DE2206636A1

DE2206636A1 - Trennung von Enzymen

Info

Publication number: DE2206636A1
Application number: DE19722206636
Authority: DE
Inventors: Peter Duncan Goodearl Formby Lancashire; Lowe Christopher Robin Maidenhead Berkshire; Dean (Großbritannien)
Original assignee: National Research Development Corp UK
Current assignee: National Research Development Corp UK
Priority date: 1971-02-11
Filing date: 1972-02-11
Publication date: 1972-08-24
Also published as: SE403292B; DE2206636B2; DE2206636C3

Description

Trennung von Enzymen Priorität: Grossbritannien vom 11. Februar 1971, Nr. 4469/71 Die Erfindung betrifft die Trennung von Gemischen, die eine Vielzahl von Enzymen enthalten.
Bei der Trennung und Reinigung von Rohgemischen, die Enzyme zusammen mit anderem organischem Material enthalten, ist vorgeschlagen worden, die Technik der Affinitätschromatographie zu verwenden, bei der ein Substrat für eines der Enzyme an ein unlösliches, polymeres Trägermaterial wie beispielsweise Zellulose gebunden ist, und das das Enzym enthaltende Gemisch mit dem unlöslich gemachten Substrat in Berührung gebracht wird. Das Enzym wird vorübergehend an das Substrat gebunden, das Urcigermaterial wird von Verunreinigungen freigewaschen und nachfolgend behandelt, um das Enzym zu gewinnen. Dieses Verfahren arbeitet in der Praxis gut, leidet jedoch unter dem flachteil, dass nur ein einziges Enzym zugleich aus diesem Gemisch entfernt werden kann. Folglich kann die Trennung von komplexen Gemischen, die eine Anzaiii Enzyme enthalten, mühsam und zeitraubend sein.
Es wurde nun gefunden, dass bestimmte Enzymgruppen, die für ihre Reaktivität ein Koenzym erfordern, leicht von anderen organischen Materialien und voneinander getrennt werden können, indem man sich ihre Affinität zu dem Koenzym zunutze macht und das Koenzym an einen unlöslichen Träger bindet.
Die Erfindung unfasst als eine neue Stoffzusammensetzung eine reaktive matrix mit einem an ein wasserunlösliches organisches polymeres Trägermaterial cherlaisch gebundenen Koenzym.
Auch umfasst ein erfindungsgemässes Verfahren zur trennung von eine Vielzahl von Enzymen enthaltenden Gemischen das In-Berührung-Bringen des Enzymgemisches in Lösung mit einer reaktiven Matrix mit einem unlöslichen organischen polymeren Trägermaterial, das ein Koenzym für die Enzyme chemisch gebunden enthält, so dass die Enzyme an den Träger gebunden werden, das Entfernen des Trägers aus der Lösung und das nachfolgende Eluieren des Enzyms von dem Träger.
Die Sindung zwischen einem Enzym und seinem Koenzym ist gewöhnlich sehr schwach im Vergleich mit einer kovalenten Bindung, und doch überraschenderweise ausreichend, um die Trennung nach dem erfindungsgemässen Verfahren zu erlauben. Ein hervorstechendes Merkmal der Erfindung besteht darin, dass sie es ermöglicht, die Stärke der Enzym-Koenzym-I3ind.ung zu ändern, beispielsweise durch In-Berührung-Bingen der reaktiven Matrix mit den daran gebundenen Enzyme, mit einer Lösung eines kleinen Moleküls wie beispielsweise einem Substrat oder einen Entlibitor für eines oder mehrere der Enzyme oder sogar Kallumchlorid, so dass die Enzyme in einer gewünschten Reihenfolge eluiert werden können.
Es wurde auc gefunden, dass es wünschenswert ist, das Enzymgemisch mit der reaktiven Matrix in Gegenwart eines Substrats für wenigstens eines der zu trennenden Enzyme in Berührung zu bringen. Bei einer bevorzugten Arbeitsweise wird das Enzymgemisch, das in einer Lösung eines geeigneten Puffersalzes wie beispielsweise eines anorganischen Phosphats gelöst ist, mit der reaktiven Matrix In berührung gebracht die matrix dann mit einer Lösung des Puffers gewaschen, der eine Menge eines Substrats für wenigstens eines der Enzyme enthalt, und das Gemiscii der Enzyme wird von der Matrix durch Elution mit Lösungen steigender Ioneiikonzentration oder durch Elution mit Lösungen von Komponenten der Enzymreaktion, 2.3. NAD oder NADH, getrennt.
Enzyme, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren getrennt und gereinigt werden können, umfassen rohe Enzyme, Enzymgenische und Enzymsysteme, die in tierischen, pflanzlichen oder mikrobiologischen Geweben vorliegen oder daraus isoliert wurden, und Ronextrakte dieser Gewebe sowie synthetische Enzyme wie beispielsweise solche, die nach der Merrifield-Festphasenmethode hergestellt wurde; Beispiele für Gruppen von Enzymen, deren Aktivität von der Gegenwart eines Koenzyms abhängt, umfassen Dehydrogenasen wie beispielsweise Alkohol-dehydrogenase, B.ctat-dehydrogenase und Threoni-dehydrogenase, Oxidasen wie beispielsweise d- und l-hminosaureoxidase, Decarboxylasen wie beispielsweise Lysindecarboxylase und Arginindec rboxylase und Kinasen wie beispielsweise Hexobinase und Glucokinase.
Das unlösliche organische polymere Trägermaterial kann ein natürliches oder synthetisches polymeres Material1 insbesondere ein hydrquiles material wie beispielsweise ein Polyacrylamid oder ein Polymerisat mit freieii Hydroxylgruppen wie etwa Zellulose, Zelluosederivate, Starke, Dextran und vernetz-te Dextrane, z.B. "Sephadex", Sepharose (TM), Proteine wio beispielsweise Wollc, und Polyvinylalkohol umfassen. Andere polymere Materialien, die verwendet werden können, umfassen Nylon, Polyester wie beispielsweise Polyäthylenterephthalat, Zelluloseezatat und substituierte vernetzte Polystyrole wie beispielsweise chlormethylierte Polystyrole.
Das polymere Material kann die Foria von Perlen. oder einer Stofflage, beispielsweise einer Webware, oder irgendeine andere geeignete gegossene oder extrudierte Form annehmen. Bevorzugt wird es in der Form eines permeablen Materials hergestellt, das geeignet ist, eine Füllkörperkolonne aufzubauen.
Das Koenzym, das an das polymere Material chemisch gebunden ist, kann beispielsweise Nikotinamid-adenin-dinucleotid (NAD), Nikotinamid-ad@nin-dinuoleotid-phosphat (NADP) und ihre reduzierten Formen, Adenosin-diphosphat-ribose (ADP-Ribose), Adenosin-triphosphat (ATP), idenosin-diphosphat (ADP), Adenosinmonophosphat (AMP), Pyridoxamin-phosphat, Pyridoxal-phosphåt und Pterine sein.
Die Koenzyme können an das polymere material durch vielfältige chcmisce Techniken gebunden werden. Azidgruppen oder Chlor-striazinyl-Gruppen können auf der polymeren matrix ausgebildet werden, die direkt mit dem Koenzym reagieren, bohne seine Fähigkeit zu beeinträchtigen, sich selbst an ein Enzymmolekül zu binden. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird Zellulose, ein Zellulosederivat oder ein anderes polymeres Material mit einer Vielzahl von vic.-Diolgruppen mit Bromzyan und dann mit dem Koenzym gemäss dem folgenden Reaktionsschema behandelt: Im obigen Reaktionsschema stellt RNH2 das Koenzym dar. Bevorzugt wird das Koenzym mit der iiauptkette der Polymerisatkette durch eine Kohlenstoffzwischenkette mit entweder 2 bis 20 Kohlenstoffatomen oder Oligopeptiden oder polyaromatischen Systemen wie beispielsweise Benzidinbrücken verbunden.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird bevorzugt durch Passieren einer Lösung des Enzymgemisches durch eine Füllkörpersäule der reaktiven Matrix durchgeführt, Nach dem Waschen der Säule zur Entfernung unerounschter Materialien werden die daran gebundenen Enzyme nacheinander durch Elution entfernt, vorzugsweise mit Pufferlösungen steigender Ionenstärke oder Pufferlösungen mit Kofaktoren für die Enzyme. Es wird gefunden, dass verschiedene Enzyme von der Säule bei verschiedenen und charakteristischen lonenstärken entfernt werden, was ein Verfahren zur Trennung und Reinigung der Enzyme liefert. Anorganische Phosphatpufferlösungen und Kaliumchloridlösungen erwiesen sicb als ausserordentlich geeignet als Mittel zur Steigerung der Ionenstärke.
Enthält die rlisonung nur zwei Enzyme, kann ein anderes und einfacheres Verfahren gewählt werden. In der ensten Stufe werden die Enzyme an die reaktive Matrix, wie zuvor beschrieben, gebunden und dann mit einer Lösung eines ßubstrats oder Auslösers (:Offefltor ) für eines der Enzyme gewaschen. Es wurde gefunden, dass diese Technik das Enzym, dessen Substrat oder Auslöser durch die Säule geführt wurde und das andere Enzym in das Elutionsmittel entfernt, oft fester an den Trager bindet. Das auf den Träger bleibende Enzym kann durch Waschen mit einer Pufferlösung höherer Ionenstärke oder durch Entfernen des Auslösers oder durch Zusatz eines konkurrierenden Mittels für diesen Auslöser entfernt werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht: Beispiel 1 Dieses Beispiel beschreibt die Trennung eines Gemisches von L-malabdehydrogenase und L-Lactat-dehydrogenase an NAD-Zellulose.
10 g Zellulosepulver werden nach dem Bromzyanverfahren von Axen, Porath und Emback, Nature 1967, 214, Seite 1302 alctiviert und mit 100 mg Nikotinamid-adenin-dinucleotid in 0,1 pi Natriumkarbonatpuffer vom pH 9 für 12 Stunden umgesetzt. Ein künstliches Gemisch wird aus L-Malat-dehydrogenase (MDH) L-Lacta@dehydrogenas (IDII) und Rinder-Serumalbumin (BSA) hergestellt und über Nacht gegen 10 m-molaren Phosphatpuffer dialysiert. Die MAD-Zollulose wird in eine Saule von 5 mm Durchmesser und 20 mm tiöie gebracht un mit 10 m-molarem Phosphatpuffer vom pH 7,5 ins Gleichgewicht gesetzt. Eine 50 µl-Probe mit 0,335 Einneiten MDH, 1,@5 Einheiten LDN und 0,@ mg BSA wird auf die Säule gebracht und nicht adsorbiertes Protein mit 2 ml Phosphatpuffer ausgewaschen.
Die Säule wird dann mit einem Kaliumchloridgradienten in 10 mmolarem Phosphatpuffer eluiert, wobei der Gradient von 0, bis 0,5 m KC1 (20 ml insgesamt) liegt, NDII, LDI-I und BSA werden in der von der Säule ablaufenden Lösung untersucht und die anfänglichen und abschliessenden spezifischen Aktivitäten, Gewinnungsquoten und Reinigungsfaktoren sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben: Enzym zugesetz- spezifi- gewonne- spezifi- Reinigungs te Ein- sche An- ne Ein- sche End- fazktor heiten fangsak- heiten Aktivität tivität (E/mg) (E/mg) 0,42 0,3 20 47,6 LDH 185 2,3Q 1,3 26 11,3 BSA 0s8 mg Es wird gefunden, dass MDH bei 0,1 m KCl, BSA bei 0,175 m und LDH bei 0,3 C1 eluiert wird.
Beispiel 2 Dieses Beispiel veranschaulicht die Chromatographie eines rohen Extrakts von Pseudomonas oxalaticus an NAD-Zellulose, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde. Der Rohextrakt wurde über Nacht gegen 10 m-molaren Phosphatpuffer voe?, 5 dialysiert,und eine 0s5 ml-Probe auf eine 1,4 cm x 9,0 cm-Säule mit NAD-Zellulose gebracht, die mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gesetzt worden war. Nichtadsorbiertes Protein wurde aus der Säule mit 40 ml des Pulvers ausgewaschen und das Enzym mit einem Kaliumpnospilatgradienten von 0,01 bis 0,5 m, 160 ml Gesamtvolumen , bei einer Str0mungsgeschwindigkeit von 30 ml/h eluiert. Die folgenden Enzyme wurden in dem Eluat untersucht und die Konzentration des zu ihrem Eluieren notwendigen Phosphats in Klammern angegeben.
D-Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (45mMol) L-Lactat-dehydrogenase (130 mMol) L-Xhreonin-dehydrogenase (ca. 250 mMol).
Eine grössere Spitze inerten rroteins wurde bei 45 mMol Phosphat, wie in Fig. 1 gezeigt, eluiert.
Beispiel 3 Dieses Beispiel veranschaulicht die Chromatographie von L-Threonin-dehydrogenase aus einem dialysierten Rohextrakt von Pseudomonas oxalaticus an NAD-Zellulose in Abwesenheit (A) und Anwesenheit (B) von 10 mMol L-Threonin. Es wurde das Verfahren wie in Beispiel 2 gewählt, ausser dass im Falle 13 10 mMol L-Threonin in den Puffer und dem Gradienten eingeschlossen war.
L-Threonin-dehydrogenase und ein grösserer Anteil enzymatisch aktiven Proteins wurden bei den folgenden Konzentrationen an Kaliumphosphat, wie in Fig. 2 gezeigt, eluiert.
(A) Kein Threonin (B) 10 mMol L-Threonin L-Threonin-dehydrogenase 220 mMol 220 mMol inertes Protein 140 mMol 90 mMol Dieses Beispiel veranschaulicht den Vorteil, L-Threonin in das Puffersystem einzuschliessen, um die Reinigung des Enzyms L-Threonin-dehydrogenase an NAD-Zellulose zu unterstützen.
Beispiel 4 Dieses Beispiel veranschaulicht die Affinitätschromatographie der L-Threonin-deJiydrogenase aus einem Rohextrakt von Pseudomonas oxalaticus an einem diazo-verbundenen NAD-Zellulosederivat;' das wie folgt hergestellt wurde. o-Amino-phenol wurde nach der Bromzyantechnik von Axen, Porath und Emback (1967) an Zellulose gekuppelt. Die o-Hydroxyamino-Zollulose (15 g) wurde mit diazotiertem Benzidin (aus 1 g Benzidin-HCl) bei 00 C 10 Minuten behandelt. Das Zellulosederivat wurde mit eiskaltem Wasser 10 Minuten gewaschen und in einer Lösung von NAD (50 mg) in 0,1 molarem Matriumbicarbonatpuffer, pH 9,0 (15 ml), suspendiert. Die Suspension wurde über Nacht bei 0° C Eeruhrt und mit einem grossen Volumen eiskalten destillierten Wassers durchgewaschen.
Eine 50-Mikroliter-Probe des rohen dialysierten Extrakts wurde auf eine 5 mm x 20 mm-Säule der diazo-verbundenon NAD-Zellulose gebracht, die ist 10 mMol Phosphatpuffer vom pli 7,5 equilibriert war. Nichtadsorbiertes Protein wurde mit 10 ml des gleichen Rffers ausgewaschen und das Enzym mit einem Kaliumchloridgradienten, 0 bis 0,5 molar, 20 ml Gesamtvolumen bei einer Durch geschwindigkeit von 5 bis 6 ml/h eluiert.
Auf L-Threonin-dehydrogenase und anderes enzymatisch aktives Protein wurde in der ablaufenden Lösung, wie in Fig. 3 gezeigt, geprüft.
Beispiel 5 Diesse Beispiel zeigt die Chromatographie von D-Glucose-6-phosphat-dehydrogenase aus einem extrakt an #-Amino@@proyl-NADP-sepharese, die tJie folgt hergestellt war: #-Amino-caproyl-sepharose wurde dadurch Kuppeln von -Aminokapron-.
säure (1 g) mit $Sepharose 4B (10 g) nach der Mothode von Axen, Porath und Emback (1967) hergestellt. Zu 10 g dieses Polymerisats wurden 5 g Dicyclohexyl-carbodiimid in 12 ml Pyridin und 100 mg NADP in 3 ml Wasser zugesetzt. Dieses Gemisch wurde 10 Tage bei Raumtemperatur langsam gerührt, und das Gel nacheinander mit 80%igem wässrigen Pyridin, Äthanol, Butanol, Äthanol, Wasser, molarer KC1 und schliesslich mit Wasser gewaschen.
Eine Probe (1 ml) des rohen Hefeextrakts wurde auf eine 1 cm 5 cm-Säule der #-Amino-capro@l-NADP-sopharose aufgebracht, die mit 0,05 molarem Driätharolamin-IJaOh-Puffer vom pH 7,6 equilibäert war. Nichtadsorbiertes Protein wurde mit 50 ml des gMlcichen Puffers ausgewaschen und das Enzym mit einem Saliumchloridgradichten von 0 bis 0,5 klar, 200 ml Gesamtvolumen, bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 12 ml/h, eluiert.
In der ablaufenden Lösung wurde auf D-Glucose-6-p losphatdehydrogenase und anderes enymatisch aktives Protein geprüft.
Enzym wurde bei 0,15 molarer XCl eluiert, wobei seine speifische Aktivität von 0,29 µMol NADPH/min/mg im Anfangsextrakt auf 6,50 µMol NADPH/min im gereinigten Produkt, wie in Fig.
4 gezeigt, anstieg. Die Gewinnung der Enzymaktivität war quantitativ.
Beispiel 6 Dieses Beispiel veranschaulicht die Isolierung von ß-Hydroxybutyrat-dehydrogenase aus einem Rohextrakt von Rhodopseudomonas sphaeroides an #-Amino-caproyl-NAD-sepharose. Die reaktive Matrix wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, hemgostollt, ausser dass NAD anstelle von NADP verwondet wurde.
Eine 50-Mikroliter-Probe des Rohextrakts wurde auf eine 5 mm x 20 mm-Säule mit #-Amino-caproyl-NAD-sepharose gebracht, die mit 0,05molarem Tris-HCl-Puffer vom pli @,0 equilibriert war.
Nichtadsorbiertes Protein wurde mit 20 ml des gleichen Puffers ausgewaschen, und das Enzym mit einem KCl-Gradienten von 0 bis 0,5 molar in 0,05 molarem Tris-HCl-Puffer vom pH @,0 cluiert.
Die spe3ifische Aktivität der ß-Hydroxy-butyrat-dehydrogenuse stieg von 3,1 x 10-4 µMol NADH gobildet pro min/mg Protein auf annähernd 3 x 10-² µMol NADH/min/mg, nach Fig. 5 ein Anstieg um einon Faktor von einigen Hundert.

Beispiel 7 Dieses Beispiel fasst in Tabellenform einige mit verschiedenen Koenzymen' Matrixarten, Enzymen und Auslegergruppen" erhaltenen Ergebnisse zusammen. Die Ergebnisse sind in Einheiten der Konzentration des zur Elution des Enzyms oder Rinder-Serumalumins in künstlich hergestellten Gemischen erforderlichen Kaliumchlorids ausgedruckt. In jedem Falle wurde das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren angewandt.

Zur Elu-

tion er-

forder-

liche

Salzkon-

zentra-

tion

Matrix Koenzym "Auslegergruppe" Enzym En- BSA Anmerkungen

zym

Zellulose ADP keine L-Lactat-dehydrogenase 280 155

Zellulose ADP-Ribose keine L-Lactat-dehydrogenase 295 140

Zellulose ADP-Ribose keine L-Glutamat-dehydrogenase 460 155

Sephadex G-200 NAD keine L-Lactat-dehydrogenase 120 0

Sephadex G-100 NAD keine L-Malat-dehydrogenase 90 0

Sepharose AMP #-Amino-caproyl L-Malat-dehydrogenase 90 0

Sepharose AMP #-Amino-caproyl Isocitrat-dehydrogenase 190 0

Sepharose NAD #-Amino-caproyl Glycerinaldehyd-3- Enzym eluiert mit 200

phosphat-dehydrogenase 1000 0 ul-Menge an 5mmolarem

NADH

Sepharose NAD Triglycyl L-Lactat-dehydrogenase 35 0 Enzym eluiert mit 50

mMel NAD

Sepharose NAD #-Amino-caproyl L-Lactat-dehydrogenase 1000 0 Säule equilibriert

mit 5 mMol Na2SO3

in allen Puffern:

Enzym eluiert mit

5 mMol NADH

Sepharose NADP #-Amino-caproyl D-Glucose-6-phosphat- 125 0

dehydrogenase

Claims

Patentansprüche 1. Reaktive Matrix, dadurch g e k e n n z e i c h n c t dass sie ein an sein wasserunlösliches organisches polymeres Trägermaterial chemisch gebundenes Koenzym aufweist.
2. Matrix nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t dass das organische polymere Trägermaterial hydrophil ist.
3. Matrix nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , dass das organische polymere Trägermaterial Polyacrylamid, Zellulose, ein Zellulosedrivat, Stärke, Dextran, ein vernetztes Dextran, ein Protein oder Polyvimylalkohol ist.
4. Matrix nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t dass das organische polymere Trägermaterial Nylon, ein Polyester, Zelluloseazotat oder ein substituiertes vernetztes Polystyrol ist.
5. Matrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass das organische polymere Trägermaterial in Form eines permeablen Materials zum Filzen einer Füllkörperkolonne geeignet vorliegt.
6. Matrix noch einem der vorhergekonden Ansprüche, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass das Koenzym Hikotinamid-adenin-dinucleotid oder eine reduzierte Forn hiervon, Nikotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat oder eille reduzierte Form hiervon, Adenosintriphosphat-ribose, Adenosintriphosphat, Adenosindiphosphat, Adenosinmonophosphat, Pyridoxaminphosphat, Pyridoxalphosphat oder ein Pterin ist.
7. Matrix nach einem der vorilertehender. Ansprüche, dadurch g e k e n n z e i c h n e t k dass es das Renktionsprodukt eines organischen polymeren Trägermatrials mit einer Vielzahl von vic.-Diolgruppen mit Dremzyan und dann mit einom Koenzym ist.
8. Matrix nach einem der vorhergeheaden Ansprüche, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass das Koenzym mit der Hauptkette der Polymerenkette des organischen polymeren Trägermaterials über eine Kohlenstoffzwischenkette mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen oder über ein Oligopeptid oder ein polyaromatisches System verbunden ist.
G9 Verfahren zur Trennung von Gemischen mit einer Vielzahl von Enzymen, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass das Enzymgemisch in Lösung mit einer reaktiven Matrix mit einem unlöslichen organischen polymeren Trägermaterial, an das ein Koenzym für die Enzyme chemisch gebunden ist, so dass die Enzyme an den Träger gebunden werden, in Berührung gebracht, der Träger aus der Lösung entfernt wird und die Enzyme nacheinander von dem Träger eluiert werden.
10. Verfahren nacii Anspruch 9, dadurch g e k e n n z e i c 11 -n e t , dass die reaktive Matrix mit den daran gobundenen Enzymen mit einer Lösung eines Substrats oder Inhibitors für ein oder mehrere der Enzyme ur Änderung der Enzym-Koenzym- Bindungsstärke in Berührung gebracht werden, und die Enzyme in der gewünschten Reihenfolge eluiert werden.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , dass das Enzymgemisch mit der reaktiven Matrix i.n Gegenwart eines Substrats für wenigstens eines der Enzyme in BerüJlrunL; gebracht wird.
12. Verfahren nach Anspruch 9 bis 11, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , dass das Enzymgemisch, in einer Lösung eines geeigneten Puffersalzes gelöst, mit der reaktiven lIatrix in Berührung gebracht, die Matrix dann mit einer Lösung des Puffers, der eine Menge eines Substrats für wenigstens eines der Enzyme enthält, gewaschen und das Gemisch der En-Enzyme von der Matrix durch Elution mit Lösungen steigender Ionenkonzentration oder Lösungen mit Komponenten der enzymaischen Region abgetrennt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , dass in dem Enzymgemisch eine Dehydrogenase, eine Oxidase, eine Decarboxylase oder eine Kinase verwendet wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch g e k e n n z e i c h -n e t , dass in dem Enzymgemisch Alkoholdehydrogenase, Lactabdehydrogenase, Threonin-dehydrogenase, d- und l-Amino-Eäure-oxidase, Lysin-decarboxylase, Arginin-decarboxylase, Hexokinase oder Glucokinase verwendet wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , dass ein hydrophiles organisches polymeres Trägermaterial verwendet wird.
IG. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch g e k e n n z e i c h -n e t , dass als organisches polymeres Trägermaterial Polyacrylamid, eine Sellulose, ein Zellulosederivat, Stärke, Dextran, ein vernetztes Dextran, ein Protein oder Polyviiiylalkohol verwendet wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14-, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , dass als organisches polymeres Trägermaterial Nylon, ein Polyester, Zelluloseazotat oder ein substituiertes vernetztes Polystyrol verwendet wird.
1£. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17, dadurch Lj -k e n n z e i c h n e t , dass als Koenzym Nikotinamidadenin-dinucleotid oder eine reduzierte Form hiervon, Mikotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat oder eine reduzierte Form hiervon, Adenosin-diphophat-ribose, Adenosin-triphosphat, Adenosin-diphosphat, Adenosin-monophosphat, Pyridoxaminphosphat, Pyridoxal-phosphat oder ein Pterin verwendet wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 18, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , dass eine durch Umsetzung eines organischen polymeren Trägermaterials mit einer Vielzahl von vic.-Diol-Gruppen mit Bromzyan und dann mit einem Koenzyi hergestellte reaktive Matrix verwendet wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 19 dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , dass eine Lösung des Enzymgemisches durch eine Füllkörpersäule mit der reaktiven Matrix geschickt wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 20, dadurch g e -k k e n n z e i c h n e t , dass die Enzyme nacheinander durch Elution mit Pufferlösungen steigender Ionenstärke oder Pufforlösungen mit Kofaktoren für die Enzyme entfernt werden.
22. Verfahren zur Trennung eines Gemisches von 2 Enzymen, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass das Gemisch in Lösung mit einer reaktiven Matrix, die ein unlöslic.les organisches polymeres Trägermaterial mit einem chemisch daran gebundenon Koenzym für die Enzyme zur Bindung der Enzyme an den Träger umfasst, in Berührung gebrachte der Träger roit einer Lösung eines Substrats oder Auslösers (effector) für eines der Enzyme zur Entfernung des anderen Eiizyms von dem Trager in Berührung gebracht und das zurückbleibende Enzym durch In-Berührung-bringen des Trägers mit einer Pufferlösung höherer Ionenstärke, durch Entfernung des Auslösers oder durch Zusatz eines konkurrierenden Mittels für den Auslöser entfernt wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 22, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , dass eine reaktive Matrix gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10 verwendet wird.
24. Gereinigtes Enzym, hergestellt nach einem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 9 bis 23.