DE3014632C2

DE3014632C2 -

Info

Publication number: DE3014632C2
Application number: DE19803014632
Authority: DE
Inventors: Karel Dr. Filka; Jiri Dipl.-Ing. Coupek; Jan Dr. Prag/Praha Cs Kocourek
Original assignee: Prirodovedecka fakulta Univezita Karlova Albertov 6
Current assignee: Prirodovedecka fakulta Univezita Karlova Albertov 6
Priority date: 1979-04-28
Filing date: 1980-04-16
Publication date: 1992-05-21
Also published as: GB2048896A; GB2048896B; FR2455061B3; CS206823B1; FR2455061A3; CH653348A5; DE3014632A1

Description

Die Erfindung betrifft Sorbentien für Saccharide, Glykoprotei ne und Saccharide enthaltende Polymerisate gemäß dem Oberbe griff von Anspruch 1 sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.

Eiweißstoffe, die fähig sind, Komplexe mit Zuckerstoffen, Polysacchariden und Glykoproteinen auf selektive Art zu bil den, und welche den allgemeinen Namen "Lektine" tragen, wurden aus einer ganzen Reihe von pflanzlichen und tierischen Quellen isoliert. Sie zeichnen sich nicht nur durch ihren Ursprung, sondern vor allem durch ihre spezifische Affinität gegenüber den Zuckerstoffen und deren Derivaten aus.

Durch Binden der Lektine an eine geeignete Trägersubstanz entstehen spezifische Adsorbentien für Saccharide; Bedingung einer solchen Bindungsreaktion besteht im Aufrechterhalten des aktiven Sorptionszentrums im Lektinmolekül, das während der Reaktion nicht blockiert werden darf. Die Lektine enthaltenden Sorbentien finden in analytischer sowie präparativer Affini täts-Chromatographie und bei selektiven, zum Isolieren von biologisch aktiven Fraktionen angewandten Präzipitations- Techniken Verwendung.

Lektine wurden an Polysaccharide vom Dextran- bzw. Agarose-Typ unter Verwendung der Cyanbromid-Methode gebunden und für eine ganze Reihe von Isoliertechniken bei Abtrennung von Glyko proteinen (K. Aspberg, J. Porath, Acta Chem.Scand. 24 - 1970 - 1839), Dextranen (K. O. Lloyd, Arch. Biochem. Biophys. 137 - 1970 - 460) oder Zellen (G. H. Edelman, U. Rutishauser, C. F. Mille te, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 68 - 1971 - 2153) angewandt. Ein Vorteil dieses Verfahrens liegt in seiner Selektivität und Geschwindigkeit. Trägerstoffe vom Dextran- oder Polysaccharid- Typ weisen jedoch auch gewisse nachteilige Eigenschaften auf; zu diesen gehören vor allem große Quellungsdifferenzen in Lösungen mit variablen Ionenstärken und pH-Wert, niedrige mechanische Festigkeit der Teilchen und daraus folgende Schwierigkeiten mit Verstopfung der mit solchen Materialien zu füllenden Kolonnen bei erhöhten Druckwerten und Durchfluß geschwindigkeiten der mobilen Phase. Nicht zuletzt kann auch die relativ niedrige Beständigkeit gegen Hydrolyse und Wirkung von Mikroorganismen im Wege stehen. Die Bindungsart der Lek tinmolekeln durch die Cyanbromid-Methode macht es notwendig, mit einem hoch toxischen Aktivierungsmittel von verhältnis mäßig niedriger Wirksamkeit zu arbeiten. Die beim Cyanbromid- Vorgang entstehende Bindung ist für bestimmte Zwecke nicht stabil genug; es wurde deren sukzessive hydrolytische Spaltung mit gleichzeitiger Herabsetzung der Sorbentkapazität festge stellt.

Die erfindungsgemäßen Substanzen schalten die vorerwähnten Nachteile der bisher bekannten Sorptionsmaterialien aus. Eine kovalente Bindung von Zuckermolekeln kann vorzugsweise durch den Vorgang gemäß dem CSSR-AO 195 044 (DE-Patent 28 58 715) erzielt werden; dieser besteht auf einer sauer katalysierten Reaktion der Saccharide mit Hydroxylgruppen enthaltenden Polymerisaten in Dioxan oder Tetrahydrofuran. Außer hydrophi len synthetischen Polymerisaten (makroporösen Hydroxyalkyl acrylaten und Hydroxyalkylmethacrylaten, teilweise hydroly siertem vernetzten Polyvinylacetat u. a.) kann man auch mehrere natürliche oder halbsynthetische hydrophile Polymerisate (Polydextrane, Agarose-Polymeren, Cellulose o. dgl.) verwenden, da die eigentliche Reaktion in einem wasserfreien, eventuelle Hydrolyse von glykosidischen oder peptidischen Bindungen ausschließenden Medium durchgeführt werden muß.

Aufgabe der Erfindung war es nun, Sorbentien bereitzustellen, die unter anderem in der Herstellung einfacher und weniger gefährlich sind.

Diese Aufgabe wird wie aus den vorstehenden Ansprüchen er sichtlich gelöst.

Die erhaltenen Glykosylderivate der Polymere werden mit Perjo dat oxidiert; durch die Wirkung des Letztgenannten erfolgt die Spaltung der C-C-Bindung zwischen zwei Kohlenstoffatomen mit vicinal gebundenen Hydroxylgruppen in Molekülen der kovalent gebundenen Saccharide unter Entstehung zweier Aldehydgruppen, die erheblich reaktiv sind. Das durch Oxidation aktivierte Polymere reagiert in der nächsten Stufe mit Lektinen unter Entstehung der Schiff′schen Base. Die Schnelligkeit dieser Reaktion hängt von der Konzentration der Komponenten und von der Temperatur ab und wird durch den pH-Wert des Reaktions mediums stark beeinflußt. Die nicht reagierten aktiven Alde hydgruppen werden durch Natriumborhydrid reduziert. Die so entstandenen Sorptions- bzw. Präzipitationssubstanzen zeichnen sich durch eine hohe Kapazität aus.

In ihrer Wirkung sind die erfindungsgemäßen Substanzen mit bekannten und zur Verfügung stehenden Materialien auf Grund von mit Lektinen durch die Cyanbromid-Methode gebundenen Sacchariden vergleichbar, wobei für den Prüfstein der Wirksam keit die Adsorptionskapazität der Sorbentien genommen wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist vom technologischen Ge sichtspunkt im wesentlichen leichter, erfordert keine besonde ren Maßnahmen für die Arbeit mit hoch toxischen Aktiviermit teln und ermöglicht einfache Steuerung des Konversionsgrades der Bindungsreaktion bei hoher Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus verleihen die nicht oxidierten, an den Trägerstoff gebundenen Saccharidmoleküle diesem Trägerstoff einen hydro philen Charakter oder steigern seine ursprüngliche Hydrophi lie. Auf diese Weise wird die Wahrscheinlichkeit gewisser unspezifischer Interaktionen von geschiedenen Systemen bei der Verwendung der Sorbentien in Affinitäts-Chromatographie her abgesetzt.

Beispiel 1

15 g Mischpolymerisat von 2-Hydroxyäthylmethacrylat und Ethy lenmethacrylat mit Molekulargerwicht-Ausscheidungslimit von 1 000 000, enthaltend auch 16% von kovalent gebundener Galac tose (Separon HEMA-1000-Gal), wurde in 150 ml Wasser 20 Stun den gequollen. Die Flüssigkeit wurde dann abgesaugt und 346 ml 0,1 M NaIO₄ zugegeben. Die Oxidation wurde 100 Minuten bei 25°C vorgenommen. Das Produkt wurde mit Wasser bis zur nega tiven Reaktion auf Oxidationsmittel (Mn⁺⁺) durchgewaschen, mit Puffer, in welchem die Bindung des Lektins (Acetatpuffer mit verschiedenem pH) durchgeführt wurde, in Gleichgewicht ge bracht und in die nachfolgende Bindungsreaktion eingesetzt.

140 ml Acetatpuffer (pH 7,8) wurden zum Lösen von 2,4 g Lektin aus Canavalia ensiformis DC (Konkanavalin A) verwendet und der Lösung der ins Gleichgewicht gebrachte oxidierte Trägerstoff von der vorherigen Stufe in Form eines dicken Breis zusammen mit 250 mg D-Glucose zugesetzt. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei 4°C in einem Kühlschrank gerührt. Darauf wurden 25 mg NaBH₄, und nach 20 Minuten eine weitere Dosis von 25 mg NaBH₄ zugegeben. Das Gemisch wurde im Kontakt mit Natriumborhydrid insgesamt 40 Minuten gelassen. Nachher wurde das Sorbens mit Acetatpuffer (pH 7,3) durchgewaschen und ferner dreimal mit 200 ml Tris HCl-Puffer in 1 Mol NaCl (pH 8) und mit Acetatpuf fer in 1 Mol NaCl (pH 4) durchgewaschen. Das derart behandelte Sorbens wurde in eine Kolonne übertragen und mit einem Puffer durchgewaschen, in welchem eine Sorptionswirkung gegenüber Saccharidderivaten nachgewiesen wurde. Die Menge an gebundenem Konkanavalin betrug 15 mg pro Gramm des trockenen Trägerstof fes.

Die Wirkung des gebundenen Lektins wurde durch Sorption eines synthetischen, kovalent gebundene Saccharide (Glucose, Galac tose) enthaltenden Acrylamidpolymerisaten (V. Horejsi, P. Smolek und J. Kocourek, Biochim. Biophys. Acta 538, 293, 1979) durch den nachfolgenden Vorgang bewiesen:
An eine Kolonne von 1 g Trägerstoff mit gebundenem Lektin nach Äquilibrierung mit Acetatpuffer (pH 7,3) wurde 0,3427 g lösli ches Polyacrylamidpolymer mit 0,4 gewichtsprozentigem Inhalt von Glucose im Anfahrpuffer angesetzt. Bei Elution von 102 ml Puffer wurde der Zuckergehalt bis zum Nullwert überwacht. An die Kolonne wurde dann eine Lösung von 0,5 Mol Methyl-α-D- glucopyranosid (30 ml) gebracht, worauf die Kolonne mit dem Anfahrpuffer (pH 7,3) durchgewaschen wurde. Das Eluat wurde aufgefangen, dialysiert und lyophilisiert. Durch gravimetri sche Methode wurde 0,016 g Polymer festgestellt. Auf Grund der Stoffbilanz wurde bei Chromatographie 3,1%iger Verlust an glykosyliertem Polyacrylamid-Standard gefunden.

Beispiel 2

Das Sorbens wurde analog wie in Beispiel 1 vorbereitet und behandelt. Seine Wirkung wurde durch selektive Sorption von Ovalbumin nachgewiesen; darüber hinaus wurde wiederholte Verwendung untersucht. 1 g Sorbens gemäß Beispiel 1 mit gebun denem Konkanavalin A wurde durch Acetatpuffer (pH 7,3) und nachher durch Tris HCl-Puffer pH 7,8 + 0,15 M NaCl äquili briert. An die Kolonne wurde 49 mg Ovalbumin in 5 ml Anfahr puffer angesetzt und das System mit Puffer bis zur negativen Reaktion auf Eiweißstoffe (UV-Absorption 280 nm) unter gleich zeitigem Auffangen von Eluat durchgewaschen. Darauf wurde 0,1 M Lösung von Methyl-α-D-Glucopyranosid (50 ml) angesetzt. Das Eluat wurde aufgefangen, dialysiert und lyophilisiert. Die Ausbeute im Eluat betrug 7,8 mg, der Gehalt von ungebundenem Eiweißstoff auf 40 mg bestimmt; 2,44% Verlust.

Die Kolonne wurde dann mit 20 ml Tris HCl-Puffer pH 7,8 + 1 M NaCl und mit 20 ml Acetatpuffer + 1 M NaCl pH 4 durchgewa schen, mit Tris HCl-Puzffer + 15 M NaCl pH 7,8 eingestellt und der gesamte Prozeß wiederholt.

Beim zweiten Zyklus wurde der Eiweißstoffgehalt im Elutions mittel nach dem Durchwaschen mit Methyl-α-D-glucopyranosid auf 7,6 mg, beim dritten auf 7,8 mg und beim vierten auf 7,6 mg festgestellt.

Beispiel 3

Das Sorbens wurde analog wie in Beispiel 1 vorbereitet, mit der Ausnahme, daß an Stelle des Mischpolymerisates mit dem Molekulargewicht-Ausscheidungslimit von 1 Mill. dalton, Mischpolymerisat von 2-Hydroxyäthylmethacrylat mit Ethylendimethacrylat von 300 000 Molekulargewicht als Trägerstoff verwendet wurde. Beim Testen der Wirkung durch glykosyliertes Polyacrylamid wurde 4,6%iger Verlust (Ansatzmenge 0,3470 g, im Elutionsmittel 0,0154 g) gefunden. Das Ausgangssorbens enthielt 18 Gew.-% von kovalent gebundener Glucose.

Beispiel 4

Zur Bindung des Lektins aus Ricinus communis wurde der oxydierte, in Beispiel 3 beschriebene Trägerstoff angewandt. 1,9 g Lektin wurde in 70 ml Acetatpuffer (pH 7,3), enthaltend 220 mg Galactose, gelöst und 10 g des oxydierten Trägerstoffes zugesetzt. Die Eliminierung der nicht reagierten aktiven Aldehydgruppen wurde mit 25 mg NaBH₄ vorgenommen; Reaktionszeit wie in Beispiel 1.

Die Wirkung wurde durch Polyacrylamid mit 9,4 gewichtsprozentigem Zuckergehalt geprüft. Ansatzmenge 0,3412 g, Ausbeute im Elutionsmittel 0,0154 g, Verluste 3,8%.

Beispiel 5

Die Bindung des Lektins aus Ricinus communis wurde analog wie in Beispiel 4 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß der oxydierte Trägerstoff das Molekulargewicht-Ausscheidungslimit von 300 000 dalton aufwies.

Beim Prüfen der Wirkung durch Polyacrylamid mit gebundener Glucose wurde pro 1 g der Kolonne 0,3400 g Polymer angesetzt; Ausbeute im Elutionsmittel 0,0171 g, Verluste 4,75%.

Beispiel 6

4,2 g sphärische Cellulose wurde binnen 20 Stunden in 50 ml Dioxan, gesättigt mit gasförmigem Chlorwasserstoff, bis zum 16gewichtsprozentigen Gehalt quellen gelassen. Nach dieser Zeitspanne wurde der Reaktionsmischung 2,0 g D-Galactose zugegeben und sie wurde dann 24 Stunden bei Laboratoriumstemperatur geschüttelt. Darauf wurde der Inhalt des Gefäßes in 5 l Wasservolumen eingegossen und das Produkt nach Absaugen über einen Filter mit Wasser bis zum neutralen pH-Wert und zur negativen Reaktion auf Zucker wiederholt durchgewaschen.

4,0 g sphärische Cellulose mit gebundener D-Galactose (11,7gewichtsprozentiger Gehalt von gebundener D-Galactose analytisch bestimmt) wurde 20 Stunden in destilliertem Wasser quellen gelassen. Das Wasser wurde dann abfiltriert und dem nassen Gel 100 ml 0,1 M NaJO₄ zugesetzt. Die Oxydation verlief eine Stunde bei Laborationstemperatur unter Rühren. Darauf wurde die Natriumperjodatlösung abfiltriert und das Gel an der Kolonne mit destilliertem Wasser durchgewaschen, bis die Leitfähigkeit des Eluats der des angewandten destillierten Wassers entsprach. Dem Cellulosegel wurde dann Boratpuffer von pH 8,5 und nach einer Stunde 500 mg Konkanavalin A (d. h. Lektin aus Canavalia ensiformis) zugegeben. Das Lektin wurde mit Methyl-alpha-D-glucopyranosid inhibiert. Nach 70stündiger Verweilperiode bei 4°C wurden die nichtreagierten aktiven Gruppen bei 4°C mit 20 mg NaBH₄ unter 20 Minuten dauerndem Rühren reduziert. Das Gel wurde nachher abwechselnd mit Acetatpuffer bei pH 4,1 (1 M NaCl) und Tris HCl-Puffer pH 9 (1 M NaCl) durchgewaschen. In der finalen Phase vor der Applizierung wurde das Gel im Acetatpuffer pH 6 (1 M Nacl), enthaltend 10⁻³ M MnCl₂ und 10⁻³ M CaCl₂, aufbewahrt. Der Gehalt an gebundenem Eiweißstoff betrug 9,0 mg pro Milliliter des nassen Gels.

Beispiel 7

Aminoglykosyl-Derivat von Cellulose wurde analog wie in Bei spiel 6 vorbereitet, mit der Ausnahme, daß in die Reaktion 0,8 g N-Acetyl-D-glukosamin eingesetzt und daß das Produkt nicht oxidiert wurde; es wurde nur die Menge des an den Cellulose träger angebundenen Aminozuckers bestimmt.

Beispiel 8

Ein ähnliches Experiment wie in Beispiel 7 wurde mit dem aus Hydroxyäthylmethacrylat-Mischpolymerisat von 1 Mill. Moleku largewicht-Ausscheidungslimit (s. Beispiel 1) bestehenden Trägerstoff durchgeführt. Der Gehalt des gebundenen Aminozuc kers betrug 8,9 Gew.-%, was die Doppelmenge gegenüber dem Beispiel 7 war.

Beispiel 9

4,0 g von löslichem Polyacrylamid-Gel mit einpolymerisiertem Allyl-α-D-glucosid (vorbereitet nach V. Horejsi, P. Smolek und J. Kocourek: Biochim. Biophys. Acta, 538 - 1978 - 293-298) wurde in 100 ml 0,1 M NaIO₄ binnen einer Stunde bei Laboratoriums temperatur oxidiert. Nach dieser Zeit wurde das Reaktions gemisch auf 250 ml verdünnt und gegen destilliertes Wasser dialysieren gelassen. Nach der Beseitigung des Perjodats aus dem Reaktionsgemisch durch Dialyse wurde das Gel lyophyli siert. Das Lyophylisat wurde in 20 ml destilliertem Wasser gelöst. Der Lösung wurde 500 mg Lektin aus Canavalia ensifor mis, inhibiert mit Methyl-α-D-glucopyranosid, zugegeben. Das Gemisch reagierte binnen 70 Stunden bei 4°C, worauf die übrig bleibenden aldehydischen Gruppen durch Reaktion mit NaBH₄ - ähnlich wie in Beispiel 6 - reduziert wurden. Die erhaltene Reaktionsmischung - nach Verdickung durch Lyophilisation - wurde durch präparative Gel-Chromatographie im Dextran-Gel auf eine Lektin-Fraktion und eine an glykosyliertes polymeres Acrylamid gebundenes Lektin enthaltende Fraktion getrennt.

Beispiel 10

4,0 g Polyvinylalkohol (125 000 Molekulargwicht und 87-89% Hydrolyse-Grad), welcher durch D-Glucose gemäß dem CSSR-AO 195 044 (DE-Patent 28 58 715) substituiert wurde, wurde analog wie nach Beispiel 9 oxidiert.

Beispiel 11

Das Sorbens wurde analog wie in Beispiel 1 vorbereitet, mit der Ausnahme, daß anstelle des Mischpolymerisats von Äthylen dimethacrylat und Hydroxyäthylmethacrylat ein Mischpolymerisat von Hydroyäthylacrylat mit Äthylendiacrylat von 500 000 dalton Molekulargewicht-Ausscheidungslimit angewandt wurde. Durch Prüfung der Wirkung der Bindungskapazität durch Sorption von löslichem Polyacrylamid mit eingebautem Allyl-α-D-glucosid wurde ein 5,3%iger Verlust festgestellt.

Claims

1. Sorbentien für Saccharide, Glykoproteine und Saccharide enthaltende Polymerisate, die an einem Trägerstoff Lektine kovalent gebunden enthalten, dadurch gekenn zeichnet, daß man als Trägerstoff einen aus der Gruppe von oxidierten glykosylierten Polysacchariden, oxidierten glykosylierten Hydroxyalkylacrylatpolymerisaten, oxidierten glykosylierten Hydroxyalkylmethacrylatpolymerisaten, oxidier tem glykosyliertem Polyacrylamid und oxidiertem glykosyliertem Polyvinylalkohol auswählt.

2. Verfahren zur Herstellung von Sorbentien nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die als Trä gerstoffe gewählten Polymerisate mit Natrium- oder Kaliumper jodat oxidiert, dann die derart aktivierten Polymerisate mit Lektinen bei einer Temperatur von 0 bis 40°C in Pufferlösung von pH 7-12 reagieren läßt und schließlich die nach der Reak tion übriggebliebenen aktiven Aldehydgruppen aus dem Polymeri sat durch Einwirkung von Reduktionsmitteln eliminiert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, daß man als Reduktionsmittel Natriumbor hydrid verwendet.