DE3644651C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine aktive Trägersubstanz bzw. ein aktives Trägermaterial und auf ein Adsorptionsmittel für die Affinitätschromatographie.

Die Affinitätschromatographie wird angewendet, um die Iso­ lierung und Reinigung durch Ausnutzung der Affinität zwischen einem Paar von Substanzen, die spezifische Wechselwirkung haben, zu erreichen. So eignet sich beispielsweise die Affinitäts­ chromatographie zur Reinigung von organischen Substanzen auf­ grund des Unterschieds ihrer biologischen Eigenschaften, oder aufgrund des Unterschieds der spezifischen chemischen Struktur des Moleküls.

Ein Adsorptionsmittel für die Affinitätschromatographie (Affi­ nitätsgel) kann hergestellt werden, indem Brückengruppen bzw. Verbindungsgruppen (Spacer) an eine unlösliche Matrix gebunden werden, so daß eine aktive Trägersubstanz erhalten wird, und indem danach ein Ligand an diesen Spacer gebunden wird. Die Adsorption einer Substanz, welche spezifisch in Wechselwirkung mit dem Liganden tritt, wird unter Verwendung eines solchen Adsorptionsmittels durchgeführt.

Geeignete Beispiele, welche Kombinationen aus einer solchen Substanz und einem Liganden veranschaulichen, sind folgende:

Enzym - Substrat, Produkt, Inhibitor, Coenzym, Effektor;
Antigen - Antikörper,
Rezeptor - Antagonist,
Nucleinsäure - Basenpaar,
Lecitin - Saccharose (Protein),
Metallchelat - Protein,
Hydrophobe Gruppe - Protein,
Wirtssubstanz - Gassubstanz.

Bei einem Trenn- oder Reinigungsverfahren oder bei der Analyse durch Affinitätschromatographie ist es wünschenswert, daß das vorstehend beschriebene aktive Trägermaterial, welches die Hauptkomponente des Adsorptionsmittels darstellt, die nachstehenden Eigenschaften besitzt: (1) Möglichst geringe nicht-spezifische Adsorption, (2) hohe Porosität, (3) es muß leicht eine Verbindung mit einer großen Menge des Liganden eingehen, (4) geeignete chemische Beständigkeit unter verschiedenen pH-Bedingungen, Salzkonzentrationen und Temperaturbedingungen, (5) es darf keine Volumenveränderung erleiden, (6) ausreichende physikalische Festigkeit und Beständigkeit, (7) hohe Fluidität bzw. Fließfähigkeit und (8) gute Beständigkeit gegen biologische Kontamination bzw. Verunreinigung.

Diese erwünschten Eigenschaften werden von den üblichen Trä­ germaterialien für Adsorptionsmittel für die Affinitäts­ chromatographie, wie Cellulose, Dextran, Polyacrylamid und Agarose, nicht immer erfüllt. Diese typischen Materialien sind sogenannte weiche Gele mit unzureichender Härte und besitzen daher unzureichende Fließfähigkeit und ungünstige Trenneigenschaften., was schwerwiegende Nachteile bedeutet. Sie haben außerdem nur kurze Lebensdauer.

P. D. G. Dean et al. beschreiben in "Affinity chromatography", IRL Press, Oxford 1985, Seiten 34 und 35, aktive Trägermate­ rialien für die Affinitätschromatographie, deren Ausgangs­ stoffe Hydroxy- oder Amino-Gruppen enthaltende Gele sind, die bei alkalischem pH-Wert zu Derivaten reagieren, die an den Stellen der früheren Substitution mit OH- oder NH₂-Gruppen langkettige hydrophile reaktive Oxiran-Seitenketten enthalten. Zur Bildung bioselektiver aktiver Trägermaterialien werden die Seitenketten, die an ihrem vom Polymer entfernten Ende noch Epoxy-Gruppen (Oxiran-Gruppen) tragen, mit nukleophilen Ligan­ den, wie Aminen oder Phenolen, umgesetzt. Als Beispiele für Polymere, die als Grundstoffe für derartige Trägermaterialien dienen, sind Sepharose®, Agarose oder Materialien auf der Basis von polymeren Acrylsäure-Derivaten genannt.

Aus einem Artikel von Jaroslava Turková in "Affinity chromato­ graphy", Elsevier, Amsterdam - New York 1978, Seiten 169 und 180, sind Gele bekannt, in denen OH-Gruppen enthaltende Poly­ mere mit 1,4-Butandioldiglycidylether umgesetzt und dadurch an der Hydroxy-Gruppe des Polymeren eine Seitenkette gebunden wur­ den, die an ihrem dem Polymeren entfernt gelegenen Ende eine reaktive Epoxy-Gruppe trägt.

In der US-Patentschrift Nr. 41 18 347 ist ein Füllstoff für Säulen für die Flüssigkeits-Chromatographie offenbart, der im wesentlichen aus einem porösen Copolymeren, einem Glycidyl­ monovinylester oder einem Glycidylmonovinylether und einem Alkylenglykoldivinylester als Vernetzungsmittel besteht. Die Eignung dieses Füllers für die Flüssigkeits-Chromatographie wird dadurch erreicht, daß man die Epoxy-Gruppen im erhaltenen Copolymeren durch hydrolytische bzw. alkoholytische Ringöff­ nungs-Reaktion in Hydroxy-Gruppen überführt, so daß das Polymere wiederum Seitenketten aufweist, die an ihren Enden Hydroxy- Gruppen tragen.

In der japanischen Patentschrift Nr. 5 40 09 991 ist ein Verfah­ ren zur Bestimmung bestimmter Glycoside durch Flüssigkeits- Chromatographie beschrieben. In diesem Verfahren wird ein porö­ ses Copolymer-Gel verwendet, das dadurch erhalten wird, daß man eine Mischung eines Glycidylmonovinylesters oder Glycidylmono­ vinylethers mit einem Alylenglykoldivinylester copolymerisiert und die Glycidyl-Gruppen des Copolymeren durch Hydrolyse ring­ öffnet, also in Hydroxy-Gruppen überführt. Das entstehende Polymere wird als Füllmaterial für die Chromatographiesäule verwendet.

Kieselsäure-Perlen, die in jüngerer Zeit angewendet wurden, besitzen geeignete Härte. Da dieses Material jedoch nicht unter alkalischen Bedingungen angewendet werden kann, be­ deutet die Verwendung dieses Materials eine weitgehende Beschränkung im Hinblick auf die Bedingungen für die Iso­ lierung, Elution und das Waschen.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein aktives Trägermaterial und ein Adsorptionsmittel für die Chromatographie zur Verfügung zu stellen, die frei von den vorstehen­ den Nachteilen der üblichen Adsorptionsmittel für die Chromatographie sind und die alle der genannten erwünschten Eigenschaften besitzen.

Die vorstehend genannte Aufgabe der Erfindung wird gelöst mit Hilfe des erfindungsgemäß aktiven Trägermaterials für die Affinitätschromatographie in Form eines porösen Copolymeren aus einem Gelcopolymeren, das im wesentlichen aus (A) einem Glycidylmonovinylester oder Gly­ cidylmonovinylether und (B) einem Alkylenglycoldivinylester gebildet ist, wobei die Komponente (A) mit Hilfe der Komponente (B) vernetzt ist und welches über die Epoxygruppe der Komponen­ te (A) gebundene Brückengruppen (Spacer-Gruppen) enthält, die befähig sind, Liganden über kovalente Bindungen zu binden, dadurch gekennzeichnet, daß die Brückengruppen

• (i) Glycidylgruppen sind, die erhältlich sind durch Ringöff­ nung der Epoxygruppen des Gelcopolymeren mit Wasser in Gegen­ wart einer Säure oder von Alkali unter Bildung von Hydroxygruppen und Umsetzen der Hydroxygruppen mit einer eine Glycidylgruppe enthaltenden Verbindung,
• (ii) Gruppen sind, die durch Umsetzen einer Verbindung der Formel I H₂NR′ (I)worin R′ für Wasserstoff, eine Aminogruppe, eine ω-Aminoalkyl­ gruppe oder eine ω-Carboxyalkylgruppe steht, mit der Epoxygruppe des Gelcopolymeren oder mit der Glycidylgruppe eines modifizierten Gelpolymeren erhältlich sind, das durch Ringöffnung der Epoxygruppen des Gelcopolymeren mit Wasser in Gegenwart einer Säure oder von Alkali und Binden einer eine Glycidylgruppe enthaltenden Verbindung an die so gebildeten Hydroxygruppen gebildet wird, wobei das Gewichtsverhältnis des Gelcopolymeren oder des modifizierten Gelcopolymeren zu der Verbindung mit der Gruppe der vorstehenden Formel I im Bereich von 1 zu 0,3 bis 10 liegt, oder
• (iii) Gruppen sind, die durch Binden einer eine Hydroxygruppe enthaltenden Aminocarbonsäure an die Epoxygruppe des Gelcopolymeren oder an die Glycidylgruppe des modifizierten Gelcopolymeren, welches durch Ringöffnung der Epoxygruppen des Gelcopolymeren mit Wasser in Gegenwart von Säure oder Alkali, Umsetzen der gebildeten Hydroxygruppen mit einer eine Glycidylgruppe enthaltenden Verbindung gebildet wurde, wobei das Gewichtsverhältnis des Gelcopolymeren oder des modifizierten Gelcopolymeren zu der eine Hydroxygruppe enthaltenden Aminocarbonsäure im Bereich von 1 zu 0,3 bis 10 liegt, erhältlich sind.

Die vorstehende erfindungsgemäße Aufgabe wird außerdem mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Adsorptionsmittels für die Affinitätschromatographie gelöst, welches aus dem aktiven Trägermaterial gemäß der Erfindung und Liganden, die über kovalente Bindungen an die Brücken­ gruppen des erfindungsgemäßen aktiven Trägermaterials gebunden sind.

Ausführungsformen der Erfindung werden durch die beigefügten Zeichnungen verdeutlicht.

Darin zeigen Fig. 1 und 2 Chromatographie von Globulin, das der Adsorption und Elution an erfindungsgemäßen Adsor­ bentien unterworfen worden ist. In Fig. 1 und 2 zeigt (A) den Fall, in welchem nur Elutionsmittel (2) angewendet wird und (B) den Fall, in dem das Elutionsmittel (1) zuerst an­ gewendet wird und dieses dann von dem durch den Pfeil ange­ zeigten Zeitpunkt an durch das Elutionsmittel (2) ersetzt wird.

Die Fig. 3, 4 und 5 zeigen Chromatogramme von DL-Tryptophan, D-Tryptophan bzw. L-Tryptophan, die an erfindungsgemäßen Adsorptionsmitteln der Adsorption und der anschließenden Elution unterworfen wurden.

Fig. 6 zeigt ein Chromatogramm von N-(3,5-Dinitrobenzoyl)-DL- leucin, das unter Anwendung eines erfindungsgemäßen Adsorp­ tionsmittels der Adsorption und der Elution unterworfen wur­ de.

Fig. 7 zeigt ein Chromatogramm von N-(3,5-Dinitrobenzoyl)-DL- phenylglycin, das mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Adsorp­ tionsmittels der Adsorption und Elution unterworfen wurde.

Die Fig. 8 bis 11 zeigen Chromatogramme von Proteinen bzw. Enzymen, welche unter Anwendung von erfindungsgemäßen Ad­ sorptionsmitteln der Adsorption und Elution unterworfen worden sind.

Die Fig. 12 bis 25 zeigen Chromatogramme, die unter Anwendung der erfindungsgemäßen Adsorptionsmittel durch Adsorption und Elution bei der Hochleistungs-Flüssigchromatographie erhalten wurden.

Die Erfindung wird nachstehend ausführlicher erläutert.

Wie in der US 41 18 347 angegeben ist, kann das erfindungs­ gemäße Copolymere durch Herstellung eines porösen Gels erhal­ ten werden, indem (A) Glycidylmonovinylester oder Glycidyl­ monovinylether und (B) ein Alkylenglycoldivinylester der Suspensionspolymerisation im wäßrigen Medium in Gegenwart eines wasserunlöslichen organischen Verdünnungsmittels unter­ worfen werden.

Da die vorstehend angegebenen Komponenten (A) und (B) in Wasser schwerlöslich sind, können diese Verbindungen mit Hilfe der wäßrigen Suspensionspolymerisation copolymerisiert werden, wobei diese Polymerisation mit Hilfe der Öl-in- Wasser-Suspensionsmethode durchgeführt werden kann. Wegen des Vorliegens eines organischen Verdünnungsmittels in dem Copoly­ merisationssystem unterliegt die Komponente (A) einer Ver­ netzung durch die Komponente (B), welche das Hauptver­ netzungsmittel darstellt. Der größte Teil der Epoxygruppen der Komponente (A), die keiner Ringöffnungsreaktion unter­ legen sind, verbleibt in dem Copolymerisationsprodukt. Die Gegenwart des organischen Lösungsmittels erleichtert außer­ dem die Einstellung des Porendurchmessers des gebildeten po­ rösen Gels.

Als die angegebene Komponente (A) können Glycidylester von Monovinylcarbonsäuren mit 3 bis 12 Kohlenstoffatomen und Glycidylether von Monovinylalkoholen mit 3 bis 12 Kohlen­ stoffatomen eingesetzt werden. Unter diesen Verbindungen werden besonders solche mit einer niederen Anzahl von Koh­ lenstoffatomen bevorzugt, zu denen Glycidylmethacrylat, Glycidylacrylat und Allylglycidylether gehören.

Es wird bevorzugt, als Komponente (B), mit deren Hilfe die Komponente (A) der Vernetzung unterworfen wird, einen Acryl­ säure- oder Methacrylsäureester eines Alkylenglycols mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen oder ein Polymerisat davon zu verwenden. So können beispielsweise als Komponente (B) Alkylenglycoldivinylester, wie Ethylenglycoldiacrylat, Ethylenglycoldimethacrylat, Propylenglycoldiacrylat und Propylenglycoldimethacrylat sowie Polyalkylenglycoldi­ vinylester, wie Polyethylenglycoldimethacrylat und Poly­ propylenglycoldimethacrylat verwendet werden.

Das Molverhältnis von Komponente (A) zu Komponente (B) sollte 10 bis 90 : 90 bis 10, vorzugsweise 40 bis 80 : 60 bis 20 betragen. Es ist möglich, bis zu der Hälfte der Menge der Komponente (A) durch ein Comonomeres oder einen niederen Vinylester, wie Methylmethacrylat, Methylacrylat oder Vinylacetat, zu ersetzen. Es ist selbstverständlich, daß der Anteil an Epoxygruppen in dem gebildeten Copolymeren ansteigt, wenn der Anteil der Komponente (A) erhöht wird. Ein höherer Anteil der Komponente (B) führt zu einem höheren Vernetzungsgrad, wobei ein härteres Copolymeres, welches eine dichter vernetzte Struktur und einen geringeren Quellungsgrad besitzt, gebildet wird. Copolymergele, die alle erwünschten Eigenschaften und Charakteristika aufweisen, können nicht gebildet werden, wenn das Molverhältnis zwischen den beiden Komponenten außerhalb des vorstehenden Bereiches liegt.

Das erfindungsgemäß angewendete organische Verdünnungsmittel kann irgendein Verdünnungmittel sein, welches während der Polymerisation nicht aktiviert wird, welches in Wasser ent­ weder unlöslich oder schwerlöslich ist und die organischen Monomeren löst. Die Volumenmenge des organischen Verdünnungs­ mittels sollte mindestens 30%, vorzugsweise 40 bis 80% des Gesamtvolumens aus Verdünnungsmittel und Monomerkompo­ nenten sein. Die Anwendung einer größeren Menge des orga­ nischen Verdünnungsmittels führt im allgemeinen zur Inhi­ bierung der Ringöffnungsreaktion der Epoxygruppen während der Polymerisation. Es ist normalerweise möglich, zu erreichen, daß 60 bis 90% der in dem ursprünglichen Anteil der Komponente (A) enthaltenen Epoxygruppen in dem Polymeri­ sationsprodukt verbleiben. Es scheint, daß die übrigen Epoxygruppen entweder während der Polymerisation hydroly­ siert werden oder für die Vernetzung verbraucht werden.

Wie vorstehend angegeben wurde, kann der Anteil an Epoxy­ gruppen in dem gebildeten Gel durch das Verhältnis der Komponente (A) zu der Komponente (B) oder durch partiellen Ersatz der Komponente (A) durch ein Comonomeres sowie auch durch die Menge des organischen Verdünnungsmittels geregelt werden. Der Gehalt an Epoxysauerstoff in dem Polymerprodukt beträgt vorzugsweise mindestens 1 Gew.-% und sollte maximal etwa 10 Gew.-% sein.

Wie vorstehend erwähnt, erleichtert die Anwendung des organischen Verdünnungsmittels während der wäßrigen Suspensionspolymerisation auch die Regelung des Porendurchmessers in dem gebildeten porösen Gel. Die Anwendung eines organischen Verdünnungsmittels, in welchem das gebildete Gel einen niederen Quellungsgrad zeigt, verursacht eine Phasentrennung in den suspendierten Teilchen, wodurch ein Gel mit riesigen Löchern gebildet wird. Im Gegensatz dazu verursacht die Anwendung eines Verdünnungsmittels, mit dem ein hoher Quellungsgrad erreicht wird, kaum eine Phasentrennung, da das gebildete Gel während der Polymerisation im gequollenen Zustand vorliegt, wodurch ein gequollenes Polymeres mit relativ kleinem Porendurchmesser gebildet wird. Der Quellungsgrad des Polymeren in dem organischen Verdünnungsmittel kann anhand der Lösungsparameter bestimmt werden. Zu organischen Verdünnungsmitteln, die vorteilhaft für die Zwecke der Erfindung verwendet werden können, gehören Cyclohexanon, Chlorbenzol, Benzol, Toluol, n-Propylacetat, n-Butylacetat und n-Octan, die in der Reihenfolge einer Erhöhung der Quellungseigenschaften für das resultierende Gel aufgeführt sind.

Die Ausgangsmonomeren können mit Hilfe einer gut bekannten üblichen Methode in Gegenwart eines freie Radikale bildenden Katalysators der wäßrigen Suspensionspolymerisation unterworfen werden. Das Volumen der wäßrigen Phase sollte mindestens gleich dem und bis zu etwa dem 10-fachen des Volumens der organischen Phase sein, wenn auch diese Volumina keiner speziellen Beschränkung unterliegen.

Die vorstehend erwähnten Spacer (Verbindungsgruppen bzw. Brückenglieder) können erfindungsgemäß in das Copolymergel eingeführt werden, indem die Reaktivität der Epoxygruppen der vorstehend beschriebenen Komponente (A) in dem Copolymergel ausgenutzt wird. Obwohl es erforderlich ist, daß die Verbindungsgruppen bzw. Brückenglieder eine funktionelle Gruppe aufweisen, welche über kovalente Bindungen eine Verbindung mit einem Liganden eingehen können, unterliegt die Struktur der Verbindungsgruppen keiner speziellen Beschränkung, ausgenommen, daß sie die vorstehend genannten funktionellen Gruppen aufweisen sollen. Die funktionelle Gruppe, welche sich mit einem Liganden kombinieren kann, kann beispielsweise eine Epoxygruppe, eine Aminogruppe, eine Hydrazinogruppe, eine Carboxylgruppe, eine Formylgruppe oder eine Thiolgruppe sein. Die Verbindungsgruppe kann leicht mit Hilfe einer gut bekannten Methode entweder in einer Reaktionsstufe oder in mindestens zwei Reaktionsstufen in das Polymergel eingeführt werden. Die Einführung der Verbindungsgruppen wird nachstehend anhand von Beispielen beschrieben.

(i) Einführung von Verbindungsgruppen, die eine Epoxy­ gruppe als funktionelle Gruppe aufweisen

Gemäß einer beispielhaften Ausführungsform kann, nachdem die Epoxygruppe der Komponente (A) in dem Copolymergel gemäß der Erfindung der ringöffnenden Modifizierung mit Hilfe einer eine Hydroxylgruppe enthaltenden Verbindung, wie Wasser, unter Bildung einer Hydroxylgruppe unterworfen worden ist, eine Verbindung mit einer Glycidylgruppe an der Hydroxylgruppe gebunden werden, wodurch eine Verbindungsgruppe eingeführt wird, welche die Epoxygruppe dieser Glycidylgruppe enthält. Das gebildete Polymere, in welches eine Glycidylgruppe eingeführt worden ist, wird nachstehend auch als modifiziertes Copolymergel gemäß der Erfindung bezeichnet. Die vorstehend erwähnte Modifizierung unter Ringöffnung wird in Gegenwart einer Säure oder von Alkali durchgeführt, wobei z. B. das Copolymere in einer wäßrigen, Schwefelsäure oder Chlorwasserstoffsäure als Katalysator enthaltenden Lösung etwa 2 Stunden auf 70° bis 100°C erhitzt wird. Es wird bevorzugt, daß die Konzentration der Säure 0,1 n bis 0,5 n beträgt. Die ringöffnende Modifizierung des Copolymeren läuft fast quantitativ ab. Als Verbindung mit einer Glycidylgruppe, welche an die durch die ringöffnende Modifizierung gebildete Hydroxylgruppe gebunden wird, können Epihalogenhydrine, wie Epichlorhydrin und Epibromhydrin, Diglycidylether, wie Ethylenglycol-di-glycidylether, 1,4-Butandiol-diglycidylether, Polyethylenglycol-diglycidylether und Alkyldien-diepoxide, wie 1,3-Butadien-epoxid und 1,7-Octadien-epoxid verwendet werden. Die Verbindung mit einer Glycidylgruppe kann an die Hydroxylgruppe gebunden werden, indem das Copolymergel, welches der ringöffnenden Modifizierung unterworfen worden ist, in einer wäßrigen Lösung einer anorganischen Base, wie Natriumhydroxid oder Kaliumcarbonat, mit Epichlorhydrin umgesetzt wird, oder indem das hydrophile Copolymere in einer wäßrigen Lösung einer anorganischen Base, wie Natriumhydroxid oder Kaliumcarbonat mit einem Gehalt an Natriumborhydrid mit Ethylenglycol-diglycidylether, 1,4-Butandiol-diglycidylether oder Polyethylenglycol-diglycidylether umgesetzt wird. Es wird bevorzugt, daß die Anzahl der -C₂H₄O-Einheiten in dem erfindungsgemäß eingesetzten Polyethylenglycol-diglycidylether 1 bis 10 beträgt.

(ii) Einführen von Verbindungsgruppen mit einer Amino­ gruppe einer Hydrazinogruppe oder einer Carboxylgruppe als funktionelle Gruppe

Eine Verbindungsgruppe, die eine Aminogruppe, eine Hydra­ zinogruppe, die durch die nachstehende allgemeine Formel (II) dargestellt wird, oder eine Carboxylgruppe enthält

-NHR (II)

(worin R ein Wasserstoffatom, eine Aminogruppe, eine ω- Aminoalkylgruppe, ω-Carboxyalkylgruppe, eine ω-Carboxy­ alkanoylgruppe, eine ω-Carboxyalkanoyl-aminogruppe oder eine ω-Carboxyalkanoyl-aminoalkylgruppe bedeutet) wird entweder durch Umsetzung der Epoxygruppe der Komponente (A) in dem erfindungsgemäßen Copolymergel oder der Glycidylgruppe in dem modifizierten erfindungsgemäßen Copolymergel eingeführt, indem eine Aminoverbindung der allgemeinen Formel (I)

H₂NR′ (I)

(worin R′ für Wasserstoff, eine Aminogruppe, eine ω-Aminoalkylgruppe oder eine ω-Carboxyalkylgruppe steht) entweder mit der Epoxygruppe in der Komponente (A) oder mit der Glycidylgruppe in dem modifizierten Copolymeren umge­ setzt wird.

Wenn eine Aminoverbindung eingesetzt wird, in der R′ keine ω-Carboxyalkylgruppe ist, kann man wahlweise die Aminoverbin­ dung mit der Epoxygruppe umsetzen und danach das Reaktions­ produkt mit einem Alkylen-dicarbonsäureanhydrid zur Umsetzung bringen. Diese Reaktionen laufen nach dem nachstehend an­ gegebenen Formelschema ab. In den Formeln bedeuten die Bezeichnungen (Grundpolymer)

das Copolymergel oder das modifizierte Copolymergel gemäß der Erfindung und

eine Epoxy- oder Glycidylgruppe in diesen Copolymeren. Da­ bei steht m für 1 oder 2 und jedes der Symbole m, p, q und r für eine ganze Zahl von mindestens 1, vorzugsweise 1 bis 12.

Es ist zwar möglich, die Umsetzung der Verbindung der Formel (D) oder der Verbindung der allgemeinen Formel (D′) oder (F) in dem vorstehenden Reaktionsschema mit der Epoxygruppe des Copolymergels oder mit der Glycidylgruppe des modifizierten Copolymergels in einem Lösungsmittel durchzuführen, es ist jedoch nicht erforderlich, ein Lösungsmittel zu verwenden, wenn diese Verbindungen unter den Reaktionsbedingungen flüssig sind. Als Lösungsmittel wird gewöhnlich Wasser angewendet. Zu anderen Verbindungen, die als Lösungsmittel geeignet sind, gehören Kohlenwasserstoffe, wie n-Hexan, Benzol und Xylol, Ether, wie Tetrahydrofuran und Dioxan, chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform und Chlorbenzol, Alkohole, wie Ethanol und Methylcellosolve und Ketone, wie Aceton und Methylisobutylketon, sowie Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid. Diese Verbindungen können einzeln oder in Kombination angewendet werden. Es ist zwar nicht speziell notwendig, einen Katalysator anzuwenden, es ist jedoch möglich, ein Alkali- oder Erdalkalihydroxid oder -carbonat einzusetzen, wie Natriumhydroxid oder Kaliumcarbonat.

Als Verbindungen, die durch die allgemeine Formel (D′) dargestellt werden, können Diaminoalkane, wie Ethylendiamin, 1,3-Diaminopropan, 1,4-Diaminobutan, 1,5-Diaminopentan, 1,6-Diaminohexan, 1,7-Diaminoheptan, 1,8-Diaminooctan, 1,9- Diaminononan, 1,10-Diaminodecan und 1,12-Diaminododecan verwendet werden.

Als Verbindungen der allgemeinen Formel (F) sind Aminocarbonsäuren anwendbar, wie Glycin, β-Alanin, 4-Aminobuttersäure, 6-Aminocapronsäure und 8-Aminocaprylsäure.

Die Reaktionsbedingungen unterliegen zwar keinen strengen Beschränkungen, es wird jedoch bevorzugt, die Reaktion unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen durchzuführen:

• (1) Es wird bevorzugt, das Verhältnis (a/b) zwischen dem Gewicht (a) des Copolymergels oder des modifizierten Copolymergels gemäß der Erfindung und dem Gewicht (b) der Verbindung der Formel (D) oder der allgemeinen Formel (D′) oder (F) auf einen Wert im Bereich von 1 : 0,3 bis 10, vorzugs­ weise 1 : 0,3 bis 3, einzustellen.
• (2) Es wird bevorzugt, daß die Reaktionstemperatur 0 bis 150°C, vorzugsweise Raumtemperatur bis 100°C, beträgt.
• (3) Es wird bevorzugt, daß die Reaktionsdauer bei 1 bis 60 Stunden, vorzugsweise 1 bis 30 Stunden, liegt.
• (4) Es wird bevorzugt, daß der Reaktionsdruck im Bereich von Atmosphärendruck bis 10 MPa liegt, wobei Normal­ druck bzw. Atmosphärendruck bevorzugt wird.

Es gibt keine speziellen Erfordernisse für die Aufarbeitung nach der Reaktion und das Reaktionsprodukt kann mit Hilfe üblicher Methoden, wie durch Filtration und Waschen, in geeigneter Weise aufgearbeitet werden.

Das Adsorptionsmittel für die Affinitätschromatographie, welches unter Verwendung einer Verbindung der Formel (D) oder einer Ver­ bindung der allgemeinen Formel (D′) erhalten wurde, wird erforderlichenfalls einer zusätzlichen Behandlung durch Einwirkung eines Säureanhydrids der allgemeinen Formel (E) oder (E′) auf die endständige Aminogruppe des aktiven Trä­ gers unterworfen, wodurch es in ein aktives Trägermaterial mit Carboxylgruppen umgewandelt wird. Als Lösungsmittel für diese Reaktion wird gewöhnlich Wasser eingesetzt, außer­ dem können Ether, Tetrahydrofuran und Dioxan, Carbonsäuren, wie Essigsäure, und Pyridin als Lösungsmittel verwendet werden. Wenn auch keine spezielle Notwendigkeit für die Anwendung eines Katalysators besteht, ist es doch möglich, den pH-Wert des flüssigen Reaktionssystems durch Zugabe einer Säure, wie Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure, oder einer alka­ lischen Verbindung, wie Natriumhydroxid oder Kaliumcarbonat, einzustellen.

Als Alkylendicarbonsäureanhydride, die durch die allgemeine Formel (E) oder (E′) dargestellt werden, können Bernsteinsäureanhydrid, Glutarsäureanhydrid, Adipinsäureanhydrid, Pimellinsäureanhydrid, Korksäureanhydrid, Azelainsäureanhydrid und Sebacinsäureanhydrid verwendet werden.

Die Reaktionsbedingungen unterliegen keiner strengen Einschränkung, es wird jedoch im allgemeinen bevorzugt, die Reaktion unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen durchzuführen:

• (1) Es wird bevorzugt, das Verhältnis (a′/b′) aus dem Gewicht (a′) des Aminierungsprodukts des Copolymergels oder des modifizierten Copolymergels gemäß der Erfindung zu dem Gewicht (b′) der Verbindung der allgemeinen Formel (E) oder (E′) auf einen Wert im Bereich von 1 : 0,3 bis 10, vorzugsweise 1 : 0,3 bis 3 einzustellen.
• (2) Es wird bevorzugt, daß die Reaktionstemperatur bei 0° bis 150°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur bis 100°C liegt.
• (3) Es wird bevorzugt, daß die Reaktionsdauer 1 bis 60 Stunden, vorzugsweise 1 bis 30 Stunden, beträgt.
• (4) Es wird bevorzugt, daß der Reaktionsdruck zwischen Normaldruck (Atmosphärendruck) bis 10 MPa liegt, wobei Atmosphärendruck bevorzugt wird.

Im Hinblick auf die Aufarbeitung nach dieser Reaktion sind keine speziellen Erfordernisse zu beachten und das Reaktionsprodukt kann in geeigneter Weise mit Hilfe von üblichen Methoden, wie durch Filtration und/oder Waschen aufbereitet werden.

Gemäß einer anderen geeigneten Methode zum Einführen von Verbindungsgruppen, die eine Carboxylgruppe als funktionelle Gruppe enthalten, wird eine Aminocarbonsäure, die eine Hydroxylgruppe enthält, entweder auf die Epoxygruppe des Copolymergels (A) gemäß der Erfindung oder auf die Glycidylgruppe des modifizierten Copolymergels gemäß der Erfindung zur Einwirkung gebracht, wobei die Carboxylgruppe an die Epoxygruppe oder die Glycidylgruppe gebunden wird.

Als Aminocarbonsäuren, die Hydroxylgruppen aufweisen, eignen sich Aminosäurederivate, wie Serin, Homoserin, Threonin, 4-Hydroxyprolin, 4-Amino-3-hydroxybuttersäure und N-Tris-(hydroxymethyl)- methylglycin sowie Aminozucker-Derivate, wie Glucosaminsäure.

Bei dieser Umsetzung tritt die Epoxygruppe des erfindungsgemäßen Copolymergels oder die Glycidylgruppe des erfindungsgemäßen modifizierten Copolymergels in Reaktion (in Kombination) mit der Aminogruppe der eine Hydroxylgruppe enthaltenden Aminocarbonsäure, wobei eine Ringöffnungsreaktion der Epoxygruppe oder Glycidylgruppe stattfindet, wodurch eine Hydroxylgruppe und ein Carbonsäurerest mit einer Hydroxylgruppe gebildet wird.

Die Einwirkung der Aminocarbonsäure mit einer Hydroxylgruppe auf die Epoxygruppe oder auf die Glycidylgruppe kann in Gegenwart eines Lösungsmittels erfolgen. Als Lösungsmittel für diese Reaktion wird gewöhnlich Wasser angewendet, es können aber auch Kohlenwasserstoffe, wie n-Hexan, Benzol und Xylol, Ether, wie Tetrahydrofuran und Dioxan, chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform und Chlorbenzol, Alkohole, wie Ethanol, sowie Methylcellosolve und Ketone, wie Aceton und Methylisobutylketon, sowie Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid als Lösungsmittel angewendet werden. Diese Verbindungen können entweder einzeln oder in Kombination verwendet werden. Es besteht zwar keine bestimmte Notwendigkeit zur Anwendung eines Katalysators, es ist jedoch möglich, ein Hydroxid oder Carbonat eines Alkali- oder Erdalkalimetalls, wie Natriumhydroxid oder Kaliumcarbonat, als Katalysator einzusetzen.

Die Bedingungen dieser Reaktion unterliegen keiner speziellen Beschränkung und es ist möglich, diese Reaktion unter ähnlichen Bedingungen durchzuführen, wie sie für die Umsetzung der Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit der Epoxygruppe oder der Glycidylgruppe angewendet werden.

Durch die Einführung von Verbindungsgruppen mit Hilfe der vorstehend erwähnten, Hydroxylgruppen enthaltenden Aminocarbonsäure wird sogar die nicht-spezifische Adsorption vermieden, die auf die hydrophoben Eigenschaften des Teils des Copolymergels oder des modifizierten Copolymergels, der verschieden von dem vorstehenden Grundcopolymeren ist, oder auf die hydrophoben Eigenschaften des Spacers zurückzuführen ist.

(iii) Einführen von Verbindungsgruppen, die eine Formyl­ gruppe als funktionelle Gruppe enthalten

Die funktionelle Gruppe einer Verbindungsgruppe, die eine Epoxygruppe als funktionelle Gruppe enthält und die durch die vorstehende Einführungsreaktion (i) erhalten worden ist, kann in einfacher Weise hydrolysiert werden, wobei der Spacer in ein 1,2-Glycol umgewandelt wird. Dieses 1,2-Glycol wird dann durch Umsetzung mit Periodsäure in eine Formylgruppe übergeführt. Die Bedingungen für diese Reaktion unterliegen keiner speziellen Beschränkung. Die Reaktion kann durchgeführt werden, indem Periodsäure oder deren anorganische Salze mit Hilfe einer üblichen Methode auf das 1,2-Glycol zur Einwirkung gebracht werden, beispielsweise unter Anwendung von Wasser, Ethanol, Essigsäure oder eines Gemisches dieser Flüssigkeiten als Lösungsmittel bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 50°C.

(iv) Einführen von Verbindungsgruppen mit einer Thiolgruppe als funktionelle Gruppe

Durch Einwirkung von Natriumthiosulfat auf die funktionelle Gruppe des Spacers, der eine Epoxygruppe als funktionelle Gruppe aufweist, erhalten durch die vorstehend beschriebene Einführungreaktion (i), und durch anschließende Einwirkung von Chlorwasserstoffsäure auf die modifizierte Verbindungsgruppe, ist es möglich, eine Thiolgruppe einzuführen. Diese Reaktion kann in einfacher Weise nach einer üblichen Methode durchgeführt werden, beispielsweise unter Anwendung von Wasser als Lösungsmittel und bei Raumtemperatur.

Die Art des erfindungsgemäß zu verwendenden Liganden unterliegt keiner speziellen Beschränkung. Der Ligand wird unter Berücksichtigung des zu adsorbierenden Materials ausgewählt.

Zu bevorzugten Beispielen für Liganden, die gemäß der Erfindung eingesetzt werden, gehören Lectin, Heparin, Protein A, Serum-Albumin, Triazinfarbstoffe, Acriflavin, Phenylborsäure, Iminodiessigsäure, Ethylendiamindiessigsäure, Biotin und N-Acetylglucosamin.

Lecitin ist ein Protein, welches eine spezifische Verbindung mit einem Zucker einer bestimmten Struktur eingehen kann. In neuerer Zeit wurde festgestellt, daß Zuckerproteine oder Zuckerlipoide (Liposaccharide) an der Zelloberfläche eine Schlüsselrolle bei der Selbsterkennung von Zellen und bei der interzellulären Weiterleitung von Informationen spielen. Adsorptionsmittel, welche Lectin als Liganden enthalten, werden nun weitgehend für Untersuchungen auf diesem Gebiet eingesetzt.

Die Art des Lectins, das an den vorstehend beschriebenen Spacer gebunden ist, unterliegt keiner speziellen Beschränkung. So können beispielsweise Pflanzenlectine, wie Concanavalin A, und Lectine, die sich von Abrus precatorius, Triticum vulgaris, Ricinus communis, Glycine max, Ulex europaeus, Phaseolus vulgaris, Lotus tetragonolobus, Lens culinaris, Pisum sativum und Arachis hypogaea ableiten, sowie tierische Lectine, wie von Limulus polyphemus, Aalen und Schnecken abgeleitete Lectine, eingesetzt werden.

Heparin ist ein Mucopolysaccharid mit koagulationshemmender Aktivität. Es ist befähigt, verschiedene Blutgerinnungsfaktoren, Lipoprotein-Lipase, DNS-Polymerase und viele andere Proteine zu adsorbieren, so daß es in weitem Umfang als Ligand in Adsorptionsmittel für die Affinitätschromatographie angewendet wird.

Protein A ist ein Protein, das aus der Zellmembran von Staphylococcus aureus erhalten wird. Da es starke Adsorptionswirkung für Immunoglobulin hat, ist es als Ligand für die Affinitätschromatographie zur Untersuchung der Mechanismen der Immunität wertvoll.

Serum-Albumin ist der Hauptproteinbestandteil im Blutplasma und hat die Funktion, Fettsäuren, Wirkstoffe bzw. Arzneimittel etc. zu transportieren, indem es diese bindet. Da es eine Polypeptidstruktur aufweist, die viele optische aktive Zentren besitzt, ist es als Ligand für ein Affinitätsgel wertvoll, welches in Wechselwirkung mit optisch aktiven, physiologisch aktiven Substanzen treten kann und ist somit zur Trennung und Analyse solcher Substanzen wertvoll.

Triazinfarbstoffe wurden ursprünglich als Reaktivfarbstoffe zum Färben von Textilien entwickelt. Wenn ein aus Dextran und dem Triazinfarbstoff Cibacron®Blau F3GA gebildetes Konjugat als Markerreagenz für die Gelfiltration angewendet wird, zeigt sich, daß Triazinfarbstoffe die Fähigkeit haben, Enzyme, wie Dehydrogenase und Kinase, zu adsorbieren. Danach zeigte sich, daß Triazinfarbstoffe die Fähigkeit haben, sich spezifisch mit den meisten Enzymen, die NAD⁺ und NADP⁺ benötigen, zu konjugieren (kombinieren). Infolgedessen wurden Triazinfarbstoffe in weitem Umfang zur Durchführung von zahlreichen Analysen und Reinigungsverfahren auf dem Gebiet der Biochemie angewendet.

Die Art des zu verwendenden Triazinfarbstoffes unterliegt keiner speziellen Beschränkung. Zu geeigneten Beispielen gehören Cibacron Blau 3G-A (Procion Blau H-B), Procion Rot HE-3B, Procion Gelb H-A und Procion Blau MX-3G.

Acriflavin ist eine kationische tricyclische aromatische Verbindung mit bakterizider Aktivität. Es eignet sich als Ligand für die Affinitätschromatographie zur Adsorption und Isolierung von zahlreichen Verbindungen, die aromatische Ringe aufweisen, aufgrund der ionischen Wechselwirkung und des Ladungstransfers.

Phenylborsäure kann durch reversible Reaktion mit einer Verbindung, die Hydroxylgruppen, gebunden an benachbarte Kohlenstoffatome aufweist, cyclische Ester bilden. Es eignet sich als Ligand für die Affinitätschromatographie zur Adsorption und Isolierung von Nucleosiden, Nucleotiden, Catecholaminen, Kohlenhydraten und t-RNA's.

Iminodiessigsäure kann zahlreiche Metallchelate mit Kobalt, Nickel, Kupfer, Zink bzw. Cadmium bilden, indem es über seine zwei Sauerstoffatome und ein Stickstoffatom als dreizähniger Ligand fungiert. Andererseits können Proteine, die spezifische Aminosäure-Einheiten aufweisen, Liganden für Metallatome darstellen. Daher kann Iminodiessigsäure als Ligand für Chromatographieverfahren dienen, bei denen Proteine mit Hilfe von Iminodiessigsäure, die kombinierte Metallatome enthält, isoliert und gereinigt werden.

Ethylendiamindiessigsäure kann, wie Iminodiessigsäure, zahlreiche Metallchelate bilden. Sie eignet sich daher ebenfalls zur Isolierung und Reinigung von Proteinen.

Biotin ist ein Vitamin, das in der Leber und in Hefen vorkommt und die Rolle eines Coenzyms für Enzyme spielt, welche an der Reaktion der Bindung von Kohlendioxid beteiligt sind. Es kann spezifisch an Avidin im Eiweiß gebunden werden und kann daher auf ein Adsorptionsmittel für die Hochleistungs-Isolierung oder -Reinigung von instabilen physiologisch aktiven Substanzen angewendet werden, die üblicherweise mit Hilfe eines weichen Gels isoliert und gereinigt wurden.

N-Acetylglucosamin besitzt Affinität gegenüber dem Enzym Lysozym, das im Eiweiß und in tierischen Sekreten vorkommt. Außerdem hat es Affinität gegenüber Lectinen, wie dem von Triticum vulgaris abgeleiteten Lectin. Aus diesem Grund eignet sich N-Acetylglucosamin als Ligand für die Affinitätschromatographie, bei der diese Enzyme und Proteine isoliert und/oder gereinigt werden.

Die Bindung des Liganden an die Verbindungsgruppe über eine kovalente Bindung kann in einem geeigneten Lösungsmittel, falls erforderlich mit Verwendung eines geeigneten Katalysators, eines geeigneten Reagens oder eines ähnlichen Mittels, in Abhängigkeit von der funktionellen Gruppe des Spacers bzw. der Verbindungsgruppe, durchgeführt werden. Wenn die funktionelle Gruppe eine Epoxygruppe ist, kann z. B. Chlorwasserstoffsäure oder eine alkalische Substanz, wie Natriumcarbonat oder Natriumhydrogencarbonat, als Katalysator eingesetzt werden. Wenn die funktionelle Gruppe eine Carboxylgruppe ist, kann in typischer Weise N-Hydroxysuccinimid oder Dicyclohexyl-carbodiimid als Reagens eingesetzt werden. Wenn die funktionelle Gruppe eine Carboxylgruppe, eine Aminogruppe oder eine Hydrazinogruppe ist, kann ein Kondensationsmittel, wie 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid verwendet werden. Außerdem wird ein Reduktionsmittel, wie Natriumcyanborhyrid, angewendet, wenn die funktionelle Gruppe eine Formylgruppe ist. Wasser wird normalerweise als Lösungsmittel eingesetzt und falls erforderlich kann als Lösungsmittel auch eine Alkalimetallphosphat- oder -acetatpufferlösung verwendet werden. Es ist möglich, ein anorganisches Salz, wie Natriumchlorid, zuzusetzen.

Die Bedingungen der Reaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Copolymergel oder modifizierten Copolymergel und einem Liganden unterliegen keiner strengen Einschränkung, es ist jedoch im allgemeinen wünschenswert, daß die Reaktion unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen vorgenommen wird:

• (1) Es wird bevorzugt, daß das Gewichtsverhältnis von Copolymergel oder modifiziertem Copolymergel gemäß der Erfindung, an welches der Spacer gebunden ist, zu dem Liganden im Bereich von 1 : 0,003 bis 0,3, vorzugsweise 1 : 0,05 bis 0,2, liegt.
• (2) Es wird bevorzugt, die Reaktionstemperatur bei 0°C bis Raumtemperatur, vorzugsweise 4°C bis Raumtemperatur, zu halten.
• (3) Es wird bevorzugt, daß die Reaktionsdauer 1 bis 72 Stunden, insbesondere 2 bis 12 Stunden, beträgt.

Für die Aufarbeitung nach dieser Reaktion bestehen keine speziellen Erfordernisse; das Reaktionsprodukt kann daher mit Hilfe üblicher Methoden, wie durch Filtration und/oder Waschen in geeigneter Weise nachbehandelt werden.

Mit Hilfe der Erfindung wird eine wie vorstehend beschriebene aktive Trägersubstanz zur Verfügung gestellt, welche aktive Trägergruppen enthält und befähigt ist, über kovalente Bindungen einen Liganden für die Affinitätschromatographie zu binden. Die aktive Trägersubstanz bzw. das aktive Trägermaterial eignet sich daher als wasserunlösliches aktives Trägermaterial für die Affinitätschromatographie.

Außerdem zeigt das aktive Trägermaterial, welches hydrophile Eigenschaften hat, und von einem Gelcopolymeren oder modifizierten Gelcopolymeren gemäß der Erfindung abgeleitet ist, keine nichtspezifische Adsorption, so daß es aufgrund seiner porösen Struktur vorteilhaft für die Wechselwirkung zwischen Liganden und zu adsorbierenden Substanzen eingesetzt werden kann.

Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße aktive Trägermaterial ein synthetisches Polymeres, das durch chemische kovalente Bindung hergestellt worden ist. Es ist daher physikalisch, chemisch und physiologisch beständig und beeinflußt unter keiner der angewendeten Bedingungen die Bindung der Liganden oder die Isolierung und Elution sowie das Auswaschen der zu adsorbierenden Substanzen. Diese guten Eigenschaften sind für die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und für industrielle Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Substanzen notwendig.

Mit Hilfe der Erfindung wird ein Adsorptionsmittel für die Chromatographie zugänglich, welches durch Binden von Liganden über kovalente Bindungen an geeignete Verbindungsgruppen gebildet wird, die ihrerseits an ein Basis-Copolymer gebunden sind, das alle vorstehend erläuterten, für ein Adsorptionsmittel für die Affinitätschromatographie erwünschten Eigenschaften aufweist.

Wie das übliche Adsorptionsmittel, welches ein weiches Gel darstellt, kann das erfindungsgemäße Adsorptionsmittel als Füllmaterial bzw. Trägermaterial für die Affinitätschromatographie verwendet werden. Da das erfindungsgemäße Adsorptionsmittel in geeigneter Weise unter Druck angewendet werden kann, nachdem es in eine druckfeste Kolonne gepackt worden ist, wird darüber hinaus der für die Chromatographie benötigte Zeitbedarf weitgehend vermindert, wodurch der Wirkungsgrad der Isolierung und Reinigung erhöht werden kann. Es bedarf keiner Erwähnung, daß dieser außerordentliche Vorteil wesentlich ist, wenn das Adsorptionsmittel für die Hochleistungs-Flüssigphasenchromatographie oder für ein industrielles System zur Isolierung und Trennung angewendet werden soll. Im Vergleich mit den normalerweise eingesetzten Adsorptionsmitteln für die Affinitätschromatographie, die Bromcyan als Spacer enthalten, zeigt das Adsorptionsmittel, welches durch Binden von Liganden über kovalente Bindungen an die vorstehend erwähnten, an das Copolymergel gebundenen Spacergruppen gebildet ist, nicht nur die vorstehend erwähnten zahlreichen Vorteile, sondern hat auch nicht den Nachteil, daß die Liganden während der Anwendung abgetrennt werden. Außerdem ist es möglich, daß bei diesem Adsorptionsmittel die Länge der Spacer beliebig geregelt wird. Die Liganden zeigen daher ausgezeichnete Fähigkeit zur Adsorption der gewünschten Substanz und zeigen praktisch keine nicht-spezifische Adsorption. Das erfindungsgemäße Adsorptionsmittel für die Chromatographie ist daher außerordentlich wirksam.

Nachstehend wird das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Adsorptionsmittels für die Chromatographie aus bekannten Substanzen ausführlicher anhand von repräsentativen Beispielen beschrieben. Es ist selbstverständlich, daß diese Beispiele lediglich der Erläuterung, nicht jedoch der Beschränkung der Erfindung dienen sollen.

Beispiel 1

Zu einem Epoxygruppen enthaltenden, aus Glycidylmethacrylat und Ethylenglycoldimethacrylat gebildeten Copolymergel (2,0 g) wurden 6 ml 25-%iges wäßriges Ammoniak gegeben und das Gemisch wurde unter Rühren 5 Stunden lang bei etwa 45°C gehalten, um die Umsetzung durchzuführen. Danach wurde das gebildete Gel durch Filtration gewonnen, das gewonnene Gel mit einer großen Wassermenge gewaschen und getrocknet. Die Menge der durch Neutralisationstitration bestimmten Aminogruppen betrug 1,3 mM pro 1 g des trockenen Gels.

Beispiel 2

Ein aus Glycidylmethacrylat und Ethylenglycol-dimethacrylat hergestelltes Copolymeres wurde mit Hilfe von Wasser einer Ringöffnungsreaktion unterworfen. In das Reaktionsprodukt wurden mit Hilfe von Epichlorhydrin Glycidylgruppen eingeführt, wobei ein Gel erhalten wurde (Epoxygruppengehalt : 0,3 mM pro 1 g des trockenen Gels). Dann wurde 1,0 g des vorstehenden Gels mit 2,0 ml Wasser und 0,42 g 1,3-Diaminopropan vermischt und das Gemisch dann 10 Stunden lang unter Rühren und Erhitzen auf 60°C umgesetzt. Das Gel wurde dann durch Filtration gewonnen, mit Wasser, einer 0,01 n wäßrigen Chlorwasserstoffsäurelösung und einer 0,1 n wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, wonach das gewaschene Gel erneut mit einer großen Menge Wasser gewaschen wurde, und getrocknet wurde. Der Anteil an Aminogruppen, bestimmt durch Kolorimetrie mit Hilfe von Natriumtrinitrobenzolsulfonat, betrug 0,29 mM pro 1 g des trockenen Gels.

Beispiel 3

Ein aus Glycidylmethacrylat und Ethylenglycol-dimethacrylat gebildetes Copolymeres wurde unter Ringöffnung mit Wasser umgesetzt. Dann wurden mit Hilfe von 1,4-Butandiol-glycidylether Glycidylgruppen in das Reaktionsprodukt eingeführt, wobei ein Gel erhalten wurde (Epoxygruppengehalt : 25 mM pro 1 g des trockenen Gels). Schließlich wurde 1,0 g des so erhaltenen Gels mit einer Lösung vermischt, die durch Auflösen von 0,5 g Natriumcarbonat in 2 ml Wasser und 1,0 g 4-Aminobuttersäure erhalten worden war, und das Gemisch unter Rühren 10 Stunden lang auf 60°C erhitzt und umgesetzt. Schließlich wurde das Gel durch Filtration gewonnen und mit Wasser und 0,01 n wäßriger Chlorwasserstoffsäure-Lösung gewaschen. Das gewaschene Gel wurde erneut mit einer großen Menge an Wasser gewaschen und schließlich getrocknet. Der Anteil der Aminogruppen, bestimmt durch Titration im nicht-wäßrigen System mit Hilfe von Perchlorsäure, betrug 0,15 mM pro 1 g des trockenen Gels.

Beispiel 4

5 ml einer 0,1 m wäßrigen Natriumchloridlösung wurden zu 1,0 g des in Beispiel 1 gebildeten Gels zugefügt, wonach 1,0 g Bernsteinsäureanhydrid allmählich zugefügt wurde, während der pH-Wert der Reaktionslösung mit Hilfe einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf etwa 5 eingestellt wurde. Danach wurde das Gemisch einen Tag lang bei Raumtemperatur gerührt und das gebildete Gel schließlich durch Filtration gewonnen. Dann wurde das gewonnene Gel mit Wasser, 0,1 m wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und 0,01 n wäßriger Chlorwasserstoffsäurelösung gewaschen, wonach der gewaschene Gel wieder mit einer großen Menge an Wasser gewaschen und getrocknet wurde. Die Menge der durch Titration bestimmten Carboxylgruppen betrug 0,37 mM pro 1 g des trockenen Gels.

Beispiel 5

0,6 g des in Beispiel 2 hergestellten Gels wurde zu 1,3 ml einer 0,2 m wäßrigen Dikaliumhydrogenphosphatlösung gegeben, welche 30 mg Heparinnatrium enthielt. Dazu wurden etwa 10 mg Natriumcyanborhydrid gegeben und das so erhaltene Gemisch wurde dann 15 Stunden lang unter Rühren auf 60°C erhitzt und umgesetzt. Das gebildete Gel wurde dann durch Filtration gewonnen und mit einer 1 m wäßrigen Natriumchloridlösung und mit Wasser gewaschen. Dann wurde das gewaschene Gel zu 1 ml einer 0,2 m wäßrigen Natriumacetatlösung zugegeben, 0,5 ml Essigsäureanhydrid wurde zugefügt und das Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Daraufhin wurde das gebildete Gel durch Filtration gewonnen, mit Wasser und 0,1 n wäßriger Natriumhydroxidlösung gewaschen und schließlich erneut mit Wasser gewaschen. Es wurde bestätigt, daß das so hergestellte Heparin tragende Gel Thrombin (etwa 10 mg pro 1 g des trockenen Gels) aus einer 0,15 m wäßrigen Natriumchloridlösung adsobiert und daß das adsorbierte Thrombin durch Leiten von 0,125 m wäßriger Natriumchloridlösung durch die Kolonne eluiert werden kann.

Beispiel 6

1,0 g des in Beispiel 3 hergestellten Gels wurde ausreichend mit absolutem Dioxan gewaschen und das gewaschene Gel wurde in 4 ml absolutes Dioxan gegeben. 80 mg N-Hydroxysuccinimid und 144 mg Dicyclohexyl-carbodiimid wurden zugefügt und das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene Gel wurde dann durch Filtration gewonnen und rasch mit 20 ml absolutem Dioxan, 6 ml Methanol und 3 ml kaltem Wasser in der angegebenen Reihenfolge gewaschen. Dann wurde das gewaschene Gel in eine Lösung gegeben, die durch Auflösen von 20 mg Concanavalin A und 25 mg α-Methyl-D-mannopyranosid in 2 ml einer wäßrigen Lösung von 0,1 millimolar (mM) Calciumchlorid, 0,1 millimolar (mM) Manganchlorid und 0,01 molar (M) Natriumhydrogencarbonat gebildet war. Nachdem das Gemisch 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und bei 4°C über Nacht stehengelassen worden war, wurde das gebildete Gel durch Filtration gewonnen und mit 1 m (1 molar) Natriumchloridlösung und Wasser gewaschen. Daraufhin wurde das gewaschene Gel in 2 ml einer 1 m Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 8,0) gegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Gel erneut durch Filtration gewonnen und mit Wasser gewaschen. Durch die Menge an Concanavalin A, die gewonnen worden war, ohne daß eine Reaktion stattgefunden hatte, wurde festgestellt, daß 12 mg Concanavalin A auf jeweils 1 g des so gebildeten trockenen Gels aufgetragen worden waren.

Beispiel 7

1,0 g des in Beispiel 1 hergestellten, Epoxygruppen enthaltenden Copolymergels wurde mit 2,0 g einer 1 m wäßrigen Natriumhydroxidlösung und 1,0 g 4-Amino-3-hydroxybuttersäure vermischt und das Gemisch wurde unter Rühren 6 Stunden lang auf 50°C erhitzt und umgesetzt. Nachdem das gebildete Gel durch Filtration gewonnen und mit Wasser und einer 0,01 n wäßrigen Chlorwasserstoffsäurelösung gewaschen worden war, wurde das gewaschene Gel erneut mit einer großen Menge an Wasser gewaschen und getrocknet. Die Menge der Aminogruppen, die durch Titration mit Hilfe von Perchlorsäure im nicht-wäßrigen Medium bestimmt wurde, betrug 0,45 mM pro 1 g des trockenen Gels.

Beispiel 8

1,0 g des durch Einführen von Glycidylgruppen in Beispiel 2 hergestellten Gels (Epoxygruppengehalt 0,5 mM pro 1 g des trockenen Gels) wurde mit einer Lösung, die durch Auflösen von 0,5 g Natriumcarbonat in 2 ml Wasser erhalten worden war, und 1,0 4-Amino-3-hydroxybuttersäure zusammengegeben und das Gemisch wurde 10 Stunden lang unter Rühren auf 60°C erhitzt und umgesetzt. Nachdem das gebildete Gel durch Filtration gewonnen und mit Wasser und 0,01 n wäßriger Chlorwasserstoffsäurelösung gewaschen worden war, wurde das gewaschene Gel erneut mit einer großen Wassermenge gewaschen und getrocknet. Die Menge der Aminogruppen, bestimmt durch Titration mit Perchlorsäure im nicht-wäßrigen Medium, betrug 0,25 mM pro 1 g des trockenen Gels.

Beispiel 9

Der gleiche Vorgang wie in Beispiel 8 wurde unter Verwendung von 1,4-Butandiol-diglycidylether und Serin anstelle von Epichlorhydrin und 4-Amino-3-hydroxybuttersäure durchgeführt. Das so hergestellte trockene Gel enthielt 0,3 mM Aminogruppen pro 1 g.

Beispiel 10

Die gleichen Verfahrensweise wie in Beispiel 9 wurde wiederholt, wobei jedoch 4-Amino-3-hydroxybuttersäure anstelle von Serin verwendet wurde. Das dabei erhaltene trockene Gel enthielt 0,15 mM Aminogruppen pro 1 g.

Beispiel 11

Die gleiche Verfahrensweise wie in Beispiel 8 wurde durchgeführt, indem Ethylenglykol-diglycidylether und Glucosaminsäure anstelle von Epichlorhydrin bzw. 4-Amino- 5-hydroxybuttersäure verwendet wurden. Das so gebildete trockene Gel enthielt 0,08 mM Aminogruppen pro 1 g.

Beispiel 12

Die gleiche Verfahrensweise wie in Beispiel 6 wurde unter Verwendung des in Beispiel 10 hergestellten Gels durchgeführt, wobei ein trockenes adsorptionsfähiges Gel erhalten wurde, welches 9,6 mg Concanavalin A pro 1 g aufgetragen enthielt.

Beispiel 13

Concanavalin A wurde an das in Beispiel 12 hergestellte Gel und die in Beispielen 8 und 9 hergestellten Träger nach der in Beispiel 12 beschriebenen Verfahrensweise gebunden, wobei Gele hergestellt wurden. Danach wurde jedes dieser Gele in eine aus rostfreiem Stahl bestehende Kolonne (4,6 mm Durchmesser × 75 mm Länge) gepackt und die Mengen an γ-Globulin, die an diese Gele adsorbiert wurden, wurden unter Anwendung der Hochleistungs-Flüssigphasenchromatographie verglichen. Als Ergebnis wurden die in Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse erzielt.

Tabelle 1

Beispiel 14

1,0 g des durch Einführen von Epoxygruppen in Beispiel 3 hergestellten Gels (Epoxygruppengehalt 0,3 mM pro 1 g des trockenen Gels) wurde in 2 ml einer wäßrigen Lösung gegeben, die 0,1 mM Calciumchlorid, 0,1 mM Manganchlorid, 0,05 M Natriumhydrogencarbonat und 0,05 M Natriumcarbonat enthielt, und 20 mg Concanavalin A und 25 mg α-Methyl-D- mannopyranosid wurden zugesetzt und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 8 Stunden lang gerührt. Danach wurde das gerührte Gemisch bei 4°C über Nacht stehengelassen und das erhaltene Gel wurde durch Filtration gewonnen und schließlich mit 1-molarer wäßriger Natriumchloridlösung und Wasser gewaschen. Danach wurden 2 ml einer 1 m (1 molar) wäßrigen Ethanolaminlösung zugefügt und das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt und das Gel erneut durch Filtration gewonnen und mit Wasser gewaschen. Aus der Menge an Concanavalin A, das wiedergewonnen wurde, ohne daß es eine Reaktion eingegangen war, wurde festgestellt, daß 1,5 mg Concanavalin A auf jeweils 1 g des so gebildeten adsorptionsfähigen Gels aufgetragen waren.

Beispiel 15

1,0 g des durch Einführen von Epoxygruppen in Beispiel 14 hergestellten Gels wurde zu 20 ml einer wäßrigen Essigsäurelösung gegeben (Verhältnis von Wasser zu Essigsäure 1 : 9), die 1,0 g Natriumperiodat enthielt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Das erhaltene Gel wurde dann durch Filtration gewonnen und mit Wasser gewaschen. Danach wurde das gewaschene Gel in 3 ml einer wäßrigen Lösung gegeben, die 1 millimolar (mM) Calciumchlorid, 1 mM Manganchlorid, 0,03 molar (M) Essigsäure und 0,06 M Natriumacetat enthielt. Schließlich wurden 20 mg Concanavalin A und 25 mg α-Methyl-D-mannopyranosid zugesetzt und das Gemisch wurde 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene Gel wurde durch Filtration gewonnen und mit 1 m wäßriger Natriumchloridlösung und Wasser gewaschen. Schließlich wurde das gewaschene Gel zu 2 ml einer 1 molaren Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 8,0) gegeben, die 20 mg Natriumcyanborhydrid enthielt und das Gemisch wurde dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Gel erneut durch Filtration gewonnen und mit Wasser gewaschen. Es wurde festgestellt, daß 10,3 mg Concanavalin A pro 1 g des trockenen Gels aufgetragen waren.

Beispiel 16

Die Epoxygruppen in einem Epoxygruppen enthaltenden Copolymergel, das aus Glycidylmethacrylat und Ethylenglycol-dimethacrylat hergestellt worden war, wurden der Ringöffnungsreaktion mit Hilfe von Wasser unterworfen. Danach wurden Epoxygruppen unter Verwendung von Ethylenglycoldiglycidylether in das Reaktionsprodukt eingeführt und schließlich wurden Carboxylgruppen unter Verwendung von 4-Aminobuttersäure in das erhaltene Reaktionsprodukt eingeführt. Das erhaltene Gel wurde dann der gleichen Verfahrensweise wie in Beispiel 6 unterworfen, wobei ein trockenes Adsorptionsmittelgel erhalten wurde, das 25 mg Concanavalin A, aufgetragen pro 1 g enthielt.

Beispiel 17

0,8 g des Gels gemäß Beispiel 16 wurde mit N-Hydroxysuccinimid aktiviert und in 4,7 ml einer Lösung von 0,05 m Kaliumphosphat und 0,15 m Natriumchlorid gegeben, die 5 mg Lectin aus Abrus precatorius enthielt. Außerdem wurden 40 mg 0,1 molares wäßriges Natriumhydrogencarbonat zugesetzt. Schließlich wurde das Gemisch der gleichen Verfahrensweise wie in Beispiel 3 unterworfen, wobei ein trockenes Adsorptionsmittelgel erhalten wurde, welches, aufgetragen pro 1 g, 2 mg Lectin aus Abrus precatorius enthielt.

Beispiel 18

Das in Beispiel 15 hergestellte Adsorptionsmittel wurde in eine Kolonne aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser von 4,7 mm und einer Länge von 75 mm gepackt. Gemäß "Journal of Chromatography", Vol. 244, S. 52 (1982) wurde dann ein Gemisch aus p-Nitrophenol-α-D-glucosid (Verbindung 1), p-Nitrophenol-β-D-glucosid (Verbindung 2) und p-Nitrophenol- α-D-mannosid (Verbindung 3) unter Anwendung der Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie der Trennung unterworfen. Dabei wurden die in Tabelle 2 gezeigten guten Ergebnisse erzielt.

Verbindung
Retentionszeit (min)
Verbindung 1
2,6
Verbindung 2	3,6
Verbindung 3	6,8

Ei-Albumin wurde gut von dem Adsorptionsmittel adsorbiert, wenn eine 0,02 molare Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 7,4), die 0,5 molar Natriumchlorid enthielt, als Elutionsmittel verwendet wurde, und konnte danach sofort eluiert werden, als 0,01 molar α-Methylmannosid zugesetzt wurde.

Beispiel 19

Das in Beispiel 17 hergestellte Adsorptionsmittel wurde in eine Kolonne aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser von 7,5 mm und einer Länge von 50 mm gepackt. Dann wurde ein aus Verbindung (2) und Verbindung (3) sowie p-Nitrophenyl-α-galactosid (Verbindung 4) und p-Nitrophenyl- β-galactosid (Verbindung 5) bestehendes Gemisch der Trennung unterworfen. Dabei wurden die in Tabelle 3 gezeigten guten Ergebnisse erhalten.

Tabelle 3

Transferrin (human) und Rinder-Thyroglobulin wurden bei Verwendung von Elutionsmittel (A) gut an dem Adsorptionsmittel adsorbiert und wurden sofort eluiert, als Elutionsmittel (B) anstelle von Elutionsmittel (A) eingesetzt wurde. Ei-Albumin und Serum-Albumin (Rind) wurden nicht adsorbiert.

Beispiel 20

Die Epoxygruppen eines aus Glycidylmethacrylat und Ethylenglycol- dimethacrylat hergestellten Copolymeren wurden mit Hilfe von Wasser der Ringöffnungsreaktion unterworfen, wonach Glycidylgruppen in das Reaktionsprodukt eingeführt wurden. Dann wurde das modifizierte Reaktionsprodukt mit Ammoniak umgesetzt, wobei ein Gel hergestellt wurde (Aminogruppengehalt: 0,16 mM pro 1 g des trockenen Gels). Schließlich wurde das so hergestellte Gel der gleichen Verfahrensweise wie in Beispiel 5 unterworfen, wobei ein trockenes adsorptionsfähiges Gel gebildet wurde. Durch Schwefelanalyse wurde festgestellt, daß auf jeweils 1 g dieses trockenen Gels etwa 8 mg Heparin aufgebracht waren.

Beispiel 21

1,0 g des in Beispiel 3 hergestellten Gels wurden ausreichend mit absolutem Dioxan gewaschen und das gewaschene Gel wurde in 4 ml absolutes Dioxan gegeben. 80 mg N-Hydroxysuccinimid und 144 mg Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugefügt und das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das gebildete Gel wurde dann durch Filtration gewonnen und rasch mit 20 ml absolutem Dioxan, 6 ml Methanol und 3 ml kaltem Wasser gewaschen. Danach wurde das gewaschene Gel in 2 ml einer 0,1 m wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung gegeben, die 100 mg Heparinnatrium enthielt, und das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Gemisch über Nacht bei 4°C stehengelassen, das gebildete Gel durch Filtration gewonnen und mit einer 1 m wäßrigen Natriumchloridlösung und Wasser gewaschen. Schließlich wurde das gewaschene Gel in 2 ml 1 m Tris- Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 8,0) gegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt und das Gel erneut durch Filtration gewonnen und mit Wasser gewaschen. Es wurde festgestellt, daß etwa 25 mg Heparin auf jeweils 1 g des so gebildeten trockenen Gels aufgetragen waren.

Beispiel 22

Das in Beispiel 20 hergestellte Adsorptionsmittel wurde in eine Kolonne aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser von 4,6 mm und einer Länge von 75 mm gepackt. Die Adsorption von Thrombin mit Hilfe dieses Adsorptionsmittels wurde dann mit Hilfe der Hochleistungs-Chromatographie geprüft. Thrombin wurde gut an dem Adsorptionsmittel adsorbiert, wenn als Lösungsmittel eine 0,01 molare Tris-Chlorwasserstoffsäure- Pufferlösung (pH 7,5) mit einem Gehalt an 0,15 molar Natriumchlorid verwendet wurde. Das adsorbierte Thrombin wurde sofort eluiert, wenn die vorstehende Pufferlösung durch eine 0,01 molare Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 7,5) mit einem Gehalt an 1,25 molar Natriumchlorid ersetzt wurde.

Beispiel 23

1,0 g des Gels, das durch Einführen von Epoxygruppen gemäß Beispiel 14 erhalten worden war, wurde zu einer Lösung gegeben, die durch Auflösen von 20 mg Protein A in 2 ml einer wäßrigen Lösung von 0,05 molar Natriumhydrogencarbonat und 0,05 molar Natriumcarbonat hergestellt worden war, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 8 Stunden gerührt und schließlich über Nacht bei 4°C stehengelassen. Das gebildete Gel wurde dann durch Filtration gewonnen und mit Hilfe einer 1 molaren wäßrigen Natriumchloridlösung und Wasser gewaschen. Dann wurden 2 ml 1 molare wäßrige Ethanolaminlösung zu dem gewaschenen Gel zugefügt und das Gemisch erneut bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt, das Gel wieder durch Filtration gewonnen und mit Wasser gewaschen. Aus der Menge an Protein A, das wiedergewonnen werden konnte, ohne daß es eine Reaktion eingegangen war, wurde bestimmt, daß 2,2 mg Protein A pro 1 g des trockenen Gels aufgetragen waren.

Beispiel 24

1,0 g des in Beispiel 14 durch Einführen von Epoxygruppen hergestellten Gels wurde in 20 ml einer wäßrigen Essigsäurelösung (bestehend aus Wasser und Essigsäure in einem Verhältnis von 1 : 9) gegeben, die 1,0 g Natriumperiodat enthielt und das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das gebildete Gel wurde durch Filtration gewonnen und mit Wasser gewaschen und das gewaschene Gel wurde in 3 ml einer wäßrigen Lösung gegeben, die 0,03 molar Essigsäure und 0,06 molar Natriumacetat enthielt. Danach wurden 20 mg Protein A zugesetzt und das gebildete Gemisch wurde bei Raumtemperatur 8 Stunden lang gerührt. Das so erhaltene Gel wurde schließlich durch Filtration gewonnen und mit einer 1 molaren wäßrigen Natriumchloridlösung und Wasser gewaschen. Das gewaschene Gel wurde in 2 ml einer 1 molaren Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 8,0) gegeben, die 20 mg Natriumcyanborhydrid enthielt, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Gel wieder durch Filtration gewonnen und mit Wasser gewaschen. Es wurde festgestellt, daß 10,3 mg Protein A jeweils auf 1 g des so gebildeten Adsorptionsmittelgels aufgetragen waren.

Beispiel 25

1,0 g des in Beispiel 16 durch Einführen von Carboxylgruppen hergestellten Gels wurde ausreichend mit absolutem Dioxan gewaschen und zu 4,0 ml absolutem Dioxan gegeben. Dazu wurden 80 mg N-Hydroxysuccinimid und 144 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugefügt und das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene Gel wurde dann durch Filtration gewonnen und rasch mit 20 ml absolutem Dioxan, 6 ml Methanol und 3 ml kaltem Wasser in der angegebenen Reihenfolge gewaschen. Schließlich wurde das gewaschene Gel zu 2 ml einer wäßrigen Lösung von 0,1 millimolar Calciumchlorid, 0,1 millimolar Manganchlorid und 0,01 molar Natriumhydrogencarbonat gegeben, die 50 mg Concanavalin A und 60 mg α-Methyl-mannopyranosid enthielt, und das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann über Nacht bei 4°C stehengelassen. Das so erhaltene Gel wurde durch Filtration gewonnen und mit einer 1 molaren wäßrigen Natriumchloridlösung und Wasser gewaschen. Das gewaschene Gel wurde in 2 ml einer 1 molaren Tris-Chlorwasserstoffsäure- Pufferlösung (pH 8,0) gegeben und das Gemisch wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das so behandelte Gel wurde wieder durch Filtration gewonnen und mit Wasser gewaschen. Es wurde festgestellt, daß 12,5 mg Concanavalin A auf jeweils 1 g des so gebildeten trockenen adsorptionsfähigen Gels aufgetragen waren.

Beispiel 26

Das in Beispiel 24 hergestellte Adsorptionsmittel wurde in eine Kolonne aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser von 4,6 mm und einer Länge von 75 mm gepackt. Dann wurde menschliches IgG der chromatischen Analyse unterworfen, wobei eine Vorrichtung für die Hochleistungs-Flüssigkeits- Säulenchromatographie verwendet wurde, die mit der so hergestellten Kolonne ausgestattet war. Dabei wurden die in Fig. 1 gezeigten Chromatogramme erhalten.
Analysebedingungen:
Elutionsmittel (1): 0,1 molare Natriumphosphat-Puffer­ lösung (pH 4,5),
Elutionsmittel (2): 0,1 molare Natriumphosphat-Puffer­ lösung (pH 3,0),
Elutionsgeschwindigkeit: 1,0 ml/min,
Detektor: Ultraviolettspektrophotometer, 280 nm.

Die Chromatogramme zeigen die Tatsache, daß menschliches IgG nicht adsorbiert werden kann, oder, selbst wenn eine Fraktion davon adsorbiert wird, daß es leicht bei einem pH-Wert von 3 eluiert wird (Fig. 1(A)), sowie die Tatsache, daß es partiell adsorbiert wird und partiell nicht adsorbiert ist (Fig. 1(B)).

Beispiel 27

Die Zubereitung eines Adsorptionsmittels sowie die Analyse wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 26 durchgeführt, mit der Abänderung, daß das in Beispiel 25 hergestellte Adsorptionsmittel anstelle des in Beispiel 24 hergestellten Adsorptionsmittels eingesetzt wurde und das Rinder-γ-Globulin anstelle von menschlichem IgG geprüft wurde.

Dabei wurden die in Fig. 2 gezeigten Chromatogramme erhalten. Diese Chromatogramme zeigen die Tatsache, daß Rinder-γ-Globulin nicht adsorbiert werden kann oder daß es bei einem pH-Wert von 3 leicht eluiert wird (Fig. 2(A)), selbst wenn eine Fraktion davon adsorbiert wird, sowie die Tatsache, daß es partiell adsorbiert wird und partiell nicht der Adsorption unterliegt (Fig. 2(B)).

Beispiel 28

Ein Adsorptionsmittel wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 23 hergestellt, mit der Abänderung, daß Rinder- Serumalbumin anstelle von Protein A verwendet wurde. Aus der Menge des Rinder-Serumalbumins, die wiedergewonnen wurde, ohne daß es eine Reaktion eingegangen hatte, wurde festgestellt, daß 5,5 mg Rinder-Serumalbumin von jeweils 1 g des so gebildeten trockenen adsorptionsfähigen Gels festgehalten wurden.

Beispiel 29

Ein Adsorptionsmittel wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 24 hergestellt, mit der Abänderung, daß Rinder- Serumalbumin anstelle von Protein A verwendet wurde. Aus der Menge des Rinder-Serumalbumins, das wiedergewonnen wurde, ohne daß es eine Reaktion eingegangen hatte, wurde festgestellt, daß 7,3 mg Rinder-Serumalbumin von je 1 g des so gebildeten trockenen adsorptionsfähigen Gels festgehalten wurden.

Beispiel 30

Ein Adsorptionsmittel wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 25 hergestellt, mit der Abänderung, daß Rinder-Serumalbumin anstelle von Protein A verwendet wurde. Aus der Menge von Rinder-Serumalbumin, die wiedergewonnen wurde, ohne daß es eine Reaktion eingegangen war, wurde festgestellt, daß 11,4 mg Rinder-Serumalbumin von jeweils 1 g des so hergestellten trockenen Adsorptionsmittelgels festgehalten worden sind.

Beispiel 31

Die Analyse von DL-Tryptophan (Fig. 3 bis 5), N-(3,5-Dinitrobenzoyl)- DL-leucin (Fig. 6) und N-(3,5-Dinitrobenzoyl)- DL-phenylglycin (Fig. 7) wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 26 unter Verwendung des in Beispiel 30 hergestellten Adsorptionsmittels durchgeführt. Auf diese Weise wurden die in Fig. 3 bis 7 gezeigten Chromatogramme erhalten.
Bedingungen der Analysen:
Pufferlösung: 0,02 molare Tris-Chlorwasserstoffsäure, 0,10 molar Natriumchlorid;
Elutionsbedingungen: A: pH = 8,0; B: pH = 7,0;
Elutionsgeschwindigkeit: 0,5 ml/min;
Detektor: Ultraviolett-Spektrophotometer, 254 nm.
Fig. 3:
DL-Tryptophan
31: D-Isomeres
32: L-Isomeres
Elutionsbedingung: A
Fig. 4:
D-Tryptophan
Elutionsbedingung: A
Fig. 5:
L-Tryptophan
Elutionsbedingung: A
Fig. 6:
N-(3,5-Dinitrobenzoyl)-DL-leucin
61: L-Isomeres
62: D-Isomeres
Elutionsbedingung: B
Fig. 7:
N-(3,5-Dinitrobenzoyl)-DL-phenylglycin
71: S-Isomeres
72: R-Isomeres
Elutionsbedingung: A

Bei der in Fig. 3 bis 5 gezeigten Analyse von DL-Tryptophan wurde L-Tryptophan stärker adsorbiert und später eluiert als D-Tryptophan.

Im Fall von N-(3,5-Dinitrobenzoyl)-DL-leucin, der in Fig. 6 gezeigt ist, wurde das D-Isomere stärker adsorbiert und später eluiert als das L-Isomere.

Bei der Analyse von N-(3,5-Dinitrobenzoyl)-DL-phenylglycin wurde das R-Isomere stärker adsorbiert und später eluiert als das S-Isomere.

Beispiel 32

Zu einer Lösung von 1,286 g Cibacron Blau F3G-A in 20 ml Wasser wurde eine Lösung von 1,16 g 1,6-Diaminohexan in 10 ml einer 0,5 n Chlorwasserstoffsäure (pH 10,0) gegeben. Nachdem das Gemisch 1 Stunde bei 50°C reagiert hatte, wurde es allmählich in 200 ml 0,3 n Chlorwasserstoffsäure gegossen und 5 Minuten gerührt. Dann wurden die abgeschiedenen Kristalle abfiltriert und nacheinander mit 0,3 n Chlorwasserstoffsäure, Aceton und Ether gewaschen. Die so erhaltenen gewaschenen Kristalle wurden getrocknet, wobei 0,78 g pulverförmiges Aminohexyl-Cibacron Blau F3G-A erhalten wurde (Ausbeute: 53%).

Beispiel 33

Ein Adsorptionsmittel wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 23 hergestellt, mit der Abänderung, daß das in Beispiel 32 hergestellte Aminohexyl-Cibacron Blau F3G-A anstelle von Protein A verwendet wurde und daß die Reaktion bei 50°C durchgeführt wurde.

Durch Messung der Adsorption des Filtrats und der verwendeten Waschflüssigkeiten wurde festgestellt, daß 0,047 mM Cibacron Blau F3G-A von je 0,6 g des so gebildeten trockenen Adsorptionsmittelgels festgehalten wurde.

Beispiel 34

Ein Adsorptionsmittel wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 24 hergestellt, mit der Abänderung, daß das in Beispiel 32 hergestellte Aminohexyl-Cibacron Blau F3G-A anstelle von Protein A verwendet wurde.

Es wurde festgestellt, daß 0,094 mM Cibacron Blau F3G-A von jeweils 1 g des so hergestellten trockenen Adsorptionsmittelgels festgehalten wurde.

Beispiel 35

Ein Adsorptionsmittel wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 25 hergestellt, mit der Abänderung, daß das in Beispiel 32 hergestellte Aminohexyl-Cibacron Blau F3G-A anstelle von Protein A verwendet wurde.

Es wurde festgestellt, daß 0,063 mM Cibacron Blau F3G-A auf je 1 g des so hergestellten trockenen Adsorptionsmittelgels aufgetragen war.

Beispiel 36

Cytochrom C wurde in der in Beispiel 26 beschriebenen Weise analysiert, mit der Abänderung, daß das in Beispiel 33 hergestellte Adsorptionsmittel angewendet wurde. Dabei wurde das in Fig. 8 gezeigte Chromatogramm erhalten.
Analysebedingungen:
Elutionsmittel (1): 0,1 molare Kaliumphosphat-Puffer­ lösung (pH 5,0),
Elutionsmittel (2): 0,1 molare Kaliumphosphat-Puffer­ lösung mit einem Gehalt an 1,5 molar Kaliumchlorid (pH 5,0),
Elutionsgeschwindigkeit: 1,0 ml/m.
Detektor: Ultraviolett-Spektrophotometer, 280 nm

Beispiel 37

Die Analyse wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 36 durchgeführt, mit der Abänderung, daß Lactatdehydrogenase als zu analysierende Substanz anstelle von Cytochrom C eingesetzt wurde und daß anstelle der Elutionsmittel (1) und (2) die nachstehenden Elutionsmittel (3) und (4) verwendet wurden.
Elutionsmittel (3): 0,1 molare Kaliumphosphat-Puffer­ lösung (pH 7,5),
Elutionsmittel (4): 0,1 molare Kaliumphosphat-Puffer­ lösung (pH 7,5) + 1,5 molar Kaliumchlorid.

Auf diese Weise wurde das in Fig. 9 gezeigte Chromatogramm erhalten.

Beispiel 38

Die Analyse erfolgte in gleicher Weise wie in Beispiel 36, mit der Abänderung, daß Rinder-Serumalbumin anstelle von Cytochrom C der Analyse unterworfen wurde und mit der weiteren Abänderung, daß das vorstehend angegebene Elutionsmittel (4) anstelle des Elutionsmittels (2) angewendet wurde. Auf diese Weise wurde das in Fig. 10 gezeigte Chromatogramm erhalten.

Beispiel 39

Die Analyse wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 36 durchgeführt, mit der Abänderung, daß Eiweiß-Albumin anstelle von Cytochrom C analysiert wurde.

Als Ergebnis wurde das in Fig. 11 gezeigte Chromatogramm erhalten.

Wie aus den Fig. 8 bis 11 ersichtlich ist, wurden die überprüften Proben unter Anwendung der Lösungsmittel (1) oder (3) (die vorstehend aus als "Elutionsmittel" bezeichnet worden sind) adsorbiert und danach an dem durch den Pfeil anzeigten Punkt unter Verwendung der Elutionsmittel (2) oder (4) eluiert. Außerdem wurde die Probe des Beispiels 39 bei Anwendung des Lösungsmittels (Elutionsmittels) (1) nicht adsorbiert.

Beispiel 40

Ein Adsorptionsmittel wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 33 hergestellt, mit der Abänderung, daß Acriflavin anstelle des Aminohexyl-Cibacron Blau F3G-A verwendet wurde.

Durch Titration mit Hilfe von 0,01 n-Chlorwasserstoffsäure wurde festgestellt, daß 0,020 mM Acriflavin pro 1 Gramm des so hergestellten trockenen Adsorptionsmittelgels festgehalten wurde.

Beispiel 41

Ein Adsorptionsmittel wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 24 hergestellt, mit der Abänderung, daß Acriflavin anstelle von Protein A verwendet wurde. Es wurde festgestellt, daß 0,041 mM Acriflavin von je 1 Gramm des so hergestellten trockenen Adsorptionsmittelgels festgehalten wurde.

Beispiel 42

Ein Adsorptionsmittel wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 25 hergestellt, mit der Abänderung, daß Acryflavin anstelle von Protein A verwendet wurde.

Es wurde festgestellt, daß 0,038 mM Acriflavin auf je 1 g des so hergestellten trockenen Adsorptionsmittelgels aufgetragen war.

Beispiel 43

Adenosin-5′-monophosphat (121), Adenosin-5′-diphosphat (122) und Adenosin-5′-triphosphat (123) sowie Adenosin (131) und Adenin (132) wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 26 der Analyse unterworfen, mit der Abänderung, daß das in Beispiel 40 hergestellte Adsorptionsmittel verwendet wurde. Auf diese Weise wurden die in Fig. 12 und 13 gezeigten Chromatogramme erhalten.
Analysebedingungen:
Elutionsmittel bzw. Lösungsmittel: 0,1 m Ethylmorpholinacetat-Puffer­ lösung (pH 7,0) auch als "Elutions­ mittel (1) bezeichnet
Elutionsgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
Detektor: Ultraviolett-Spektrophotometer, 260 nm

Wie aus den Fig. 12 und 13 ersichtlich ist, wurden die der Prüfung unterworfenen Proben mit Hilfe des Elutionsmittels (1) isoliert und eluiert.

Beispiel 44

Adenosin-5′-monophosphat wurde in der in Beispiel 43 beschriebenen Weise der Analyse unterworfen, mit der Abänderung, daß als Elutionsmittel (2) eine 0,01 molare Ethylmorpholiniumacetat- Pufferlösung (pH 7,0), die nachstehend auch als Elutionsmittel (2) bezeichnet ist, zusätzlich zu dem Elutionsmittel (1) angewendet wurde. Auf diese Weise wurde das in Fig. 14 gezeigte Chromatogramm erhalten.

Wie aus Fig. 14 ersichtlich ist, wird Adenosin-5′-monophosphat bei Anwendung des Elutions-Lösungsmittels (1) nicht adsorbiert, es kann jedoch unter Verwendung des Elutionsmittels (2) adsorbiert werden (der Beginn der Zugabe ist in Fig. 14 durch den Pfeil angezeigt).

Beispiel 45

Riboflavin wurde in der in Beispiel 43 beschriebenen Weise der Analyse unterworfen, mit der Abänderung, daß das Elutionsmittel (2) anstelle des Elutionsmittels (1) angewendet wurde. Auf diese Weise wurde das in Fig. 15 gezeigte Chromatogramm erhalten. Wie aus Fig. 15 ersichtlich ist, wurde die geprüfte Probe bei Verwendung des Elutionsmittels (2) nicht adsorbiert, sondern eluiert.

Beispiel 46

1,0 g des Gels aus Beispiel 14 wurde zu 3 ml einer Lösung von 0,53 g Natrium-iminodiacetat in einer 2 molaren wäßrigen Lösung von Natriumcarbonat gegeben und das Gemisch wurde 24 Stunden bei 65°C gerührt. Nach dem Rühren wurde das Gemisch über Nacht bei 4°C stehengelassen und das gebildete Gel durch Filtration gewonnen, wonach es mit 10%-iger Essigsäure und Wasser gewaschen wurde.

Durch Titration mit 0,1 normaler wäßriger Natriumhydroxidlösung wurde festgestellt, daß das so gebildete Adsorptionsmittelgel 0,090 mM-Iminodiessigsäure festhielt.

Beispiel 47

Ein Adsorptionsmittel wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 25 hergestellt, mit der Abänderung, daß Natriumiminodiacetat anstelle von Protein A verwendet wurde.

Es wurde festgestellt, daß jeweils 1 g des so hergestellten trockenen Adsorptionsmittelgels 0,055 mM Iminodiessigsäure festhielt.

Beispiel 48

Adenosin-5′-monophosphat (AMP), Guanosin-5′-monophosphat (GMP) und Cytidin-5′-monophosphat (CMP) wurden in der in Beispiel 26 beschriebenen Weise der Analyse unterworfen, mit der Abänderung, daß das in Beispiel 46 hergestellte Adsorptionsmittel verwendet wurde. Auf diese Weise wurde das in Fig. 16 gezeigte Chromatogramm erhalten.
Analysebedingungen:
Elutionsmittel: 0,05 molare Ethylmorpholiniumacetat-Puf­ ferlösung (pH 6,0),
Elutionsgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
Detektor: Ultraviolett-Spektrophotometer, 280 nm.

Beispiel 49

Die Analyse wurde in der in Beispiel 48 beschriebenen Weise durchgeführt mit der Abänderung, daß das Adsorptionsmittel einer Behandlung unterworfen wurde, bei der eine 50 millimolare wäßrige Lösung von Kupfersulfat durchgeleitet wurde, um Kupfer koordinativ zu binden und danach ausreichend mit der zu verwendenden Elutionsmittel nachgewaschen wurde. Auf diese Weise wurde das in Fig. 17 gezeigte Chromatogramm erhalten.

Wie aus dem Vergleich zwischen den Fig. 16 und 17 ersichtlich ist, verursachte die koordinative Bindung von Kupfer eine Verzögerung der Elution.

Beispiel 50

Die Analyse wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 49 durchgeführt, mit der Abänderung, daß Uridin, Guanosin und Adenosin anstelle von AMP, GMP und CMP der Analyse unterworfen wurden. Als Ergebnis wurde das in Fig. 18 gezeigte Chromatogramm erhalten. In Fig. 18 bedeutet 181 Uridin und Cytidin, 182 steht für Guanosin und 183 bedeutet Adenosin.

Wie aus Fig. 18 ersichtlich ist, verursachte die koordinative Bindung von Kupfer eine Verzögerung der Elution.

Beispiel 51

Rinder-Serumalbumin (BSA) und Transferrin wurden in der in Beispiel 48 beschriebenen Weise der Analyse unterworfen, mit der Abänderung, daß eine Pufferlösung aus 0,1 molarem Natriumacetat (pH 7,7) und 0,5 m Natriumchlorid (nachstehend auch als Elutionsmittel (1) bezeichnet) anstelle der 0,05 molaren Ethylmorpholiniumacetatlösung verwendet wurde. Als Ergebnis wurde das in Fig. 19 gezeigte Chromatogramm erhalten.

Beispiel 52

BSA wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 49 der Analyse unterworfen, mit der Abänderung, daß das in Beispiel 51 genannte Elutionsmittel (1), dem eine Pufferlösung aus 0,05 molar Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH 8,0) und 0,15 m Ammoniumchlorid zugesetzt worden war (nachstehend auch als Elutionsmittel (2) bezeichnet), anstelle der 0,05 molaren Ethylmorpholiniumacetat-Pufferlösung verwendet wurde.

Auf diese Weise wurde das in Fig. 20 gezeigte Chromatogramm erhalten.

Wie aus den Fig. 19 und 20 ersichtlich ist, wurden BSA und Transferrin nicht adsorbiert, ohne daß eine koordinative Bindung von Kupfer durchgeführt wurde. BSA kann abgetrennt werden, indem es unter Verwendung von Elutionsmittel (1) an der Kolonne, die Kupfer enthält, absorbiert wird und danach mit Hilfe von Elutionsmittel (2) eluiert wird. Der Beginn der Elution ist in der Figur durch den Pfeil angezeigt.

Beispiel 53

BSA und Transferrin wurden der in Beispiel 49 beschriebenen Analyse unterworfen, mit der Abänderung, daß eine wäßrige Lösung von Zinksulfat anstelle eine wäßrigen Lösung von Kupfersulfat angewendet wurde und mit der weiteren Abänderung, daß das Elutionsmittel (1) gemäß Beispiel 51 und das Elutionsmittel (2) gemäß Beispiel 52 anstelle der 0,05 molaren Ethylmorpholiniumacetat-Pufferlösung eingesetzt wurden.

Als Ergebnis wurde das in Fig. 21 gezeigte Chromatogramm erhalten.

Wie aus Fig. 21 ersichtlich ist, führt die Anwendung von Zink als koordinativ gebundenes Metall dazu, daß BSA nicht adsorbiert wird und daß Transferrin bei Verwendung des Elutionsmittels (1) adsorbiert und daß das so adsorbierte Transferrin unter Verwendung von Elutionsmittel (2) eluiert wird. Der Beginn der Elution ist durch den Pfeil angezeigt.

Beispiel 54

140 mg des Hydrogensulfatsalzes von 3-Aminophenylborsäure wurden zu einer wäßrigen Suspension von 600 mg des Gels gegeben, das durch Einführen von Epoxygruppen in Beispiel 14 erhalten worden war. Der pH-Wert des Gemisches wurde durch Zugabe von 4-molarer wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 8,5 eingestellt und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Dann wurde das gebildete Gel durch Filtration gewonnen und mit 1 m wäßriger Lösung von Natriumchlorid und mit Wasser gewaschen.

Durch Titration mit 0,1 molarer wäßriger Natriumhydroxidlösung wurde festgestellt, daß auf je 1 g des so hergestellten Adsorptionsmittelgels 0,06 mM Phenylborsäure aufgetragen war.

Beispiel 55

Ein Adsorptionsmittel wurde in der in Beispiel 54 beschriebenen Weise hergestellt, mit der Abänderung, daß Epichlorhydrin anstelle von 1,4-Butandiol-diglycidylether verwendet wurde. Es wurde festgestellt, daß auf jeweils 1 g des so gebildeten Adsorptionsmittelgels 0,12 mMol Phenylborsäure aufgetragen war.

Beispiel 56

Ein Adsorptionsmittel wurde in der in Beispiel 25 beschriebenen Weise hergestellt, mit der Abänderung, daß anstelle von Protein A das Hydrogensulfatsalz von 3-Aminophenylborsäure verwendet wurde.

Es wurde festgestellt, daß auf jeweils 1 g des so hergestellten trockenen Adsorptionsmittelgels 0,03 mMol Phenylborsäure aufgetragen war.

Beispiel 57

600 mg des in Beispiel 4 hergestellten Gels wurden in 10 ml einer 0,1 molaren wäßrigen Lösung von Natriumchlorid gegeben und das Gemisch wurde bei 0°C gehalten, während 164 g mg des Hydrogensulfatsalzes von 3-Aminophenylborsäure zugefügt wurden. Danach wurde der pH-Wert des Gemisches auf 8,5 eingestellt und es wurde mit 165 mg des Hydrochloridsalzes von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid versetzt. Das so gebildete Gemisch wurde dann 3 Stunden gerührt und über Nacht bei 4°C stehengelassen. Das erhaltene Gel wurde durch Filtration gewonnen und mit 0,1 n wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen.

Durch Adsorptionsmessung wurde festgestellt, daß auf jeweils 1 g des so erhaltenen trockenen Adsorptionsmittelgels 0,47 mM 3-Aminophenylborsäure aufgetragen war.

Beispiel 58

Ein Adsorptionsmittel wurde in der in Beispiel 57 beschriebenen Weise hergestellt, mit der Abänderung, daß 1,3-Diaminopropan anstelle von 25%-igem wäßrigen Ammoniak eingesetzt wurde.

Es wurde festgestellt, daß auf je 1 g des so erhaltenen trockenen Adsorptionsmittelgels 0,32 mMol Phenylborsäure aufgebracht war.

Beispiel 59

Chromatographische Analysen wurden in der in Beispiel 26 beschriebenen Weise durchgeführt, mit der Abänderung, daß die in Beispielen 54 bis 58 hergestellten Adsorptionsmittel eingesetzt wurden.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Analysebedingungen:
Elutionsmittel: 0,1 molare Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,5),
Elutionsgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
Detektor: Ultraviolettspektrophotometer, 260 nm, oder Differential-Refraktometer.

Tabelle 1

Zeit in min., während der die Proben adsorbiert bleiben

Beispiel 60

Ein Adsorptionsmittel wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 46 hergestellt, mit der Abänderung, daß 0,35 g Ethylendiamindiessigsäure anstelle von Natriumiminodiacetat verwendet wurde. Es wurde festgestellt, daß jeweils 1 g des so erhaltenen trockenen Adsorptionsmittelgels 0,07 mMol Ethylendiamindiessigsäure festhielt.

Beispiel 61

Cytidin (221), Uridin (221), Guanosin (222), Adenosin (223) und Desoxyadenosin (224) wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 26 der Analyse unterworfen, mit der Abänderung, daß das in Beispiel 60 hergestellte Adsorptionsmittel verwendet wurde. Als Ergebnis wurde das in Fig. 22 gezeigte Chromatogramm erhalten.
Bedingungen der Analyse:
Elutionsmittel: 0,05 molar 4-Ethylmorpholiniumacetat (pH 5,65),
Fließrate: 0,5 ml/min.
Temperatur der Kolonne: 25°C
Detektor: Ultraviolett-Spektrophotometer

Beispiel 62

Ein Gel, das pro 1 g des trockenen Gels 0,2 mMol Aminogruppen enthielt, wurde durch Überführen der Epoxygruppen des in Beispiel 3 hergestellten Gels, in welches Epoxygruppen eingeführt worden sind, in Aminogruppen unter Verwendung von Wasser hergestellt. Zu 1 g dieses Gels wurde eine Lösung von 243 mg Biotin in 3 ml Dimethylsulfoxid und 206 mg Dicyclohexylcarbodiimid gegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt und das erhaltene Gel wurde durch Filtration gewonnen und mit Methanol und Wasser gewaschen.

Aus dem Schwefelgehalt, der durch Elementaranalyse gemessen wurde, wurde festgestellt, daß 10 mg Biotin auf jeweils 1 g des so gebildeten trockenen Adsorptionsmittelgels aufgetragen waren.

Beispiel 63

Die Analyse von Avidin wurde in der in Beispiel 26 beschriebenen Weise durchgeführt, mit der Abänderung, daß das in Beispiel 62 hergestellte Adsorptionsmittel verwendet wurde. Als Ergebnis wurde das in Fig. 23 gezeigte Chromatogramm erhalten.
Bedingungen für die Analyse:
Elutionsmittel: 0,01 molare Natriumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0), nachstehend auch als Elutionsmittel (1) bezeichnet),
Pufferlösung aus 0,01 molar Natriumphosphat und 0,1 molar NaCl (pH 7,0), nachstehend auch als Elutionsmittel (2) bezeichnet
Elutionsmittel (1)→(2), Lineargradient,
Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min,
Kolonnentemperatur: 28°C,
Detektor: Ultraviolett-Spektrophotometer, 230 nm.

Beispiel 64

Die analytische Bestimmung von Eiweiß (Hühnereiweiß) wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 63 durchgeführt. Als Ergebnis wurde das in Fig. 24 gezeigte Chromatogramm erhalten.

Beispiel 65

Ein Adsorptionsmittel wurde in der in Beispiel 20 beschriebenen Weise hergestellt, mit der Abänderung, daß 30 mg N-Acetylglucosamin anstelle von Natriumheparin verwendet wurden.

Es wurde festgestellt, daß nahezu 8 mg N-Acetylglucosamin auf je 1 g des so erhaltenen trockenen Adsorptionsmittelgels aufgetragen waren.

Beispiel 66

Ein Adsorptionsmittel wurde in der in Beispiel 21 beschriebenen Weise hergestellt, mit der Abänderung, daß 40 mg N-Acetylglucosamin anstelle von Natriumheparin eingesetzt wurden.

Es wurde festgestellt, daß nahezu 15 mg N-Acetylglucosamin auf je 1 g des so erhaltenen trockenen Adsorptionsmittelgels aufgetragen waren.

Beispiel 67

Die Analyse von Lysozym wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 26 durchgeführt, mit der Abänderung, daß das in Beispiel 65 hergestellte Adsorptionsmittel verwendet wurde. Als Ergebnis wurde das in Fig. 25 gezeigte Chromatogramm erhalten.
Analysebedingungen:
Elutionsmittel: Pufferlösung aus 0,01 molar Tris-Chlor­ wasserstoffsäure und 0,01 molar NaCl (pH 7,5), nachstehend auch als Elutionsmittel (1) bezeichnet,
Pufferlösung aus 0,01 molar Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH 7,5), nachstehend auch als Elutionsmittel (2) bezeichnet.
Elutionsgeschwindigkeit: 1 ml/min.
Detektor: Ultraviolett-Spektrophotometer, 280 nm

Claims (3)

1. Aktives Trägermaterial für die Affinitätschromatographie in Form eines porösen Copolymeren aus einem Gelcopolymeren, das im wesentlichen aus (A) einem Glycidylmonovinylester oder Gly­ cidylmonovinylether und (B) einem Alkylenglycoldivinylester ge­ bildet ist, wobei die Komponente (A) mit Hilfe der Komponente (B) vernetzt ist und welches über die Epoxygruppe der Komponen­ te (A) gebundene Brückengruppen (Spacer-Gruppen) enthält, die befähigt sind, Liganden über kovalente Bindungen zu binden, da­ durch gekennzeichnet, daß die Brückengruppen.

• (i) Glycidylgruppen sind, die erhältlich sind durch Ringöff­ nung der Epoxygruppen des Gelpolymeren mit Wasser in Gegen­ wart einer Säure oder von Alkali unter Bildung von Hydroxygrup­ pen und Umsetzen der Hydroxygruppen mit einer eine Glycidyl­ gruppe enthaltenen Verbindung,
• (ii) Gruppen sind, die durch Umsetzen einer Verbindung der Formel I H₂NR′ (I)worin R′ für Wasserstoff, eine Aminogruppe, eine ω-Aminoalkyl­ gruppe oder eine ω-Carboxyalkylgruppe steht, mit der Epoxygruppe der Gelcopolymeren oder mit der Glycidylgruppe eines modifizierten Gelcopolymeren erhältlich sind, das durch Ringöffnung der Epoxygruppen des Gelcopolymeren mit Wasser in Gegenwart einer Säure oder von Alkali und Binden einer eine Glycidylgruppe enthaltenden Verbindung an die so gebildeten Hydroxygruppen gebildet wird, wobei das Gewichts­ verhältnis des Gelcopolymeren oder des modifizierten Gelcopoly­ meren zu der Verbindung der vorstehenden Formel I im Bereich von 1 zu 0,3 bis 10 liegt, oder
• (iii) Gruppen sind, die durch Binden einer eine Hydroxygruppe enthaltenden Aminocarbonsäure an die Epoxygruppe des Gelcopoly­ meren oder an die Glycidylgruppe des modifizierten Gelcopolyme­ ren, welches durch Ringöffnung der Epoxygruppen des Gelcopoly­ meren mit Wasser in Gegenwart von Säure oder Alkali, Umsetzen der gebildeten Hydroxygruppen mit einer eine Glycidylgruppe enthaltenden Verbindung gebildet wurde, wobei das Gewichtsver­ hältnis des Gelcopolymeren oder des modifizierten Gelcopolyme­ ren zu der eine Hydroxygruppe enthaltenden Aminocarbonsäure im Bereich von 1 zu 0, 3 bis 10 liegt, erhältlich sind.

2. Aktives Trägermaterial nach Anspruch 1 (i), worin die Glycidylgruppen des modifizierten Gelcopolymeren durch Einwir­ kung von Natriumthiosulfat und anschließende Einwirkung von Chlorwasserstoffsäure in eine Thiolgruppe überführt wurden.

3. Adsorptionsmittel für die Affinitätschromatographie, be­ stehend aus einem aktiven Trägermaterial gemäß Anspruch 1 oder 2 und Liganden, die über kovalente Bindungen an die Brücken­ gruppen des aktiven Trägermaterials gebunden sind.