DE2323422C2 - Verfahren zur Isolierung von biologisch aktiven Verbindungen durch Affinitätschromatographie - Google Patents

Verfahren zur Isolierung von biologisch aktiven Verbindungen durch Affinitätschromatographie

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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Isolierung von biologisch aktiven Verbindungen, wie beispielsweise Enzymen, Enzyminhibitoren, Antikörpern, Antigenen, Hormonen u. ä., durch Affinitätschromatographie an selektiven Sorbentien.
Bei der Affinitätschromatographie, die zu den modernsten Trennmethoden in der Biochemie gehört, wird die Fähigkeit von biologisch wirksamen Verbindungen zur spezifischen, reversiblen Bildung von Sorptionskomplexen mit anderen biologisch aktiven Stoffen ausgenutzt, wobei eine der Komponenten des Sorptionskomplexes kovalent an einen festen Träger gebunden ist und der so präparierte Träger unter geeigneten Bedingungen einem Verbindungsgemisch in Lösung in Kontakt gebracht wird und aus dem Gemisch lediglich Verbindungen mit einer spezifischen Affinität zur trägerfixierten Substanz selektiv an der Oberfläche des Trägers sorbiert werden.
Bei Änderung der Bedingungen, wie beispielsweise des pH, der Ionenstärke des Lösungsmittels, der Temperatur usw., erfolgt eine Dissoziation des Sorptionskomplexes und Abtrennung der löslichen Komponente von der an den Träger chemisch gebundenen Komponente.
Die Affinitätschromatographie eignet sich besonders zur Reinigung von Enzymen, Enzyminhibitoren, Antikörpern, Antigenen, Nucleinsäuren, Proteinen mit einem gebundenen Cofaktor oder Vitamin, Proteinen mit gebundenen Giftrezeptoren oder Hormonen, repressorischen Proteinen, Suifhydrylgruppen enthaltenden Proteinen, synthetisch hergestellten Peptiden u.dgl., ferner zur Konzentrierung verdünnter Proteinlösungen, zur Entfernung denaturierter Formen aus gereinigten Proteinen sowie etwa zur Trennung und Unterscheidung von durch spezifische chemische Modifizierung gebildeten Protein- und Peptidkomponenten.
Als Träger werden bei der Affinitätschromatographie z. B. Copolymere von Fthylen mit Maleinsäureanhydrid, modifizierte Copolymere von Styrol mit Divinylbenzol, Copolymere von Acrylamid mit Methy!en-bis(acrylamid), Poiysaccharide, poröses Glas u. a. verwendet (vgl. W. B. Jakoby, Methods in Enzymology XXII, 346-348). Für die Affinitätschromatographie ungeeignete Träger sind solche, die gebundene ionogene funktioneile Gruppen enthalten und entsprechend beispielsweise Proteine
ίο nur unspezifisch sorbieren. Andere Trägermaterialien weisen eine unzureichende mechanische, hydrolytische, mikrobielle oder thermische Stabiltät oder eine ungeeignete Verteilung der Porengröße auf, wodurch Hir Anwendungsbereich erheblich eingeschränkt wird. Bei zahlreichen handelsüblichen Trägergelen kommt ferner hinzu, daß sie nicht austrocknen dürfen, was Lagerung und Transport erschwert
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Verwendung neuer Träger bei der Affinitätschromatographie anzugeben.
Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung biologisch aktiver Verbindungen durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines porösen Copolymers als Träger ist dadurch gekennzeichnet, daß als Träger makroporöse Copolymere von Hydroxyalkylacrylaten, Hydroxyalkylmethacrylaten, Oligo- uder Polyglycolacrylaten, Oligo- oder Polyglycolmethacrylaten, Acrylnitril, Methacrylnitril, Aminoalkylacrylaten, Aminoalkylmethacrylaten. Acrylsäure, Methacrylsäure oder Methylolacrylamid als hydrophilen Monomeren mit Alkylendiacrylaten, Alkylendimethacrylaten, Oligo- oder Poiyglycoldiacrylaten, Oligo- oder Polyglycoldimethacrylaten, Alkyl- oder Glycol-tri- und -polyacrylaten und -methacrylaten und Alkylenbismethacrylamiden und Divinylbenzol als Divinyl- oder Polyvinyl-Comonomeren verwendet werden.
Die mit der kovalent gebundenen biologisch aktiven Komponente modifizierten gelförmigen Träger werden im ersten Verfahrensschritt mit einer Lösung des zu trennenden Verbindungsgemisches in Kontakt gebracht, wobei es unter geeigneten Bedingungen zur selektiven Sorption der Stoffe kommt, die zur Bildung von Sorptionskomplexen befähigt sind. Im zweiten Verfahrensschritt wird dann durch Änderung der physikalischen oder chemischen Bedingungen die Desorption dieser Stoffe und ihre Abtrennung vom modifizierten Gel bewirkt, ohne daß hierdurch die Aktivität der gebundenen oder der desorbierten Komponente beeinträchtigt wird. Der Zyklus der spezifischen Sorption und der physikalisch-chemisch bedingten Desorption kann wiederholt werden, solange die biologische Aktivität der an den Träger gebundenen Verbindungen anhält.
Die Träger auf der Basis der hydrophilen Acrylsäure- und Methacrylsäureester können vorteilhaft in Form von diskreten Teilchen, am günstigsten mit kugelförmiger Gestalt, oder in Form von Blöcken, Membranen, Fäden oder Bändern verwendet werden. Die Trennung kann ferner absatzweise diskontinuierlich oder in wiederholten Zyklen an einer Säule erfolgen. Bei der kontinuierlichen Verfahrensführung wird das Trägergel z. B. in Form eines endlosen Bandes oder auf einem Transporteur bewegt, wobei die Lösungen stationär sind oder im Gegenstrom zur Bewegungsrichtung de:; Trägergels
b-5 fließen.
Hin großer Vorteil der Affinitätschromatographie ist die rasche Trennung der isolierten biologisch aktiven Verbindungen von Inhibitoren und abbauend wirken-
den Verunreinigungen.
Die isolierten biologisch aktiven Verbindungen sind durch die Stabilisierung ihrer Tertiärstruktur infolge der Bindung der Liganden im aktiven Zehtrum vor Denaturierung geschützt Das gesamte Verfahren ist sehr schonend und relativ schnell durchführbar und ermöglicht die Gewinnung von hochaktiven Produkten in einem einzigen Verfahrensschritt Die große mechanische und hydrolytische Stabilität der erfindungsgemäßen hydrophilen makroporösen Träger gestattet ihre Anwendung in der Form, die für die gegebene Applikation am günstigsten ist
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Trennung von biologisch aktiven Verbindungen durch Affinitätschromatographie wird nachfolgend an Beispielen erläutert.
Beispiel 1
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Affinitätschromatographische Isolierung von hochaktivem Chymotrypsin an Hydroxyethylmethacrylat-Gel mit kovalent gebundenem Trypsininhibitor
0,02 Gew.-Teile kristallisiertes Chymotrypsin wurden in 1 Gew.-Teil 0,05 m Tris-HCl-Puffer, pH 8, gelöst; diese Lösung wurde auf eine Säule (10 · 80 mm) aus Hydroxyethylmethacrylat-Gel aufgegeben, das durch Suspensionscopolymerisation von 2-Hydroxyethylmethacrylat mit Ethylendimethacrylat in Gegenwart inerter Lösungsmittel erhalten worden war und eine Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 300 000 besaß. Vor der Aufgabe der Chymotrypsinlösung wurde Pankreas-Trypsininhibitor kovalent an dar. Gel gebunden und dann das Gel mit 0,05 m Tris HCl-Puffer, pH 8,0, äquilibriert.
Nach Einziehen der Probe wurde die Säule mit dem gleichen Puffer bei einem Durchsatz von 30 ml/h eluiert, wobei Fraktionen in Intervallen von jeweils 10 min gesammelt wurden. Sobald diese keine im ultravioletten Spektralbereich bei 280 nm absorbierenden Verbindungen mehr enthielten, wurde die Elution abgebrochen und die Gelsäule dann mit etwa 0,1 m Essigsäure, pH 3,0, eluiert. Infolge der Änderung des pH-Wertes des EIutionsmittels erfolgte eine Dissoziation des Sorptionskomplexes, wobei Chymotrypsin aus der Säule eluiert wurde, das sich nach Lyophilisierung durch hohe Aktivität auszeichnete. Die proteolytische Aktivität wurde an Hämoglobin, pH 8,0, und die Esterase-Aktivität an Acetyltyrosinethylester, pH 8,0, gemessen. Die Chymotrypsinkonzentration wurde photometrisch durch Messung der Absorption der Chymotrypsinlösung in 0, 001 m HCl bei 280 nm bestimmt.
Beispiel 2
Isolierung von hochaktivem Trypsin durch Affinitätschromatographie an Hydrc/Xyethylmethacrylat-Gel mit kovalent gebundenem Trypsin-lnhibitor
Es wurde wie in Beispiel 1 verfahren mit dem Unterschied, daß ein Trägergel mit einer Molekulargewichts-Ausschbßgrenze von 350 000 verwendet wurde und die Bestimmung der Esteraseaktivität des erhaltenen gereinigten Trypsinpräparats mit Benzoylargininethylester vorgenommen wurde.
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Beispiel 3
Isolierung von Insulin-Antikörpern durch Affinitätschromatographie an Ethylenglycoiacrylat-Gel (Ausschlußgrenze 300 000) mit kovalent gebundenem Insulin-Antigen
2 Gew.-Teile Antiinsulinserum mit 3% Albumin wurden in 0,1 m Natriumbarbital-Puffer, pH 8, auf eine mit einem Copolymer aus Ethylenglycolacrylat und Ethylenglycoldiacrylat gepackte Säule (8 · 40 mm), an dem Insulin kovalent gebunden war, gegeben. Das Gel wurde auch Waschen mit 50 Gew.-Teilen 0,05 m Phosphatpuffer, pH 8, der 0,08 m NaCI enthielt, äquilibriert Nach Aufgeben und Einziehen der Probe in die Säule wurde mit dem gleichen Puffer eluiert. Die reinen Antikörper gegen Insulin wurden kann ähnlich wie in Beispiel 1 durch Elution mit 3 η HCl aus der Säule verdrängt.
Beispiel 4
Isolierung von Papain-SH-Protease durch Affinitätschromatographie an Hydroxyethylmethacrylat-Gel (Ausschlußgrenze 300 000) mit kovalent gebundenem p-Aminophenylmercuriacetat
50 Gew.-Teile gequollenes Gel wurden nach Aktivierung mit Bromcyan in 20 Gew.-Teilen einer 10%igen Dimethylsulfoxidlösung suspendiert. 1 Gew.-Teil p-Aminophenylmercuriacetat wurde in 20 Gew. -Teilen Dimethylsulfoxid gelöst und langsam zur Suspension hinzugefügt. Nach vollständigem Zusatz der p-Aminophenylmercuriacetat-Lösung wurde die Suspension mit einem Magnetrührer 24 h bei 4°C gerührt. Dann wurde die Suspension auf 3O0C erhitzt und das Gel fünfmal mit 150 Gew.-Teilen 20%iger wässeriger Dimethylsulfoxidlösung aufgeschlämmt und dekantiert. Schließlich wurde die Gelsuspension in eine Säule gefüllt und mit 500 Gew. -Teilen einer 20%igen wässerigen Dimethylsulfoxidlösung bei einem Durchsatz von 10 ml/h eluiert. Das in dieser Weise gründlich gewaschene Gel diente zur Herstellung einer 10 · 60 mm Säule, in die eine 5%ige Papainlösung in einem Standartpuffer (0,5Gew.-% Butanol, 10Gew.-% Dimethylsulfoxid, 0,1 m KCl, 0,5 m Natriumacetat, pH 5,0), der durch einen Gehalt von 0,001 m EDTA und 0,01 m Na2SO3 modifiziert war, so lange eingeleitet wurde, bis die Absorption der aus der Säule eluierten Lösung bei 280 nm gleich der Absorption der in die Säule eingeleiteten Lösung bei 280 nm war. Dann wurde die Säule mit dem Standardpuffer eluiert, bis das Eluat bei 280 nm nicht mehr absorbierte. Das am Gel sorbierte aktive Papain wurde mit dem durch einen Gehalt von 0,5 ■ 10~3 m HgCb modifizierten Standardpuffer freigesetzt. Nach Entsalzen des Eluats an Sephadex G 25 bzw. nach der Dialyse wurde hochaktives Papain erhalten.
Beispiel 5
Isolierung von Chymotrypsin-Inhibitor aus Kartoffeln durch Affinitätschromatographie an mit Ethylenglycol-
dimethacrylat vernetzten! Hydroxyethylmethacrylat-Gel mit kovalent gebundenem Chymotrypsin
1500 Gew.-Teile Kartoffeln wurden in einem Mixer homogenisiert und mit 2000 Gew.-Teilen eines Gemischs einer 0,05°/oigen NaCI-Lösung und einer
O,O3°/oigen Na2SO3-Lösung im Verhältnis 1 :1 extrahiert. Das Homogenisat wurde 2 h im Kühlschrank bei 4° C belassen und dann zentrifugiert Die überstehende Flüssigkeit wurde durch eine 0,5 cm starke Kieselgurschicht filtriert und dann lyophilisiert. Es wurden 33 Gew.-Teile roher Extrakt von hellbrauner Farbe erhalten. 13Gew.-Teile des rohen lyophilisierten Kartoffelextraks wurden in 75 Gew.-Teilen 0,2 m Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, gelöst; nach vollständiger Auflösung wurde der pH-Wert mit 1 m NaOH auf 8,0 eingestellt Die Probe wurde dann wieder durch eine Kieselgurschicht filtriert und danach auf eine mit C,2 m Tris-HCl-Puffer auf pH 8 äquilibrierte Säule (14 · 455 mm) aus Ethylenglycoldimethacrylat-Hydroxyethylmethacrylat-GeI mit kovaleni gebundenem Chymotrypsin aufgegeben. Nach Einziehen der Lösung wurde die Säule mit 0,2 m Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, bei einem Durchsatz von 3,5 ml/h eluiert, wobei stündlich die ablaufenden Fraktionen gesammelt wurden. Wenn die Fraktionen proteinfrei waren, wurde die Säule mit 0,2 m KCl-HCl-Lösung von pH 2,0 eluiert. Durch die pH-Änderung erfolgte die Elution des Inhibitors in einer engen Zone. Nach einem einzigen Trennschnitt war die Inhibitionsaktivität des isolierten Inhibitors auf mehr als das Dreizehnfache angestiegen.
Beispiel 6
Isolierung von Hühnerei-Chymotrypsininhibitor aus rohem Ovomucoid durch Affinitätschromatographie an Diethylenglycolacrylat-Gel mit kovalent gebundenem Trypsin
Aus dem aus Eiweiß vom Hühnerei nach Lineweaver und Murray (J. Biol. Chem. 171 (1947) 565) mit Hilfe von Trichloressigsäure und Aceton gewonnenen rohen Ovomucoid wurde nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren der Chymotrypsininhibitor isoliert Nach einem einzigen Trennschnitt war die Inhibitionsaktivität des Inhibitors auf das Dreißigfache angestiegen.
Beispiel 7
Isolierung von Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor durch Affinitätschromatographie an Hydroxyethylmethacrylat-Gel (Molekulargewichts-Ausschlußgrenze 300 000) mit kovalent gebundenem Trypsin
Es wurde wie in Beispiel 5 verfahren, wobei ein handelsüblicher Trypsin-Inhibitor aus Sojabohnen eingesetzt wurde.
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Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Isolierung biologisch aktiver Verbindungen durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines porösen Copolymers als Träger, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger makroporöse Copolymere von Hydroxyalkylacrylaten, Hydroxyalkylmethacrylaten, Oligo- oder PoIyglycolarcrylaten, Oligo- oder Polyglycolmethacrylaten. Acrylnitril, Methacrylnitril, Aminoalkylacrylaten, Aminoalkylmethacrylaten, Acrylsäure, Methacrylsäure oder Methylolacrylamid als hydrophilen Monomeren mit Alkylendiacrylaten, Alkylendimethacrylaten, Oligo- oder Polyglycoldiacrylaten, Oligo- oder Polyglycoldimethacrylaten, Alkyl- oder Glycoltri- und -poly-acrylaten und -methacrylaten und Alkylenbismethacrylamiden und Divinylbenzol als Divinyl- oder Polyvinyl-Comonomeren verwendet werden.
2. Verfahren nach Anspruch J, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger in Form von diskreten Teilchen verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger in Form von kugelförmigen Teilchen verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger in Form von Blöcken, Folien, Stäben, Fäden, Seilen oder Bändern verwendet wird.
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