bestimmte Menge eines Substrats für wenigstens eines der Enzyme enthält, wobei die Enzymmischung von der Matrix durch Eluierung mit Lösungen mit steigender lonenkonzentration oder durch Eluierung mit Lösungen von Komponenten der Enzymreaktion, beispielsweise NAD oder NADH, abgetrennt wird.

»Sepharose« ist ein Warenzeichen für Agarose.

Enzyme, die unter Einsatz der erfindungsgemäßen Matrizes getrennt und gereinigt werden können, sind beispielsweise Rohenzyme, Enzymgemische oder Enzymsysteme, die in tierischen, pflanzlichen oder mikrobiologischen Geweben vorliegen oder daraus isoliert worden sind, ferner Rohextrakte dieser Gewebe sowie synthetische Enzyme, beispielsweise solche, die nach der Merrifield-Festphasenmethode hergestellt werden. Beispiele für Enzymgruppen, deren Aktivität von der Gegenwart eines Coenzyms abhängt, sind Dehydrogenasen, wie beispielsweise Alkohol-dehydrogenase, Lacta-dehydrogenase oder Threonin dehydrogenase, Oxidasen, wie beispielsweise d- und I-Aminosäu-

reoxidase, Decarboxylasen, wie Lysindecarboxylase oder Arginindecarboxylase sowie Kinasen, wie beispielswehe Hexokinase oder Glukokinase.

Das polymere Trägermaterial kann «ι Form von Kügelchen oder einer Bahn, beispielsweise einer gewebten Bahn, oder in einer anderen gegossenen oder extrudierten Form vorliegen. Vorzugsweise wird das Material in Form eines durchlässigen Materials hergestellt, das sich in eine Säule einfüllen läßt

Die Coenzyme können mit dem polymeren Trägermaterial nach verschiedenen chemischen Methoden

verknüpft werden. Azidgruppen oder Chlor-s-triazinyl· Gruppen könnten auf der polymeren Matrix ausgebildet werden, die direkt mit dem Coenzym reagieren, ohne seine Fähigkeiten zu beeinträchtigen, sich selbst an ein Enzymmolekül zu binden. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wirjj Zellulose, ein Zellulosederivat oder dergleichen mit einer Vielzahl von vizinalen Diolgruppen mit Bromcyan und dann mit dem Coenzym gemäß dem folgendet) Reaktionsschema behandelt: !

-OH

—OH

+ CNBr

— O

—O C=NH

RNH₂

—O

— O

C=N-R

+ NHj

In dem vorstehenden Reaktionsschema stellt RN H2 das Coenzym dar. Bevorzugt wird das Coenzym mit der Hauptkette der Polymerisatkette durch eine Kohlenstoffzwischenkette mit entweder 2 bis 20 Kohlenstoffatomen oder Oligopeptiden oder polyaromatischen Systemen, wie beispielsweise Benzidinbrücken, verbunden.

Die Erfindung wird vorzugsweise in der Weise durchgeführt, daß eine Lösung des Enzymgemisches durch eine Füllkörpersäule, die mit der reaktiven Matrix gefüllt ist, geschickt wird Nach dem Waschen der Säule zur Entfernung unerwünschte* Materialien werden die daran gebundenen Enzyme nacheinander durch Eluieren entfernt, vorzugsweise mit Pufferlösungen, steigender lonenstärke, oder Pufferlösungen mit Kofaktoren für die Enzyme. So wurde gefunden, daß verschiedene Enzyme von der Säule bei verschiedenen und charakteristischen lonenstärken entfernt werden, so daß eine Enzymtrennung möglich ist. Anorganische Phosphatpufferlösungen und Kaliumchloridlösungen haben sich als außerordentlich geeignet als Mittel zur Steigerung der lonenstärke erwiesen.

Enthält die Mischung nur zwei Enzyme, kann ein anderes und einfacheres Verfahren gewählt werden. Dabei werden in der ersten Stufe die Enzyme an die reaktive Matrix in der beschriebenen Weise gebunden und dann mit einer Lösung eines Substrats oder Effektors für eines der Enzyme gewaschen. Es wurde gefunden, daß diese Technik das Enzym, dessen Substrat oder Auslöser durch die Säule geführt wurde und das andere Enzym in das Elutionsmittel entfernt, oft fester an den Träger bindet. Das auf dem Träger bleibende Enzym kann durch Waschen mit einer Pufferlösung höherer lonenstärke oder durch Entfernen des Auslösers oder durch Zusatz eines konkurrierenden Mittels für diesen Auslöser entfernt werden. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht:

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Trennung eines Gemisches von L-malat-dehydrogenase und L-Lactatdehydrogenase an N AD-Zellulose. 10 g Zellulosepulver werden nach dem Bromzyanver-

r> fahren von Axen, Porath und Emback, Nature 1967,214, Seite 1302 aktiviert und mit 100 mg Nikotinamid-adenin-dinucleotid in 0,1 m Natriumkarbonatpuffer vom pH 9 für 12 Stunden umgesetzt. Ein künstliches Gemisch wird aus L-Malat-dehydrogenase (MDH) L-Lactat-dehydrogenas (LDH) und Rinder-Serumalbumin (BSA) hergestellt und über Nacht gegen lOm-molaren Phosphatpuffer dialysiert. Die N A D-Zellulose wird in eine Säule von 5 mm Durchmesser und 20 mm Höhe gebracht und mit 10 m-molarem Phosphatpuffer von

4-> pH 7,5 ins Gleichgewicht gesetzt. Eine 50 μΙ-Probe mit 0335 Einheiten MDH, 1,85 Einheiten LDH und 0,8 mg

BSA wird auf die Säule gebracht und nicht adsorbiertes Protein mit 2 ml Phosphatpuffer ausgewaschen. Die Säule wird dann mit einem Kaliumchloridgra-

dienten in 10 m-molarem Phosphatpuffer eluiert, wobei der Gradient von 0 bis 0,5 m KCl (20 ml insgesamt) liegt, MDH₁ LDH und BSA werden in der von der Säule ablaufenden Lösung untersucht und die anfänglichen und abschließenden spezifischen Aktivitäten, Gewin-

v> nungsquoten und Reinigungsfaktoren sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben:

F.n/ym	Zugesetzte Einheilen	Spezifische Anfangs aktivität	Gewonnene Einheiten	Spezifische End-Aktivitiit	Remigungs- l'aktor
		(E/mg)		(E/mg)
MDH	0,335	0,42	0,3	20	47,6
LDH	1,85	2,30	1,3	26	11,3
BSA	(1.8 ITl!!

Es wird gefunden, daß MDH bei 0,1 m KCl, BSA bei 0,175 m KCi und LDH bei 03 m KCl eluiert wird.

Beispiel 2

Dieses Beispiel veranschaulicht die Chromatographie eines rohen Extrakts von Pseudomonas oxalaticus an NA D-Zellulose, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde. Der Rohextrakt wurde über Nacht gegen 10m-molaren Phosphatpuffer von 7,5 dial>siert, und eine 0,5 ml-Probe auf eine 1,4 cm χ 9,0 cm-Säule mit NAD-Zellulose gebracht, die mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gesetzt worden war. Nichtadsorbiertes Protein wurde aus der Säule mit 40 ml des Puffers ausgewaschen und das Enzym mit einem Kaliumphosphatgradienten von 0,01 bis 0,5 m, 160 ml Gesamtvolumen, bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 ml/h eluiert Die folgenden Enzyme wurden in dem Eluat untersucht und die Konzentration des zu ihrem Eluieren notwendigen Phosphats in Klammern angegeben.

D-Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (45 mMol)
L-Lactat-dehydrogenase(130 mMol)
L-Threonin-dehydrogenase (ca. 250 mMol).

Eine größere Spitze inerten Proteins wurde bei 45 mMol Phosphat, wie in F i g. 1 gezeigt, eluiert.

Beispiel 3

Dieses Beispiel veranschaulicht die Chromatographie von L-Threonin-dehydrogenase aus einem dialysierten Rohextrakt von Pseudomonas oxalaticus an NAD-Zellulose in Abwesenheit (A) und Anwesenheit (B) von 10 mMol L-Threonin. Es wurde das Verfahren wie in Beispiel 2 gewählt, außer daß im Falle B 10 mMol L-Threonin in dem Puffer und dem Gradienten eingeschlossen war.

L-Threonin-dehydrogenase und ein größerer Anteil enzymatisch aktiven Proteins wurden bei den folgenden Konzentrationen an Kaliumphosphat, wie in Fig.2a und 2b gezeigt, eluiert

(A)	(B)
Kein	10 mMol
Threonin	L-Threonin

L-Threonin-dehydrogenase 220 mMol 220 mMol Inertes Protein 140 mMol 90 mMol

Dieses Beispiel veranschaulicht den Vorteil, L-Threonin in das Puffersystem einzuschließen, um die Reinigung des Enzyms L-Threonin-dehydrogenase an NAD-Zellulose zu unterstützen.

Beispiel 4

Dieses Beispiel veranschaulicht die Affinitätschromatographie der L-Threonin-dehydrogenase aus einem Rohextrakt von Pseudomonas oxalaticus an einem diazo-verbundenen NAD-Zellulosederivat, das wie folgt hergestellt wurde. o-Amino-phenol wurde nach der Bromzyantechnik von Axen, Porath und Emback (1967) an Zellulose gekuppelt Die o-Hydroxyamino-Zellulose (15 g) wurde mit diazotierten! Benzidin (aus 1 g Benzidin-HCl) bei 0°C 10 Minuten behandelt Das Zellulosederivat wurde mit eiskaltem Wasser 10 Minuten gewaschen und in einer Lösung von NAD (50 mg) in 0,1 molarem Natriumbicarbonatpuffer, pH 9,0 (15 ml), suspendiert Die Suspension wurde über Nacht bei 0"C gerührt und mit einem großen Volumen eiskalten destillierten Wassers durchgewaschen.

Eine 50-Mikroliter-Probe des rohen dialysierten Extrakts wurde auf eine 5 mm χ 20 mm-Säule der

diazo-verbundenen NAD-Zellulose gebracht, die mit 10 mMol Phosphatpuffer vom pH 7,5 equilibriert war.

Nichtadsorbiertes Protein wurde mit 10 ml des gleichen Puffers ausgewaschen und das Enzym mit einem Kaliumchloridgradienten, 0 bis 0,5 molar, 20 ml Gesamt-

volumen bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 5 bis 6 ml/h eluiert

Auf L-Threonin-dehydrogenase und anderes enzymatisch aktives Protein wurde in der ablaufenden Lösung, wie in F i g. 3 gezeigt, geprüft

Beispiel 5

Dieses Beispiel zeigt die Chromatographie von D-Glucose-6-phosphat-dehydrogenase aus einem Heferohextrakt an e-Amino-caproyl-NADP-sepharose, die wie folgt hergestellt war:

e-Amino-caproyl-sepharose wurde durch Kuppeln von 6-Aminokapronsäure (1 g) mit Sepharose 4B (10 g) nach der Methode von Axen, Porath und Emback (1967) hergestellt. Zu 10 g dieses Polymerisats wurden 5 g

Dicyclohexyl-carbodiimid in 12 ml Pyridin und 100 mg NADP in 3 ml Wasser zugesetzt Dieses Gemisch wurde 10 Tage bei Raumtemperatur langsam gerührt, und das Gel nacheinander mit 80%igem wäßrigem Pyridin, Äthanol, Butanol, Äthanol, Wasser, 2molarer KCl und schließlich mit Wasser gewaschen.

Eine Probe (1 ml) des rohen Hefeextrakts wurde auf eine 1 cm χ 5 cm-Säule der e-Amino-caproyl-N ADP-sepharose aufgebracht, die mit 0,05 molarem Triäthanolamin-NaOH-Puffer vom pH 7,6 equilibriert war.

Nichtadsorbiertes Protein wurde mit 50 ml des gleichen Puffers ausgewaschen und das Enzym mit einem Kaliumchloridgradienten von 0 bis 03 molar, 200 ml Gesamtvolumen, bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 12 ml/h, eluiert.

In der ablaufenden Lösung wurde auf D-Glucose-6-phosphat-dehydrogenase und anderes enzymatisch aktives Protein geprüft. Enzym wurde bei 0,15 molarer KCl eluiert, wobei seine spezifische Aktivität von 0,29 μΜοΙ NADPH/min/mg im Anfangsextrakt auf 6,50 μΜοΙ NADPH/min im gereinigten Produkt, wie in F i g. 4 gezeigt, anstieg. Die Gewinnung der Enzymaktivität war quantitativ.

Beispiel 6

Dieses Beispiel veranschaulicht die Isolierung von /f-Hydroxybutyrat-dehydrogenase aus einem Rohextrakt von Rhodopseudomonas sphaeroides an e-Aminocaproyl-NAD-sepharose. Die reaktive Matrix wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, hergestellt, außer daß NAD anstelle von NADP verwendet wurde.

Eine 50-Mikroliter-Probe des Rohextrakts wurde auf eine 5 mm χ 20 mm-Säule mit e-Amino-caproyl-NAD-sepharose gebracht, die mit 0,05 molarem Tris-HCl-Puf-

eo fer vom pH 8,0 equilibriert war. Nichtadsorbiertes Protein wurde mit 20 ml des gleichen Puffers ausgewaschen, und das Enzym mit einem KCl-Gradienten von 0 bis 0,5 molar in 0,05 molarem Tris-HCl-Puffer vom pH 8,0 eluiert. Die spezifische Aktivität der ß-Hydroxy-butyrat-dehydrogenase stieg von 3,1 χ ΙΟ-⁴ μΜοΙ NADH gebildet pro min/mg Protein auf annähernd 3 χ 10~² μΜοΙ NADH/min/mg, nach Fi g. 5 ein Anstieg um einen Faktor von einigen Hundert.

Beispiel 7

Dieses Beispie) faßt in Tabellenform einige mit verschiedenen Koenzymen, Matrixarten, Enzymen und »Auslegergruppen« erhaltenen Ergebnisse zusammen. Die Ergebnisse sind in Einheiten der Konzentration des

zur Elution des Enzyms oder Rinder-Serumalbumins in künstlich hergestellten Gemischen erforderlichen Kaliumchlorids ausgedrückt. In jedem Falle wurde das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren angewandt.

Matrix	Koenzym	»Auslegergruppe«	Enzym	Zur Elution erfor	BSA	Anmerkungen
				derliche :	155
				Salzkon-	140
				zentration	155
Zellulose	ADP	keine	L-Lactat-dehydrogenase	Enzym	0
Zellulose	ADP-Ribose	keine	L-Lactat-dehydrogenase	280	0
Zellulose	ADP-Ribose	keine	L-G lutamat-dehydrogenase	295	0
Sephadex G-200	NAD	keine	L-Lactat-de hy d roge nase	460	0
Sephadex G-IOO	NAD	keine	L-Malat-dehydrogenase	120	0
Sepharose	AMP	r-Amino-caproyl	L-Malat-dehydrogenase	90
Sepharose	AMP	r-Amino-caproyl	Isocitrat-dehydrogenase	90
Sepharose	NAD	c-Amino-caproyl	G lycerinaldehyd-3-phos-	190	0	Enzym eluiert mit
			phat-dehydrogenase	> 1000		200 μΙ-Menge an
					0	5mmolarem NADH
Sepharose	NAD	Triglycyl	L-Lactat-dehydrogenase			Enzym eluiert mit
				85		50 mMol NAD
Sepharose	NAD	f-Amino-caproyl	L-Lactat-dehydrogenase			Säule equilibriert
				> 1000		mit 5 mMol
						Na2SOj in allen
					Puffern.
					Enzym eluiert mit
					5 mMol NADH

Sepharose

NADP

f-Amino-caproyl

D-Glucose-6-phosphatdehydrogenase

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Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

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Claims

Patentansprüche:

1. Reaktive Matrix zur Trennung von in einem Medium vorliegenden Enzymen voneinander und von anderen Komponenten durch Affinitätschromatographie mit einem Effektor, der chemisch an eine Matrix aus einem wasserunlöslichen organischen polymeren Trägermaterial aus einem Polyacrylamid, einem Polyester, einem substituierten vernetzten Polystyrol, Polyvinylalkohol, Zellulose, einem Zellulosederivat, Stärke, Dextran, Sepharose, einem vernetzten Dextran oder einem Protein gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Effektor aus einer als Coenzym wirkenden Adenylverbindung aus Nikotinamidadenindinucleotid oder einer reduzierten Form desselben, Nikotinamidadenin-dinucleotidphosphat oder einer reduzierten Form desselben, Adenosindiphosphatribose, Adenosintriphosphat, Adenosindipnosphat oder Adenosinmonophosphat besteht.

2. Matrix nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form eines durchlässigen Materials zum Füllen einer Füllkörper-Kolonne vorliegt.

3. Matrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Umsetzung eines organischen polymeren Trägermaterials, das eine Vielzahl von vizinalen Diolgruppen enthält, mit Bromcyan und dann mit einem Coenzym hergestellt worden ist.

4. Matrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Coenzym mit der Hauptkette der Polymerenkette des organischen polymeren Trägermaterials über eine Kohlenstoffzwischenkette mit 2 bis 20 Kohlenstoff- r> atomen oder über ein Oligopeptid oder ein polyaromatisches System verbunden ist.

5. Verwendung der reaktiven Matrix gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 zur affinitätschromatographischen Trennung einer Vielfalt von Enzymen.