DE2319495A1 - Verfahren zum selektiven und reversiblen binden von biomolekuelen an adsorbenzien - Google Patents

Verfahren zum selektiven und reversiblen binden von biomolekuelen an adsorbenzien

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Description

NACHGEREIOHTJ
Patentanwälte
Dipl. ing. C. Wallach
Dipl. Ing. G. Koch
Dr. T. Haibach
8 München 2
Kaufkigerstr.S, Tel. 240275
1 0. ΟΚΓ. 1974
14215 d/d
YEDA RESEARCH & DEVELOPMENT GO., LTD. ' Rehovot, Israel
"Verfahren zum selektiven und reversiblen Binden von Biomolekülen an Adsorbenzien11
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum selektiven und reversiblen Binden von Makromolekülen an einMsorbens, das im wesentlichen aus einem Träger mit damit verknüpfter Kohlenwasserstoffkette mit vorbestimmter Kohlenstoffkettenlänge besteht sowie ein Verfahren zur Bestimmung der Anzahl von C-Atomen in der Kohlenwasserstoffkette, die eine selektive und reversible Bindung des gewünschten Makromoleküls bewirkt. Hierbei werden Biomoleküle, wie Peptide,;Vitamine, Hormone, Lipide, Proteine oder Enzyme, sowie Membranen oder Zellen, getrennt und gereinigt unter Verwendung eines oder mehrerer chromatographischer Adsorbenzien einer homologen Reihe, di.e Kohlenwasserstoffketten von .vorbestimmter Länge hiermit ^erknüpft,enthalten.
Die Erfindung betrifft auch mehrere kleine chromatographische Säulen enthaltende Packungen bzw. Anordnungen,'· die für die rasche Identifizierung des für die Reinigung eines bestimmten
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Makromoleküls wirksamsten spezifischen Adsorbens verwendet werden. ■
Bisher "beruhen herkömmliche Verfahren zur Trennung und Reinigung von Proteinen auf Unterschieden in deren Löslichkeit, Ladung, Größe und Gestalt. In jüngerer Zeit ist eine neue Lösung für die Proteinreinigung entwickelt worden, bei der die spezifische biologische Affinität zwischen Proteinen und ihrer Substraten, Aktivatoren, Inhibitoren usv. ausgenutzt wird- (vgl. die Übersicht von Cuatrecasas und Anfinsen in "Methods in Enzymology" 23, (1972) 345). Das angewendete Verfahren wird auch oft als "Affinitätschromatographie" (Cuatrecasas, Wilchek und Anfinsen in "Proc. Nat. Acad. Sei. USA 6I-, (1968) 636 ) oder als "Immunospezifische Reinigung" (Campbell, Luescher und Lerman, in "Proc. Nat. Acad. Sei. USA ££, (1951) 575 ) bezeichnet. Hierbei wird eine Lösung, die das zu reinigende Makromolekül enthält, durch eine Säule mit einem wasserunlöslichen Träger geleitet, mit demein geeigneter Ligand covalent verknüpft ist. Diejenigen Makromoleküle, die keine erhebliche Affinität gegenüber dem Ligand besitzen, durchlaufen die Säule ohne Verzögerung, während diejenigen Makromoleküle, die den Ligand erkennen und sich an ihn binden, verzögert werden. Das spezifisch adsorbierte Protein kann dann nach einem beliebigen der Verfahren eluiert werden, die eine Dissoziation bewirken, z.B. durch Veränderung der Zusammensetzung des Lösungsmittels. -
Zur Verbesserung der Wirksamkeit der Affinitätschromatographie-Säulen schlägt Cuatrecasas die Verwendung von Kohlenwasserstoffketten zwischen dem Ligand und der Matrix-Hauptkette (backbone) vor, um durch den Träger verursachte sterische Behinderungen zu beseitigen und um die Flexibilität und Mobilität des Liganden zu erhöhen, der auf diese Weise weiter in das Lösungsmittel hineinreicht (Cuatrecasas in "J. Biol. Chem."245 (1970) 3059; "Nature" 228 (1970) 1327 ).'
Es wurde gefunden, daß das Überziehen von Agarose-Perlen mit kovalent gebundenen Kohlenwasserstoff ketten die Agarose befähigt,
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verschiedene Proteine zu binden, selbst wenn keinbiospezifLsiEii1 Ligand mit diesen Kohlenwasserstoffketten verknüpft ist. Diese Beobachtung führte zu systematischen Untersuchungen mit homologen Reihen von Kohlenwasserstoff-überzogenen Ägarosen und zum Beweis dafür, daß verschiedene Proteine ziemlich selektiv auf den verschiedenen Gliedern der. vorgenannten Reihen von Kohlenwasserstoff-überzogenen Ägarosen adsorbiert werden können.
Yon (s. "Bioehem. J." 1£6 (1972) 765-767 ) entdeckte, daß bestimmte lipophile Proteine an ein Affinitätschromatographie-Adsorbens gebunden werden können, das eine C^Q-Kohlenwasserstoffkette mit Aminoendgruppe besitzt, die normalerweise für das Verbindendes biospezifischen Liganden mit der Kohlenwasserstoffkette verwendet wird. Nach der Theorie von Yon rührt das Vermögen dieses speziellen Adsorbens, mit diesen besonderen lipophilen Proteinen zu reagieren, von der hydrophoben Wechselwirkung unter Beteiligung der O^Q-Ketten und elektrostatischen Wechsel- ; Wirkungen unter Beteiligung der ionischen Endgruppe her.
Es wurde gefunden, daß ein Adsorbens, das aus einem Träger und Kohlenwasserstoffketten mit bestimmter Kohlenstoffkettenlänge besteht, ein bestimmtes Makromolekül selektiv und reversibel zu binden vermag. Durch Variieren der Kohlenstoffkettenlänge und der Chromatographiebedingungen kann man für jedes Makromolekül ein spezifisches Adsorbens finden. Es hat sich weiter gezeigt, daß eine bestimmte Endgruppe nicht kritisch ist; selbstverständlich kann man jedoch bestimmte Endgruppen verwenden.
Der Mechanismus beim Binden des Makromoleküls beim Verfahren der Erfindung ist im allgemeinen der gleiche wie bei der Affinitätschromatographie. 3er Fachmann wird jedoch erkennen, daß die theoretische Grundlage sowae der Mechanismus des Verfahrens der Erfindung und der Affinitätschromatographie ziemlich verschieden sind. Bei der Affinitätschromatographie wird der biospezifische . Ligand als unerläßlich angesehen und die Wirkung der Kohlenwasser-
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stoffkettenlänge wird der Beseitigung der durch die Matrix-Hauptkette verursachten sterischen Hinderungen sowie einer erhöhtenFlexibilität und Mobilität des Liganden infolge seines weiteren Hineinreichens in das Lösungsmittel zugeschrieben. Bei der Erfindung verursachen hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den Kohlenwasserstoff ketten "und dem Makromolekül die Bindung · ' mittels eines Mechanismus, bei dem ein spezifisches, biologisches Erkennen des Liganden .an sich keine Rolle spielt.
Das Adsorbens der Erfindung besteht im wesentlichen aus einer festen Trägermatrix, die hiermit verknüpfte Kohlenwasserstoffketten besitzt. Beiden wasserunlöslichen, porösen Trägern kann es sich um Derivate von Cellulose, Polystyrol, synthetischenPolyaminosäuren, synthetischen Polyacrylamid-Gelen, vernetzten Dextranderivate oder sogar um · Glasoberflächen handeln. Wie bei der Affinitätschromatographie wurde gefunden, daß Agarose, ein Polysaccharid, einen guten" Träger darstellt. Die perlenförmigen Agarosederivate besitzen eine sehr lockere Struktur, die es Molekülen mit einem Molekulargewicht im Millionenbereich ermöglicht, rasch durch die Matrix hindurchzudiffundieren. Diese Polysaccharide können durch-Aktivierung mit Gyanogenhalogeniden leicht Substitutionsreaktionen eingehen (Axen, Porath und Ernback in "Nature" 214 (1967) 1302 } Porath, Axen und Ernback · in "Nature" £1£ (1967) 1941 ). Sie sind sehr stabil und besitzen ein mäßig hohes Substitutionsvermögen. Agarose ist im Handel in Form von Perlen mit kugelförmiger Gestalt mit verschiedenen, genormten Größen ,und Porositäten erhältlich. Ein Beispiel für ein Handelsprodukt ist "Sepharose 4B".
Die Kohlenwasserstoffketten sind mit dem Träger kovalent über eine difunktionelle verbindende Gruppe, wie -NH-, -S- oder -COO- , verbunden. Bei der Kohlenwasserstoffkette kann es sich z.B. um eine Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkylaryl- oder Alkylaralkylkette handeln. Die Ketten können gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder mit anderen funktionellen Gruppen substituiert sein. Die Kohlenwasserstoffkette enthält nach:Maßgabe des für die Herstellung des Adsorbens verwendeten Reagens 1 bis 20 oder
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mehr C-Atome. Die Kohlenwasserstofflcetten stellen also Arme oder Verlängerungen dar, die Über die !covalent verknüpfende Gruppe mit dem Träger verbunden sind. Bei der Bestimmung der Anzahl von C-Atomen in der Kohlenwasserstoffkette bleiben jegliche funktionelle Gruppen, die an der Kette substituiert sind, unberücksicht. Desgleiche bleiben alle Yerzweigungen unberücksichtigt und die längste kontinuierliche Kette wird in Übereinstimmung mit der lUPAC-Nomenklatur bezeichnet« *
Die Kohlenwasserstoffkette braucht nicht in einem Wasserstoffatom, sondern kann auch in einer funktioneilen Gruppe enden, wie ionische Gruppen, z.B. NH2, SO5H, PCLH2, SHf Imidazole oder phenolische Gruppen, oder nichtionisehe Gruppen, z.B. OH oder CONH2.
Die Adsorbenzien der Erfindung können durch die Formel A-B-C-D beschrieben werden. A steht für den Kern oder Sräger, z.B. die Agarose. B stellt die kovalente verknüpfende Gruppe dar. C ist die Kohlenwasserstoffkette und bei D handelt es sich um die Endgruppe. ,
Affinitätschromatographie-Adsorbenzien werden so hergestellt, daß man zunächst die Kohlenwasserstoffkette mit dem Ligand verknüpft und dann das andere Ende der Kohlenwasserstoffkette mit dem (Träger oder Kern verbindet, oder indem man die Kohlenwasserstoffkette mit dem Mgand verknüpft. Das Adsorbens der Erfindung wird in gleicher Weise wie bei der vorgenannten Methode hergestellt, wobei selbstverständlich die Verknüpfung des Liganden weggelassen wird. Z.B. wird die Agarose zunächst durch Reaktion mit Oyan^bromid aktiviert· und dann mit einem oC ,(J-Diamonoalkan zur Herstellung von£v)-Aminoalkyl-Agarose umgesetzt·
Ein bestimmtes Makromolekül, z.B. ein Protein, Enzym oder Lipid, wird selektiv und reversibel an ein Adsorbens gebunden, das eine bestimmte Anzahl von C-Atomen in seiner Kohlenwasserstoffkette besitzt. Die Anzahl der für die selektive und reversible Bindung erforderliche Anzahl von C-Atomen ist für ;)edes Makromolekül
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verschieden. Es wird angenommen, daß dies auf einen Unterschied in der Größe der verfügbaren hydrophoben Taschen in den einzelnen Makromolekülen zurückzuführen ist. Wird z.B.eine homologe Reihe von Kohlenwasserstoff-überzogenen Agarosen, deren Alkylseitenketten in der Länge variieren (Agarose-NH-(CHp) H ), zum Adsor-.bieren von Glykogenphosphorylase verwendet, so unterscheiden sich die Adsorbenzien erheblich in. ihrem Bindung vermögen für das Enzym, wobei der Bereich von keine Verzögerung (n=1) über Verzögerung (n=3) und reversible Bindung (n=4) bis zu sehr feste Bindung (n=6) führt, wenn die Kohlenwasserstoffkette allmählich verlängert wird. Sehr wenig andere Proteine werden reversibel von der Butyl-Agarose-Säule zurückgehalten. Dieses Verfahren ermöglicht "überraschenderweise eine bis zu 100-fache Reinigung des Enzyms in einer einzigen Stufe»
Die Anwesenheit einer ionischen Gruppe an der Kohlenwasserstoffiette beeinflußt die Anzahl der O-Atome, die .für die selektive , Bindung eines bestimmten Makromoleküls erforderlich ist» Während z.B. in der Alkylagarose-Reihe Seitenketten mit 4fC-A.tomen ausreichend sind, um Glykogenphosphorylase festzuhalten, sind bei der ίο. -Aminoalkylagarose-Reihe 6 C-Atome in der Seitenkette erforderlich, um dieses Enzym zurückzuhalten. Xn ähnlicher Weise sind Kohlenwasserstoffketten mit 1 bis 2 C-Atomen ausreichend, um Glykogensynthetase in der Alkylagarose-Reihe zurückzuhalten, während bei Anwendung der 6a -Aminoalkylagarose-Reihe 4 C-Atome in der Kohlenwasserstoffkette erforderlich sind, um dieses Enzym zurückzuhalten.
Der Fachmann "wird erkennen, daß es verschiedene Variable gibt, die im Verlauf der hydrophoben Chromatographie der Erfindung verändert werden können. Solche Variablen sind z.B. die Beschickungsund Eluierungsbedingungen, wie Ionenstärke, Pufferzusammensetzung, pH-Wert, Temperatur oder Zusatz einer geringen Menge eines organischen Lösungsmittels. Diese Variablen werden jedoch auf diesem Gebiet routinemäßig eingestellt und der Fachmann vermag die optimalen Bedingungen rasch zu verwirklichen.
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Um zu bestimmen, welches Adsorbens ein bestimmtes Makromolekül selektiv und reversibel bindet, wird eine Reihe von Chromatographiesäulen aufgestellt, wobei jede mit einem Glied der homologen Reihe der Kohlenwasserstoffketten enthaltenden Agarose beschickt wird. Eine kleine Menge der Makromoleküllösung wird durch die Kolonne geschickt. Dann wenden die Eluierbedingungen verändert und das erhaltene Eluat wird auf die Anwesenheit des Makromoleküls und seine Reinheit nach bekanntsn Verfahren untersucht.
Die Beispiele erläutern die Erfindung, stellen jedoch keine Begrenzung dar. Alle Teile- und Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht und ε
anders angegeben.
das Gewicht und alle lemperaturangaben bedeuten 0C, falls nicht
B e i_s_p i e 1 1
Glykogenphosphorylase b wird nach der Methode von Fisher et al. in "Biochem, Prep. j6 (1958) 68 hergestellt und vor der Verwendung dreimal umkristallisiert. Das Enzym wird von AMP (Adenosin-51-monophosphat) befreit, indem- man es durch eine Holzkohle-Cellulose-Säuie schickt, und nach der Methode von Hedrick et al., in "Bioohem., 4 (1965)1337 analysiert.· Die Enzymkonzentrationen· werden spektrophotometrisch unter Anwendung eines Absorbens-Index von ApQQ= 13,1 bestimmt. D-Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPD) wird nach der Methode von Velick, in "Meth. Enzymoll1 1 (1955) 401 analysiert und seine Konzentration wird unter An-Wendung eines Absorbens-Index von Α«ο0= 10,0 bestimmt.
Fein zerkleinertes Kaninchenskelettmuskelfleisch wird mit 2,5 Litea Wasser pro kg Fleisch extrahiert. Man läßt die .Extraktion 15 Minuten bei 22 C vonstatten gehen, gießt dann das Gemisch durch ein Nesseltuch und läßt abtropfen. Nach dem Zentrifugieren, 40 Minuten bei 3000 g, wird das Überstehende durch Glaswolle filtriert, um den rohen Auszug zu erhalten, der hier für die Isolierung von Phosphorylase verwendet wird.
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Agarose (Sepharose 4B) wird mit CNBr bei pH 11 und 220C durch Zugabe von 1 g CNBr auf 10 g (Naßgewicht) der Agarose aktiviert. Man läßt die Reaktion 8 Minuten vonstatten gehen, wobei man den pH mit 5 η NaOH auf einen Wert von 11 hält. Die Aktivierung wird durch Filtration und Waschen des Gels mit eiskaltem, entionisiertem Wasser beendet. In der Zwischenzeit sind Lösungen von jedem Glied einer homologen Reihe von Alkylaminen (Methylamin bis Decylamin) in 40-prozehtigem Dioxän hergestellt und mit 6 η HCl auf einen pH von 9,0 angesäuert worden. Die aktivierte Agarose wird dann in kaltem 0,1 m NaHCO, suspendiert und mit dem gleichen Volumen der Alkylaminlösung vermischt. Die Aufschlämmung wird mit Dioxan bis zu einer Endkonzentration von 40 Prozent versetzt, um das Alkylamin in Lösung zu halten. Das Reaktionsgemisch enthält jetzt 4 Mol des Alkylamins pro Mol des für die Aktivierung der Agarose angewendeten CNBr. Man läßt das - Alkylamin mit der aktivierten Agarose 24 Stunden bei 40C reagieren. Anschließend wird die Kohlenwasserstoff-überzogene-Agarose mit Wasser, 0,1 m NaHCO,, 0,05 m NaOH, 0,1 mCH5COOH und·anschließend erneut mit Wasser gewaschen; Unter dem Mikroskop besteht zwischen den überzogenen Perlen und der nicht-modifizierten Agarose Identität. Auf diese Weise wird Kohlenwasserstoff-überzogene Agarose hergestellt, bei der die Kohlenwasserstoffketten 1,2,3,4,5,6,7,8, 9 bzw. 10 C-Atome enthalten.
Mit jedem Glie'd der homologen Reihe von kohlenwasserstoffmodifitzierter Agarose wird eine kurze Säule beschickt. Dann werden Gemische aus GAPD und Phosphorylase b durch die Säulen geschickt. Es zeigt sich, daß das GAPD von allen Säulen (C. bis Cg) nicht adsorbiert oder verzögert wird. Während jedoch die C.-Säule Phosphorylase b nicht verzögert, verzögert die C,-Kolonne das Enzym und die höhere Alkylagarose (OV bis Cg) absorbiert sie. Die Eluierung der Phosphorylase b aus den Kolonnen, in denen sie absorb jerb ist, ist durch bloße Erhöhung der Ionenstärke mit NaCl (bis auf 0,5 m) nicht möglich; unter Verwendung eines Ablösepuffers (0,4 m Imidazol und 0,05 m 2-Mercaptoäthanol, mit Citronensäure auf pH 7,0 eingestellt) kann das Enzym von C4, nicht jedoch von Cg eluiert werden. Die Bindung der Phosphorylase b an die O^-kohlenwasserstoffmodifizierte Agarose ist sehr fest,
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da das Enzym selbst dann nicht eluiert werden kann, wenn der pH des Ablösepuffers auf 5,8 erniedrigt wird. Die Isolierung des Enzyms aus der Cg-Säule ist nur in denaturierter 3?orm möglich, indem man die Säule mit 0,2 m Essigsäure wäscht.
.· B e-i spiel 2
Das rohe, in vorgenannter Weise hergestellte Muskelextrakt wird durch die C.-kohlenwasserstoffmodifizierte Agarose-Säule geschickt. Über 95 Prozent des Proteins (bezogen auf die Absorption bei 280 nm) werden aus der Säule ausgeschieden. Diese Fraktionen zeigen im wesentlichen keine Phosphorylaseaktivität, wie die Messung in Gegenwart von AMP ergibt. Beim Eluieren mit dem
Ablösepuffer tritt eine kleine Menge des Proteins mit sehr hoher Phosphorylaseaktivität aus der Säule aus. Die spezifische Aktivität des eluierten Enzyms (nach dem Herausdialysieren des
Ablösepuffers) beträgt bis zu 68 Einheiten/mg. Diese Aktivität liegt sehr nahe an derjenigen für das reine, kristalline Enzym (80 Einheiten/mg). Der rohe Extrakt besitzt eine Phosphorylaseaktivität von 0,7 Einheiten/mg und die.spezifische Aktivität des in der C.-Säule gereinigten Enzyms beträgt bis zu 68 Einheiten/mg. Somit wird ungefähr eine 100-fache Reinigung in einer einzigen Stufe erJzielt. Darüber hinaus beträgt die Ausbeute des Verfahrens über 95 Prozent, bezogen auf die Aktivitätsmessung.
Beispiel 3
Agarose (Sepharose 4B) wird bei pH 10,,5 bis 11 und 220C durch Zugabe von 1 g CNBr auf 10 g (Naßgewicht) Agarose aktiviert. Man läßt die Reaktion 8 Minuten vonstatten gehen und hält den pH durch Zugabe von 5 η NaOH zwischen 10,5 und 11. Die Aktivierung wird durch !Filtration und Waschen des Gels mit eiskaltem, entienisiertem Walteer beendet. Die aktivierte Agarose wird in kaltem 0,1 m NaHCO5 (pH 9ϊ etwa das 2-fache des abgesetzten Volumens des Gels) suspendiert und mit dem gleichen Volumen Wasser, das 4 Mol eines oC, dJ-Diaminoalkans (NH2(CHg)nNH2 ) pro Mol des für die
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-■ίο-
Aktivierung der Agarose verwendeten CNBr enthält, vermischt. Der pH.des Diamins wird vor dem Vermischen mit der aktivierten Agaros mit 6 η HCl auf einen Wert von 9 eingestellt. Die Kupplungsreaktion erfolgt bei 40C oder "bei 250C für 24 Stunden, während das Reaktionsgemisch vorsichtig gerührt bzw. "bewegt wird. Anschliessend wird die (0-Aminoalkylagarose mit Wasser, 0,1 m NaHCO,, 0,05 m NaOH, Wasser, 0,1. m Essigsäure und dann wieder mit.Wasser gewaschen.· Schließlich werden die Säulen mit einem Puffer, der aus 50mncüaren ß-Glycerinphosphat, 50nmQlaraii 2-Mercaptoäthanol und immolaiHrÄ'thylendiamintetraessigsäure (pH 7) besteht, ins Gleichgewicht gebracht. Alle auf diese V/eise dargestellten Agarosederivate sind identisch in der Anzahl ihrer Aminogruppen pro Einheits gewicht, wie durch Reaktion mit 2,4,6-Irinitrobenzolsulfonat bestimmt wird.
Pein zerkleinertes Kaninchenskelettmuskelfleisch (1 kg) wird in 4 Liter 50 mmolarer tris^Höt-SOmmolarer Äthylendiamintetraessigsäure (pH 8,1) suspendiert und in einem Waring-Mischer mit großer Kapazität 1 Minute homogenisiert. Nachdem das homogenisierte Gemisch bei 5860 g zentrifugiert worden ist, wird das Überstehende durch Glaswolle filtriert. Es wird das gleiche Volumen neutralisierte, gesättigte (NHApSO.-Lösung zugegeben und, nach 24 Stunden bei 40C, wird das Überstehende dekantiert. Der abgesetzte Niederschlag wird dann 20 Minuten bei 16 300 g zentrifugiert. Das erhaltene Plätzchen wird suspendiert (und teilweise gelöst) in den 2-fachen Volumen 50 mmolares /S -Glycerinphosphat/50 mmolares 2-Mercaptoäthanol/1 mmolare Ä'thylendiamintetraessigsäure (pH 7). Die Suspension wird 2 mal gegen das 20-fache Volumen des ß> -GIycerinphosphatpuffers dialysiert und dann 3 Stunden bei 35 000 g zentrifugiert. Die erhaltene, teilweise geklärte Lösung enthält 70 Prozent der Glykogensynthetaseaktivität und 40 Prozent der Glykogenphosphorylaseaktiyität, die in dem Glaswollefiltrat vor der Ausfällung mit (NH^)2SO;, gefunden wird.
Die Glykogensynthetase wird in Anwesenheit und in Abwesenheit von Glucose-6-phqsphat, wie von Soderling et al. in "J.Biol.Chem.n (1970) 6317-6328 beschrieben, analysiert. 1' Aktivitätsein--
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heit ist definiert als diejenige Enzymmenge, die (tinter den Standard-Analysebedingungen) den Einbau von 1^u.Mol Glucose pro Minute aus UDP-Glucose in Glykogen katalysiert·
Glykogenphosphorylase wird wie in Beispiel 1 analysiert. Eine Aktivitätseinheit ist definiert als diejenige Enzymmenge, die die !Freisetzung von 1 ^u Mol anorganisch er Phosphorylase aus Glucose-1-phosphoryläse pro Minute verursacht. * -
Die Elektrophorese des Acrylamids erfolgt mit 5-prozentigen Gelen in Gegenwart von 0,1-prozentigem Natriumdodecylsulfat/10 mmolarem 2-Mercaptoäthanol (pH 7,2), wie von Dudai et al. in "Biochim. Biophye. Acta" 268 (1972) 138-157 beschrieben. Die Proteinkonzentrationen werden nach der Biuret-Methode (J. Bio. Chem. 177 (1949) 751-766 ) bestimmt.
Bei der Herstellung der homö logen Reihen von d -Aminoalkylagarosen (Agarose-NH-(CH2V-NHp ) wird ein großer Überschuß des Diamins zur Verringerung der Vemetzungswahrscheinlichkeit angewendet. Die Kohlenwasserstoffketten der hergestellten Agarosen besitzen 2,3,4,5,6,7,8,10 bzw. .12 C-Atome. Während der Verknüpfung der längeren Kohlenwasserstoffketten (7 C-Atome und darüber) mit der aktivierten Agarose wird als Lösungsmittel ein 1:1-Gemisch von wäßrigem Puffer und entweder Dioxan oder N,Nr-Dimethylformamid verwendet. Der Kaninchenmuskelextrakt wird durch kurze Säulen von jedem dieser Agarosederivate geschickt. Die austretenden Fraktionen werden auf Glykogenphosphorylase und Glykogensynthetase analysiert, und ihre Absorption bei 280 nm wird aufgezeichnet. Sowahl die Synthetase als auch die Phosphorylase werden aus den C2- und Cj-Säulen ausgeschieden. Während jedoch die Glykogenphosphorylase auch aus der C.-Säule ausgeschieden wird, wird die Glykogensynthetase von dieser Säule zurückgehalten, aus der sie unter Anwendung eines linearen Natriumchlorid-Gradienten eluiert werden kann. Höhere Glieder dieser homologen Reihe von Agarosederivaten (n=5 bis 8) binden die Synthetase so fest, daß sie nur in denaturierter Form eluiert werden kann. Die Phosphorylase wird von der Cg-Säule selektiv gebunden. Deshalb ist es möglich,, die Synthetase
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durch Passieren des rohen Muskelextrakts durch die C.-Säule zu isolieren und dann die Phosphorylase zu extrahieren, indem man die ausgeschiedenen Proteine der^Chromatographie in der Cg-Säule untei*· wirft.
: B e-i s ρ i e 1 4
Gemäß dem Verfahren des Beispiels 3 werden 70' ml Muskelextrakt, die 1750 mg Protein enthalten und eine Synthetaseaktivität von 0,2 Einheiten/mg besitzen, auf eine kurze Säule ( 10 χ 2,4 cm) Agarose-0--NH2 aufgebracht. Die Säule scheidet eine große Menge Protein, einschließlich Glykogenphosphorylase ausj in den ausgeschiedenen Fraktionen kann jedoch keine Synthetaseaktivität beobachtet werden. Nach der Anwendung eines Natriumchlorid-Gradienten wird die Glykogensynthetase eluiert. Die erhaltene spezifische Aktivität der Synthetase beiträgt 5 Einheiten/mg , was einer 25-fachen Reinigung in einer Stufe entspricht. In einem getrennten Veriahren wird, ausgehend von Muskelextrakten, die eine Synthetaseaktivität von nur 0,09 Einheiten/mg besitzen, eine 48-fache Reinigung erreicht. Die mittels der vorgenannten. Verfahren hergestellte Synthetase ist nicht 'homogen auf Acrylamidgelen in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat und 2-Mercaptoäthanol. Bei der Herstellung eines Muskelextakts, wie beschrieben, und anschließendes Chromatographieren unter Verwendung von Agarose-C.-NH« wird jedoch eine 350-fache Reinigung mit 50-prozentiger Aktivitätsausbeute erreicht.
B ei. s ρ i e Ie 5 - 11
Gemäß dem Verfahren des Beispiels 3 wird eine homologe Reihe von £o -Aminoalkylagarose (Sepharose 4B), d.h. Agarοse-NH-(CHp) -NH2 hergestellt; die wirksamsten Glieder für verschiedene Biomoleküle werden bestimmt. In der Tabelle sind die Biomoleküle und ihr Ursprung, die verwendeten Säulen (Kohlenstoffkettenlänge) sowie der erzielte Reinigungsgrad aufgeführt.
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Beispiel Biomolekül verwendete
Quelle Säule		 - s-
"Lactobacillus
30a		 °6 Reinigung
(x-fach)
5
e.		 Histidinolphoaphat Salmonella
Amino^ransferase Typhimirium		 Lactobacillus
30a		 C10 46
6 Histidin
Decarboxylase		 E. CoIi. B °5 >10 ;·
7 Ornithin
Decarboxylase .		 E. CoIi. °2 5-10
8 Restriction
Endonuclease		 .ATP:Glutamin- E. CoIi
Synthetase Adenyl—
Transferase		 Cr- oder Gr
ο 6		 >10
9 r. ■ Glutamin-
Synthetase		 Cr- oder C,- 6
10 6
11 ^ Ketopantoat- E. CoIi
Hydroxymethyl transferase
Die hydrophoben Säulen der Erfindung können wiederholt verwendet werden. Sie wiederstehen dem Waschen mit 1 m NaOH und 1 m HCl und können monatelang bei 40C in wäßriger Suspension, die bakteriostatische Mittel enthält, gelagert werden. Die Säulen besitzen eine große Bindungskapazität und hohe 3?ließgeschwindigkeiten ( 1 bis 3 ml/min). Der Hauptvorteil der Säulen besteht darin, daß sie 3e nach den Erfordernissen der speziellen Makromoleküle "maßgeschneidert11 werden können.
Das Verfahren der Erfindung und die erfindungsgemäß hergestellten Produkte können auf verschiedene Weise abgewandelt und modifiziert werden, ohne daß hierdurch von dem Erfindungsgedanken abgewichen wird. So kann z.B. ein gewünschtes Biomolekül dadurch gereinigt werden, daß man das unreine Material durch eine Säulenreihe schieß hierdurch alle Verunreinigungen bindet- und das reine, gewünschte Molekül eluiert. Die verschiedenen, beschriebenen Ausführungsformen dienen lediglich der Erläuterung der Erfindung und stellen in keinem Fall eine Beschränkung dar.
Patentansprüche
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Claims (20)

■-■■■ - Ί4 - Patentansprüche
1. Verfahren zum selektiven und reversiblen Binden von Biomolekülen an ein Absorbens in einer chromatographysehen Säule, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Absorbens der Formel A-B-C-D verwendet, in der A einen wasserunlöslichen Träger, B eine koväfente, verknüpfende Gruppe, G einen Kohlenwasserstoffrest und D eine Endgruppe aus der Gruppe Wasserstoff, ionische Reste und nicht-ionische Reste * darstellen, wobei im EaIl, daß das Biomolekül ein lipophiles Protein ist, B , C und D ke^ne Kombinati an- von -NH-, -Decyl- und Amino- bzw. N-(3-Carboxypropionyl)-amino-gruppe darstellen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß A Agarose iaft.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reste aus der Gruppe -NH2, ^S-O-H, -CONH2, -PO.H2, -OH, -SH1 Imidazol und phenolische Gruppen ausgewählt sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß B aus der Gruppe -NH-, -S-, und -COO- ausgewählt ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß C ein Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkylaryl- oder Alkylaralkylrest ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß A Agarose, B -NH- und C ein Alkylrest ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß D ein Wassastoffatom ist,
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch'gekennzeichnet, daß D eine Aminogruppe ist und der Alkylrest 1 bis 12 C-Atome enthält.
9. Verfahren zur Bestimmung desjenigen Gliedes einer homologen leihe von Verbindungen der Formel A-B-C-D, in der A einen wasserunlöslichen Träger, B eine kovalente, verknüpf ende Gruppe, C einen Cohlenwasserstoffrest und D eine Endgruppe aus der Gruppe Wasserstoff, ionische und nicht-ionische Reste bedeuten, wobei die Rei-
bei C
henglieder in der Anzahl der C-Atomeidifferieren, das selektiv
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und reversibel ein .gegebenes Biomolekül bindet, dadurch gekennzeichnet, daß man einzelnen Portionen einer Lösung, die das Biomolekül enthält, mit einzelnen Gliedern der Reihe in Berührung bringt, bestimmt, welche Glieder der Reihe das Makromolekül binden, die Eluierbedingungen ändert und bestimmt, welches Glied der Reihe das Biomolekül in nicht-denaturierter Form freigibt. .
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß A Agarose, B -NH- und C ein Alkylrest ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß D ein Wasserstoffatom ist.
12. -Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß D eine Aminogruppe ist und der Alkylrest 1 bis 12 C-Atome enthält.
13. Packung bzw. Anordnung, die eine Reihe chromatographischer Säulen enthält, von denen jede ein Reagens der Formel A-B-C-D als Absorbens enthält, wobei A ein wasserunlöslicher Träger, B ein= kovalenfe,verknüpfende Gruppe, C ein Kohlenwasserstoffrest und D eine Endgruppe aus der Gruppe Wasserstoff, ionische Reste und nicht-ionische Reste ist, wobei sich die Reagenzien in den Säulen in der Anzahl der C-Atome/unterscheiden und eine homologe Reihe von Reaktanten bilden. '
14. Anordnung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß A Agarose ist.
15. Anordnung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Reste aus der Gruppe -NH2, -SO5^-PO-H2, -OH, -SH, -CONH2, Imidazol und phenolische Gruppen ausgewählt sind.
1b. Anordnung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß B aus der Gruppe -NH-,. -S-, und -COO- ausgewählt ist.
17. Anordnung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß C ein Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkylaryl- oder Alkylaralkylrest ist.
18. Anordnung nach Anspruch 13f dadurch gekennzeichnet, daß A Agarose, B -NH- und C ein Alkylrest ist.
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19. Anordnung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß T) ein Wasserstoffatom ist.
20. Anordnung nach Anspruch. 18, dadurch gekennzeichnet, daß D eine Aminogruppen ist und die Alkylreste 1 bis 12 C-Atome ent-r halten. . ·
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