DE2819522A1 - Hydrophile makroporoese dreidimensionale copolymerisate von hydroxyalkyl- acrylaten oder -methacrylaten mit vernetzungsmitteln, ihr herstellungsverfahren und ihre verwendung - Google Patents

Hydrophile makroporoese dreidimensionale copolymerisate von hydroxyalkyl- acrylaten oder -methacrylaten mit vernetzungsmitteln, ihr herstellungsverfahren und ihre verwendung

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DE2819522A1 DE19782819522 DE2819522A DE2819522A1 DE 2819522 A1 DE2819522 A1 DE 2819522A1 DE 19782819522 DE19782819522 DE 19782819522 DE 2819522 A DE2819522 A DE 2819522A DE 2819522 A1 DE2819522 A1 DE 2819522A1
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Description

Ceskoslovenska akademie ved, Prag, CSSR
Hydrophile makroporöse dreidimensionale Copolymerisate von Hydroxyalkyl-acrylaten oder -meth- -acrylaten mit Vernetzungsmitteln, ihr Herstellungsverfahren und ihre Verwendung
Die Erfindung betrifft hydrophile makroporöse dreidimensionale Copolymerisate von Hydroxyalkylmethacrylaten bzw. Hydrosyalkylacrylaten mit vernetzenden Comonomeren, die kovalent gebundene Saccharide enthalten, und ihr Herstellungsverfahren durch direkte Umsetzung von Polymerisaten mit Sacchariden unter Katalyse mit Lewis-Säuren.
Hydrophile makroporöse Copolymerisate von Hydrosyalkylmethacrylaten und Hydroxyalkylacrylaten mit Alkylendimethacrylaten oder Alkylendiacrylaten, die durch Copolymerisation von Monomeren in Suspension in Gegenwart von inerten organischen Verbindungen in wässrigem oder organischem Diapersionsmilieu hergestellt werden, sind aus dem
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OS-Urheberschein I50 819, der der GB-PS 1 370 377 entspricht, und aus der CS-PS 14-8 828 bekannt. Ihre hervorragenden mechanischen Eigenschaften, die sphärische Form der Teilchen und ihre makroporöse Struktur, die die Penetration von sogar beträchtlich großen Molekülen in die Poren des Trägers erlaubt, haben zu ausgedehnten Anwendungen dieser Materialien in der Gel-, Ionenaustausch-, Adsorptions- und Affinitätschromatographie unter Verwendung von Wasser oder wässrigen Lösungen als Elutionsmittel geführt. Sehr erfolgversprechend scheint die Ausnützung von Hydroxyalkylmethacrylat- und Hydroxyalkylacrylat-Copolymerisaten in der hydrophoben Chromatographie zu sein, bei der die Wechselwirkung des lipophilen Teils der Moleküle der getrennten Verbindungen mit der verhältnismäßig unpolaren Matrix des Trägers, dessen Hydrophilie durch Gegenwart von nicht ionogenen Hydroxylgruppen in Seitenketten der Copolymerisate verursacht wird, ausgenutzt wird.
Für einige Anwendungen ist aber diese mögliche hydrophobe Wechselwirkung zwischen dem Träger und den im Wasser gelösten Molekeln unerwünscht. Allgemein gilt dies in Fällen, in denen eine eindeutige Wechselwirkung zwischen den funktionellen Gruppen des Trägers und der gelösten Verbindung (z. B. bei der Ionenaustausch- und Affinitätschromatographie) gefordert wird oder in denen Sorptionseffekte überhaupt unterdrückt werden sollen, wie dies bei der Gelchromatographie der Fall ist. Die innere Oberfläche des makroporösen Copolymerisats muß darm durch chemische Umsetzung von Hydroxylgruppen hydrophilisiert werden. Die stärkste Hydrophilisierung kann man durch Substitution von Hydroxylgruppen durch ionogene funktioneile Gruppen, z. B. durch das Verfahren nach den OS-Urheberscheinen I71 962,
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171 963 und 177 507 oder nach, den GB~PSen 1 500 532 und 1 499 13^ erreichen.
In manchen Fällen ist jedoch auch die Gegenwart ionogener funktioneller Gruppen im Träger unerwünscht. Dann können die Copolymerisate von Hydroxyalkylmethacrylaten und Hydroxyalkylacrylaten durch hoch hydrophile neutrale Saccharidmoleküle modifiziert werden.
In einigen Fällen stört "bei den zu weiteren chemischen Umwandlungen bestimmten Trägern der niedrige Gehalt an umwandlungsfähigen Hydroxylgruppen, was sich dadurch äußert, daß das Endprodukt eine zu niedrige Kapazität aufweist. Dies kommt besonders in solchen Fällen vor, wo eine hohe mechanische Stabilität des Trägers gefordert wird (z. B. bei mikropartikulären Sorbentien und bei der hoch wirksamen Flüssigkeitschromatographie) und wo demgemäß Copolymerisate mit einem hohen Gehalt an Vernetzungsmittel, das überhaupt keine Hydroxylgruppen enthält, ausgewählt werden müssen. In diesen Fällen läßt eich durch Substitution von Hydroxylgruppen durch Saccharidmoleküle die Forderung nach höherer Kapazität bei polymeranalogen Umsetzungen erfüllen. Nicht zuletzt eignet sich dann das chemisch gebundene Saccharid sowohl als solches als auch in Form von Derivaten für eine Reihe von polymeranalogen Reaktionen, in denen das glycosylierte Polymerisat die reaktive Komponente darstellt. Einen weiteren Vorteil des Trägers, der chemisch gebundene Saccharide enthält, stellt die Regenerierbarkeit des Trägere dar, weil durch hydrophile Spaltung unter drastischen Bedingungen der ursprüngliche Träger wieder erhältlich ist, der dann seinerseits wieder modifiziert werden kann.
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Die wichtigsten "bisher verwendeten Träger sind modifizierte natürliche Polysaccharide, Glucoproteine, die an verschiedenen Trägern gebunden sind, sowie schließlich Zucker und ihre Derivate, die durch kovalente Bindung an verschiedenen Matrices gebunden sind.
Aus der ersten Gruppe haben sich besonders die kommerziell zugänglichen Polysaccharide in vernetzter Form bewährt. Hierzu gehören vor allem die mit Epichlorhydrid vernetzten Polydextrane, Agarose-Gele, vernetztes Gummiarabicum, Chitin u. dgl. Glycoproteine liegen zumeist in löslicher Form vor und müssen zur Verwendung bei der Affinitätschromatographie auf einen natürlichen oder synthetischen Träger gebunden werden.
Bei der dritten Gruppe von Sorbentien werden die Monosaccharide und Oligosaccharide am häufigsten an den PoIysaccharidträger in der Form eines reaktiven Aminoderivats entweder direkt oder indirekt über ein Zwischenglied gebunden. Ein anderes Verfahren nützt die reaktiven funktionellen Gruppen des Trägers oder das reaktive Zwischenglied, z. B. Divinylsulfon, aus.
Einen bedeutsamen Fortschritt stellt die Einführung der Acrylamidträger dar, die auf dreierlei Weise hergestellt werden: durch Modifizierung kommerzieller Präparate, durch Synthese von Gelen mit einpolymerisierten aktiven Estergruppen, die zur !Reaktion mit Aminozucker befähigt sind, oder durch Copolymerisation von ω -ungesättigten aliphatischen Glycosiden mit Acrylamid.
Die große Auswahl verschiedener Trägertypen deutet bereits
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darauf hin, daß nur wenige von ihnen ideale Eigenschaften besitzen. Zu den am einfachsten zugänglichen gehören modifizierte natürliche Polysaccharide; hierbei gibt es nur eine kleine Auswahl, auch sind diese Produkte gegenüber der Einwirkung von Mikroorganismen wenig beständig. Nachteilig ist auch die Tatsache, daß einige von ihnen nicht mit ausreichender Porosität unter Erhaltung einer befriedigenden mechanischen Stabilität hergestellt werden können. Die breitere Verwendung von auf Trägern gebundenen G-lycoproteinen wird andererseits durch die komplizierte und kostspielige Herstellung der Materialien für die Affinitätschromatographie ebenso wie ihre niedrige Zersetzungsbeständigkeit verhindert.
Acrylamidgele weisen einige der angeführten Nachteile nicht auf, sind gegenüber der Einwirkung von Chemikalien und Mikroorganismen beträchtlich beständiger und erlauben eine wiederholte Verwendung.
Alle angeführten Materialien werden jedoch in Form von weichen, homogen vernetzten Teilchen hergestellt, die in wässrigen Lösungsmitteln beträchtlich quellen und ihre Dimensionen bei Änderung des pH oder der Ionenstärke der Lösung beträchtlich ändern. Sie erlauben auch keinen Einsatz unter höheren Drucken und bei höheren Durchflußgeschwindigkeiten. Sie sind ferner aus kinetischen Gründen im Hinblick auf die Diffusion bei der Herstellung von Komplexen für die Affinitätschromatographie und ihre Dissoziation nicht besonders geeignet.
Die Erfindung betrifft hydrophile makroporöse dreidimensionale Copolymerisate von Hydroxyalkylmethacrylaten und
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Hydroxyalkylaerylaten mit 1 bis 4 C-Atomen im Alkylteil mit Vernetzungsmitteln aus der Gruppe der Divinyl- und Polyvinylmonomeren, die oberflächlich durch kovalent 0-glycosidisch gebundene Saccharide oder ihre Derivate modifiziert sind, die unter den Hono- und Oligosacchariden, Desoxyzucker^ Aminozuckern, acylierten Sacchariden, Ätheroder Halogenderivaten der Monosaccharide und Oligosaccharide ausgewählt sind.
Als Vernetzungsmittel verwendet man mit Vorteil Alkylendiacrylate, Alkylendimethacrylate, Polyglycoldiacrylate, Polyglycoldimethacrylate, Äthylen-bis-acrylamide, Divinylbenzol o. dgl. Es können Jedoch auch weitere Vernetzungsmittel verwendet werden, die copolymerisierbare Verbindungen umfassen, die zwei oder mehrere unkonjugierte äthylenische Doppelbindungen oder zwei oder mehrere Vinylgruppen enthalten, wie z. B. Divinyltoluol, Trivinylbenzol, Divinylnaphthaiin, Divinylxylol, Divinyläthy!benzol, Divinyläther, Divinylketon, Allylacrylat u. dgl.
Das Vernetzungsmittel wird in einer Menge von mindestens 15 Gew.-%, vorteilhaft 30 bis 60 Gew.-% bezogen auf das Monomergemisch zugesetzt.
Die eigentliche Polymerisation der Hydroxyalkylacrylate oder -methacrylate mit Vernetzungsmitteln wird als radikalische Suspensionspolymerisation in wässrigem Milieu in Gegenwart von inerten organischen Verbindungen, deren Art und Konzentration die Porengrößenverteilung der gebundenen Produkte beeinflussen, und in Gegenwart von Suspensionsstabilisatoren durchgeführt.
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Als inerte organische Verbindungen werden vorteilhaft Cyclohexanol, Benzylalkohol, Cyclohexylamin, Dodecylalkohol, n-Octylalkohol und gegebenenfalls deren Gemische verwendet. Als Stabilisatoren der Suspension können z. B. Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, teilweise hydrolysierte Polyvinylacetate oder einige polymere Naturstoffe wie etwa Stärke oder Pektine dienen.
Durch die Suspensionspolymerisation entstehen sphärische Teilchen. In Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen (Dimension, Form und Drehzahl des Rührers, Konzentration des Suspensionsstabilisators etc.) können Teilchen mit erwünschter Teilchengrößenverteilung hergestellt werden.
Das Herstellungsverfahren der erfindungsgemäßen Polymerisate beruht auf der Substitution der Hydroxylgruppen durch das Saccharid unter Entstehung einer O-glycosidischen Bindung, die in einem inerten organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 20 bis 100 0C unter Katalyse durch Chlorwasserstoff, Bortrifluorid oder deren Gemische durchgeführt wird.
Die eigentliche Umsetzung der Saccharide mit den makroporösen Copolymerisaten verläuft sehr glatt durch Vermischen der Suspension des Trägers im inerten organischen Lösungsmittel (vorteilhaft Dioxan oder Tetrahydrofuran), das eine bestimmte Menge an Chlorwasserstoff, Bortrifluorid oder deren Gemischen enthält. Die Lösungsmittel müssen trocken sein; auch der gasförmige Chlorwasserstoff oder das Bor-
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trifluorid werden bei dt» fiätirigwg getrocknet. Zu der Suspension wird fein gemahlenes trockenes Saccharid zugegeben und das Gemisch unter Rühren oder Schütteln bei
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Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur von 20 bis 100 0C reagieren gelassen. Die Gegenwart von Wasser in den reagierenden Komponenten verringert die Ausbeute der Bindungsre akt ion.
Da die Entstehung der O-glycosidischen Bindung und ihre Hydrolyse eine Gleichgewichtsreaktion darstellen, wurden die optimalen Arbeitsbedingungen für die Bindung einer maximalen Menge an Saccharid eingehend untersucht. Die Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 60 bis 70 0O erhöht den Umsatz mäßig; bei weiterer Temperatursteigerung bis 100 0C sinkt die Reaktionsausbeute. Einen größeren Einfluß auf den Reaktionsumsatz übt die Konzentration des Katalysators (HCl oder BFj) aus, die bis zu 70 Gew.-% verfolgt wurde. Die besten Ergebnisse wurden mit Katalysatoraischungen erreicht, in denen der Chlorwasserstoff vermutlich eine cokatalytische Wirkung aufweist. Dagegen erwiesen sich HjPO/j., P2°5» H2SO^ und weitere Säuren unter den angeführten Reaktionsbedingungen als unwirksam.
Die Analyse des Gehaltes an gebundenem Saccharid wurde durch Hydrolyse nach Dubois durchgeführt.
Die erfindungsgemäß hergestellten Stoffe weisen gleichzeitig die hervorragenden mechanischen und hydrodynamischen Eigenschaften der dreidimensionalen Hydroxyalkylacrylat- und Hydroxyalkylmethacrylat-Copolymerisate und gute Hydrophilie sowie günstige, mit Polydextranen, Agarose oder Cellulosematerialien vergleichbare Wechselwirkungseigenschaften auf, die derzeit insbesondere in der Biologie und Biochemie vorteilhaft ausgenutzt werden können.
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Die erfindungsgemäßen Copolymerisate weisen hohe mechanische Festigkeit tmd Druckbeständigkeit auf, sind gegenüber saurer und alkalischer Hydrolyse sowie Oxidation relativ beständig und weisen ferner Beständigkeit gegenüber organischen Lösungsmitteln auf. In wässrigen Lösungen quellen die Copolymerisate nur sehr wenig, und die Teilchen ändern ihre Größe bei Änderung der Ionenstärke und des pH nicht.
Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren ist technologisch einfach und liefert in einem breiten Bereich der Reaktionsbedingungen reproduzierbare Umsätze.
In den verwendeten Lösungsmitteln müssen Chlorwasserstoff und Bortrifluorid gut löslich sein und dürfen mit ihnen bei Raumtemperatur oder wenig erhöhter Temperatur nicht reagieren. Es ist ferner erwünscht, daß die Lösungsmittel polaren Charakter aufweisen, der ein wenigstens teilweises Lösen der zur Bindung auf Hydroxyalkylacrylat- oder Hydroxyalkylmethacrylatträgern ausgewählten Saccharide ermöglicht; vorteilhaft verwendet man Dioxan und Tetrahydrofuran.
Der hauptsächliche Vorteil des Verfahrens zur Herstellung von Glycosylderivaten von Hydroxyalkylmethacrylat- und Hydroxyalkylacrylat-Copolymerisaten liegt in seiner Einfachheit und erheblich höheren Geschwindigkeit gegenüber bisher zur Herstellung analoger Sorbentien verwendeter Verfahren. Die milden Bedingungen, unter denen die erfindungsgemäßen Produkte erhältlich sind, die leichte Zugänglichkeit der Reaktionskomponenten, die Beständigkeit der Matrix gegenüber Mikroorganismen, sowie die einfache
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Handhabung und Aufbewahrung stellen weitere Vorteile dar.
Die erfindungsgemäßen modifizierten Träger eröffnen eine neue Reihe chromatographischer Materialien mit sehr unterschiedlicher Verwendbarkeit, insbesondere zur Trennung von Biopolymeren und ihren Fragmenten oder zur Bindung von für katalytische Zwecke bestimmten biologisch aktiven Stoffen.
Die erfindungsgemäßen Copolymerisate können zum Beispiel als spezifische Sorbentien zur Isolierung von physiologisch und biokatalytisch wirksamen Stoffen verwendet werden, die freie Bindungszentren für Saccharide enthalten und dementsprechend mit ihnen spezifische Komplexe bilden. Aktive Stoffe werden aus Gemischen mit nicht aktiven Ballastbeimischungen auf dem erfindungsgemäßen Copolymerisat selektiv adsorbiert; aus den gebildeten Komplexen können danach durch Verdrängung mit Haptenen oder durch EIution mit geeigneten Puffern die aktiven Substanzen wieder freigesetzt werden.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen erläutert, die nicht einschränkend sind.
Beispiel 1
5 g eines Copolymerisats von Hydroxyalkylmethacrylat mit Äthylendimethacrylat (39 Gew.-%), das durch Suspensionspolymerisation in wässrigem Milieu in Gegenwart eines inerten Lösungsmittelsystems, das aus Cyclohexanol und Laurylalkohol (9:1) bestand und eine Ausschlußgrenze von 300.000 Dalton besaß, hergestellt war, wurden in einem
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500-ml-Kolben in 70 ml Dioxan mit einem Gehalt von 17,5 Gew.-% Chlorwasserstoff bei Raumtemperatur 7 h gequollen. Danach wurde das Gemisch kurz evakuiert. Zu der Suspension wurden 3 g wasserfreie, fein zerriebene D-Glucose zugegeben, worauf das Ganze bei Raumtemperatur 14 h geschüttelt wurde. Danach wurde die Reaktion durch Eingießen des Reaktionsgemische in 1 1 entionisiertes Wasser beendet. Das Zuckerderivat des Gels wurde sofort auf einer Glasfritte abgesaugt und mit entionisiertem Wasser bis zur neutralen Reaktion und zur negativen Reaktion auf Zucker gewaschen. Schließlich wurde das glycosylierte Gel mit Äthanol, Aceton und Äther gewaschen und bei einer Temperatur von 30 0G im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Der Gehalt an gebundenem Zucker betrug 13)5 Gew.-%.
Beispiel 2
4,2 g eines Copolymerisate von Hydroxyalkylmethacrylat wurden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 in ?O ml Dioxan, in das bis zu einem Gehalt von 5 Gew.-% gasförmiger Chlorwasserstoff eingeleitet worden war, gequollen. Danach wurden 1,02 g D-Glucose zugegeben und die Suspension bei einer Temperatur von 45 0C 10 h geschüttelt. Anschließend wurde sie in 1 1 entionisiertes Wasser eingegossen und wie in Beispiel 1 weiterverarbeitet. Der Gehalt an gebundenem Zucker betrug 6,42 Gew.-%.
Beispiel 3
3,5 6 eines Copolymerisate aus 2-Hydroxymethylmethacrylat
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und Äthylendiacrylat mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 300.000.DaIton wurden in 60 ml wasserfreies Dioxan, das 6 Gew.-% Chlorwasserstoff enthielt, 12 h gequollen. Nach Zusatz von 1,3 g N-Acetyl-D-glucosamin wurde das Gemisch bei einer Temperatur von 35 °C 10 h geschüttelt. Die Suspension wurde in 1 1 entionisiertes Wasser eingegossen und wie in Beispiel 1 weiterverarbeitet. Der Gehalt an gebundenem Aminozucker betrug 8,15 Gew.-%.
Beispiel 4-
5 g eines Copolymerisate aus 2-Hydroxyäthylacrylat und Ithylendimethacrylat mit einer Ausschlußgrenze von 250.000 Dalton wurden in 70 ml Dioxan, welches 7 Gew.-% Bortrifluorid enthielt, bei Raumtemperatur 12 h gequollen. Zu der Reaktionssuspension wurden 3 g wasserfreie D-Glucose zugegeben; danach wurde das Reaktionsgemisch bei einer Temperatur von 50 0C 8,5 h geschüttelt. Die Reaktion wurde durch Eingießen des Gemische in 1 1 entionisiertes Wasser beendet. Die weitere Verarbeitung wurde wie in Beispiel 1 vorgenommen. Der Gehalt an gebundenem Zucker betrug 12,4· Gew.-%.
Beispiel 5
Es wurde wie in Beispiel 1 verfahren mit dem Unterschied, daß die Reaktionstemperatur bei einem Gehalt an Chlorwasserstoff im Dioxan von 6 % auf 70 0C erhöht wurde. Der resultierende Gehalt an kovalent gebundener D-Glucose betrug 6,25 Gew.-%.
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Beispiel 6
5 g eines Copolymerisate von 2-Hydroxyäthylmethacrylat mit Äthylendimethacrylat mit einer Ausschlußgrenze von 300.000 Dalton wurden mit 66 ml Dioxan vermischt, worauf Chlorwasserstoff bis zu einer Konzentration von 3j4- Gew.-% und
Bortrifluorid bis zu einem Gehalt von 3»3 Gew.-% eingeleitet wurden. Danach wurde die Suspension bei Raumtemperatur unter periodischem Schütteln 6,6 h gequollen. Anschließend wurden 3 S wasserfreie und fein zerriebene D-Glucose zugefügt und das Gemisch bei 35 0C 1h geschüttelt. Danach
wurde das Reaktionsgemisch 12 h unter ständigem Schütteln bei Raumtemperatur belassen. Die Reaktion wurde durch Eingießen des Reaktionsgemische in 1 1 entionisiertes Wasser beendet; die Veiterverarbeitung des Copolymerisate geschah auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1. Der Zuckergehalt betrug 17,6 Gew.-%.
Beispiel 7
Es wurde ein Disaccharid auf analoge Weise wie in Beispiel 1 mit dem Unterschied gebunden, daß zur Reaktion 3,26 g
fein zerriebene Maltose verwendet und das Reaktionsgemisch bei einer Temperatur von 40 0C 10 h auf einer Laborschüttelmaschine geschüttelt wurde. Das Gel mit dem daran gebundenen Disaccharid wurde wie in Beispiel 1 weiterverarbeitet. Der Gehalt an gebundener Maltose betrug 9,7 Gew.-%.
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Beispiel 8
Es wurde wie in Beispiel 6 verfahren mit dem Unterschied,
G* lu.eoid
daß anstelle von D-Sfrihscctose 6-0-Methylglucose verwendet wurde. Der resultierende Gehalt an gebundenem Ätherderivat der Glucose betrug 15,2 Gew.-%.
Beispiel 9
Die Herstellung eines gebundenen Halogenderivats eines Saccharide wurde analog wie in Beispiel 6 mit dem Unterschied durchgeführt, daß zur Reaktion 3 g 6-I"luorglucose verwendet wurden. Die Verarbeitung des resultierenden Produkts geschah wie in Beispiel 6. Der Gehalt an gebundener betrug 14,78 Gew.-%.
Beispiel 10
400 mg Lyophilisat der aktiven Fraktion von Eiweißstoffen aus Sojasamen wurden in 4 ml Wasser gelöst. Ungelöste Reste wurden abzentrifugiert; dem Überstand wurde Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 0,9 % zugegeben. Auf eine Säule mit einem Copolymerisat aus 2-Hydroxyäthylmethacrylat und Äthylendimethacrylat (Ausschlußgrenze \ lim = 300.000 Dalton) mit 7,66 Gew.-% daran gebundener D-Galactose (Trägergewicht in trockenem Zustand 4 g), das mit physiologischer Lösung äquilibriert wurde, wurde die Lösung von 4 ml der aktiven Eiweißfraktion (Titer der 1 %-igen Lösung 64 gegenüber trypsinisierten Erythrocyten der Gruppe A^) aufgegeben. Nach dem Einsickern der Probe
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wurde die Säule mit physiologischer Lösung bei einer Geschwindigkeit von 8 ml/h eluiert, wobei jeweils 4-ml-Fraktionen abgenommen wurden. Das Eluat in den Fraktionen 3 bis 5 war hämoglutinaktiv. Ab Fraktion 20 wurde die EIution mit einer 0,2 M Lösung von D-Galactose in physiologischer Lösung weitergeführt. Die Fraktionen 22 bis 24 wurden vereinigt, 48 h 4 mal gegen je 2 1 Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Ausbeute: 6,2 mg; (Eiter der 1 %igen Lösung: 4096.
Beispiel 11
Auf eine Säule (1 χ 30 cm) mit 4 g eines Copolymerisate aus 2-Hydroxyäthylacrylat und Äthylendimethacrylat (H^ lim = 300.000 Dalton) mit 8,25 Gew.-% Covalent gebundener D-Glucose, das mit physiologischer Lösung äquilibriert wurde, wurde eine Lösung von 200 mg der aktiven Eiweißstoffe aus Linsensamen (Titer der 1 ^igen Lösung 64) in 2 ml physiologischer Lösung aufgegeben. Nach, dem Einsickern der Lösung wurde die Säule mit physiologischer Lösung bei einer Geschwindigkeit von 8 ml/h eluiert, wobei jeweils 4-ml-Fraktionen abgenommen wurden. Das Eluat in den Fraktionen 3 bis 5 war hämoglutinaktiv. Ab Fraktion wurde die Elution mit einer 0,2 M Lösung von D-Glucose in physiologischer Lösung weitergeführt. Die Fraktionen 28 bis 30 wurden vereinigt, 48 h 4 mal gegen je 2 1 Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Ausbeute: 5)8 mg; Titer der 1 %igen Lösung: 256.
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Beispiel 12
Auf eine Säule (1 χ 30 cm), die 4 g eines Copolymerisate aus 2-Hydroxyäthylacrylat und JLthylendiacrylat (T^ lim = = 500.000 Dalton) mit 9,0 Gew.-% kovalent gebundener Mannose enthielt, das durch physiologische Losung äquilibriert wurde, wurde eine Lösung von 250 mg der aktiven Eiweißfraktion aus Linsensamen (Titer der 1 %igen Lösung 64·) in 2,5 ml physiologischer Lösung aufgegeben. Nach dem Einsickern der Probe wurde die Säule mit physiologischer Lösung bei einer Geschwindigkeit von 8 ml/h eluiert, wobei jeweils 4-ml-Fraktionen abgenommen wurden. Das Eluat in den Fraktionen 3 bis 5 war hämoglutinaktiv. Ab Fraktion wurde die Elution mit einer 0,2 M Lösung von D-Mannose in physiologischer Lösung weitergeführt. Die Fraktionen 31 bis 35 wurden vereinigt, 48 h 4 mal gegen je 3 1 Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Ausbeute: ca 1 mg.
Beispiel 13
Auf eine Säule (1 χ 30 cm), die mit 4 g eines sphärischen, makroporösen Copolymerisats aus 2-Hydroxyäthylmethacrylat und Ithylendimethacrylat (H^ lim = 1 00 00 Dalton) mit 7,66 Gew.-% chemisch gebundener D-Galactose gefüllt war, das mit physiologischer Lösung äquilibriert wurde, wurde eine Lösung von 300 mg eines lyophilisierten Extrakts aus den Samen von Rhicinus communis L. (Titer der 1 %igen Lösung 8192) in 3 ml physiologischer Lösung aufgegeben. Nach dem Einsickern der Probe wurde die Säule mit physiologischer Lösung bei einer Geschwindigkeit von 8 ml/h eluiert,
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wobei Jeweils 4-ml-Fraktionen abgenommen wurden. Das Eluat der Fraktion 3 war hämoglutinaktiv. Ab Fraktion 21 wurde die Elution mit einer 0,2 M Lösung von D-Galactose in physiologischer Lösung weitergeführt. Die Fraktionen bis 28 wurden vereinigt, 4ß h 4 mal gegen je 3 1 Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Ausbeute: 77,2 mg; Titer der 1 %igen Lösung: 32 768.
Beispiel
Auf eine Säule (1 χ 30 cm), die 4 g eines sphärischen, makroporösen Copolymerisats aus 2-Hydroxyäthylmethacrylat und Äthylendimethycrylat (H. -, . = 300.000 Dalton) mit 5,42 Gew.-% L-Fucose enthielt, das mit 0,15 M Phosphatpuffer von pH 7,9 äquilibriert wurde, wurde eine Lösung von 700 mg der hämoglutinaktiven Eiweißfraktion aus den Samen von upex europaeus L. in 6 ml desselben Puffers aufgegeben. Nach dem Einsickern der Probe wurde die Säule mit demselben Puffer bei einer Geschwindigkeit von 15 ml/h eluiert, wobei jeweils 5-nil-F_aktionen gesammelt wurden. Ab Fraktion 40 wurde die Elution mit 50 ml einer 0,2 M Lösung von L-Fucose im verwendeten Puffer weitergeführt. Nach dem Einsickern der Lösung von L-FucQse wurde die weitere Elution mit Phosphatpuffer bei unveränderter Geschwindigkeit vorgenommen. Die Fraktionen 43 bis 48 wurden vereinigt, 48 h 4 mal gegen je 5 1 Wasser dialysiert und lyophilisiert; Ausbeute: 7» ^ mS·
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_ 19 -
Beispiel 15
Auf eine Säule (1 χ 20 cm), die 3»1 S eines sphärischen, makroporösen Copolymerisats aus 2-Hydroxyäthylmethacrylat und Äthylendimethacrylat mit 8,15 Gew.-% kovalent gebundenem N-Acetyl-D-glucosamin enthielt, das mit physiologischer Lösung äquilibriert wurde, wurden 5 ^1 eines hämoglutinaktiven Extrakts aus 1,5 g Albumindrüsen der Weinbergschnecke aufgegeben. Nach dem Einsickern der Probe wurde die Säule mit physiologischer Lösung bei einer Geschwindigkeit von 8 ml/h gewaschen, wobei jeweils 4—ml-Fraktionen abgenommen wurden. Das Eluat war in keiner Fraktion hämoglutinaktiv. Ab Fraktion 23 wurde die Elution mit einer 0,2 Il Lösung von N-Acetyl-glucosamin in physiologischer Lösung weitergeführt. Ab Fraktion 38 wurde die Elution mit Glycinpuffer von pH 2,7 durchgeführt. Die Fraktionen 26 bis 28 wurden vereinigt j 48 h 4 mal gegen je 3 1 Wasser dialysiert und lyophilisiert. Ausbeute: 16,3 mg; Titer der 1 %igen Lösung: 32 768.
Beispiel 16
Auf eine Säule (1 χ 30 cm), die 4 g eines makroporösen Copolymerisats aus 2-Hydroxyäthylmethacrylat und Athylendimethacrylat mit 8 % daran gebundener D-Glucose enthielt, das mit physiologischer Lösung äquilibriert wurde, wurden 20 ml hämoglutinaktiver Extrakt aus den Samen von Canavalia ensiformis D. C. (Titer der 1 %igen Lösung 512 gegenüber trypsinisierten Blutkörperchen) aufgegeben. Nach dem Einsickern der Probe wurde die Säule mit' physiologischer Lösung bei einer Geschwindigkeit von 8 ml/h eluiert, wobei
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jeweils 4-ml-Fraktionen abgenommen wurden. Das Eluat in den Fraktionen 3 bis 6 war hämoglutinaktiv. Ab Fraktion 21 wurde die Elution mit einer 0,2 M Lösung von D-Glucose in physiologischer Lösung weitergeführt. Die Fraktionen 23 bis 27 wurden vereinigt, 48 h 4 mal gegen je 3 1 Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Ausbeute: 4-1,1 mg; Titer der Lösung: 2048.
Beispiel 17
Auf eine Säule (1 χ 30 cm), die 4 g eines makroporösen Copolymerisate aus 2-Hydroxyäthylmethacrylat und Ithylendimethacrylat mit 8,25 Gew.-% daran gebundener D-Glucose enthielt, das mit physiologischer Lösung äquilibriert wurde, wurden 50 mg Concanavalin A, das aus den Samen von Oanavalia ensiformis D. 0. (liter der 1 %igen Lösung 512) isoliert wurde, aufgegeben. Das Volumen der Probe betrug 2 ml. Fach dem Einsickern der Probe wurde die Säule mit physiologischer Lösung bei einer Geschwindigkeit von 8 ml/h, eluiert, wobei jeweils 4-ml-Fraktionen abgenommen wurden. Das Eluat war in keiner der Fraktionen hämo glut inaktiv. Ab Fraktion 17 wurde die Elution mit einer 0,2 M Lösung von D-Glucose in physiologischer Lösung fortgesetzt. Ab Fraktion 28 wurde die Elution mit einem Glycinpuffer von pH 2,7 durchgeführt. Die Fraktionen 19 bis 22 wurden vereinigt, 48 h. 4 mal gegen je 3 1 Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Ausbeute: 46,9 mg; Titer der 1 %igen Lösung gegenüber trypsinxsierten Blutkörperchen: 512.
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Beispiel 18
4,2 g eines Copolymerisate aus Hydroxyäthylmethacrylat und Ithylendimethacrylat (Hy. lim = 300.000 DaIton) vrurden 12 h in 70 ml Dioxan mit 6 Gew. -% HOl gequollen. Danach wurden 1,046 g H-Acetyl-D-galactosamin zugegeben, worauf die Suspension bei Raumtemperatur 6 h und anschließend bei 40 0C 6 Ii geschüttelt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde in 1 1 entionisiertes Wasser eingegossen und bis zur neutralen Reaktion und zur negativen Reaktion auf Zucker gewaschen. Das Copolymerisat wurde dann mit Äthanol, Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum bei 50 °C bis zur Gewicht skonstanz getrocknet. Eine Säule (1 χ 30 cm), die 4 g des obigen Derivats mit daran gebundenem N-Acetyl-D-galactosamin enthielt, wurde in physiologischer Lösung äquilibriert. Auf die Säule wurde eine Lösung von 228,6 mg der hämo glut inaktiven Eiweißfraktion aus den Samen von DoIichos hiflorus L. in 3 ml physiologischer Lösung aufgegeben. Nach dem Einsickern der Lösung wurde die Säule mit physiologischer Lösung bei einer Geschwindigkeit von 10 ml/h eluiert, wobei jeweils 5-ml-Fraktionen abgenommen wurden. Mach der Abnahme von 155 ^l Eluat wurde das affinitätsgebundene Eiweiß mit einer 0,2 M Lösung von N-Acetyl-D-galactosamin (5 ml) eluiert, worauf die Elution mit physiologischer Lösung fortgesetzt wurde. Die einzelnen Fraktionen wurden ÜV-spektrometrisch bei einer Wellenlänge von 280 nm vermessen. Die eiweißhaltigen Fraktionen wurden vereinigt (Gesamtvolumen 15 ml)» 4- mal gegen je 2 1 Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Ausbeute: 17,4 mg; Titer des resultierenden Produkts gegenüber der Blutgruppe A^: 4096. Die ursprüngliche Probe besaß einen Titer von 128.
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Beispiel 19
Auf eine Säule (1 x 30 cm), die 4- g eines makroporösen Copolymerisate aus 2-Hydroxyäthylacrylat und Äthylendiacrylat mit 14,16 Gew.-% daran gebundener D-Galactose enthielt, das mit physiologischer Lösung äquilibriert wurde, wurde eine Lösung von 562*7 mg eines lyophilisierten Extrakts aus den Samen von. ßhicinus communis L. in 6 ml physiologischer Lösung aufgegeben. Nach dem Einsickern der Probe wurde die Säule mit physiologischer Lösung bei einer Geschwindigkeit von 8 ml/h eluiert, wobei jeweils 4-ml-Fraktionen abgenommen wurden· Das Eluat der Fraktionen 3 bis 8 war hämoglutinaktiv. Auch die bei 280 nm gemessene Absorption war in diesen Fraktionen maximal« Nach Durchspülen der Säule mit 200 ml physiologischer Lösung wurde der Träger mit einer 0,2 M Lösung von D-Galactose in physiologischer Lösung eluiert. Die eiweißhaltigen Fraktionen wurden vereinigt (insgesamt 40 ml) und 4 mal gegen je 4 1 Wasser 48 h dialysiert, worauf das Produkt lyophilisiert wurde·
Ausbeute: 159,8 mg.
Aktivität der 1 %igen Lösung gegenüber Blutkörperchen der Gruppe A^:
Sulfatfraktion vor der Isolierung: 4096 Reine Eiweißfraktion nach der Isolierung: 16384
Die Reinheit des Präparats wurde durch diskontinuierliche alkalische Elektrophorese auf Polyacrylamidgel kontrolliert.
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Beispiel 20
Eine 300-mg-Eiweißfraktion aus den Samen von Ehicinus communis L. wurde in 20 ml physiologischer Lösung gelöst. Die Lösung wurde gegen Blutkörperchen der Gruppe A^ titriert. Aktivität bis zur 12. Fraktion: 4096. Dann wurden 4 g desselben Copolymerisate mit daran gebundener D- -Galactose wie in Beispiel 10 zugegeben, danach wurde die Aktivitätsabnähme in Abhängigkeit von der Zeit verfolgt. Nach 8 Stunden hatte sich die Aktivität stabilisiert. Das Adsorbens wurde abfiltriert und mit physiologischer Lösung gewaschen. Die gesamte Menge des Adsorbens wurde in eine Säule gebracht und mit physiologischer Lösung bis zum Verschwinden der Aktivität und Abnahme der Absorption auf den ursprünglichen Wert der physiologischen Lösung gewaschen. Danach wurde das gebundene Eiweiß mit einer 0,2 M Lösung von D-Galactose in physiologischer Lösung gewaschen. Die eiweißhaltigen Fraktionen wurden vereinigt und 48 h 4 mal gegenüber je 4 1 entionisiertem Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Ausbeute: 238,4 mg, entsprechend einer Kapazität von 59»6 mg pro g trockenes Copolymerisat mit daran gebundener D-Galactose.
Beispiel 21
Die Isolierung wurde analog zu Beispiel 20 mit dem Unterschied durchgeführt, daß die eingesetzte Eiweißmenge 184,4 g in 20 ml physiologischer Lösung betrug und als Adsorbens ein Copolymerisat mit 13,08 Gew.-% D-Glucose (3,05) diente. Die erzielte Ausbeute von 149,6 mg reinem
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Eiweiß entspricht einer Kapazität von 49,4 mg/g trockenem Sorbens.
Die Erfindung "betrifft zusammengefaßt makroporöse dreidimensionale Copolymerisate von Hydroxyalkylacrylaten oder Hydroxyalkylmethacrylaten, die im Alkylteil 1 "bis 4 C-Atome enthalten, mit Vernetzungsmitteln aus der Gruppe der Divinyl- oder Polyvinyl-Monomeren; sie sind dadurch gekennzeichnet, daß sie auf ihrer Oberfläche O-glycosidisch kovalent gebundene Saccharide oder Saccharidderivate aus der Gruppe der Monosaccharide, Oligosaccharide, Desoxyzucker, Aminozucker, der acylierten Saccharide oder Äther oder Halogenderivate von Monosacchariden und Oligosacchariden enthalten, ferner ein Herstellungsverfahren für die obigen Copolymerisate, bei dem dreidimensionale hydroxylgruppenhaltige Copolymerisate mit Sacchariden oder ihren Derivaten in einem inerten organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 20 bis 100 0C unter Katalyse mit HCl, BF* oder deren Gemischen umgesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen hydrophilen makroporosen dreidimensionalen Copolymerisate sind beispielsweise zur Isolierung physiologisch wirksamer Stoffe, die freie Bindungsstellen für Saccharide enthalten und mit ihnen also spezifische Komplexe bilden, verwendbar.
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Claims (2)

  1. Pat ent anspräche
    Hydrophile makroporöse dreidimensionale Copolymerisate von Hydroxyalkylacrylaten oder Hydroxyalkylmethacrylaten, die im Alkylteil 1 bis 4· C-Atome enthalten, mit unter den Divinyl- oder Polyvinyl-Monomeren ausgewählten Vernetzungsmitteln,
    dadurch gekennzeichnet, daß sie auf ihrer Oberfläche O-glycosidisch kovalent gebundene Saccharide oder deren Derivate aus der Gruppe der Monosaccharide, Oligosaccharide, Desoxyzucker, Aminozucker, der acylierten Saccharide und Äther oder Halogenderivate von Monosacchariden und Oligosacchariden aufweisen.
  2. 2. Verfahren zur Herstellung der Copolymerisate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die dreidimensionalen hydroxylgruppenhaltigen Copolymerisate mit den Sacchariden oder ihren Derivaten in einem inerten organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 20 bis 100 0C unter Katalyse mit HCl, BP, oder deren Gemischen umgesetzt werden.
    Verwendung der hydrophilen makroporosen dreidimensiona len Copolymerisate nach Anspruch 1 als oder zur Herstellung von spezifischen Sorbentien zur Isolierung physiologisch wirksamer Stoffe, die freie Bindungsstel len für Saccharide enthalten und mit ihnen spezifische Komplexe bilden.
    -(S 9326)-SI'-nu
    8Q9846/1Q&1
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