JPS62151753A - クロマトグラフイ−用担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、アフィニティークロマトグラフィーをはじめ
として各種クロマトグラフィーに利用することのできる
クロマトグラフィー用担体に関する７゜ 従来の技術 クロマトグラフィー技術の１つとして、アフィニティー
クロマトグラフィーは互いに特異的に相互作用を及ぼし
合う物質対の親和性を利用して分離・精！！！！！を行
なうものであり、例えば生体物質をその生物学的特性即
ち分子上のある特定の化学構造を識別して精製する場合
に有用である。

７フイニテイ一クロマトグラフイー用吸着担体（アフィ
ニティーゲル）は、例えば不溶性の担体（マトリックス
）にス４−サーを結合させて得られる活性支持体の前記
スペーサーにリガンドを結合させたものであり、このリ
ガンドと互いて相互作用を及ぼし合う物質の胆合せを選
択して吸着操作を行なう。

リガンドと吸着目的物質の組合せとしては、例えば次の
様な組合せが挙げられる。

酵素−基質、生成物、阻害剤、補酵素。

エフェクター、 抗原−抗体、 リセプターーアゴニヌト。

核酸塩基対、 レクチン−糖（蛋白） 金属キレ　トー・蛋白質 疎水性基−蛋白質 ホヌトーグヌト。

アフィニティークロマトグラフィーによる分離・精製や
分析において、前記アフィニティークロマトグラフィー
用活性支持体に望まれる性質としては、非特異的吸着が
少ないこと、高い多孔性を有すること、リガンドの結合
が容易であり固定化可能容ｌが大きいこと、化学的に安
定で声域、塩濃度、温度の広範な条件下で十分安定であ
シ体積変化か立いこと、十分４機械的強度と安定性全有
し流動特性が良いこと、生物学的汚染に耐えること、な
どが挙げられる。

従来よシアフィニテイークロマトグラフイー用吸着担体
の基材として用いられているセルロース、デキストラン
、ポリアクリルアミド、アガロース等は、必ずしもこれ
ら望まれる性質を具有していない。とりわけ、硬さが不
足した所謂ソフトゲルであるため流動特性が悪く、分離
特性が良くないという重大な欠点を有し、また寿命も短
い。

更に、近年用いられるシリカビーズは、硬さの点では満
足できるものの、アルカリ性条件下では使用できないた
め、分離条件や溶出・洗浄の条件の選択に大きな制約が
加わるという問題点を有していた。

本発明の目的は、前記従来のクロマトグラフィー用担体
の欠点を克服して、アフィニティークロマトグラフィー
用活生支持体として望まれる前述した諸性質を千金に具
有するクロマトグラフィー用担体を提供することにある
。

本発明によって上記目的を達成し得るクロマトグラフィ
ー用担体が提供される。

即チ、本発明は、（Ａｌグリシジルモノビニルエエステ
ルはグリシジルモノビニルエーテル及び（Ｂ）フルキレ
ングリコールジビニルエステルｔＪＥａ分トし前記（Ａ
Ｉ　Ｊｉ分が（Ｂ）　成分で架橋されたゲル状共重合体
（以下、本発明に係るゲル状共重合体という）の前記（
Ａ）成分に基づくエポキシ基に、又は該エポキシ基が水
により開環変性されて生成するヒドロキシル基にグリシ
ジル基を有する化合物を結合させて得られる変性ゲル状
共重合体（以下、本発明に係る変性ゲル状共重合体とい
う）の前記グリシジル基に、水酸基を有するアミノカル
メン酸が結合している多孔性の共重合体から成ることを
特徴とするクロマトグラフィー用担体に関する。

以下、本発明のクロマトグラフィー用担体の製造方法に
ついて説明する。

本発明のクロマトグラフィー用担体は、（Ａ）グリシジ
ルモノビニルエステル又はグリシジルモノビニルエーテ
ル及び（Ｂ）アルキレングリコールジビニルエステルを
主成分とし前記（Ｎ成分が（８１ｇ分で架橋されたゲル
状共重合体の前記（Ａ）成分に基づくエポキシ基に、又
は該エポキシ基が水によシ開環変性されて生成するヒド
ロキシル基にグリシジル基ヲ有する化合物を結合させて
得られる変性ゲル状共重合体の前記グリシジル基に、水
酸基を有するアミノカルメン酸を作用させることによっ
て製造される。

本発明に係るゲル状共重合体は、特開昭６０−１０４２
５６号公報等に記載されている様に、例えば、（Ａ）グ
リシジルモノビニルエステル又はグリシジルモノビニル
ニーテルト（Ｂ）アルキレンクリコールジビニルエステ
ルとを水溶性の有機希釈剤の存在下で水性懸濁重合せし
めて多孔性のゲルを得ることによシ調製することができ
る。

前記（Ａ）　ｌ１ｉ３ｉ分及び（Ｂｌ　ｆｆ１分は水に
難溶性であるため水性懸濁重合方式によって共重合させ
ることができ、水性懸濁重合は簡単な水中油型懸濁方法
で行なうことができる。共重合は有機希釈剤の存在下に
行カわれ、この有機希釈剤の存在に起因して、（Ｂ）の
アルキレンクリコールジビニルエステル成分が主な架橋
成分として作用し、（Ａｌのグリシジルモノビニルエス
テル又はグリシジルモノビニルエーテル成分中のエポキ
シ基の大部分は開環することなくその−ｉｔ生成共重合
体中に残留せしめると共に、生成する多孔性ゲルの孔径
調整にも役立つ。

前記（Ａ）　成分としては、炭素数３〜１２のモノビニ
ルアルコールのグリシジルエステルまたは炭素数３〜１
２のモノビニルアルコールのグリシジルエーテルが用い
られる。これらのうち炭素数の少ないものが特に好まし
く用いられ、その例の中にはメタクリル酸グリシジル、
アクリル酸グリシジル、アリルグリシジルエーテル等が
含まれる。

一方架橋成分として働＜（Ｂ）ＩｌｉＭ分としては炭素
数２又は３のアルキレングリコールまたはそのポリアル
キレングリコールとアクリル酸もしくはメタクリル酸と
のエステルが好ましく用いられる。例としてエチレング
リコールジアクリレート、エチレングリコールジメタク
リレート、プロピレングリコールジアクリレート、プロ
ピレングリコールジメタクリレートの如きアルキレング
リコールジビニルエステル及びチリエチレングリコール
ジメタクリレート、ポリプロピレングリコールジメタク
リレートの如きポリアルキレングリコールジビニルエス
テルが挙げらレル。

（Ａ）　ｊｆｆ１分対（Ｂｌ　成分の割合は、前者１，
０〜９０モルチに対し後者９０〜１０モルチとする。好
ましくは（Ａ１５！分４０〜８０モルチ、（Ｂ）成分６
０〜２０モルチである。（ＡＧ　ｆｆ１分の半量以下を
コモノマー即ちメチルメタクリレート、メチルアクリレ
ート、酢酸ビニルの如き低級のビニルエステルで置きか
えることができる。（Ａｌ　ｌｆｆ１分の割合が大きい
程もちろん共重合体中のエポキシ基の含有量は増大する
。

（Ｂｌ戚酸分割合が大きい程共重合体の架橋度は大とな
り、従って網目構造が密で膨潤度が小さく硬くなる。上
記画法分の割合の範囲外では所期の特徴と特性を充分に
みたすゲル状共重合が得られない。

用いられる有機希釈剤は、重合反応に不活性で、水に不
溶乃至難溶性であるが原料モノマーを溶解するものであ
ればよい。使用量はモノマー成分と有機希釈剤との合量
に基づき少くとも３０容量係とし、好ましくは４０〜８
０容量チである。使用量が多い程重合過程におけるエポ
キシ基の開環が抑制される。一般的に云って、使用（Ａ
）　ｌ１ｉ２分の仕込量中の含有エポキシ基の６０〜９
５％程度を容易に生成重合体中に残留せしめることがで
きる。残余は重合過程で加水分解されまた一部は架橋に
費されるものと思われる。

以上の如く生成ゲル中のエポキシ基の含量は、（ＡＩ　
Ｉｆ１分の使用量即ち（Ｂ）成分に対する割合又はコモ
ノマーによる部分的代替によって、そしてまた有機希釈
剤の用量によって、調節することができるが、生成重合
体中にエポキシ酸素量として表わして１重量％以上存在
せしめるようにすることが好ましく、最高約１０重量％
である。

前述した様に、水性懸濁重合時における有機希釈剤の使
用はまた、生成多孔性ゲルの孔径調節にも役立つ。生成
ゲルに対し膨潤性の小さい有機希釈剤全使用すると、重
合過程で懸濁粒子内に相分離が起シ、その結果孔径の大
きいゲル所謂巨大有孔構造を有するゲルを得ることがで
きる。これに対し、膨潤性の大きい希釈剤を使用すると
、重合過程で生成物が膨潤状態で重合が進行するから、
相分離は起り難く膨潤によって形成された比較的小さい
孔径の重合体が得られる。膨潤性の大小は、有機希釈剤
の溶解ツクラメ−ターに基づいて知ることができる。本
発明において好適に用いうる有機希釈剤の例として、生
成ｒｋＫ対する膨潤性の大きいものの順に挙げれば、シ
クロヘキサノン、クロロベンゼン、ベンゼン、トルエン
、ｎ−ゲルビルアセテート、ｎ−ブチルアセテート、ｎ
−オクタン等である。

水性懸濁重合は、遊離基発生触媒の存在下にそれ自体は
公知の常法に従って行なうことができる。

水相の量は有機相の量に基づきほぼ同容量またはそれ以
上とし、特に制約はないが約１０倍容量までの量で用い
られる。

又、本発明に係る変性ゲル状共重合体を得るには、先ず
、本発明に係るゲル状共重合体の（Ａ）ｆｆ１分に基づ
くエポキシ基を、酸又はアルカリの存在下で水により処
理して開環変性し、生成するヒドロキシル基に、（Ｃ＞
グリシジル基を有する化合物を作用させてグリシジル基
を導入すればよい。

水による開環変性は、例えば酸の存在下で行われる場合
には、硫酸または塩酸を触媒として水中でこれらの共重
合体ｔ−７０℃〜１００℃に約２時間加熱することによ
シ行われる。酸の濃度は０．１規定〜０．５規定が好ま
しい。開環変性はほぼ定量的に行われる。

（Ｃ）のグリシジル基を有する化合物としては、エピク
ロロヒドリン、エピブロモヒドリン、などのエピハロヒ
ドリン類、エチレングリコールツクリシジルエーテル、
１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルまたはポ
リエチレングリコールジグリシジルエーテルなどのジグ
リシジルエーテル類、１．３−ブタジエンジエデキサイ
ド、１，７−オクタジニンジエ４キサイドなどのアルキ
ルジエンジエデキサイド類などが挙げられる。

グリシジル基を導入するＫは、例えば開環変性されたゲ
ル状共重合体に水酸化ナトリウムまたは炭酸カリウム等
の無機塩基の水浴液中でエピクロルヒドリンを反応させ
るか、または親水性共重合体に水素化ホウ素ナトリウム
を含む水酸化ナトリウムまたは炭酸カリウム等の無機塩
基の水溶液中で、エチレングリコールまたは１．４−ブ
タンジオールジグリシジルエーテルまたはポリエチレン
グリコールジグリシジルエーテルと反応させるなどして
行われる。用いられるポリエチレングリコールジグリシ
ジルエーテルの繰返し単位−Ｃ２Ｈ４〇−の繰返し数が
１〜１０のものを用いるのが好ましい。

次に、本発明に係るゲル状共重合体のエポキシ基又は本
発明に係る変性ゲル状共重合体のグリシジル基に、水酸
基を有するアミツカＡ／ｆン［？作用させて、前記エポ
キシ基又はグリシジル基に水酸基を有するアミノカルボ
ン酸を結合させる。

水酸基を有するアミノカルぎン酸としては、セリン、ホ
モセリン、ヌレオニン、４−ヒドロキシプロリン、４−
アミノ−３−ヒドロキシ酪酸、Ｎ−）リス（ヒドロキシ
メチル）メチルグリシン等のアミノ酸誘導体や、ゲルコ
サミン酸等のアミノ糖誘導体などを例示することができ
る。

結合の状態は、本発明に係るゲル状共重合体のエポキシ
基又は本発明に係る変性ゲル状共重合体のグリシジル基
が水酸基を有するアミノカルがン酸のアミノ基と結合し
た結果、該工ｄキシ基又はグリシジル基は開環し、水酸
基と水酸基を有するカルボキシル残基が生成することに
なる。

水酸基を有するアミノカルがン酸を作用させるのは、溶
媒の存在下で行なうことができる。溶媒としては、水が
通常用いられるが、その他ｎ−ヘキサン、ベンゼン、午
シレンなどの炭化水素類テトラヒドロフラン、ジオキサ
ンなどのエーテル類、クロロホルム、クロロベンゼンな
どの塩素化炭化水素類、エタノールやメチルセロソルブ
などのアルコール類、アセトンやメチルイソブチルケト
ンなどのケトン類などの他、ジメチルホルムアミド、ジ
メチルスルホキサイドなども用いられ、又これらは単一
でも混合溶媒系でも良い。又、特に触媒は用いないでも
よいが水酸化ナトリ９ムや炭酸カリウムなどのアルカリ
又はアルカリ土類金属の水酸化物又は炭酸塩などを用い
ることもできる。

反応条件については必ずしも制限はないが、一般に次の
様な条件を選択して反応を行なうのが好ましい。

本発明に係るゲル状共重合体又は本発明に係る変性ゲル
状共重合体の重量（ａ）と水酸基を有するアミノカルボ
ン酸の重量（ｂ）の比： ａ：ｂ＝１：０．３〜１０゜ よシ好ましくは、 ａ　：　ｂ＝１　：　０．３〜３、 反応温度：０−１５０℃、よシ好ましくは室温〜１００
℃、 反応時間：１〜６０時間、より好ましくは１〜３０時間
、 反応圧カニ常圧〜１０　ａｔｍ、より好ましくは常圧Ｏ 反応後の後処理についても特別な要件はなく、ｐ別、洗
浄等通常行なわれている方法にて適宜実施される。

発明の効果 本発明によシ提供されるクロマトグラフィー用担体は、
既に結合されているカルボキシル基を介してアフィニテ
ィークロマトグラフィー用配位子（リガンド）を容易に
共有結合させることが可能であり、従ってアフィニティ
ークロマトグラフィー用の水不溶性活性支持体として非
常に有用なものである。

その上、前述したアフィニティークロマトグラフィー用
活性支持体に望まれる性質については、本発明に係るゲ
ル状共重合体、又は本発明に係る変性ゲル状共重合体の
もたらす親水的性質は例えば蛋白質等と接触する際の疎
水的非特異的吸着を抑え、又その有孔構造はリガンドと
吸着目的物質の相互作用の発現に有利に作用しうろこと
が明らかである。更に本発明によシ提供嘔れるクロマト
グラフィー用担体は総て化学的共有結合によシ製せられ
た合成高分子物質である為、物理的、化学的、生物学的
に非常に安定なものでアシ通常供せられるアフィニティ
ークロマトグラフィーのリガンドの結合、目的物質の分
離、溶出および洗浄の条件下で全く何らかの影響を受け
ることがないことは大きな利点となる。これらの性質は
特に高速アフィニティークロマトグラフィー用の担体お
よび工業的分離精製プロセス用の担体としては欠くべか
らざるものでアシ本発明により提供されるクロマトグラ
フィー用担体の効果は非常に大きい。

また、本発明のクロマトグラフィー用担体は、活性支持
基となるアミノカルボン酸誘導体として水酸基を有する
化合物を用いることによシ基剤以外の部分即ち活性支持
基の部分に基く疎水性に由来する非特異的吸着をも排除
することができる。

更に、本発明のクロマトグラフィー用担体を用いること
により、実験室レベルから大容量の分離精製設備にまで
適用でき各種条件下で高能率で操作可能であるばかシで
なく分析用としても所謂高性能をアフィニティークロマ
トグラフィーとして高圧下でも使用できるアフィニティ
ークロマトグラフィー用充填剤を製造することができる
。

本発明によ〕提供されるクロマトグラフィー用担体は前
述の如くアフィニティークロマトグラフィー用の活性支
持体として有用なものであるが、以下に本発明のクロマ
トグラフィー用担体の製造法について代表的な例を示し
、更に具体的に説明する。但しこれらは説明の為の単な
る例示であって本発明はこれらに何ら制限されないこと
は言うまでもない。

実施例１ グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタ
クリレートから得られた工Ｉキシ基含有ゲル状共重合体
１．０ｇに、１モル−水酸化ナトリ９ム水溶ｆｉ２．０
Ｉｉ及び４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸１．Ｏｇを加
え、５０℃に加熱して振盪下で６時間反応させた。次い
でゲルをＦ取し、水及び０．０１規定塩酸で洗浄し、再
び大量の水で洗い乾燥させた。過塩素酸による非水滴定
によるアミン基の定量値は乾燥ゲル１ｙ当！＋０．４５
ミリモルであっ九。

実施例２ グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタ
クリレートから得られた共重合体を水によシ開環変性し
、更にエビクロロヒドリンでグリシジル基を導入したゲ
ル（エポキシ基：乾燥ゲル１ｇ当り０．５ミリモル）１
．０．９に、炭酸ナトリウム−Ｑ、５ｐの水２ｄによる
溶液及び４−アミノ−３−ヒドロキシ醋酸１．０１７　
ｔ−加え、６０℃に加熱して振盪下で１０時間反応させ
た。次いで、ゲルをｐ取し水及び０．０１Ｎ塩酸で洗浄
し再び大量の水で洗い乾燥させた。過塩素酸による非水
滴定によるアミノ基の定量値は乾燥ゲル１ｇ当り０．２
５ミリモルであった。

実施例３ 実施例２におけるエビクロロヒドリン及び４−アミノ−
３−ヒドロキシ酪酸の代りにそれぞれ１．４−ブタジオ
ールジグリシジルエーテル及びセリンを用いて同様の操
作を行なうことによシ、アミノ基の定量値が乾燥ゲル１
ｇ当ｊＱ０．３ミリモルのゲルが得られた。

実施例４ 実施例３におけるセリンの代りに４−アミノ−３−ヒド
ロキシ酪酸を用いて同様の操作を行なうことによシ、ア
ミン基の定量値が乾燥ゲルＩＩ当シ０．１５　ミＩＪそ
ルのゲルが得られた。

実施例５ 実施例２におけるエビクロロヒＰリン及び４−アミノ−
３−ヒドロキシ酪酸の代シに、それぞれエチレングリコ
ールジグリシジルエーテル及びゲルコサミン酸を用いて
同様の操作を行なうことによりアミノ基の定量値が乾燥
ゲルＩＩ当シ０．０８ミリモルのゲルが得られた＠ 参考例 実施例４によシ得られたゲル１．０ｇを無水ジオキサン
で充分洗浄した後、無水ジオキサン４ｄ中に加え更にＮ
−ヒドロキシコノ・り酸イミド８０〜及びジシクロへキ
シルカル？ジイミド１４４ｆｆ＋９’ｉ加えて室温で２
時間振盪した後ゲルを戸取し、無水ジオキサン２０−、
メタノール６ゴ、冷水３ｄの順で素早く洗浄した。この
ゲルをコンカナノぐリンＡ２０ｍ？及びα−メチル−マ
ンノピラノシド２５■の０，１ミリモル塩化カルシウム
、０．１ミリモル塩化マンガン及び０８０１モル炭酸水
素ナトリウムの水２ａにおける溶液に加え室温で２時間
振盪後、４℃で一夜放置した。ゲルを戸取し１モル塩化
す）　ＩＪウム水溶液及び水で洗浄し次後、１モルのト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　２　ｍ／に加え室温
で１時間振盪した後、再びゲルを戸数して水洗した。

こうして得られたゲルは乾燥ゲルｌ　ｇ描りコンカナバ
リンＡを９．６１ｎ９担持させていることが未反応によ
る回収コンカナバリンＡの量から確かめられた。

試験例 参考例で得られたゲル及び実施例２及び３で得られた支
持体に参考例と同様の操作によシコンカナハＩＪンＡを
結合させたゲルについて、夫々カラム（ステンレス製４
．６φ×７５ｍ罵）に充填し高速液体クロマトグラフ装
置を用いてγ−グロブリンの吸着の程度を比較したとこ
ろ次の表１に示すような結果が得られた。

比較ゲル■：実施例２の４−アミノ−３−ヒドロキシ酪
酸の代シに４−アミノ酪酸を 用いたもの、 比較ゲル■：実施例４の４−アミノ−３−ヒドロキシ酪
酸の代シに４−アミノ酪酸を 用いたもの、 溶離液＠：０．０２モル）　ＩＪスス−酸緩衝液（ｐＨ
７，４）＋１．５モル硫酸アンモニウム、溶離液■　：
０．０２モル）　ＩＪスス−酸緩衝液（ｐＨ７，４）＋
１．３モル硫酸アンモニウム、検出器　　：　紫外線２
８０　ｎｍ、

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （Ａ）グリシジルモノビニルエステル又はグリシジルモ
   ノビニルエーテル及び（Ｂ）アルキレングリコールジビ
   ニルエステルを主成分とし前記（Ａ）成分が（Ｂ）成分
   で架橋されたゲル状共重合体の前記（Ａ）成分に基づく
   エポキシ基に、又は該エポキシ基が水により開環変性さ
   れて生成するヒドロキシル基にグリシジル基を有する化
   合物を結合させて得られる変性ゲル状共重合体の前記グ
   リシジル基に、水酸基を有するアミノカルボン酸が結合
   している多孔性の共重合体から成ることを特徴とするク
   ロマトグラフィー用担体。