CH637146A5 - Hydrophile, makroporoese, dreidimensionale beladene mischpolymerisate. - Google Patents

Hydrophile, makroporoese, dreidimensionale beladene mischpolymerisate. Download PDF

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CH637146A5
CH637146A5 CH485878A CH485878A CH637146A5 CH 637146 A5 CH637146 A5 CH 637146A5 CH 485878 A CH485878 A CH 485878A CH 485878 A CH485878 A CH 485878A CH 637146 A5 CH637146 A5 CH 637146A5
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Description

Die Erfindung betrifft hydrophile, makroporöse, dreidimensionale Mischpolymerisate von Hydroxyalkylmethacry-laten bzw. Hydroxyalkylacrylaten mit vernetzenden Como-nomeren, welche kovalent gebundene Saccharide oder Saccharid-Derivate enthalten, ein Herstellungsverfahren derselben sowie deren Verwendung.
Hydrophile, makroporöse Mischpolymerisate von Hydro-xylalkylmethacrylaten und Hydroxyalkylacrylaten mit Alky-lendimethacrylaten oder Alkylendiacrylaten, welche durch Mischpolymerisation in Suspension von Monomeren in Gegenwart von inerten organischen Verbindungen in wäss-rigem oder organischem Dispersionsmilieu hergestellt werden, sind aus dem tschechoslow. Urheberschein Nr. 150 819, der dem britischen Patent Nr. 1370 377 entspricht, und aus dem tschechoslow. Patent Nr. 148 828 bekannt. Ihre hervorragenden mechanischen Eigenschaften, sphärische Form der Teilchen und makroporöse Struktur, welche die Penetration von auch beträchtlich grossen Molekeln in die Poren des Trägers erlaubt, haben zu ausgedehnten Verwendungen dieser Materialien in der Gel-, Ionenaustausch-, Adsorption- und Affinitätschromatographie unter Verwendung von Wasser oder von wässrigen Lösungen als Eluie-rungsmittel geführt. Als sehr wichtig scheint die Verwendung von Hydroxylalkylmethacrylat- und Hydroxyalkylacrylat-mischpolymerisaten in der hydrophoben Chromatographie zu sein, welche die Wechselwirkung des lipophilen Teils der Moleküle von Verbindungen mit der verhältnismässig nichtpolaren Matrix des Trägers, dessen Hydrophilität durch Gegenwart von nicht ionogenen Hydroxylgruppen in Seitenketten der Mischpolymerisate verursacht wird, ausnützt.
Für einige Anwendungen ist aber diese mögliche hydrophobe Wechselwirkung zwischen dem Träger und den im Wasser gelösten Molekeln unerwünscht. Allgemein gilt dies in Fällen, wo eine eindeutige Wirkung zwischen den funktionellen Gruppen des Trägers und der gelösten Verbindung (die Ionenaustausch- und Affinitätschromatographie) gefordert ist oder wo man die Sorptionseffekte überhaupt unterdrückt, wie es bei der Gelchromatographie der Fall ist. Dann muss die innere Oberfläche des makroporösen Mischpolymerisats durch einen chemischen Umsatz von Hydroxylgruppen hydrophilisiert werden. Die stärkste Hydrophilisierung kann man durch Substitution von Hydroxylen durch die ionogenen funktionellen Gruppen, z.B. gemäss den Verfahren nach den tschechoslow. Urheberscheinen Nr. 171962, 171963,177 507 oder nach den britischen Patenten Nr. 1500 532 und 1499134 erreichen. In manchen Fällen ist aber auch die Gegenwart von ionogenen funktionellen Gruppen im Träger unerwünscht. Dann kann man die Mischpolymerisate von Hydroxyalkylmethacrylaten und Hydroxyalkylacrylaten durch hoch-hydrophile, neutrale Moleküle der Saccharide modifizieren.
In einigen Fällen stört der bei den zu weiteren chemischen Umwandlungen bestimmten Trägern niedrige Gehalt an umwandlungsfähigen Hydroxylgruppen, was sich durch zu niedrige Kapazität des Endproduktes äussert. Dies kommt besonders in jenen Fällen vor, wo hohe mechanische Stabilität des Trägers nötig ist (bei mikropartikularer Sorbention, in der hoch effektiven Flüssigkeitschromatographie), d.h., wo es also notwendig ist, Mischpolymerisate mit einem hohen Gehalt an Vernetzungsmittel, das überhaupt keine Hydroxylgruppen enthält, zu wählen. In diesen Fällen erbringt die Substitution von Hydroxylgruppen durch das Saccharidmo-lekül eine höhere Kapazität bei polymeranalogen Umwandlungen. Nicht zuletzt stellt dann das chemisch gebundene Saccharid sowohl in der Grundform als auch in der derivati-sierten Form den Ausgangspunkt für eine Reihe von polymeranalogen Reaktionen dar, in denen das glycosilierte Polymerisat die reaktive Komponente bedeutet. Als weiteren Vorteil des Trägers, welcher chemisch gebundene Saccharide enthält, kann man seine Regenerierbarkeit angeben, weil man durch eine hydrophilische Spaltung unter drastischen Bedingungen den ursprünglichen Träger gewinnen kann, der sich wieder modifizieren lässt.
Von den bisher verwendeten Trägern sind von grösster Bedeutung die modifizierten natürlichen Polysaccharide, Glucoproteine, welche zu verschiedenen Trägern gebunden sind, und schliesslich Zucker und ihre Derivate, welche durch kovalente Bindung an verschiedene Matrices gebunden sind.
Aus der ersten Gruppe haben sich besonders die kommerziell zugänglichen Polysaccharide in vernetzter Form bewährt. Es gehören hierher vor allem die mit Epichlorhy-drid vernetzten Polydextrane, Agarose-Gele, vernetzter arabischer Gummi, Chitin, usw. Glycoproteine kommen in der Mehrheit in löslicher Form vor und müssen zum Zwecke der Affinitätschromatographie auf natürlichen oder synthetischen Trägern gebunden werden. In der dritten Gruppe von Sorbentien werden die Monosaccharide und Oligosaccharide am häufigsten an den Polysaccharidträger in der Form eines reaktiven Aminoderivats entweder direkt oder durch Distanzstücke gebunden. Ein anderes Verfahren nützt die reaktiven funktionellen Gruppen des Trägers oder das reaktive Zwischenglied - das Divinylsulfon - aus. Zu einem bedeutsamen Fortschritt wurde die Einführung der Acryla-midträger, welche auf dreierlei Weise hergestellt werden: durch Modifikation kommerzieller Präparate, durch Synthese von Gelen mit einpolymerisierten Gruppen des aktiven Esters, welche mit den Aminozuckern reaktionsfähig sind, oder durch Mischpolymerisation von (B-ungesättigten aliphatischen Glycosiden mit Acrylamid.
Die grosse Anzahl von verschiedenen Typen von Trägern deutet daraufhin, dass nur wenige von ihnen ideale Eigenschaften besitzen. Zu den am einfachsten zugänglichen gehören modifizierte Naturpolysaccharide, aber sie kommen in kleiner Auswahl vor und sind gegenüber der Wirkung von Mikroorganismen wenig beständig.
Ein Nachteil ist auch die Tatsache, dass einige von ihnen nicht mit ausreichender Porosität unter Erhaltung befriedi-
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gender mechanischer Stabilität hergestellt werden können. Eine breitere Verwendung von den auf dem Träger gebundenen Glycoproteinen wird verhindert durch die komplizierte und kostspielige Herstellung der Materialien ebenso wie ihre ungenügende Zersetzungsbeständigkeit.
Manche der angeführten Nachteile treten bei den Acryl-amid-Gelen nicht auf. Sie sind gegenüber der Wirkung von Chemikalien und Mikroorganismen beträchtlich beständiger und erlauben eine wiederholte Verwendung.
Alle angeführten Materialien werden aber in Form von weichen, homogenen vernetzten Teilchen hergestellt, welche in wässrigen Lösungsmitteln beträchtlich quellen und bei Änderung von pH oder Ionenstärke der Lösung ihren Umfang beträchtlich ändern. Sie erlauben so nicht die Arbeit unter höheren Drücken und höheren Durchflussgeschwindigkeiten. Sie sind auch nicht gut geeignet hinsichtlich der Kinetik bei der Herstellung von Komplexen für die Affinitätschromatographie und deren Dissoziation.
Die erfindungsgemässen hydrophilen, makroporösen, dreidimensionalen Mischpolymerisate von Hydroxyalkylacrylaten oder Hydroxyalkylmethacrylaten, welche im Alkyl 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten und welche mit Vernetzungsmitteln aus der Gruppe von divinylischen oder polyvi-nylischen Monomeren erhalten werden, sind im vorangehenden Patentanspruch 1 charakterisiert.
Das Vernetzungsmittel wird vorteilhafterweise mindestens zu 15 Gew.-%. vorteilhaft 30 bis 60 Gew.-% auf das Monomergemisch bezogen - zugefügt.
Die eigentliche Polymerisation der Hydroxyalkylacrylate oder -methacrylate mit Vernetzungsmitteln wird als Radikal-Suspensionspolymerisation in wässrigem Milieu in Gegenwart von inerten organischen Verbindungen, deren Charakter und Konzentration die Porengrösseverteilung der gebundenen Produkte beeinflussen, und in Gegenwart von Stabilisatoren der Suspension, durchgeführt.
Als inerte organische Verbindungen werden mit Vorteil Cyclohexanol, Benzylalkohol, Cyclohexylamin, Dodecylal-kohol, n-Octylalkohol, gegebenenfalls ihre Gemische verwendet. Als Stabilisatoren der Suspension können z.B. Poly-vinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, teilweise hydrolysiertes Polyvinylacetat oder einige polymere Naturstoffe (Stärke, Pektine) dienen.
Durch die Suspensionspolymerisation entstehen sphärische Teilchen. In Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen (Dimension, Form, Umdrehungen des Rührers, Konzentration des Suspensionsstabilisators u.ä.) kann man die Teilchen mit erwünschter Teilchengrösseverteilung herstellen.
Das Herstellungsverfahren der erfindungsgemässen Materialien stellt die Substitution der Hydroxylgruppe durch das Saccharid unter Ausbildung der O-glycosidischen Bindung dar, welche in inertem organischem Lösungsmittel bei der Temperatur 20 bis 100°C unter Katalyse durch Chlorwasserstoff, Bortrifluorid oder ihre Gemische durchgeführt wird.
Der eigentliche Umsatz von Sacchariden mit den makroporösen Mischpolymerisaten verläuft glatt durch Vermischen der Suspension des Trägers in inertem organischem Lösungsmittel (vorteilhafterweise Dioxan oder Tetrahydrofuran), welches bestimmte Mengen von Chlorwasserstoff, Bortrifluorid oder ihren Gemischen enthält. Die Lösungsmittel müssen trocken sein. Auch der gasförmige Chlorwasserstoff oder das Bortrifluorid wird vor der Sättigung getrocknet. Zur Suspension wird fein gemahlenes trockenes Saccharid bzw. Saccharidderivat zugegeben, und das Gemisch lässt man unter Rühren oder Schütteln bei Raumtemperatur oder bei ■erhöhter Temperatur (20 bis 100°C) reagieren. Die Gegenwart von Wasser in reagierenden Komponenten erniedrigt die Ausbeute der Bindungsreaktion. Weil die Entstehung der
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O-glycosidischen Bindung und ihre Hydrolyse eine Gleichgewichtsreaktion darstellen, wurden die optimalen Arbeitsbedingungen für das Koppeln der maximalen Menge der Saccharide eingehend untersucht. Die Erhöhung der Reaktionstemperatur bis zu 60 bis 70°C erhöht den Umsatz mässig. Bei weiterer Temperaturerhöhung bis 100°C sinkt die Reaktionsausbeute. Einen grösseren Einfluss auf den Reaktionsumsatz übt die Konzentration des Katalysators (HCl oder BF3) aus. Diese wurde bis zu 70 Gew.-% verfolgt. Die besten Ergebnisse wurden mit einer Mischung von Katalysatoren erreicht, in der sich der Chlorwasserstoff durch eine vermutliche kokata-lytische Wirkung geltend macht. Dagegen hat die Katalyse von H3PO4, P2O5, H2SO4 und weiteren Säuren sich unter den angeführten Reaktionsbedingungen als unwirksam gezeigt.
Die Analyse des Gehaltes an gebundenem Saccharid wurde mittels der Hydrolyse nach Dubois durchgeführt.
Die nach dieser Erfindung hergestellten Stoffe stellen eine Kombination von hervorragenden mechanischen und hydrodynamischen Eigenschaften der dreidimensionalen Hydro-xyalkylacrylat- und Hydroxyalkylmethacrylat-Mischpo-lymerisate mit guter Hydrophilität und mit den geeigneten mit Polydextranen, Agarose oder Cellulosematerialien vergleichbaren Wechselwirkungseigenschaften dar, welche bisher besonders in der Biologie und Biochemie am verbrei-tetsten vorliegen.
Die Mischpolymerisate weisen hohe mechanische Stabilität und Druckbeständigkeit auf, sind sowohl gegenüber der sauren und alkalischen Hydrolyse und der Oxydation wie auch gegenüber dem Einfluss der organischen Lösungsmittel beständig. In wässrigen Lösungen quellen die Mischpolymerisate nur sehr wenig auf und die Teilchen ändern ihre Grösse bei Änderung von Ionenstärke und pH-Wert nicht.
Das Herstellungsverfahren ist technologisch nicht anspruchsvoll und liefert in einem breiten Bereich von Reaktionsbedingungen reproduzierbare Umsätze.
Die Lösungsmittel, in welchen die Reaktion verläuft, müssen den Chlorwasserstoff und das Bortrifluorid gut lösen und dürfen mit ihnen bei der Raumtemperatur oder wenig erhöhter Temperatur nicht reagieren. Es ist ferner erwünscht, dass die Lösungsmittel einen polaren Charakter aufweisen, welcher wenigstens ein partielles Auflösen der zur Bindung von auf Hydroxyalkylacrylate- oder Hydroxyalkylmethacry-latträger ausgewählten Sacchariden ermöglicht. Mit Vorteil verwendet man Dioxan und Tetrahydrofuran.
Der hauptsächliche Vorteil des Herstellungsverfahrens von Glycosylderivaten der Hydroxyalkylmethacrylat- und Hydroxyalkylacrylatmischpolymerisate liegt in seiner Einfachheit und Geschwindigkeit, welche die bisher für die Herstellung von vergleichbaren Sorbentien verwendeten Verfahren hoch übersteigt. Die milden Bedingungen, unter denen die Materialien nach dieser Erfindung hergestellt werden, die leichte Zugänglichkeit der Reaktionskomponenten, wie Beständigkeit der Matrix gegenüber den Mikroorganismen und die einfache Manipulation und Aufbewahrung, gehören zu ihren weiteren Vorteilen.
Die modifizierten Träger stellen den Ausgangspunkt zu einer neuen Reihe von chromatographischen Materialien mit sehr unterschiedlicher Verwendung dar. Sie sind besonders für Trennung von Biopolymeren und ihren Fragmenten oder für Bindung der für die Katalyse bestimmten biologisch aktiven Stoffe geeignet.
Die Mischpolymerisate kann man zum Beispiel als spezifische Sorbentien zur Isolation von physiologisch und bioka-talytisch wirksamen Stoffen verwenden, welche freie Bindungszentren für Saccharide enthalten und also mit ihnen spezifische Komplexe bilden. Aktive Stoffe werden aus Gemischen mit nicht aktiven Ballastbeimischungen auf dem erfindungsgemässen Mischpolymerisat selektiv adsorbiert
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und aus den gebildeten Komplexen werden durch Verdrängung mit Heptan oder durch Eluation mit einer geeigneten Pufferlösung freigemacht.
In den weiteren Ausführungen wird der Gegenstand der Erfindung anhand von Beispielen erläutert.
Beispiel 1
5 g Mischpolymerisat von Hydroxyalkylmethacrylat mit Äthylendimethacrylat (39 Gew.-%), welches durch Suspensionspolymerisation in wässrigem Milieu in Gegenwart von inertem Lösungsmittelsystem Cyclohexanol und Laurylal-kohol (9:1) hergestellt wurde, und eine obere Molmasse von 300 000 Dalton hatte, wurden in einem 500-ml-Reaktionskolben in 70 ml Dioxan mit Gehalt an 17,5 Gew.-% Chlorwasserstoff bei Raumtemperatur innerhalb von 7 Stunden gequollen. Danach wurde das Gemisch kurz evakuiert. Zu der Suspension wurden 3 g wasserfreie fein zerriebene D-Glucose zugegeben, und alles wurde bei Raumtemperatur innerhalb von 14 Stunden geschüttelt. Nach dieser Zeit wurde die Reaktion durch Eingiessen des Reaktionsgemisches in 11 deionisiertem Wasser beendet. Das Zuckerderivat des Gels wurde sofort auf der Glasfritte abgesaugt und mit deionisiertem Wasser bis zur neutralen Reaktion und zur negativen Reaktion auf Zucker durchgewaschen. Schliesslich wurde das glycosilierte Gel mit Äthanol, Aceton und Äther durchgewaschen und bei Temperatur von 50°C im Vakuum bis zu konstantem Gewicht ausgetrocknet. Der Gehalt an gebundenem Zucker betrug 13,5 Gew.-%.
Beispiel 2
4,2 g Mischpolymerisat von Hydroxyalkylmethacrylat wurden auf ähnliche Weise wie im Beispiel 1 in 70 ml Dioxan, das durch gasförmigen Chlorwasserstoff auf 5 Gew.-% gesättigt war, gequollen. Danach wurden 1,02 g D-Glucose zugegeben, und die Suspension wurde bei Temperatur von 45°C innerhalb von 10 Stunden geschüttelt. Anschliessend wurde sie in 11 deionisiertes Wasser eingegossen und weiter wie im Beispiel 1 verarbeitet. Der Gehalt an gebundenem Zucker betrug 6,42 Gew.-%.
Beispiel 3
3,5 g Mischpolymerisat aus 2-Hydroxyäthylmethacrylat und Äthylendiacrylat mit der oberen Molmasse von 300 000 Dalton wurden in 60 ml wasserfreies Dioxan, welches 6 Gew.-% Chlorwasserstoff enthielt, innerhalb von 12 Stunden gequollen. Danach wurden 1,3 g N-Acetyl-D-glucosamin zugegeben und das Gemisch wurde bei Temperatur von 35ÖC innerhalb von 10 Stunden geschüttelt. Die Suspension wurde in 11 deionisiertes Wasser eingegossen und weiter wie im Beispiel 1 verarbeitet. Der Gehalt an gebundenem Aminozucker betrug 8,15 Gew.-%.
Beispiel 4
5 g Mischpolymerisat aus 2-Hydroxyäthylacrylat und Äthylendimethacrylat mit der oberen Molmasse von 250 000 Dalton wurden in 70 ml Dioxan, welches mit Bortrifluorid auf 7 Gew.-% gesättigt wurde, bei Raumtemperatur innerhalb von 12 Stunden gequollen. Zu der Reaktionssuspension wurden 3 g wasserfreie D-Glucose zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde bei Temperatur von 50°C innerhalb von 8,5 Stunden geschüttelt.
Die Reaktion wurde durch Eingiessen des Gemisches in 11 deionisiertes Wasser beendet. Die weitere Verarbeitung wurde auf dieselbe Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt. Der Gehalt an gebundenem Zucker betrug 12,4 Gew.-%.
Beispiel 5
Die Reaktion wurde in analoger Weise wie im Beispiel 1
durchgeführt mit dem Unterschied, dass die Reaktionstemperatur auf 70°C bei Gehalt an Chlorwasserstoff im Dioxan von 6% erhöht wurde. Der resultierende Gehalt an kovalent gebundener D-Glucose betrug 6,25 Gew.-%.
Beispiel 6
5 g Mischpolymerisat des 2-Hydroxyäthylmethacrylats mit Äthylendimethacrylat mit oberer Molmasse von 300 000 Dalton wurden 66 ml Dioxan vermischt und mit Chlorwasserstoff auf die Konzentration von 3,4 Gew.-% und mit Bortrifluorid auf 3,3 Gew.-% gesättigt. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur unter periodischem Durchschütteln innerhalb von 6,6 Stunden gequollen. Danach wurden 3 g wasserfreie und fein zerriebene D-Glucose zugefügt und das Gemisch wurde bei 35°C innerhalb von einer Stunde geschüttelt. Anschliessend wurde das Reaktionsgemisch innerhalb von 12 Stunden bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln belassen. Die Reaktion wurde durch Eingiessen des Reaktionsgemisches in 11 desionisiertem Wasser beendet, das Mischpolymerisat ferner auf dieselbe Weise wie im Beispiel 1 verarbeitet. Der Zuckergehalt betrug 17,6 Gew.-%.
Beispiel 7
Die Bindung des Disaccharids wurde auf analoge Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt mit dem Unterschied, dass man zur Reaktion 3,26 g fein zerriebene Maltose verwendete und das Reaktionsgemisch bei Temperatur von 40°C innerhalb von 10 Stunden auf der Laborschüttelmaschine durchrührte. Das Gel mit gebundenem Disaccharid wurde auf dieselbe Weise wie im Beispiel 1 verarbeitet: Der Gehalt an gebundener Maltose betrug 9,7 Gew.-%.
Beispiel 8
Das Experiment wurde auf dieselbe Weise wie im Beispiel 6 durchgeführt mit dem Unterschied, dass anstelle der D-Galactose die 6-O-Methylglucose verwendet wurde. Der resultierende Gehalt an gebundenem Ätherderivat der Glucose betrug 15,2 Gew.-%.
Beispiel 9
Die Herstellung von gebundenem Halogenderivat des Sac-charids wurde auf analoge Weise wie im Beispiel 6 durchgeführt mit dem Unterschied, dass zur Reaktion 3 g 6-Fluorglu-cose verwendet wurden. Die Verarbeitung des resultierenden Produktes wurde dem Beispiel 6 entsprechend durchgeführt. Der Gehalt an gebundener 6-Fluorglucose betrug 14,78 Gew.-%.
Beispiel 10
400 mg Lyophilisat der aktiven Fraktion von Eiweiss-stoffen aus Sojasamen wurden in 4 ml Wasser aufgelöst. Ungelöste Reste wurden mittels Zentrifugieren beseitigt und zum Supernatant wurde Natriumchlorid bis zur Konzentration von 0,9 Gew.-% zugegeben. Auf die Säule des Mischpolymerisats aus 2-Hydroxyäthyimethacrylat und Äthylendi-methacrylats (M. iim = 300 000 Dalton) mit 7,66 Gew.-% angebundene D-Galactose (das Trägergewicht in trockenem Zustand 4 g), welches mit physiologischer Lösung äquilibriert wurde, wurde die Lösung von 4 ml aktive Eiweisstoff-fraktion (Titer der l%igen Lösung: 64 gegenüber den trypsini-sierten Erythrocyten der Gruppe Ai) appliziert. Nach Einsik-kerung der Probe wurde die Säule mit Hilfe der physiologischen Lösung mit der Geschwindigkeit 8 ml/h durchgewaschen und Fraktionen zu je 4 ml abgenommen. Das Eluat in den Fraktionen 3-5 war hämoglutinaktiv. Ab der Fraktion 20 wurde die Elution mit der 0,2-M-Lösung von D-Galactose in physiologischer Lösung weitergeführt. Die Fraktionen 22-24 wurden vereinigt, innert 48 Stunden gegenüber 4 mal je 21 Wasser dialysiert und lyophilisiert.
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Ausbeute: 6,2 mg, Titer der l%igen Lösung: 4096.
Beispiel 11
Auf die Säule (1 x30 cm), welche 4 g Mischpolymerisat aus 2-Hydroxyäthylacrylat und Äthylendimethacrylat (Mw iim ~300 000 Dalt.) mit 8,25 Gew.-% kovalent gebundene D-Glucose, welches mit physiologischer Lösung äquilibriert wurde, wurde die Lösung von 200 mg aktiver Eiweisstoff aus Linsensamen (Titer der l%igen Lösung: 64) in 2 ml physiologischer Lösung appliziert. Nach Einsickerung der Lösung wurde die Säule mit physiologischer Lösung mit der Geschwindigkeit 8 ml/h durchgewaschen und Fraktionen zu je 4 ml wurden abgenommen. Das Eluat in den Fraktionen 3-5 war hämoglutinaktiv. Ab der Fraktion 25 wurde die Elution mit 0,2 M Lösung von D-Glucose in physiologischer Lösung angefangen. Die Fraktionen 28-30 wurden vereinigt, innert 48 Stunden gegenüber 4mal je 21 Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Ausbeute 5,8 mg, Titer der l%igen Lösung: 256.
Beispiel 12
Auf die Säule (1 x30 cm), welche 4 g Mischpolymerisat aus 2-Hydroxyäthylacrylat und Äthylendiacrylat (Mw nm =
500 000 Dalton) mit 9,0 Gew.-% kovalent gebundene Man-nose enthielt, welches durch physiologische Lösung äquilibriert wurde, wurde die Lösung von 250 mg aktiver Eiweiss-stofffraktionen aus den Linsensamen (Titer der l%igen Lösung: 64) in 2,5 ml physiologischer Lösung appliziert.
Nach Einsickerung der Probe wurde die Kolonne mit der physiologischen Lösung mit der Geschwindigkeit 8 ml/h durchgewaschen und die Fraktionen zu je 4 ml wurden abgenommen. Das Eluat in den Fraktionen 3-5 war hämoglutinaktiv. Ab der Fraktion 28 wurde die Elution mit der 0,2 M-Lösung von D-Mannose in physiologischer Lösung angefangen. Die Fraktionen 31-35 wurden vereinigt, innert 48 Stunden gegenüber 4mal je 3 1 Wasser dialysiert und lyophilisiert. Ausbeute etwa 1 mg.
Beispiel 13
Auf die Säule (1x30 cm), welche mit 4 g sphärischem makroporösem Mischpolymerisat aus 2-Hydroxyäthylmeth-acrylat und Äthylendimethacrylat (Mw iim = 100 000 Dalton) mit 7,66 Gew.-% chemisch gebundene D-Galactose, welche mit physiologischer Lösung äquilibriert wurde, gefüllt war, wurde die Lösung von 300 ml lyophilisiertem Extrakt aus den Samen von Ricunus communis L. (Titer der l%igen Lösung: 8192) in 3 ml physiologischer Lösung appliziert. Nach Einsik-kerung der Probe wurde die Säule mit physiologischer Lösung mit der Geschwindigkeit 8 ml/h durchgewaschen und Fraktionen zu je 4 ml wurden abgenommen. Das Eluat in der Fraktion 3 war hämoglutinaktiv. Ab der Fraktion 21 wurde die Elution mit 0,2 M Lösung von der D-Galactose in physiologischer Lösung angefangen. Die Fraktionen 24-28 wurden vereinigt, innert 48 Stunden gegenüber 4mal je 3 1 Wasser dialysiert und lyophilisiert. Ausbeute: 77,2 mg. Titer der l%igen Lösung: 32768.
Beispiel 14
Auf die Säule (1 x30 cm), welche 4 g sphärisches makroporöses Mischpolymerisat aus 2-Hydroxyäthylmethacrylat und Äthylendimethacrylat (Mw iim=300 000 Dalton) mit 5,42 Gew.-% L-Fucose, welches mit 0,15 M Phosphatpuffer von pH 7,9 äquilibriert wurde, enthielt, wurde die Lösung von 700 mg hämoglutinaktiver Fraktion der Eiweissstoffe aus dem Samen von Upex europeaeus L. in 6 ml desselben Puffers appliziert. Nach Einsickerung der Probe wurde die Säule mit demselben Puffer mit der Geschwindigkeit 15 ml/h
637 146
durchgewaschen und Fraktionen zu je 5 ml wurden gesammelt. Ab Fraktion 40 wurde die Elution mit 50 ml 0,2 M Lösung von L-Fucose in verwendetem Puffer angefangen. Nach Einsickerung der Lösung von L-Fucose wurde die weitere Elution mit Phosphatpuffer mit unveränderter Geschwindigkeit durchgeführt. Die Fraktionen 43-48 wurden vereinigt, innert 48 Stunden gegenüber 4mal je 51 Wasser dialysiert und lyophilisiert. Ausbeute: 7,1 mg.
Beispiel 15
Auf die Säule (1 x20 cm), welche 3,1 g sphärisches makroporöses Mischpolymerisat aus 2-Hydroxyäthylmethacrylat und Äthylendimethacrylat mit 8,15 Gew.-% kovalent gebundenes N-Acetyl-D-glucosamin enthielt, welches mit physiologischer Lösung äquilibriert wurde, wurden 5 ml hämoglutinaktiver Extrakt, der aus 1,5 g Albumindrüsen der Weinbergschnecke gewonnen worden war, aufgetragen. Nach Einsickerung der Probe wurde die Säule mit physiologischer Lösung mit der Geschwindigkeit 8 ml/h durchgewaschen und Fraktionen zu je 4 ml wurden abgenommen. Das Eluat war in keiner Fraktion hämoglutinaktiv. Ab der Fraktion 23 wurde die Elution mit 0,2 M Lösung von N-Acetyl-gluco-samin in physiologischer Lösung begonnen. Ab der Fraktion 38 wurde die Elution mit dem Glycinpuffer von pH 2,7 durchgeführt. Die Fraktionen 26-29 wurden vereinigt innert 48 Stunden gegenüber 4mal je 31 Wasser dialysiert und lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 16,3 mg, der Titer der l%igen Lösung: 32 768.
Beispiel 16
Auf die Säule (1 x30 cm), welche 4 g makroporöses Mischpolymerisat aus 2-Hydroxyäthylmethacrylat und Äthylendimethacrylat mit 8% gebundene D-Glucose, welches mit physiologischer Lösung äquilibriert wurde, enthielt, wurden 20 ml hämoglutinaktiver Extrakt aus den Samen von Cana-valia ensiformis D.C. (Titer der l%igen Lösung: 512 gegenüber den trypsinisierten Blutkörperchen) aufgetragen. Nach Einsickerung der Probe wurde die Säule mit physiologischer Lösung mit der Geschwindigkeit 8 ml/h durchgewaschen und Fraktionen zu je 4 ml wurden abgenommen. Das Eluat in den Fraktionen 3-6 war hämoglutinaktiv. Ab der Fraktion 21 wurde die Elution mit der 0,2 M Lösung von D-Glucose in physiologischer Lösung begonnen. Die Fraktionen 23-27 wurden vereinigt, innert 48 Stunden gegenüber 4mal je 3 1 Wasser dialysiert und lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 41,1 mg, der Titer der Lösung: 2048.
Beispiel 17
Auf die Säule (1 x30 cm), welche 4 g makroporöses Mischpolymerisat aus 2-Hydroxyäthylmethacrylat und Äthylendimethacrylat mit 8,25 Gew.-% angebundene D-Glucose, welches mit physiologischer Lösung äquilibriert wurde, enthielt, wurden 50 mg Concanavalin A, das aus den Samen von Canavalia ensiformis D.C. (Titer der l%igen Lösung: 512) isoliert wurden, aufgetragen. Das Volumen der Probe betrug 2 ml. Nach der Einsickerung der Probe wurde die Säule mit physiologischer Lösung mit der Geschwindigkeit 8 ml/h durchgewaschen und Fraktionen zu je 4 ml wurden abgenommen. Das Eluat war in jeder Fraktion nicht hämoglutinaktiv. Ab der Fraktion 17 wurde die Elution mit der 0,2 M Lösung von D-Glucose in physiologischer Lösung angefangen. Ab der Fraktion 28 wurde die Elution mit dem Glycinpuffer von pH 2,7 durchgeführt. Die Fraktionen 19-22 wurden vereint, innert 48 Stunden gegenüber 4mal je 31 Wasser dialysiert und lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 46,9 mg, der Titer der l%igen Lösung gegenüber den trypsinisierten Blutkörperchen: 512.
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Beispiel 18
4,2 g Mischpolymerisat aus Hydroxyäthylmethacrylat und Äthylendimethacrylat (Mw iim=300 000 Dalton) wurden innert 12 Stunden in 70 ml Dioxan mit 6 Gew.-% HCl gequollen. Danach wurden 1,046 g N-Acetyl-D-galactosamin zugegeben und die Suspension wurde.bei Raumtemperatur innert 6 Stunden und anschliessend bei 40°C innert 6 Stunden geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde in 11 deionisiertem Wasser eingegossen und dann bis zur neutralen Reaktion und zur negativen Reaktion auf Zucker durchgewaschen. Das Mischpolymerisat wurde dann mit Äthanol, Aceton und Äther durchgewaschen und im Vakuum bei 50°C bis zum konstanten Gewicht ausgetrocknet. Die Säule (1x30 cm), welche 4 g beschriebenes Derivat mit angebundenem A-Acetyl-D-galactosamin enthielt, wurde in physiologischer Lösung äquilibriert. Auf die Säule wurde die Lösung von 228,6 mg der hämoglutinaktiven Fraktion der Eiweiss-stoffe aus den Samen von Dolichos biflorus L. in 3 ml physiologischer Lösung appliziert. Nach Einsickerung der Lösung wurde die Säule mit physiologischer Lösung mit der Geschwindigkeit 10 ml/h durchgewaschen und Fraktionen zu je 5 ml wurden abgenommen. Nach der Abnahme von 155 ml Effluent wurde der affinitätsgebundene Eiweissstoff mit der 0,2 M Lösung N-Acetyl-D-galactosamin (5 ml)
eluiert, und dann wurde die Elution mit physiologischer Lösung fortgesetzt. Die einzelnen Fraktionen wurden mit Hilfe der UV-Spectrophotometer bei Wellenlänge 280 nm durchgemessen. Die Fraktionen, welche Eiweissstoffe enthielten, wurden vereinigt (Gesamtvolumen 15 ml), gegenüber 4mal je 21 Wasser dialysiert und lyophilisiert. Ausbeute: 17,4 mg. Der Titer des resultierenden Produktes gegenüber der Blutgruppe Ai: 4096. Die ursprüngliche Probe wies den Titer 128 auf.
Beispiel 19
Auf die Säule (1x30 cm), welche 4 g makroporöses Mischpolymerisat aus 2-Hydroxyäthylacrylat und Äthylendiacrylat mit 14,16 Gew.-% gebundene D-Galactose, welches mit physiologischer Lösung äquilibriert wurde, enthielt, wurde die Lösung von 562,7 mg lyophilisierter Extrakt aus den Samen von Ricinus communis L. in 6 ml physiologischer Lösung appliziert. Nach Einsickerung der Probe wurde die Säule mit physiologischer Lösung mit der Geschwindigkeit 8 ml/h durchgewaschen und Fraktionen zu je 4 ml wurden abgenommen. Das Eluat in den Fraktionen 3-8 war hämoglutinaktiv. Auch die Absorbenz, welche bei 280 nm gemessen wurde, war in diesen Fraktionen maximal. Nach Durchwaschen der Säule mit 200 ml physiologischer Lösung wurde der Träger mit 0,2 M Lösung von D-Galactose in physiologischer Lösung eluiert. Die Fraktionen mit Gehalt an Eiweissstoff wurden vereinigt (insgesamt 40 ml) und gegenüber 4mal je 41 Wasser innert 48 Stunden dialysiert. Das Produkt wurde anschliessend lyophilisiert. Ausbeute: 159,8 mg.
Aktivität der l°/oigen Lösung gegenüber den Blutkörperchen der Gruppe Ai
Die Sulfatfraktion vor der Isolierung: 4096
Reiner Eiweissstoff nach der Isolierung: 16 384
Die Reinheit des Präparats wurde durch alkalische diskontinuierliche Elektrophorese auf dem Polyacrylamidgel kontrolliert.
Beispiel 20
300 mg Fraktion von Eiweissstoff aus den Samen von Ricinus communis L. wurden in 20 ml physiologische Lösung aufgelöst. Die Lösung wurde gegenüber den Blutkörperchen der Gruppe Ai titriert. Die Aktivität bis zur 12. Fraktion betrug 4096. Dann wurden 4 g desselben Mischpolymerisats mit der angebundenen D-Galactose wie im Beispiel 10 zugegeben. Es wurde die Aktivitätsabnahme in Abhängigkeit von Zeit verfolgt. Nach 8 Stunden hatte sich die Aktivität stabilisiert. Das Adsorbens wurde abfiltriert und mit physiologischer Lösung durchgewaschen. Die gesamte Menge des Adsorbens wurde in die Säule aufgetragen und mit physiologischer Lösung bis zum Verschwinden der Aktivität und Abnahme der Adsorbenz auf den ursprünglichen Wert für die physiologische Lösung durchgewaschen. Danach wurde der angebundene Eiweissstoff mit 0,2 M Lösung von D-Galac-tose in physiologischer Lösung ausgewaschen. Die Fraktionen mit Gehalt an Eiweissstoff wurden vereinigt und innert 48 Stunden gegenüber 4mal je 41 deionisiertem Wasser dialysiert und lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 238,4 mg, was einer Kapazität von 59,6 mg pro 1 g trockenes Mischpolymerisat mit angebundener D-Galactose entspricht.
Beispiel 21
Die Isolierung wurde auf analoge Weise wie im Beispiel 20 durchgeführt mit dem Unterschied, dass die ursprüngliche Menge des Eiweissstoffes 184,4 g in 20 ml physiologische Lösung betrug und dass als Adsorbens das Mischpolymerisat mit 13,08 Gew.-% D-Glucose (3,05) diente. Die Ausbeute betrug 149,6 mg reiner Eiweissstoff entsprechend der Kapazität 49,4 mg/g trockenes Sorbens.
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Claims (3)

637 146 PATENTANSPRÜCHE
1. Hydrophile, makroporöse, dreidimensionale Mischpolymerisate von Hydroxyalkylacrylaten oder Hydroxyalkyl-methacrylaten, welche im Alkyl 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten, mit Vernetzungsmitteln, welche aus der Gruppe von divinylischen oder polyvinylischen Monomeren ausgewählt sind, dadurch gekennzeichnet, dass sie auf der Oberfläche des Polymerisats O-glycosidisch kovalent gebundene Saccharide oder Saccharid-Derivate, welche aus der Gruppe der Monosaccharide, Oligosaccharide, Desoxyzucker, Ami-nozucker, acylierten Saccharide und Äther- oder Halogenderivate von Monosacchariden und Oligosacchariden ausgewählt sind, enthalten.
2. Verfahren zur Herstellung von Mischpolymerisaten gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die dreidimensionalen hydroxylgruppenhaltigen Mischpolymerisate mit den Sacchariden oder Saccharid-Derivaten in inertem organischem Lösungsmittel bei einer Temperatur zwischen 20 und 100°C und unter Katalyse mit HCl, BF3 oder einem Gemisch davon, umsetzt.
3. Verwendung der Mischpolymerisate gemäss Patentanspruch 1 als spezifische Sorbentien zur Isolierung von physiologisch wirksamen Stoffen, welche freie Bindungsstellen für Saccharide enthalten und mit ihnen spezifische Komplexe bilden.
CH485878A 1977-05-03 1978-05-03 Hydrophile, makroporoese, dreidimensionale beladene mischpolymerisate. CH637146A5 (de)

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