DE2858715C2

DE2858715C2 -

Info

Publication number: DE2858715C2
Application number: DE2858715A
Authority: DE
Inventors: Jiri Dipl.-Ing. Coupek; Karel Filka; Jan Prag/Praha Cs Kocourek
Original assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Current assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Priority date: 1977-05-03
Filing date: 1978-05-03
Publication date: 1989-06-22
Also published as: CH637146A5; DE2819522C2; NL7804782A; US4251634A; DD138667A1; DE2819522A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur chromatographi schen Isolierung von biologisch aktiven oder physiologisch wirksamen Stoffen, die freie Bindungsstellen für Saccharide enthalten und mit ihnen spezifische Komplexe bilden, gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Hydrophile makroporöse Copolymerisate von Hydroxyalkyl acrylaten und Hydroxyalkylmethacrylaten mit Alkylenglycol diacrylaten oder Alkylenglycoldimethacrylaten, die durch Copolymerisation in Suspension in Gegenwart von inerten organischen Verbindungen in wässerigem oder organischem Dispersionsmilieu hergestellt werden, sind aus dem CS 1 50 819 A (= GB 13 70 377 A) und aus CS 1 48 828 A bekannt. Ihre hervorragenden mechanischen Eigenschaften, die sphärische Form der Teil chen und ihre makroporöse Struktur, die die Penetration von sogar beträchtlich großen Molekülen in die Poren des Trägers erlaubt, haben zu ausgedehnten Anwendungen dieser Materialien in der Gel-, Ionenaustausch-, Adsorptions- und Affinitätschromatographie unter Verwendung von Wasser oder wässerigen Lösungen als Elutionsmittel geführt. Sehr er folgversprechend ist die Anwendung von Hydroxyalkylacry lat- und Hydroxyalkylmethacrylat-Copolymerisaten in der sog. hydrophoben Chromatographie, bei der die Wechselwir kung des lipophilen Teils der Moleküle der getrennten Verbindungen mit der verhältnismäßig unpolaren Matrix des Trägers, dessen Hydrophilie durch Gegenwart von nichtiono genen Hydroxylgruppen in Seitenketten der Copolymerisate verursacht wird, ausgenutzt wird.

Für einige Anwendungen ist aber diese mögliche hydrophobe Wechselwirkung zwischen dem Träger und den im Wasser ge lösten Molekülen unerwünscht. Allgemein gilt dies in Fäl len, in denen eine eindeutige Wechselwirkung zwischen den funktionellen Gruppen des Trägers und der gelösten Ver bindung (z. B. bei der Ionenaustausch- und Affinitätschro matographie) gefordert wird, oder in denen Sorptionseffek te überhaupt unterdrückt werden sollen, wie dies bei der Gelchromatographie der Fall ist. Die innere Oberfläche des makroporösen Copolymerisats muß dann durch chemische Umsetzung von Hydroxylgruppen hydrophilisiert werden. Die stärkste Hydrophilisierung kann man durch Substitution von Hydroxylgruppen durch ionogene funktionelle Gruppen, z. B. durch die Verfahren nach CS 1 71 962 A, CS 1 71 963 A, CS 1 77 507 A, GB 15 00 532 A oder GB 14 99 134 A erreichen.

In manchen Fällen ist jedoch auch die Gegenwart ionogener funktioneller Gruppen im Träger unerwünscht. Dann können die Copolymerisate von Hydroxyalkylacrylaten und Hydroxy alkylmethacrylaten durch hoch hydrophile neutrale Saccha ridmoleküle modifiziert werden.

In einigen Fällen stört bei den zu weiteren chemischen Umwandlungen bestimmten Trägern der niedrige Gehalt an umwandlungsfähigen Hydroxylgruppen, was sich dadurch äußert, daß das Endprodukt eine zu niedrige Kapazität aufweist. Dies kommt besonders in solchen Fällen vor, wo eine hohe mechanische Stabilität des Trägers gefordert wird (z. B. bei mikropartikulären Sorbentien und bei der Flüssigkeitschromatographie), und wo demgemäß Copolymeri sate mit einem hohen Gehalt an Vernetzungsmittel, das überhaupt keine Hydroxylgruppen enthält, ausgewählt werden müssen. In diesen Fällen läßt sich durch Substitution von Hydroxylgruppen durch Saccharidmoleküle die Forderung nach höherer Kapazität bei polymeranalogen Umsetzungen erfül len. Nicht zuletzt eignet sich dann das chemisch gebundene Saccharid sowohl als solches als auch in Form von Deriva ten für eine Reihe von polymeranalogen Reaktionen, in denen das glycosylierte Polymerisat die reaktive Komponen te darstellt. Einen weiteren Vorteil des Trägers, der chemisch gebundene Saccharide enthält, stellt die Regene rierbarkeit des Trägers dar, weil durch hydrophile Spaltung unter drastischen Bedingungen der ursprüngliche Träger wieder erhältlich ist, der dann seinerseits wieder modifiziert werden kann.

Die wichtigsten bisher verwendeten Träger sind modifizier te natürliche Polysaccharide, Glucoproteine, die an ver schiedenen Trägern gebunden sind, sowie schließlich Zucker und ihre Derivate, die durch kovalente Bindung an ver schiedenen Matrices gebunden sind.

Aus der ersten Gruppe haben sich besonders die kommerziell zugänglichen Polysaccharide in vernetzter Form bewährt. Hierzu gehören vor allem die mit Epichlorhydrin vernetzten Dextrane, Agarose-Gele, vernetztes Gummiarabicum, Chitin und dergleichen. Glycoproteine liegen zumeist in löslicher Form vor und müssen zur Verwendung bei der Affinitätschro matographie an einem natürlichen oder synthetischen Träger gebunden werden.

Bei der dritten Gruppe von Sorbentien werden die Mono saccharide und Oligosaccharide am häufigsten in Form eines reaktiven Aminoderivats entweder direkt oder indirekt über ein Zwischenglied an den Polysaccharidträger gebunden. Ein anderes Verfahren nützt die reaktiven funktionellen Gruppen des Trägers oder das reaktive Zwischenglied, z. B. Divinylsulfon, aus.

Einen bedeutsamen Fortschritt stellt die Einführung der Acrylamidträger dar, die auf dreierlei Weise hergestellt werden: Durch Modifizierung kommerzieller Präparate, durch Synthese von Gelen mit einpolymerisierten aktiven Ester gruppen, die zur Reaktion mit Aminozuckern befähigt sind, oder durch Copolymerisation von ω-ungesättigten aliphati schen Glycosiden mit Acrylamid.

Die große Auswahl verschiedener Trägertypen deutet bereits darauf hin, daß nur wenige von ihnen ideale Eigenschaften besitzen. Zu den am einfachsten zugänglichen gehören modi fizierte natürliche Polysaccharide; hierbei gibt es nur eine kleine Auswahl, auch sind diese Produkte gegenüber der Einwirkung von Mikroorganismen wenig beständig. Nach teilig ist auch die Tatsache, daß einige von ihnen unter Erhaltung einer befriedigenden mechanischen Stabilität nicht mit ausreichender Porosität hergestellt werden kön nen. Die breitere Verwendung von auf Trägern gebundenen Glycoproteinen wird andererseits durch die komplizierte und kostspielige Herstellung der Materialien für die Affi nitätschromatographie ebenso wie ihre geringe chemische Beständigkeit verhindert.

Acrylamidgele weisen einige der angeführten Nachteile nicht auf, sind gegenüber der Einwirkung von Chemikalien und Mikroorganismen beträchtlich beständiger und erlauben eine wiederholte Verwendung.

Alle angeführten Materialien werden jedoch in Form von weichen, homogen vernetzten Teilchen hergestellt, die in wässerigen Lösungsmitteln beträchtlich quellen und ihre Dimensionen bei Änderung des pH-Wertes oder der Ionenstär ke der Lösung beträchtlich ändern. Sie erlauben auch kei nen Einsatz unter höheren Drucken und bei höheren Durchflußgeschwindigkeiten. Sie sind ferner aus kineti schen Gründen im Hinblick auf die Diffusion bei der Her stellung von Komplexen für die Affinitätschromatographie und ihre Dissoziation nicht besonders geeignet.

Aus DE 25 18 352 A sind Sorbentien zur Affinitätschromato graphie von Proteinen und insbesondere Proteasen bekannt, die aus einem hydrophilen, makroporösen Copolymerisat von Hydroxyalkylacrylaten oder Hydroxyalkylmethacrylaten mit vernetzenden Acrylat- oder Methacrylat-Comonomeren be stehen und als Liganden über Spacer gebundene D-Amino Säuren oder eine oder mehrere D-Aminosäureeinheiten ent haltende Peptide aufweisen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur chromatographischen Isolierung von biologisch aktiven oder physiologisch wirksamen Stoffen, die freie Bindungszentren für Saccharide enthalten und mit ihnen spezifische Komplexe bilden, anzugeben, bei denen als chromatographische Sorbentien hydrophile, makroporöse, dreidimensional vernetzte Copolymerisate eingesetzt wer den, die mit Dextranen, Agarose oder Cellulosederivaten vergleich bare Wechselwirkungseigenschaften besitzen, hohe chemische Beständigkeit und geringe Quellung in wässerigen Systemen aufweisen und bei Änderung des pH-Werts und der Ionenstärke ihre Teilchengröße praktisch nicht ändern und zugleich einfach herstellbar sind.

Die Aufgabe wird gemäß den kennzeichnenden Merkmalen von Anspruch 1 gelöst. Die Unteransprü che betreffen vorteilhafte Ausführungsformen des erfin dungsgemäßen Verfahrens.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur chromatographischen Isolierung von biologisch aktiven oder physiologisch wirk samen Stoffen, die freie Bindungszentren für Saccharide enthalten und mit ihnen spezifische Komplexe bilden, beruht auf der Sorption an einem Sorbens und der Elution mit einem Lösungsmittel unter Gewinnung von Fraktionen mit den biologisch aktiven oder physiologisch wirksamen Stoffen und ist gekennzeichnet durch Verwendung von hydrophilen makro porösen, dreidimensional vernetzten Copolymerisaten aus einem Monomerengemisch von Hydroxyalkylacrylaten oder Hydroxyalkylmethacrylaten, die im Alkylteil 1 bis 4 C-Atome enthalten, mit 15 bis 60 Masse-%, bezogen auf das Monomerengemisch, unter Alkylenglycoldiacrylaten, Alkylenglycoldimethacrylaten, Polyglycoldiacrylaten, Polyglycoldimethacrylaten, Ethylen-bis(acrylamiden), Divinylbenzol, Divinyltoluol, Trivinylbenzol, Divinylnaphthalin, Divinylxylol, Divinylethylbenzol, Divinylether, Divinylketon und Allylacrylat ausgewählten Vernetzungsmitteln, die O-glycosidisch kovalent an ihre Oberfläche gebundene Monosaccharide, Oligosaccharide, Desoxyzucker, Aminozucker, acylierte Saccharide und/oder Ether- und/oder Halogenderivate von Monosacchariden und/oder Oligosacchariden aufweisen, als Sorbentien.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Copolymerisate selbst sowie ihre Herstellung sind Gegenstand des Patents 28 19 522.

Die eigentliche Polymerisation der Hydroxyalkylacrylate oder -methacrylate mit den Vernetzungsmitteln wird als radikalische Suspensionspolymerisation in wässerigem Milieu in Gegenwart von inerten organischen Verbindungen, deren Art und Konzentration die Porengrößenverteilung der Pro dukte beeinflussen, und in Gegenwart von Suspensionsstabi lisatoren durchgeführt.

Als inerte organische Verbindungen werden vorteilhaft Cyclohexanol, Benzylalkohol, Cyclohexylamin, Dodecylalko hol und/oder n-Octylalkohol verwendet. Als Suspensions stabilisatoren können z. B. Polyvinylpyrrolidon, Polyvinyl alkohol, teilweise hydrolysierte Polyvinylacetate oder einige polymere Naturstoffe, wie etwa Stärke und Pectine, dienen.

Durch die Suspensionspolymerisation entstehen sphärische Teilchen. In Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen (Dimension, Form und Drehzahl des Rührers, Konzentration des Suspensionsstabilisators etc.) können Teilchen mit erwünschter Teilchengrößenverteilung hergestellt werden.

Das Herstellungsverfahren der erfindungsgemäß verwendeten Copolymerisate beruht auf der Substitution von Hydroxyl gruppen durch Saccharidgruppen unter Entstehung O-glycosi discher Bindungen, die in einem inerten organischen Lö sungsmittel bei einer Temperatur von 20 bis 100° C unter Katalyse durch Chlorwasserstoff, Bortrifluorid oder deren Gemische durchgeführt wird.

Die eigentliche Umsetzung der Saccharide mit den makro porösen Copolymerisaten verläuft sehr glatt durch Ver mischen der Suspension des Trägers im inerten organischen Lösungsmittel (vorteilhaft Dioxan oder Tetrahydrofuran), das eine bestimmte Menge an Chlorwasserstoff, Bortrifluo rid oder deren Gemischen enthält. Die Lösungsmittel müssen trocken sein; auch der gasförmige Chlorwasserstoff oder das Bortrifluorid werden beim Einleiten getrocknet. Zu der Suspension wird fein gemahlenes trockenes Saccharid zuge geben und das Gemisch unter Rühren oder Schütteln bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur von 20 bis 100° C reagieren gelassen. Die Gegenwart von Wasser in den rea gierenden Komponenten verringert die Ausbeute der Bin dungsreaktion.

Die erfindungsgemäß eingesetzten modifizierten Copolymeri sate weisen gleichzeitig die hervorragenden mechanischen und hydrodynamischen Eigenschaften der dreidimensionalen Hydroxyalkylacrylat- und Hydroxyalkylmethacrylat-Copoly merisate und gute Hydrophilie sowie günstige, mit Dextra nen, Agarose oder Cellulosematerialien vergleichbare Wech selwirkungseigenschaften auf, die im Rahmen der Erfindung insbesondere in der Biologie und Biochemie vorteilhaft ausgenutzt werden können.

Die erfindungsgemäß verwendeten Copolymerisate weisen hohe mechanische Festigkeit und Druckbeständigkeit auf, sind gegenüber saurer und alkalischer Hydrolyse sowie Oxidation relativ beständig und weisen ferner Beständigkeit gegen über organischen Lösungsmitteln auf. In wässerigen Lösungen quellen die Copolymerisate nur sehr wenig, und die Teil chen ändern ihre Größe bei Änderung der Ionenstärke und des pH-Wertes nicht.

Ein besonderer Vorteil des Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemäß herangezogenen Glycosylderivate von Hy droxyalkylacrylat- und Hydroxyalkylmethacrylat-Copolymeri saten liegt in seiner Einfachheit und erheblich höheren Geschwindigkeit gegenüber bisher zur Herstellung analoger Sorbentien verwendeten Verfahren. Die milden Bedingungen, unter denen diese Copolymerisate erhältlich sind, die leichte Zugänglichkeit der Reaktionskomponenten, die Be ständigkeit der Matrix gegenüber Mikroorganismen sowie die einfache Handhabung und Aufbewahrung stellen weitere Vor teile dar.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist breit anwendbar, insbe sondere zur Trennung von Biopolymeren und ihren Fragmenten oder zur Isolierung von physiologisch oder biokatalytisch wirksamen Stoffen.

Aktive Stoffe werden aus Gemischen mit nicht aktiven Begleit substanzen an den Copolymerisaten selektiv adsorbiert; aus den gebildeten Komplexen können danach durch Verdrängung mit Haptenen oder durch Elution mit geeigneten Puffern die aktiven Substanzen wieder freigesetzt werden.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen erläutert, wobei sich die Herstellungsbeispiele 1 bis 9 auf die Herstellung der saccharidmodifizierten Copolymeri sate beziehen, die Gegenstand des Patents 28 19 522 ist.

Herstellungsbeispiel 1

5 g eines Copolymerisats von Hydroxyalkylmethacrylat mit Ethylenglycoldimethacrylat (39 Masse-%), das durch Suspen sionspolymerisation in wässerigem Milieu in Gegenwart eines inerten Lösungsmittelsystems, das aus Cyclohexanol und Laurylalkohol (9 : 1) bestand, hergestellt war und eine einer mittleren Molekülmasse von 300 000 entsprechende Ausschlußgrenze besaß, wurden in einem 500 ml-Kolben in 70 ml Dioxan mit einem Gehalt von 17,5 Masse-% Chlorwasser stoff bei Raumtemperatur 7 h gequollen. Danach wurde das Gemisch kurz unter Vakuum gesetzt. Zu der Suspension wurden dann 3 g wasserfreie, fein zerriebene D-Glucose zugegeben, worauf das Ganze bei Raumtemperatur 14 h ge schüttelt wurde. Danach wurde die Reaktion durch Eingießen des Reaktionsgemischs in 1 l entionisiertes Wasser been det. Das Zuckerderivat des Gels wurde sofort auf einer Glasfritte abgesaugt und mit entionisiertem Wasser bis zur neutralen Reaktion und zur negativen Reaktion auf Zucker gewaschen. Schließlich wurde das glycosylierte Gel mit Ethanol, Aceton und Ether gewaschen und bei 30° C im Vakuum bis zur Massenkonstanz getrocknet. Der Gehalt an gebundenem Zucker betrug 13,5 Masse-%.

Herstellungsbeispiel 2

4,2 g eines Copolymerisats von Hydroxyalkylmethacrylat wurden auf ähnliche Weise wie in Herstellungsbeispiel 1 in 70 ml Dioxan, in das bis zu einem Gehalt von 5 Masse-% gasförmiger Chlorwasserstoff eingeleitet worden war, ge quollen. Danach wurden 1,02 g D-Glucose zugegeben, worauf die Suspension bei 45° C 10 h geschüttelt wurde. An schließend wurde sie in 1 l entionisiertes Wasser einge gossen und wie in Herstellungsbeispiel 1 weiterverarbei tet. Der Gehalt an gebundenem Zucker betrug 6,42 Masse-%.

Herstellungsbeispiel 3

3,5 g eines Copolymerisats aus 2-Hydroxymethylmethacrylat und Ethylenglycoldiacrylat mit einer einer mittleren Mole külmasse von 300 000 entsprechenden Ausschlußgrenze wurden in 60 ml wasserfreies Dioxan, das 6 Masse-% Chlorwasser stoff enthielt, 12 h gequollen. Nach Zusatz von 1,3 g N- Acetyl-D-glucosamin wurde das Gemisch bei einer Temperatur von 35° C 10 h geschüttelt. Die Suspension wurde in 1 l entionisiertes Wasser eingegossen und wie in Herstellungs beispiel 1 weiterverarbeitet. Der Gehalt an gebundenem Aminozucker betrug 8,15 Masse-%.

Herstellungsbeispiel 4

5 g eines Copolymerisats aus 2-Hydroxyethylacrylat und Ethylenglycoldimethacrylat mit einer einer mittleren Mole külmasse von 250 000 entsprechenden Ausschlußgrenze wurden in 70 ml Dioxan, das 7 Masse-% Bortrifluorid enthielt, bei Raumtemperatur 12 h gequollen. Zu der Reaktionssuspension wurden 3 g wasserfreie D-Glucose zugegeben; danach wurde das Reaktionsgemisch bei 50° C 8,5 h geschüttelt. Die Reaktion wurde durch Eingießen des Gemischs in 1 l ent ionisiertes Wasser beendet. Die weitere Verarbeitung wurde wie in Herstellungsbeispiel 1 vorgenommen. Der Gehalt an gebundenem Zucker betrug 12,4 Masse-%.

Herstellungsbeispiel 5

Es wurde wie in Herstellungsbeispiel 1 verfahren mit dem Unterschied, daß die Reaktionstemperatur bei einem Gehalt an Chlorwasserstoff im Dioxan von 6 Masse-% auf 70° C erhöht wurde. Der resultierende Gehalt an kovalent gebun dener D-Glucose betrug 6,25 Masse-%.

Herstellungsbeispiel 6

5 g eines Copolymerisats von 2-Hydroxyethylmethacrylat mit Ethylenglycoldimethacrylat mit einer einer mittleren Mole külmasse von 300 000 entsprechenden Ausschlußgrenze wurden mit 66 ml Dioxan vermischt, worauf Chlorwasserstoff bis zu einer Konzentration von 3,4 Masse-% und Bortrifluorid bis zu einem Gehalt von 3,3 Masse-% eingeleitet wurden. Danach wurde die Suspension bei Raumtemperatur unter periodischem Schütteln 6,6 h gequollen. Anschließend wurden 3 g wasser freie und fein zerriebene D-Glucose zugefügt und das Ge misch bei 35° C 1 h geschüttelt. Danach wurde das Reak tionsgemisch unter ständigem Schütteln 12 h bei Raumtempe ratur belassen. Die Reaktion wurde dann durch Eingießen des Reaktionsgemischs in 1 l entionisiertes Wasser been det; die Weiterverarbeitung des Copolymerisats geschah wie in Herstellungsbeispiel 1. Der Zuckergehalt betrug 17,6 Masse-%.

Herstellungsbeispiel 7

Es wurde ein Disaccharid auf analoge Weise wie in Herstel lungsbeispiel 1 mit dem Unterschied gebunden, daß zur Reaktion 3,26 g fein zerriebene Maltose verwendet und das Reaktionsgemisch bei 40° C 10 h auf einer Laborschüttel maschine geschüttelt wurde. Das Gel mit dem daran gebunde nen Disaccharid wurde wie in Herstellungsbeispiel 1 wei terverarbeitet. Der Gehalt an gebundener Maltose betrug 9,7 Masse-%.

Herstellungsbeispiel 8

Es wurde wie in Herstellungsbeispiel 6 verfahren mit dem Unterschied, daß anstelle von D-Glucose 6-O-Methylglucose verwendet wurde. Der resultierende Gehalt an gebundenem Etherderivat der Glucose betrug 15,2 Masse-%.

Herstellungsbeispiel 9

Die Herstellung eines Copolymerisats mit einem gebundenen Halogenderivat eines Saccharids wurde analog Herstellungs beispiel 6 mit dem Unterschied durchgeführt, daß zur Reak tion 3 g 6-Fluorglucose verwendet wurden. Die Verarbeitung des resultierenden Produkts geschah wie in Herstellungs beispiel 6. Der Gehalt an gebundener 6-Fluorglucose betrug 14,78 Masse-%.

Erfindungsgemäße Beispiele: Beispiel 1

400 mg Lyophilisat der aktiven Fraktion von Proteinen aus Sojasamen wurden in 4 ml Wasser gelöst. Ungelöste Reste wurden abzentrifugiert; dem Überstand wurde Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 0,9% zugegeben. Auf eine Spule mit einem Copolymerisat aus 2-Hydroxyethylmethacry lat und Ethylenglycoldimethacrylat (Ausschlußgrenze ent sprechend einer mittleren Molekülmasse M_{w lim} = 300 000) mit 7,66 Masse-% daran gebundener D-Galactose (Trägermasse in trockenem Zustand 4 g), das mit physiologischer Lösung äquilibriert worden war, wurde die Lösung von 4 ml der aktiven Proteinfraktion (Titer der 1%-igen Lösung gegen über trypsinisierten Erythrocyten der Gruppe A₁: 64 aufge geben. Nach dem Einsickern der Probe wurde die Säule mit physiologischer Lösung bei einem Durchsatz von 8 ml/h eluiert, wobei jeweils 4-ml-Fraktionen abgenommen wurden. Das Eluat in den Fraktionen 3 bis 5 war hämagglutinations aktiv. Ab Fraktion 20 wurde die Elution mit einer 0,2 M Lösung von D-Galactose in physiologischer Lösung weiter geführt. Die Fraktionen 22 bis 24 wurden vereinigt, 48 h 4 Mal gegen je 2 l Wasser dialysiert und lyophilisiert. Ausbeute: 6,2 mg; Titer der 1%-igen Lösung: 4096.

Beispiel 2

Auf eine Säule (1 × 30 cm) mit 4 g eines Copolymerisats aus 2-Hydroxyethylacrylat und Ethylenglycoldimethacrylat (M_{w lim} = 300 000) mit 8,25 Masse-% kovalent gebundener D- Glucose, das mit physiologischer Lösung äquilibriert worden war, wurde eine Lösung von 200 mg der aktiven Proteine aus Linsensamen (Titer der 1%-igen Lösung: 64) in 2 ml physiologischer Lösung aufgegeben. Nach dem Einsickern der Lösung wurde die Säule mit physiologischer Lösung bei einem Durchsatz von 8 ml/h eluiert, wobei jeweils 4-ml-Fraktio nen abgenommen wurden. Das Eluat in den Fraktionen 3 bis 5 war hämagglutinationsaktiv. Ab Fraktion 25 wurde die Elu tion mit einer 0,2 M Lösung von D-Glucose in physiologi scher Lösung weitergeführt. Die Fraktionen 28 bis 30 wurden vereinigt, 48 h 4 Mal gegen je 2 l Wasser dialy siert und lyophilisiert.
Ausbeute: 5,8 mg; Titer der 1 %-igen Lösung: 256.

Beispiel 3

Auf eine Säule (1 × 30 cm), die 4 g eines Copolymerisats aus 2-Hydroxyethylacrylat und Ethylenglycoldiacrylat (M_{w lim} = 500 000) mit 9,0 Masse-% kovalent gebundener Mannose enthielt, das durch physiologische Lösung äquili briert worden war, wurde eine Lösung von 250 mg der akti ven Proteinfraktion aus Linsensamen (Titer der 1%-igen Lösung: 64) in 2,5 ml physiologischer Lösung aufgegeben. Nach dem Einsickern der Probe wurde die Säule mit physio logischer Lösung bei einem Durchsatz von 8 ml/h eluiert, wobei jeweils 4-ml-Fraktionen abgenommen wurden. Das Eluat in den Fraktionen 3 bis 5 war hämagglutinationsaktiv. Ab Fraktion 28 wurde die Elution mit einer 0,2 M Lösung von D-Mannose in physiologischer Lösung weitergeführt. Die Fraktionen 31 bis 35 wurden vereinigt, 48 h 4 Mal gegen je 3 l Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Ausbeute: ca. 1 mg.

Beispiel 4

Auf eine Säule (1 × 30 cm), die mit 4 g eines sphärischen, makroporösen Copolymerisats aus 2-Hydroxyethylmethacrylat und Ethylenglycoldimethacrylat (M_{w lim} = 10 000) mit 7,66 Masse-% chemisch gebundener D-Galactose gefüllt war, das mit physiologischer Lösung äquilibriert worden war, wurde eine Lösung von 300 mg eines lyophylisierten Ex trakts aus den Samen von Ricinus communis L. (Titer der 1%-igen Lösung: 8192) in 3 ml physiologischer Lösung aufgegeben. Nach dem Einsickern der Probe wurde die Säule mit physiologischer Lösung bei einem Durchsatz von 8 ml/h eluiert, wobei jeweils 4-ml-Fraktionen abgenommen wurden. Das Eluat der Fraktion 3 war hämagglutinationsaktiv. Ab Fraktion 21 wurde die Elution mit einer 0,2 M Lösung von D-Galactose in physiologischer Lösung weitergeführt. Die Fraktionen 24 bis 28 wurden vereinigt, 48 h 4 Mal gegen je 3 l Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Ausbeute: 77,2 mg; Titer der 1%-igen Lösung: 32 768.

Beispiel 5

Auf eine Säule (1 × 30 cm), die 4 g eines sphärischen, makroporösen Copolymerisats aus 2-Hydroxyethylmethacrylat und Ethylenglycoldimethacrylat (M_{w lim} = 300 000) mit 5,42 Masse-% L-Fucose enthielt, das mit 0,15 M Phosphatpuffer von pH 7,9 äquilibriert worden war, wurde eine Lösung von 700 mg der hämagglutinationsaktiven Proteinfraktion aus den Samen von Upex europaeus L. in 6 ml des gleichen Puffers aufgegeben. Nach dem Einsickern der Probe wurde die Säule mit dem gleichen Puffer bei einem Durchsatz von 15 ml/h eluiert, wobei jeweils 5-ml-Fraktionen gesammelt wurden. Ab Fraktion 40 wurde die Elution mit 50 ml einer 0,2 M Lösung von L-Fucose im verwendeten Puffer weiterge führt. Nach dem Einsickern der Lösung von L-Fucose wurde die weitere Elution mit Phosphatpuffer bei unverändertem Durchsatz vorgenommen. Die Fraktionen 43 bis 48 wurden vereinigt, 48 h 4 Mal gegen je 5 l Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Ausbeute: 7,1 mg.

Beispiel 6

Auf eine Säule (1 × 20 cm), die 3,1 g eines sphärischen, makroporösen Copolymerisats aus 2-Hydroxyethylmethacrylat und Ethylenglycoldimethacrylat mit 8,15 Masse-% kovalent gebundenem N-Acetyl-D-glucosamin enthielt, das mit physio logischer Lösung äquilibriert worden war, wurden 5 ml eines hämagglutinationsaktiven Extrakts aus 1,5 g Albumin drüsen der Weinbergschnecke aufgegeben. Nach dem Ein sickern der Probe wurde die Säule mit physiologischer Lösung bei einem Durchsatz von 8 ml/h eluiert, wobei jeweils 4-ml-Fraktionen abgenommen wurden. Das Eluat war in keiner Fraktion hämagglutinationsaktiv. Ab Fraktion 23 wurde die Elution mit einer 0,2 M Lösung von N-Acetyl-D- glucosamin in physiologischer Lösung weitergeführt. Ab Fraktion 38 wurde die Elution mit Glycinpuffer von pH 2,7 durchgeführt. Die Fraktionen 26 bis 28 wurden vereinigt, 48 h 4 Mal gegen je 3 l Wasser dialysiert und lyophili siert.
Ausbeute: 16,3 mg; Titer der 1%-igen Lösung: 32 768.

Beispiel 7

Auf eine Säule (1 × 30 cm), die 4 g eines makroporösen Copolymerisats aus 2-Hydroxyethylmethacrylat und Ethylen glycoldimethacrylat mit 8 Masse-% daran kovalent gebunde ner D-Glucose enthielt, das mit physiologischer Lösung äquilibriert worden war, wurden 20 ml hämagglutinations aktiver Extrakt aus den Samen von Canavalia ensiformis D. C. (Titer der 1%-igen Lösung gegenüber trypsinisierten Blutkörperchen: 512) aufgegeben. Nach dem Einsickern der Probe wurde die Säule mit physiologischer Lösung bei einem Durchsatz von 8 ml/h eluiert, wobei jeweils 4-ml-Fraktio nen abgenommen wurden. Das Eluat in den Fraktionen 3 bis 6 war hämagglutinationsaktiv. Ab Fraktion 21 wurde die Elu tion mit einer 0,2 M Lösung von D-Glucose in physiologi scher Lösung weitergeführt. Die Fraktionen 23 bis 27 wurden vereinigt, 48 h 4 Mal gegen je 3 l Wasser dialy siert und lyophilisiert.

Beispiel 8

Auf eine Säule (1 × 30 cm), die 4 g eines makroporösen Copolymerisats aus 2-Hydroxyethylmethacrylat und Ethylen glycoldimethacrylat mit 8,25 Masse-% daran gebundener D- Glucose enthielt, das mit physiologischer Lösung äquili briert worden war, wurden 50 mg Concanavalin A, das aus den Samen von Canavalia ensiformis D. C. (Titer der 1%-igen Lösung: 512) isoliert worden war, aufgegeben. Das Volumen der Probe betrug 2 ml. Nach dem Einsickern der Probe wurde die Säule mit physiologischer Lösung bei einem Durchsatz von 8 ml/h eluiert, wobei jeweils 4-ml-Fraktio nen abgenommen wurden. Das Eluat war in keiner der Frak tionen hämagglutinationsaktiv. Ab Fraktion 17 wurde die Elution mit einer 0,2 M Lösung von D-Glucose in physiolo gischer Lösung fortgesetzt. Ab Fraktion 28 wurde die Elu tion mit einem Glycinpuffer von pH 2,7 durchgeführt. Die Fraktionen 19 bis 22 wurden vereinigt, 48 h 4 Mal gegen je 3 l Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Ausbeute: 46,9 mg; Titer der 1%-igen Lösung gegenüber trypsinisierten Blutkörperchen: 512.

Beispiel 9

4,2 g eines Copolymerisats aus Hydroxyethylmethacrylat und Ethylenglycoldimethacrylat (M_{w lim} = 300 000) wurden 12 h in 70 ml Dioxan mit 6 Masse-% HCl gequollen. Danach wurden 1,046 g N-Acetyl-D-galactosamin zugegeben, worauf die Suspension bei Raumtemperatur 6 h und anschließend bei 40° C 6 h geschüttelt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde in 1 l entionisiertes Wasser eingegossen und bis zur neutra len Reaktion und zur negativen Reaktion auf Zucker ge waschen. Das Copolymerisat wurde dann mit Ethanol, Aceton und Ether gewaschen und im Vakuum bei 50° C bis zur Mas senkonstanz getrocknet. Eine Säule (1 × 30 cm), die 4 g des obigen Derivats mit daran gebundenem N-Acetyl-D-galac tosamin enthielt, wurde in physiologischer Lösung äquili briert. Auf die Säule wurde eine Lösung von 228,6 mg der hämagglutinationsaktiven Proteinfraktion aus den Samen von Dolichos biflorus L. in 3 ml physiologischer Lösung aufge geben. Nach dem Einsickern der Lösung wurde die Säule mit physiologischer Lösung bei einem Durchsatz von 10 ml/h eluiert, wobei jeweils 5-ml-Fraktionen abgenommen wurden. Nach der Abnahme von 155 ml Eluat wurde das affinitäts gebundene Protein mit einer 0,2 M Lösung von N-Acetyl-D- galactosamin (5 ml) eluiert, worauf die Elution mit phy siologischer Lösung fortgesetzt wurde. Die einzelnen Frak tionen wurden UV-spektrometrisch bei einer Wellenlänge von 280 nm vermessen. Die proteinhaltigen Fraktionen wurden vereinigt (Gesamtvolumen 15 ml), 4 Mal gegen je 2 l Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Ausbeute: 17,4 mg; Titer des resultierenden Produkts ge genüber Erythrocyten der Blutgruppe A₁: 4096 (Titer der ursprünglichen Probe: 128).

Beispiel 10

Auf eine Säule (1 × 30 cm), die 4 g eines makroporösen Copolymerisats aus 2-Hydroxyethylacrylat und Ethylengly coldiacrylat mit 14,16 Masse-% daran kovalent gebundener D-Galactose enthielt, das mit physiologischer Lösung äqui libriert worden war, wurde eine Lösung von 562,7 mg eines lyophilisierten Extrakts aus den Samen von Ricinus commu nis L. in 6 ml physiologischer Lösung aufgegeben. Nach dem Einsickern der Probe wurde die Säule mit physiologischer Lösung bei einem Durchsatz von 8 ml/h eluiert, wobei jeweils 4-ml-Fraktionen abgenommen wurden. Das Eluat der Fraktionen 3 bis 8 war hämagglutinationsaktiv. Auch die bei 280 nm gemessene Absorption war in diesen Fraktionen maximal. Nach Durchspülen der Säule mit 200 ml physiologi scher Lösung wurde der Träger mit einer 0,2 M Lösung von D-Galactose in physiologischer Lösung eluiert. Die pro teinhaltigen Fraktionen wurden vereinigt (insgesamt 40 ml) und 4 Mal gegen je 4 l Wasser 48 h dialysiert, worauf das Produkt lyophilisiert wurde.
Ausbeute: 159,8 mg.
Aktivität der 1%-igen Lösung gegenüber Erythrocyten der Gruppe A₁:
Sulfatfraktion vor der Isolierung: 4096;
reine Proteinfraktion nach der Isolierung: 16 384.

Die Reinheit des Präparats wurde durch diskontinuierliche alkalische Elektrophorese auf Polyacrylamidgel kontrol liert.

Beispiel 11

300 mg einer Proteinfraktion aus den Samen von Ricinus communis L. wurden in 20 ml physiologischer Lösung gelöst. Die Lösung wurde gegen Erythrocyten der Gruppe A₁ ti triert. Aktivität bis zur 12. Fraktion (Titer): 4096. Dann wurden 4 g des Copolymerisats von Beispiel 1 mit daran gebundener D-Galactose zugegeben; danach wurde die Aktivi tätsabnahme in Abhängigkeit von der Zeit verfolgt. Nach 8 Stunden hatte sich die Aktivität stabilisiert. Das Sorbens wurde abfiltriert und mit physiologischer Lösung gewa schen. Die gesamte Menge des Sorbens wurde in eine Säule gebracht und mit physiologischer Lösung bis zum Verschwin den der Aktivität und Abnahme der Absorption auf den ursprünglichen Wert der physiologischen Lösung gewaschen. Danach wurde das gebundene Protein mit einer 0,2 M Lösung von D-Galactose in physiologischer Lösung gewaschen. Die proteinhaltigen Fraktionen wurden vereinigt und 48 h 4 Mal gegen je 4 l entionisiertes Wasser dialysiert und lyophi lisiert.
Ausbeute: 238,4 mg, entsprechend einer Kapazität von 59,6 mg pro g trockenes Copolymerisat mit daran gebundener D- Galactose.

Beispiel 12

Die Isolierung wurde analog Beispiel 11 mit dem Unter schied durchgeführt, daß die eingesetzte Proteinmenge 184,4 g in 20 ml physiologischer Lösung betrug und als Sorbens ein Copolymerisat mit 13,08 Maase-% gebundener D-Glucose (3,05 g) diente. Die erzielte Ausbeute von 149,6 mg reinem Protein entspricht einer Kapazität von 49,4 mg/g trockenem Sorbens.

Claims

1. Verfahren zur chromatographischen Isolierung von bio logisch aktiven oder physiologisch wirksamen Stoffen, die freie Bindungszentren für Saccharide enthalten und mit ihnen spezifische Komplexe bilden, durch
Sorption an einem Sorbens
und
Elution mit einem Lösungsmittel unter Gewinnung von Fraktionen mit den biologisch aktiven oder physiolo gisch wirksamen Stoffen, gekennzeichnet durch Verwendung von hydrophilen makroporösen, dreidimensional vernetzten Copolymerisaten aus einem Monomerengemisch von Hydroxy alkylacrylaten oder Hydroxyalkylmethacrylaten, die im Alkylteil 1 bis 4 C-Atome enthalten, mit 15 bis 60 Mas se-%, bezogen auf das Monomerengemisch, unter Alkylenglycoldiacrylaten, Alkylenglycoldimethacrylaten, Polyglycoldiacrylaten, Polyglycoldimethacrylaten, Ethy len-bis(acrylamiden), Divinylbenzol, Divinyltoluol, Trivinylbenzol, Divinylnaphthalin, Divinylxylol, Di vinylethylbenzol, Divinylether, Divinylketon und Allyl acrylat ausgewählten Vernetzungsmitteln, die O-glycosi disch kovalent an ihre Oberfläche gebundene Monosaccha ride, Oligosaccharide, Desoxyzucker, Aminozucker, acy lierte Saccharide und/oder Ether- und/oder Halogenderi vate von Monosacchariden und/oder Oligosacchariden auf weisen,
als Sorbentien.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die als Sorbentien verwendeten Copolymerisate durch ra dikalisch initiierte Suspensionspolymerisation in wäß rigem Medium hergestellt sind und in Form sphärischer Teilchen vorliegen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächenmodifizierung der als Sorbentien verwendeten Copolymerisate in Suspen sion in einem inerten organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 20 bis 100° C unter Katalyse mit HCl und/oder BF₃ mit Monosacchariden, Oligosacchariden, Desoxyzuckern, Aminozuckern, acylierten Sacchariden und/oder Ether- und/oder Halogenderivaten von Mono sacchariden und/oder Oligosacchariden durchgeführt wurde.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch Isolierung von hämagglutinationswirksamen Proteinfrak tionen nach Äquilibrierung des Sorbens mit physiologi scher Lösung oder mit Pufferlösungen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekenn zeichnet durch Elution unter Verdrängung mit Haptenen.