JP2002529714A - クロマトグラフィー分離法および選択吸着体 - Google Patents
クロマトグラフィー分離法および選択吸着体Info
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- B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
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- B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
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- B01J2220/80—Aspects related to sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J2220/82—Shaped bodies, e.g. monoliths, plugs, tubes, continuous beds
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/50—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid
- G01N30/52—Physical parameters
- G01N2030/524—Physical parameters structural properties
- G01N2030/528—Monolithic sorbent material
Abstract
(57)【要約】
本発明は、クロマトグラフィーカラムにおける固定相としての使用に適した新しい選択吸着体に関し、そのコアーは合成あるいは天然起源の有機重合体からなる。更に、本発明による分離担体は、その表面上に共有結合した非芳香族両性イオン基としての複次的面を示す。更に、本発明はまた、両性イオン イオン交換クロマトグラフィーおよび、両性イオン イオン交換クロマトグラフィーの使用に適したイオン交換カラムによる、タンパク質や核酸の様な、特定の生体高分子の精製の為の手法にも関する。
Description
【０００１】 技術的分野 本発明は生体高分子の分離に適した新しいイオン交換クロマトグラフィー法に
関する。本分離手法は両性イオン官能基が結合した選択吸着体を使うことに原理
をおいている。また本発明は両性イオン・ペンダント状官能基を共有結合で付け
た新しい選択吸着体にも関する。
関する。本分離手法は両性イオン官能基が結合した選択吸着体を使うことに原理
をおいている。また本発明は両性イオン・ペンダント状官能基を共有結合で付け
た新しい選択吸着体にも関する。
【０００２】 技術的な背景 イオン交換クロマトグラフィー（IEC）は、高圧あるいは低圧クロマトグラフ
ィーのいずれかで使用されており、タンパク質精製法において最も広く利用され
ている。イオン交換選択吸着体は、通常表面に陽イオンか陰イオン基が付いた無
機のシリカ球か重合体粒子であり、それらの表面の陽イオン或いは陰イオン基が
、反対電荷のイオン分子種と静電的に相互作用する様に出来ている。タンパク質
分子の保持は従ってタンパク質分子の荷電状態、選択吸着体上の相互作用し得る
基の量、そしてそれぞれの基との相互作用の強さに依存しする。分析分子の（選
択吸着体上からの）解離は、通常移動相のイオン強度を競合的に増加させる事で
達成するが、その時、相対的に高い濃度の塩が、穏和に保持されているタンパク
質分子に対してすら、溶出に時には必要とされることがある［Deutscher,M.P.(E
d.),Guide to Protein Purification（タンパク質精製へのガイド）(Meth.Enzym
ol.,Vol.182), Academic Press, 1990］。仮に多くのタンパク質が重大な変性を
しないで高濃度の塩に耐えられても、例えば“塩析”とか、或いは分離した試料
をかなり低い生理食塩緩衝液に置き、分離後の溶質の更なる透析操作を避けたい
と言った場合の様に、常に溶出液のイオン強度にはその他の実験的な限定がある
。また理想的なイオン交換選択吸着体は非特異的な相互作用基を持たず、大きな
タンパク質でも入ることの出来る内部穴を持ち、そして、高い流速でも十分使え
る分子通過性と機械的な強度を持つものであるべきである（Muller，W., J．Chr
omatogr., 1990, 510, 133-140）。従って、高濃度の塩を用いた溶出を必要とせ
ず、上記の理想のイオン交換選択吸着体に関する条件を出来るだけ多く満足させ
た、改良されたイオン交換クロマトグラフィー法の必要性が存在する。
ィーのいずれかで使用されており、タンパク質精製法において最も広く利用され
ている。イオン交換選択吸着体は、通常表面に陽イオンか陰イオン基が付いた無
機のシリカ球か重合体粒子であり、それらの表面の陽イオン或いは陰イオン基が
、反対電荷のイオン分子種と静電的に相互作用する様に出来ている。タンパク質
分子の保持は従ってタンパク質分子の荷電状態、選択吸着体上の相互作用し得る
基の量、そしてそれぞれの基との相互作用の強さに依存しする。分析分子の（選
択吸着体上からの）解離は、通常移動相のイオン強度を競合的に増加させる事で
達成するが、その時、相対的に高い濃度の塩が、穏和に保持されているタンパク
質分子に対してすら、溶出に時には必要とされることがある［Deutscher,M.P.(E
d.),Guide to Protein Purification（タンパク質精製へのガイド）(Meth.Enzym
ol.,Vol.182), Academic Press, 1990］。仮に多くのタンパク質が重大な変性を
しないで高濃度の塩に耐えられても、例えば“塩析”とか、或いは分離した試料
をかなり低い生理食塩緩衝液に置き、分離後の溶質の更なる透析操作を避けたい
と言った場合の様に、常に溶出液のイオン強度にはその他の実験的な限定がある
。また理想的なイオン交換選択吸着体は非特異的な相互作用基を持たず、大きな
タンパク質でも入ることの出来る内部穴を持ち、そして、高い流速でも十分使え
る分子通過性と機械的な強度を持つものであるべきである（Muller，W., J．Chr
omatogr., 1990, 510, 133-140）。従って、高濃度の塩を用いた溶出を必要とせ
ず、上記の理想のイオン交換選択吸着体に関する条件を出来るだけ多く満足させ
た、改良されたイオン交換クロマトグラフィー法の必要性が存在する。
【０００３】 工業や研究における生体物質分離の重要性から、これからの要求を満たす新し
い分離固定相を求めた終わりのない研究がある。特に、現在ある手法とは直交す
るとも言える選択性をもたらす新しい分離モードへの関心が存在する。1992年、
SvecとFrechetは、クロマトグラフィー用カラム内全体で重合体化させ、内部一
帯を硬い大口径の（分子透過）穴を持つ一体型の分離担体にする試みをした（Sv
ec, F.; Frechet, J.M.J. Anal. Chem. 1992, 64, 830-832）。この一体型選択
吸着体の口径はその合成中に簡単に制御でき（Viklund, C.; Svec, F.; Frechet
, J.M.J.; Irgum, K. Chem. Mater. 1996, 8, 744-750; Viklund, C.; Ponten,
E.; Glad, B.; Irgum, K. Svec, F.; Horstedt, P. Chem. Mater. 1997, 9, 463
-471）、それが特定の生体分子分離への応用に適したものにデザインすることを
可能としている。例えば、diethylamine官能基を持つよう修飾されたpoly(glyci
dyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate)一体型選択吸着体は、タンパク
質分離の陰イオン交換モードに使われた（Svec, F.; Frechet, J.M.J., Anal. C
hem. 1992, 64, 830-832; Svec, F.; Frechet, J.M.J., J. Chromatogr. A. 199
5b, 702, 89-95）。Poly(styrene-co-divinylbenzen)一体分離カラムは逆相モー
ドでのタンパク質の高速分離に使われる事に成功し（Wang, Q. C.; Svec, F.; F
rechet, J.M.J. Anal. Chem. 1993, 65, 2243-2248）、最近ポリアクリルアミド
をベースとする一体型選択吸着体が、ブチルメタクリレートを重合剤の中に含ま
せると流体力学的な相互作用モードでタンパク質の高速分離に使うことができる
と報告されている（Xie, S.; Svec, F.; Frechet, J.M.J., J. Chromatogr. A.,
1997, 775, 65-72）。また、最近２-アクリルアミド-２-メチル-プロパンスル
ホン酸をグラフト重合した多孔性一体分離カラムが、塩基性タンパク質の高速陽
イオン交換クロマトグラフィーに使うことができると報告されている（Viklund,
C.; Svec, F.; Frechet, J.M.J.; Irgum, K., Biotechnol. Progr., 1997, 13,
597-600）。
い分離固定相を求めた終わりのない研究がある。特に、現在ある手法とは直交す
るとも言える選択性をもたらす新しい分離モードへの関心が存在する。1992年、
SvecとFrechetは、クロマトグラフィー用カラム内全体で重合体化させ、内部一
帯を硬い大口径の（分子透過）穴を持つ一体型の分離担体にする試みをした（Sv
ec, F.; Frechet, J.M.J. Anal. Chem. 1992, 64, 830-832）。この一体型選択
吸着体の口径はその合成中に簡単に制御でき（Viklund, C.; Svec, F.; Frechet
, J.M.J.; Irgum, K. Chem. Mater. 1996, 8, 744-750; Viklund, C.; Ponten,
E.; Glad, B.; Irgum, K. Svec, F.; Horstedt, P. Chem. Mater. 1997, 9, 463
-471）、それが特定の生体分子分離への応用に適したものにデザインすることを
可能としている。例えば、diethylamine官能基を持つよう修飾されたpoly(glyci
dyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate)一体型選択吸着体は、タンパク
質分離の陰イオン交換モードに使われた（Svec, F.; Frechet, J.M.J., Anal. C
hem. 1992, 64, 830-832; Svec, F.; Frechet, J.M.J., J. Chromatogr. A. 199
5b, 702, 89-95）。Poly(styrene-co-divinylbenzen)一体分離カラムは逆相モー
ドでのタンパク質の高速分離に使われる事に成功し（Wang, Q. C.; Svec, F.; F
rechet, J.M.J. Anal. Chem. 1993, 65, 2243-2248）、最近ポリアクリルアミド
をベースとする一体型選択吸着体が、ブチルメタクリレートを重合剤の中に含ま
せると流体力学的な相互作用モードでタンパク質の高速分離に使うことができる
と報告されている（Xie, S.; Svec, F.; Frechet, J.M.J., J. Chromatogr. A.,
1997, 775, 65-72）。また、最近２-アクリルアミド-２-メチル-プロパンスル
ホン酸をグラフト重合した多孔性一体分離カラムが、塩基性タンパク質の高速陽
イオン交換クロマトグラフィーに使うことができると報告されている（Viklund,
C.; Svec, F.; Frechet, J.M.J.; Irgum, K., Biotechnol. Progr., 1997, 13,
597-600）。
【０００４】 多元イオン交換クロマトグラフィー分離の実験は陰イオン交換カラムと陽イオ
ン交換カラムを連続してつないで行われた（El Rassi, Z.; Horwath, C. J. Chr
omatogr., 1986, 359, 255）、また、陰イオンと陽イオン選択吸着体の両者を混
ぜたもので作ったカラムでも行われた（Maa, Y.F.; Antia, F.; El Raasi, Z.;
Horwath, C. J. Chromatogr., 1988, 452, 331）。陰イオンと陽イオン混合の分
離担体でのタンパク質分離は間に中性膜を入れ陽イオン交換膜と陰イオン交換膜
を交互に積み上げても行われた（Freitag, R.; Splitt, H; Reif, O.-W., J. Ch
romatogr., 1996, 728, 129-37）。
ン交換カラムを連続してつないで行われた（El Rassi, Z.; Horwath, C. J. Chr
omatogr., 1986, 359, 255）、また、陰イオンと陽イオン選択吸着体の両者を混
ぜたもので作ったカラムでも行われた（Maa, Y.F.; Antia, F.; El Raasi, Z.;
Horwath, C. J. Chromatogr., 1988, 452, 331）。陰イオンと陽イオン混合の分
離担体でのタンパク質分離は間に中性膜を入れ陽イオン交換膜と陰イオン交換膜
を交互に積み上げても行われた（Freitag, R.; Splitt, H; Reif, O.-W., J. Ch
romatogr., 1996, 728, 129-37）。
【０００５】 固定相や溶出相に両性イオン雰囲気を持たせたクロマトグラフィー技術は、１
９８１年にKnoxとJurandが11-amino undecanoic酸を溶出液に“両性イオンペア
ー剤”として加えると４重極イオンペアーが形成されると言う方法を紹介して以
来、注目された（Knox, J. H.; Jurand, J. a) J. Chromatogr. 1981, 203, 85-
92; b) J. Chromatogr. 1981, 218, 341-354; J. Chromatogr. 1981, 218, 355
-363; J. Chromatogr. 1982, 234, 222-224）。このコンセプトは多様なヌクレ
オチドやアミノ酸3ヶまでで構成されるオリゴペプチドを逆相クロマトグラフィ
ーで分離する際、保持を改善することが分かった。
９８１年にKnoxとJurandが11-amino undecanoic酸を溶出液に“両性イオンペア
ー剤”として加えると４重極イオンペアーが形成されると言う方法を紹介して以
来、注目された（Knox, J. H.; Jurand, J. a) J. Chromatogr. 1981, 203, 85-
92; b) J. Chromatogr. 1981, 218, 341-354; J. Chromatogr. 1981, 218, 355
-363; J. Chromatogr. 1982, 234, 222-224）。このコンセプトは多様なヌクレ
オチドやアミノ酸3ヶまでで構成されるオリゴペプチドを逆相クロマトグラフィ
ーで分離する際、保持を改善することが分かった。
【０００６】 Kurganovと共同研究者（Kurganov, A. A.; Davankov, V. A.; Unger, K.K. J.
Chromatogr. 1991, 548, 207-214）は、スルホン酸と４級アンモニウム基の両
方を持つ固定相を用いて酸性ないし塩基性たんぱく質を分離することができた。
この混合モードの選択吸着体は、正しくないがこの論文の中で両性イオン選択吸
着体と呼ばれた。これはシリカの表層に重合されたスチレン層をクロロメチル化
ののちスルホン化し、さらにトリメチルアミノ化してスルホン基と4級アンモニ
ウム基を導入されたものである。この方法は従って表層の離れたフェニル基の上
に異なった電荷のイオン交換基を作ることになり、この論文のｐ．２１２にある
ように、二つの重要な側面が明らかにされた、つまりa)“実験結果から過剰な陰
イオン交換基の中に陽イオン交換基を含むイオン交換分離担体であること”、b)
“リゾチームのピーク（最後に溶出されるピーク）は、溶出を高流速で行っても
相対的に広がっている。この広がりはリゾチームとイオン交換基との混合モード
の相互作用によるものと思われる。” もうひとつの混合モード選択吸着体の例は、野村と共同研究者（Nomura, A.;
Yamada, J.; Tsunoda, K. Anal. Chem. 1988, 60, 2509-2512）のもので、彼ら
は、シリカ基材のHPLC（高速液体クロマトグラフィーの略）固定相の上にアミノ
基含有分子とカルボキシル基含有グループを別々にそれぞれ固定化したと報告し
ている。この真に両性といえる選択吸着体のタンパク質分離に対する安定性が研
究された。しかし、満足の行く結果は得られず、あるタンパク質は大変強く吸着
し、従ってそれらは溶出させるのが大変困難であった。
Chromatogr. 1991, 548, 207-214）は、スルホン酸と４級アンモニウム基の両
方を持つ固定相を用いて酸性ないし塩基性たんぱく質を分離することができた。
この混合モードの選択吸着体は、正しくないがこの論文の中で両性イオン選択吸
着体と呼ばれた。これはシリカの表層に重合されたスチレン層をクロロメチル化
ののちスルホン化し、さらにトリメチルアミノ化してスルホン基と4級アンモニ
ウム基を導入されたものである。この方法は従って表層の離れたフェニル基の上
に異なった電荷のイオン交換基を作ることになり、この論文のｐ．２１２にある
ように、二つの重要な側面が明らかにされた、つまりa)“実験結果から過剰な陰
イオン交換基の中に陽イオン交換基を含むイオン交換分離担体であること”、b)
“リゾチームのピーク（最後に溶出されるピーク）は、溶出を高流速で行っても
相対的に広がっている。この広がりはリゾチームとイオン交換基との混合モード
の相互作用によるものと思われる。” もうひとつの混合モード選択吸着体の例は、野村と共同研究者（Nomura, A.;
Yamada, J.; Tsunoda, K. Anal. Chem. 1988, 60, 2509-2512）のもので、彼ら
は、シリカ基材のHPLC（高速液体クロマトグラフィーの略）固定相の上にアミノ
基含有分子とカルボキシル基含有グループを別々にそれぞれ固定化したと報告し
ている。この真に両性といえる選択吸着体のタンパク質分離に対する安定性が研
究された。しかし、満足の行く結果は得られず、あるタンパク質は大変強く吸着
し、従ってそれらは溶出させるのが大変困難であった。
【０００７】 陰イオンと陽イオン交換樹脂の混合したもので構成されるよう意識的に設計さ
れた重合体キャリアーの中で、「蛇籠樹脂」と呼ばれたものがあり、これは、ア
クリル酸の重合（「蛇」）で作られ、それが結果として陽イオンと陰イオン交換
基が化学量論的に等しくなるよう、陰イオン交換樹脂（「籠」）と注意深く平衡
化が図られている（Hatch, M.J.; Dillon, A.; Smith, H.B. Ind. Eng.Chem., 1
957, 49, 1812）。結果として出来た選択吸着体は「イオン（溶出）遅延樹脂」
として、例えば砂糖シロップの脱塩などに使われた。理念的には１：１の化学量
論が保たれるべきであったが、イオン交換総量以外にはこれらの選択吸着体を生
産する際に問題があり、それは選択吸着体の中で、イオン交換基が「継ぎはぎの
様に」不均等に分布していることによると信じられている（Small, H. Ion Chro
matography, Plenum Press: New York, 1989, pp. 133-134）。
れた重合体キャリアーの中で、「蛇籠樹脂」と呼ばれたものがあり、これは、ア
クリル酸の重合（「蛇」）で作られ、それが結果として陽イオンと陰イオン交換
基が化学量論的に等しくなるよう、陰イオン交換樹脂（「籠」）と注意深く平衡
化が図られている（Hatch, M.J.; Dillon, A.; Smith, H.B. Ind. Eng.Chem., 1
957, 49, 1812）。結果として出来た選択吸着体は「イオン（溶出）遅延樹脂」
として、例えば砂糖シロップの脱塩などに使われた。理念的には１：１の化学量
論が保たれるべきであったが、イオン交換総量以外にはこれらの選択吸着体を生
産する際に問題があり、それは選択吸着体の中で、イオン交換基が「継ぎはぎの
様に」不均等に分布していることによると信じられている（Small, H. Ion Chro
matography, Plenum Press: New York, 1989, pp. 133-134）。
【０００８】 Yuらは（a) Yu, L. W.; Hartwick, R. A. J. Chromatogr. Sci. 1989, 27, 17
6-185; b) Yu, L. W.; Floyd, T. R.; Hartwich, R. A. J. Chromatogr. Sci. 1
986, 24, 177-182）化学的に結合した両イオン性シリカ選択吸着体を調製したと
述べ、核酸の分離への可能性も示している。この物質では、タンパク質の満足の
行く結果が示されていない。多くの論文の中で,Huと共同研究者は（a) Hu, W.;
Takeuchi, T.; Haraguchi, H. Anal. Chem. 1993, 65, 2204-2208; b) Hu, W.;
Tao, H.; Haraguchi, H. 1994, 66, 2514-2520）市販の逆相（オクタデシル）シ
リカカラムを市販の両性イオン界面活性剤で動的に覆って研究をした。この戦略
では、両性イオン界面活性剤が非共有結合的にカラムに吸着されている。この戦
略を用いて、無機陽イオンおよび陰イオンを移動層を純水として、一度に分離す
ることが出来得た。水を移動相に使う一つの重要な理由は、分離の際に両性イオ
ン界面活性剤が洗い流されることを少なくする為である。分離中にODS（オクタ
デシルシリカ樹脂の略）-カラムから連続的に洗い流される界面活性剤を置きか
える為、界面活性剤は場合によっては溶出液の中に含ませられた。Huは唾液から
純粋なアルファ-アミラーゼをこのような界面活性剤で修飾した疎水性シリカで
分離できたと主張している。しかし、この酵素は、脱塩操作の為のゲルろ過法で
、カラム内を遅れることなく通過したと述べていることは重要である、そして、
彼らは彼らの結果を、主にサイズ排除効果によるものだと解釈している（US5,58
9,069;Col.12，29-31行）。その他のどんなタンパク質も同時に試されておらず
、このことは、Huの界面活性剤を基剤とした動的な修飾法は異なったタンパク質
を分離する可能性を持っていることを明確にされなかったことを意味する。最後
に、もう一つ重要なことを指摘すれば、製薬産業においては、カラムの一部の物
質が、医薬品を調製するのに使用する化合物と一緒に漏れ出てくる様な分離カラ
ムを用いることは受け入れられないということである。
6-185; b) Yu, L. W.; Floyd, T. R.; Hartwich, R. A. J. Chromatogr. Sci. 1
986, 24, 177-182）化学的に結合した両イオン性シリカ選択吸着体を調製したと
述べ、核酸の分離への可能性も示している。この物質では、タンパク質の満足の
行く結果が示されていない。多くの論文の中で,Huと共同研究者は（a) Hu, W.;
Takeuchi, T.; Haraguchi, H. Anal. Chem. 1993, 65, 2204-2208; b) Hu, W.;
Tao, H.; Haraguchi, H. 1994, 66, 2514-2520）市販の逆相（オクタデシル）シ
リカカラムを市販の両性イオン界面活性剤で動的に覆って研究をした。この戦略
では、両性イオン界面活性剤が非共有結合的にカラムに吸着されている。この戦
略を用いて、無機陽イオンおよび陰イオンを移動層を純水として、一度に分離す
ることが出来得た。水を移動相に使う一つの重要な理由は、分離の際に両性イオ
ン界面活性剤が洗い流されることを少なくする為である。分離中にODS（オクタ
デシルシリカ樹脂の略）-カラムから連続的に洗い流される界面活性剤を置きか
える為、界面活性剤は場合によっては溶出液の中に含ませられた。Huは唾液から
純粋なアルファ-アミラーゼをこのような界面活性剤で修飾した疎水性シリカで
分離できたと主張している。しかし、この酵素は、脱塩操作の為のゲルろ過法で
、カラム内を遅れることなく通過したと述べていることは重要である、そして、
彼らは彼らの結果を、主にサイズ排除効果によるものだと解釈している（US5,58
9,069;Col.12，29-31行）。その他のどんなタンパク質も同時に試されておらず
、このことは、Huの界面活性剤を基剤とした動的な修飾法は異なったタンパク質
を分離する可能性を持っていることを明確にされなかったことを意味する。最後
に、もう一つ重要なことを指摘すれば、製薬産業においては、カラムの一部の物
質が、医薬品を調製するのに使用する化合物と一緒に漏れ出てくる様な分離カラ
ムを用いることは受け入れられないということである。
【０００９】 両性イオンモノマーから合成された両性イオン重合体は、その魅力的な粘弾性
的な挙動から、重合体化学の分野において主に研究されてきており（Soto, M.;
Galin, V. M. Polymer, 1984, 25, 254; Schulz, D. N.; Peiffer, D. G.; Agar
wal, P. K.; Larabee, J.; Kaladas, J. J.; Soni, L.; Handwerker, B.; Garne
r, R. T. Polymer, 1986, 27, 1734-1742; Huglin, M. B.; Rego, J. M. Macrom
olecules, 1991, 24, 2556-2563）、むしろクロマトグラフィー的分離の目的で
は使われて来なかった。最も精力的に研究された両性イオン重合体の種類は、ス
ルフォベタイン基を持つモノマーから作られるもので、この基には、陽イオン官
能基(4級アンモニウム基)と陰イオン官能基（スルホン基）が主鎖重合体上の側
鎖ペンダント内に非常に近接して存在し、従って、総電荷がゼロの重合体を得る
ことが可能である。交差結合のない両性イオン重合体のその溶液特性は、荷電基
間のクーロン相互作用の結果と考えられ、周囲の水溶媒中の電解質濃度は従って
重合体の溶解度に大きな影響を与える（Soto, M.; Galin, V. M. Polymer, 1984
, 25, 254; Schulz, D. N.; Peiffer, D. G.; Agarwal, P. K.; Larabee, J.; K
aladas, J. J.; Soni, L.; Handwerker, B.; Garner, R. T. Polymer, 1986, 27
, 1734-1742; Huglin, M. B.; Rego, J. M. Macromolecules, 1991, 24, 2556-2
563）。 両性イオン重合体選択吸着体の分野においては、GroteとSchumacher（
Grote, M.; Schumacher, U. React. Funct. Polym., 1997, 35, 179-196）が、
テトラゾリウム陰イオン交換基を含む一連の選択吸着体を調製し、その内の一つ
に、テトラゾリウム環に結合されたベンゼンスルホン酸基で、両性イオン基を含
むものも含まれる。この選択吸着体は、貴金属の回収に使われた。
的な挙動から、重合体化学の分野において主に研究されてきており（Soto, M.;
Galin, V. M. Polymer, 1984, 25, 254; Schulz, D. N.; Peiffer, D. G.; Agar
wal, P. K.; Larabee, J.; Kaladas, J. J.; Soni, L.; Handwerker, B.; Garne
r, R. T. Polymer, 1986, 27, 1734-1742; Huglin, M. B.; Rego, J. M. Macrom
olecules, 1991, 24, 2556-2563）、むしろクロマトグラフィー的分離の目的で
は使われて来なかった。最も精力的に研究された両性イオン重合体の種類は、ス
ルフォベタイン基を持つモノマーから作られるもので、この基には、陽イオン官
能基(4級アンモニウム基)と陰イオン官能基（スルホン基）が主鎖重合体上の側
鎖ペンダント内に非常に近接して存在し、従って、総電荷がゼロの重合体を得る
ことが可能である。交差結合のない両性イオン重合体のその溶液特性は、荷電基
間のクーロン相互作用の結果と考えられ、周囲の水溶媒中の電解質濃度は従って
重合体の溶解度に大きな影響を与える（Soto, M.; Galin, V. M. Polymer, 1984
, 25, 254; Schulz, D. N.; Peiffer, D. G.; Agarwal, P. K.; Larabee, J.; K
aladas, J. J.; Soni, L.; Handwerker, B.; Garner, R. T. Polymer, 1986, 27
, 1734-1742; Huglin, M. B.; Rego, J. M. Macromolecules, 1991, 24, 2556-2
563）。 両性イオン重合体選択吸着体の分野においては、GroteとSchumacher（
Grote, M.; Schumacher, U. React. Funct. Polym., 1997, 35, 179-196）が、
テトラゾリウム陰イオン交換基を含む一連の選択吸着体を調製し、その内の一つ
に、テトラゾリウム環に結合されたベンゼンスルホン酸基で、両性イオン基を含
むものも含まれる。この選択吸着体は、貴金属の回収に使われた。
【００１０】 発明の要約 クロマトグラフィーの分離過程の固定相として多孔性の選択吸着分離担体を用
い、当該選択吸着分離担体のコアーが有機樹脂であり、当該選択吸着分離担体が
、その構造全体に両性イオン性の非芳香基を持つモノマーユニットから出来てい
る重合体や共重合体であり、或いは、両性イオン性の非芳香基がペンダント状に
その表面に共有結合でグラフト結合か結合されているものを用いると、タンパク
質のような生体高分子が、大変マイルドで変性しない条件でイオン交換クロマト
グラフ分離を行う事ができることをそこで考え出した。
い、当該選択吸着分離担体のコアーが有機樹脂であり、当該選択吸着分離担体が
、その構造全体に両性イオン性の非芳香基を持つモノマーユニットから出来てい
る重合体や共重合体であり、或いは、両性イオン性の非芳香基がペンダント状に
その表面に共有結合でグラフト結合か結合されているものを用いると、タンパク
質のような生体高分子が、大変マイルドで変性しない条件でイオン交換クロマト
グラフ分離を行う事ができることをそこで考え出した。
【００１１】 定義 ここに開示した様に、“選択吸着体(sorbent)”とは、選択的な吸着（収着）
能をもつ物質に関し、クロマトグラフィー分離における固定相として使われる。
能をもつ物質に関し、クロマトグラフィー分離における固定相として使われる。
【００１２】 ここに開示した様に、複合語“選択吸着分離担体(sorbent carrier)”とは、
クロマトグラフィー分離における固定相の支持構造として使われるに適した機械
的、流体動力学的な特性を持った物質に関する。
クロマトグラフィー分離における固定相の支持構造として使われるに適した機械
的、流体動力学的な特性を持った物質に関する。
【００１３】 ここに開示した様に、“多孔性一体型選択吸着分離担体(porous monolithic
sorbent carrier)”とは、イオン交換クロマトグラフィーおよび高速液体クロ
マトグラフィー（HPLC）操作において、選択吸着分離担体として使うことの出来
る適切なサイズの細孔チャンネルを持った構造物に関する。
sorbent carrier)”とは、イオン交換クロマトグラフィーおよび高速液体クロ
マトグラフィー（HPLC）操作において、選択吸着分離担体として使うことの出来
る適切なサイズの細孔チャンネルを持った構造物に関する。
【００１４】 ここに開示した様に、“有機樹脂(organic resin)”とは、合成あるいは天然
由来の有機重合体あるいは共重合体を示し、モノあるいはオリゴビニールモノマ
ーユニットの、例えば、スチレンとその付加誘導体、アクリル酸あるいはメタク
リル酸、アルキル アクリレートとメタクリレート、ハイドロキシアルキル ア
クリレートとメタクリレート、アクリルアミドとメタクリルアミド、ビニルピリ
ジンとその付加誘導体、ジビニルベンゼン、ジビニルピリジン、アルキレン ジ
アクリレート、アルキレン ジメタクリレート、オリゴエチレン グリコール
ジアクリレート と オリゴエチレン グリコール ジメタクリレートで５ケの
エチレン グリコール 繰り返しユニットを持つものまで、アルキレン ビス（
アクリルアミド）、ピペリジン ビス（アクリルアミド）、トリメチロールプロ
パン トリアクリレート、トリメチロールプロパン トリメタクリレート、ペン
タエリスリオール トリアクリレート と テトラアクリレート、そして、これ
らの混合物からなる。また、それは、炭水化物の重合体である、アガロース、セ
ルロース、デキストラン、キトサン、それらの交差結合誘導体にも関する。後に
更に開示するように、このような有機樹脂は本発明の選択吸着体の核となる構成
物を形成する。
由来の有機重合体あるいは共重合体を示し、モノあるいはオリゴビニールモノマ
ーユニットの、例えば、スチレンとその付加誘導体、アクリル酸あるいはメタク
リル酸、アルキル アクリレートとメタクリレート、ハイドロキシアルキル ア
クリレートとメタクリレート、アクリルアミドとメタクリルアミド、ビニルピリ
ジンとその付加誘導体、ジビニルベンゼン、ジビニルピリジン、アルキレン ジ
アクリレート、アルキレン ジメタクリレート、オリゴエチレン グリコール
ジアクリレート と オリゴエチレン グリコール ジメタクリレートで５ケの
エチレン グリコール 繰り返しユニットを持つものまで、アルキレン ビス（
アクリルアミド）、ピペリジン ビス（アクリルアミド）、トリメチロールプロ
パン トリアクリレート、トリメチロールプロパン トリメタクリレート、ペン
タエリスリオール トリアクリレート と テトラアクリレート、そして、これ
らの混合物からなる。また、それは、炭水化物の重合体である、アガロース、セ
ルロース、デキストラン、キトサン、それらの交差結合誘導体にも関する。後に
更に開示するように、このような有機樹脂は本発明の選択吸着体の核となる構成
物を形成する。
【００１５】 ここに開示された様に、“非芳香族両性イオン基(zwitterionic non-aromati
c group)”とは、同じペンダント状基に正と負の電価を同時に持つ、付加され
たイオン性の非芳香族官能基に関し、結果としてその使用中の主な条件下で総電
荷がないものを言う。この様な基は、バックボーンとなる重合体に直接的に結合
されるモノマー単位として存在するか、あるいは、少なくとも部分的に非芳香族
両性イオンモノマーユニットからなる直鎖あるいは交差結合した重合体あるいは
共重合層で、結果としてバックボーン重合体に結合したペンダント状基のおのお
のには多価の非芳香族両性イオン基があるものを言う。非芳香族両性イオン基は
、非芳香族イオン基が生体高分子の分離に適用され得る水のｐH領域において、
解離或いは水素イオン付加平衡を行う事が出来るかによって“強”あるいは“弱
”として呼び分けられる。非芳香族強イオン基の例としては、スルホン酸や4級
アンモニウム基があり、一方弱イオン基の例としてはカルボキシル基やアルキル
- あるいはハイドロキシアルキル-アミンがある。強/強 非芳香族両性イオン
基の例としてスルホアルキルアンモニオベタイン類、スルホアルキルアルセノベ
タイン類、ホスホノアルキルアンモニオベタイン類、そしてホスホノアルキルア
ルセノベタイン類がある。弱/強 非芳香続両性イオンは、一つの強電荷と一つ
の弱電荷からなり、これは、基が両性イオン性であれば総電荷はゼロであり、或
いは、弱イオン基が水素イオン付加しているか、陰イオン基として解離している
か或いは中間の形かで、正か負となる。弱/弱両性イオン基は、例として、ａ）
中性側鎖をアルキルカップリングでα-アミノ基と結合したα-アミノ酸、或いは
ｂ）α位保護したアミノ酸で側鎖にある反応基で結合させ、電荷を持たない共有
結合を形成し、その後、α-アミノ基を脱保護するものがあり、どちらの場合も
、周囲のｐＨに依存して、正や負あるいは総電荷ゼロの電荷を持つことの出来る
両性のペンダント状基を形成する。総電荷ゼロの状態においては、解離性である
か水素イオン付加され得るこれらの基は、反対電荷を一つずつ持つ両性イオンと
中性/中性、非両性イオン型の間の平衡状態にある。ビニール系モノマーで強-強
非芳香族両性イオン基を共有結合したものの例としては、3-(2-アクリルアミド-
2-メチルプロパンジメチルアンモニオ)-1-ブタンサルホネート, 4-(2-アクリル
アミド-2-メチルプロパンジメチルアンモニオ)-1-ブタンサルホネート, 2-メタ
クリルオキシエチルホスホリルクロリン, 4-[(2-アクリルアミド-2-メチルプロ
ピル)ジメチルアンモニオ]ブタノエート,および3-[N-デシル,N-(2-メタクリルオ
キシエチル) N-メチル]アンモニオプロパンサルホネートがある。
c group)”とは、同じペンダント状基に正と負の電価を同時に持つ、付加され
たイオン性の非芳香族官能基に関し、結果としてその使用中の主な条件下で総電
荷がないものを言う。この様な基は、バックボーンとなる重合体に直接的に結合
されるモノマー単位として存在するか、あるいは、少なくとも部分的に非芳香族
両性イオンモノマーユニットからなる直鎖あるいは交差結合した重合体あるいは
共重合層で、結果としてバックボーン重合体に結合したペンダント状基のおのお
のには多価の非芳香族両性イオン基があるものを言う。非芳香族両性イオン基は
、非芳香族イオン基が生体高分子の分離に適用され得る水のｐH領域において、
解離或いは水素イオン付加平衡を行う事が出来るかによって“強”あるいは“弱
”として呼び分けられる。非芳香族強イオン基の例としては、スルホン酸や4級
アンモニウム基があり、一方弱イオン基の例としてはカルボキシル基やアルキル
- あるいはハイドロキシアルキル-アミンがある。強/強 非芳香族両性イオン
基の例としてスルホアルキルアンモニオベタイン類、スルホアルキルアルセノベ
タイン類、ホスホノアルキルアンモニオベタイン類、そしてホスホノアルキルア
ルセノベタイン類がある。弱/強 非芳香続両性イオンは、一つの強電荷と一つ
の弱電荷からなり、これは、基が両性イオン性であれば総電荷はゼロであり、或
いは、弱イオン基が水素イオン付加しているか、陰イオン基として解離している
か或いは中間の形かで、正か負となる。弱/弱両性イオン基は、例として、ａ）
中性側鎖をアルキルカップリングでα-アミノ基と結合したα-アミノ酸、或いは
ｂ）α位保護したアミノ酸で側鎖にある反応基で結合させ、電荷を持たない共有
結合を形成し、その後、α-アミノ基を脱保護するものがあり、どちらの場合も
、周囲のｐＨに依存して、正や負あるいは総電荷ゼロの電荷を持つことの出来る
両性のペンダント状基を形成する。総電荷ゼロの状態においては、解離性である
か水素イオン付加され得るこれらの基は、反対電荷を一つずつ持つ両性イオンと
中性/中性、非両性イオン型の間の平衡状態にある。ビニール系モノマーで強-強
非芳香族両性イオン基を共有結合したものの例としては、3-(2-アクリルアミド-
2-メチルプロパンジメチルアンモニオ)-1-ブタンサルホネート, 4-(2-アクリル
アミド-2-メチルプロパンジメチルアンモニオ)-1-ブタンサルホネート, 2-メタ
クリルオキシエチルホスホリルクロリン, 4-[(2-アクリルアミド-2-メチルプロ
ピル)ジメチルアンモニオ]ブタノエート,および3-[N-デシル,N-(2-メタクリルオ
キシエチル) N-メチル]アンモニオプロパンサルホネートがある。
【００１６】 以下では、この様な非芳香族両性イオン基を形成する重合体化モノマーを以下
では“両性イオンモノマー(zwitterionic monomer)”と呼ぶ。同様に、非芳香
族両性イオン基を形成する今回の発明による多孔性選択吸着体を以下“多孔性両
性イオン選択吸着体(porous zwitterionic sorbent)”と呼ぶ。
では“両性イオンモノマー(zwitterionic monomer)”と呼ぶ。同様に、非芳香
族両性イオン基を形成する今回の発明による多孔性選択吸着体を以下“多孔性両
性イオン選択吸着体(porous zwitterionic sorbent)”と呼ぶ。
【００１７】 本発明の詳細な説明 従って、より特定的に言えば、本発明はクロマトグラフィーカラムでの固定相
として使用するに特に適した新しい選択吸着体に関する。当該選択吸着体の核は
、合成或いは天然起源の有機重合体分離担体で出来ており、当該分離担体はその
表面に共有結合された非芳香族両性イオン基の２面性を示す。
として使用するに特に適した新しい選択吸着体に関する。当該選択吸着体の核は
、合成或いは天然起源の有機重合体分離担体で出来ており、当該分離担体はその
表面に共有結合された非芳香族両性イオン基の２面性を示す。
【００１８】 重合体／共重合体の選択は重要ではなく、従って多くの異なった種類の有機樹
脂を使って発明を遂げることが可能である。表面の蜜な両性イオン官能基によリ
現れる静電的なバリアーは、その下にある分離担体が生体高分子と相互作用する
ことを遮蔽する。従って有機樹脂の役目は主に本発明の非芳香族両性イオン基の
為の安定な分離担体となることである。従って選ばれた有機樹脂が後述する例で
示された様な何らかの化学的手法を使って結合することが可能な反応基を表面に
持っている限り、重合体／共重合体の選択は重要ではない。よって、多くの異な
った種類の有機樹脂に対し、非芳香族両性イオン性ペンダント性基を結合するこ
とで、本発明を実施する事が可能である。
脂を使って発明を遂げることが可能である。表面の蜜な両性イオン官能基によリ
現れる静電的なバリアーは、その下にある分離担体が生体高分子と相互作用する
ことを遮蔽する。従って有機樹脂の役目は主に本発明の非芳香族両性イオン基の
為の安定な分離担体となることである。従って選ばれた有機樹脂が後述する例で
示された様な何らかの化学的手法を使って結合することが可能な反応基を表面に
持っている限り、重合体／共重合体の選択は重要ではない。よって、多くの異な
った種類の有機樹脂に対し、非芳香族両性イオン性ペンダント性基を結合するこ
とで、本発明を実施する事が可能である。
【００１９】 本発明の特異な具体例では、非芳香族両性イオンモノマーが、有機樹脂の選択
吸着分離担体を構成するモノマーの中の一部として含まれることも可能であり、
これは従ってそれ自身が多孔性の両性イオン吸着体となる。
吸着分離担体を構成するモノマーの中の一部として含まれることも可能であり、
これは従ってそれ自身が多孔性の両性イオン吸着体となる。
【００２０】 本発明の特定の具体例では、本発明による選択吸着分離担体が多孔性である。
より特定すれば、その孔の直径は、溶出溶液の全体の流路を与えるために、0.01
〜10μｍの範囲でよいかもしれず、最も好ましいのは0.5〜5μｍの範囲に孔サイ
ズの意味のある分画をもっているものである。
より特定すれば、その孔の直径は、溶出溶液の全体の流路を与えるために、0.01
〜10μｍの範囲でよいかもしれず、最も好ましいのは0.5〜5μｍの範囲に孔サイ
ズの意味のある分画をもっているものである。
【００２１】 本発明の最初の側面の具現においては、非芳香族両性イオン基は、どんなこの
分野の知られている技術の至適な重合法でも、できればグラフト重合法で、非芳
香族両性イオン基を持つモノマーが、分離担体の表面に結合される。ある特定の
具体例では、非芳香族両性イオン基が、非芳香族両性イオン基をもつモノマーが
この分野に習熟した誰かによって容易に選ばれる適切な架橋モノマーと一緒に重
合させられることで、選択吸着分離担体の構造全部を構成することもある。より
特異的には、非芳香族両性イオン基が分離担体にアルキル基の活性化で結合され
ることもありえる、そして、それは続いてω-ジアルキルアミノアルキルスルホ
ン酸と反応させ、分離担体上に非芳香族両性イオン基を形成する；ちょうど、表
面に結合された非芳香族両性イオンペンダント基が、この分野で知られた反応手
法を使い、適切に活性化された選択吸着分離担体上にジアルキルアミン、オプシ
ョンとしていずれかあるいは両方のアルキル置換基に水酸基を含むが、を取り込
み、次にアルキルスルホンの反応をさせることで得られるように。ある特定の具
体例では、選択吸着分離担体は一体型の多孔性ポリマーである。本文脈で、“非
芳香族両性イオン基(zwitterionic non-aromatic group)”とは、一つの同定
できるペンダント性基として有機樹脂分離担体に結合された官能基に関し、当該
官能基は負と正のイオン電荷の両方を持つものとして特徴づけられ、有機樹脂分
離担体上に、直接的にか或いは活性化をした後かに有機樹脂分離担体上に存在す
る官能基を覆う反応によるか、或いはそれらの性質を持った官能機を持つモノマ
ーを重合することにより有機樹脂分離担体に結合されたものである。もう一つの
本発明の最初の側面の具体例では、選択吸着分離担体が、その有機樹脂の表面が
適切な反応可能な官能基を持つことで活性化されたものと特徴付けられる。その
官能基としては、エポキシ基、塩化アルキル基あるいは臭化アルキル基のような
ハロゲン化アルキル基のようなもの、および、アミノアルキルスルホン酸のアミ
ノ基をアルキル化できる様なもので、その反応で選択吸着分離担体上に共有結合
した非芳香族両性イオン基を形成する事ができるものを言う。
分野の知られている技術の至適な重合法でも、できればグラフト重合法で、非芳
香族両性イオン基を持つモノマーが、分離担体の表面に結合される。ある特定の
具体例では、非芳香族両性イオン基が、非芳香族両性イオン基をもつモノマーが
この分野に習熟した誰かによって容易に選ばれる適切な架橋モノマーと一緒に重
合させられることで、選択吸着分離担体の構造全部を構成することもある。より
特異的には、非芳香族両性イオン基が分離担体にアルキル基の活性化で結合され
ることもありえる、そして、それは続いてω-ジアルキルアミノアルキルスルホ
ン酸と反応させ、分離担体上に非芳香族両性イオン基を形成する；ちょうど、表
面に結合された非芳香族両性イオンペンダント基が、この分野で知られた反応手
法を使い、適切に活性化された選択吸着分離担体上にジアルキルアミン、オプシ
ョンとしていずれかあるいは両方のアルキル置換基に水酸基を含むが、を取り込
み、次にアルキルスルホンの反応をさせることで得られるように。ある特定の具
体例では、選択吸着分離担体は一体型の多孔性ポリマーである。本文脈で、“非
芳香族両性イオン基(zwitterionic non-aromatic group)”とは、一つの同定
できるペンダント性基として有機樹脂分離担体に結合された官能基に関し、当該
官能基は負と正のイオン電荷の両方を持つものとして特徴づけられ、有機樹脂分
離担体上に、直接的にか或いは活性化をした後かに有機樹脂分離担体上に存在す
る官能基を覆う反応によるか、或いはそれらの性質を持った官能機を持つモノマ
ーを重合することにより有機樹脂分離担体に結合されたものである。もう一つの
本発明の最初の側面の具体例では、選択吸着分離担体が、その有機樹脂の表面が
適切な反応可能な官能基を持つことで活性化されたものと特徴付けられる。その
官能基としては、エポキシ基、塩化アルキル基あるいは臭化アルキル基のような
ハロゲン化アルキル基のようなもの、および、アミノアルキルスルホン酸のアミ
ノ基をアルキル化できる様なもので、その反応で選択吸着分離担体上に共有結合
した非芳香族両性イオン基を形成する事ができるものを言う。
【００２２】 本発明の優位な具体例としては、上記の反応の結果できる両性イオン基が、ω
-スルホアルキル-トリアルキルアンモニウム（スルホベタイン）基であることで
、ここでは、少なくともアンモニア基の一つのアルキル誘導基が選択吸着分離担
体に共有結合で結合され、いずれかあるいは両方のアルキル基が水酸基を持つこ
とができることである。
-スルホアルキル-トリアルキルアンモニウム（スルホベタイン）基であることで
、ここでは、少なくともアンモニア基の一つのアルキル誘導基が選択吸着分離担
体に共有結合で結合され、いずれかあるいは両方のアルキル基が水酸基を持つこ
とができることである。
【００２３】 更に、後述の例３の類推で、また本分野の習熟した人達によく知られた化学反
応を用い、選択吸着分離担体上への両性イオン基の取り付けは、適切に活性化し
た選択吸着分離担体、例えば、後述の例２を見よ、に、既知の反応を使いジアル
キルアミン、オプションとしていずれかあるいは両方のアルキル置換基に水酸基
を含む、を結合することによって得られる。アミンを脱置換され、かくして、官
能基を付けられた選択吸着分離担体は、その後アルキルスルホンと反応させ、置
換されたアミンの4級化スルホアルキル化が行われる。この反応は、図１Bに示さ
れているように、選択吸着分離担体にペンダント状に結合されたスルホベタイン
両性イオン基の形成をもたらす。これらが、両性イオン選択吸着体を調製するた
めに後述した例５，６，８において用いた両性イオンモノマーを生じるために用
いられた反応であり、その生体高分子の分離における有用性は、後述の例９、１
０、１２から１４までに示されている。
応を用い、選択吸着分離担体上への両性イオン基の取り付けは、適切に活性化し
た選択吸着分離担体、例えば、後述の例２を見よ、に、既知の反応を使いジアル
キルアミン、オプションとしていずれかあるいは両方のアルキル置換基に水酸基
を含む、を結合することによって得られる。アミンを脱置換され、かくして、官
能基を付けられた選択吸着分離担体は、その後アルキルスルホンと反応させ、置
換されたアミンの4級化スルホアルキル化が行われる。この反応は、図１Bに示さ
れているように、選択吸着分離担体にペンダント状に結合されたスルホベタイン
両性イオン基の形成をもたらす。これらが、両性イオン選択吸着体を調製するた
めに後述した例５，６，８において用いた両性イオンモノマーを生じるために用
いられた反応であり、その生体高分子の分離における有用性は、後述の例９、１
０、１２から１４までに示されている。
【００２４】 従って、本発明は新しい選択吸着体に関するものであり、それは、優位性のあ
る両性イオン基のおかげで、今までの技巧に満ちた手法より優れているものであ
る。もっと特定すれば、上記の手法と比較し、確かに以前のやり方には、陰イオ
ン交換や陽イオン交換と並行して、混合イオン交換と呼ばれるモードが、タンパ
ク質の分離に使用できる方法として存在した。しかしながら、陽イオン基と陰イ
オン基の空間的な分離により、そして、その両イオン基の間の化学量論的なバラ
ンスを取ることが難しかった為、混合モードのイオン交換選択吸着体は、本発明
による陰イオンと陽イオン交換基が非常に接近して同じペンダント官能基の上に
存在する真の両性イオン選択吸着体に比べると劣っている。
る両性イオン基のおかげで、今までの技巧に満ちた手法より優れているものであ
る。もっと特定すれば、上記の手法と比較し、確かに以前のやり方には、陰イオ
ン交換や陽イオン交換と並行して、混合イオン交換と呼ばれるモードが、タンパ
ク質の分離に使用できる方法として存在した。しかしながら、陽イオン基と陰イ
オン基の空間的な分離により、そして、その両イオン基の間の化学量論的なバラ
ンスを取ることが難しかった為、混合モードのイオン交換選択吸着体は、本発明
による陰イオンと陽イオン交換基が非常に接近して同じペンダント官能基の上に
存在する真の両性イオン選択吸着体に比べると劣っている。
【００２５】 本発明者達によってなされた更なる観察によると、酸性タンパク質に対して、
後述する例１２において見られた低い保持は、巨大分子と両性イオン選択吸着体
の間の立体障害に起因し、溶液中に伸びるペンダント状両性イオン基の結合鎖側
に位置する4級アンモニア基が、溶液中にアクセスするのを限定している為であ
ろう。その結果、溶液側に突き出している官能基はスルホン酸なので、概念的に
は、両性イオン基の陽イオン交換能の“過剰発現”となる。従って本発明の追加
的な具体化の中では、両性イオンの陰イオンと陽イオン交換基をつなぐアルキル
スペーサーに存在する水酸基で重合体鎖と結合したイオン基をもつ両性イオンペ
ンダント状基が使用には有利であるかもしれない。これらの“横方向に結合され
た”両性イオン分離基剤は新しい両性イオンモノマーから調整されるもので、そ
れはアミノアルキルスルホン酸型両性イオン生体分子用緩衝剤で、水酸基か同様
な反応基をイオン基間の連結アルキルスペーサー部に持っているものの４級化の
後（適切な化合物のリストは、例えばSigma Chemical Company, St.Louis, USA;
1995 Catalog, p.1685-1691を見よ）アミド、エステル、エーテル各結合のよう
な、この分野で習熟されている手法として知られている原理に従って、結合を形
成することに基づいて、中間の結合部のアルキル鎖の中にある反応基を介して両
性イオン中間体にビニールモノマーを共有結合で結合させることによって得られ
る。このモノマーを共重合体としてか或いはグラフト過程で重合体化すれば両性
イオン・選択吸着体が得られる。この選択吸着体では、ペンダント性両性イオン
基が重合体分離担体に、4級アンモニウム基を介さず、イオン基同士を中間で結
合しているアルキル鎖の中の反応基を介して結合され、従ってペンダント両性イ
オン基の両方の電荷が横方向に周囲の溶液に対して同時に突き出す。したがって
、同様な共有結合的化学的手法を適用して、両性イオン中間体は、両性イオンの
イオン基をつなぐ中間のアルキルスペーサー中の反応基と共有結合を形成するの
に適した官能基をもつ多孔性重合体基剤に横方向に結合できよう。
後述する例１２において見られた低い保持は、巨大分子と両性イオン選択吸着体
の間の立体障害に起因し、溶液中に伸びるペンダント状両性イオン基の結合鎖側
に位置する4級アンモニア基が、溶液中にアクセスするのを限定している為であ
ろう。その結果、溶液側に突き出している官能基はスルホン酸なので、概念的に
は、両性イオン基の陽イオン交換能の“過剰発現”となる。従って本発明の追加
的な具体化の中では、両性イオンの陰イオンと陽イオン交換基をつなぐアルキル
スペーサーに存在する水酸基で重合体鎖と結合したイオン基をもつ両性イオンペ
ンダント状基が使用には有利であるかもしれない。これらの“横方向に結合され
た”両性イオン分離基剤は新しい両性イオンモノマーから調整されるもので、そ
れはアミノアルキルスルホン酸型両性イオン生体分子用緩衝剤で、水酸基か同様
な反応基をイオン基間の連結アルキルスペーサー部に持っているものの４級化の
後（適切な化合物のリストは、例えばSigma Chemical Company, St.Louis, USA;
1995 Catalog, p.1685-1691を見よ）アミド、エステル、エーテル各結合のよう
な、この分野で習熟されている手法として知られている原理に従って、結合を形
成することに基づいて、中間の結合部のアルキル鎖の中にある反応基を介して両
性イオン中間体にビニールモノマーを共有結合で結合させることによって得られ
る。このモノマーを共重合体としてか或いはグラフト過程で重合体化すれば両性
イオン・選択吸着体が得られる。この選択吸着体では、ペンダント性両性イオン
基が重合体分離担体に、4級アンモニウム基を介さず、イオン基同士を中間で結
合しているアルキル鎖の中の反応基を介して結合され、従ってペンダント両性イ
オン基の両方の電荷が横方向に周囲の溶液に対して同時に突き出す。したがって
、同様な共有結合的化学的手法を適用して、両性イオン中間体は、両性イオンの
イオン基をつなぐ中間のアルキルスペーサー中の反応基と共有結合を形成するの
に適した官能基をもつ多孔性重合体基剤に横方向に結合できよう。
【００２６】 ２つ目の側面として、本発明は、タンパク質や核酸のような、特定の生体高分
子を、両性イオン性イオン交換クロマトグラフィーにより、精製するための方法
に関することであり、次の様なステップからなる。 ａ）その生体高分子の水溶液中のおよその総電荷数をその水溶液のｐＨの関数と
して決定する。 ｂ）ステップａ）の情報を、生体高分子が両性イオン性イオン交換カラムと適切
な強度で相互作用が持てる様、ｐＨとイオン強度を選ぶのに使う。 ｃ）ステップｂ）の情報を、重合体が溶出する単一溶出溶液或いは溶出溶液傾斜
濃度組成のｐＨとイオン強度を選ぶのに使う。 ｄ）当該生体高分子を含む溶液を両性イオン選択吸着分離担体で成る分離カラム
に流す、その溶液はステップｂ）で決められたｐＨとイオン強度を持つ。 ｅ）ステップｄ）の分離カラムを、ステップｃ）で決められたｐＨとイオン強度
を持つ溶液で溶出する、そして ｆ）当該生体高分子を回収する。 最も望ましいのは、両性イオン選択吸着分離担体は、前に定義したように、本発
明の優位性のある具体例のどれかがであることである。 本手法のある特定の具体例では、用いられたイオン強度の最大値は0.25Ｍである
。この分野に習熟した人はその時にうまく行くコンディションかどうかで、適切
な値を簡単に選ぶであろう。
子を、両性イオン性イオン交換クロマトグラフィーにより、精製するための方法
に関することであり、次の様なステップからなる。 ａ）その生体高分子の水溶液中のおよその総電荷数をその水溶液のｐＨの関数と
して決定する。 ｂ）ステップａ）の情報を、生体高分子が両性イオン性イオン交換カラムと適切
な強度で相互作用が持てる様、ｐＨとイオン強度を選ぶのに使う。 ｃ）ステップｂ）の情報を、重合体が溶出する単一溶出溶液或いは溶出溶液傾斜
濃度組成のｐＨとイオン強度を選ぶのに使う。 ｄ）当該生体高分子を含む溶液を両性イオン選択吸着分離担体で成る分離カラム
に流す、その溶液はステップｂ）で決められたｐＨとイオン強度を持つ。 ｅ）ステップｄ）の分離カラムを、ステップｃ）で決められたｐＨとイオン強度
を持つ溶液で溶出する、そして ｆ）当該生体高分子を回収する。 最も望ましいのは、両性イオン選択吸着分離担体は、前に定義したように、本発
明の優位性のある具体例のどれかがであることである。 本手法のある特定の具体例では、用いられたイオン強度の最大値は0.25Ｍである
。この分野に習熟した人はその時にうまく行くコンディションかどうかで、適切
な値を簡単に選ぶであろう。
【００２７】 溶出溶液の溶媒に関しては、１０％以下の有機溶媒含量の水から成るものが優
位性があり、これは、この分野の習熟したある人によって適切と選ばれたもので
ある。
位性があり、これは、この分野の習熟したある人によって適切と選ばれたもので
ある。
【００２８】 更なる側面では、本発明が、両性イオン性イオン交換クロマトグラフィーで使
うに適切なイオン交換カラムで、それが本発明に従う選択吸着分離担体からなる
点である。
うに適切なイオン交換カラムで、それが本発明に従う選択吸着分離担体からなる
点である。
【００２９】 要約すると、本発明は、多孔性重合選択吸着体で両性イオン官能基をその表面
にそれとは離れて同定できるペンダント状に存在させているものを調整する基本
的には３つの異なったやり方を開示し、また、生体高分子の分析や精製の為の新
しい分離カラムクロマトグラフ的プロセスにおけるこれらの選択吸着物質の有用
性を示した。本発明にしたがっての三つの異なった合成ルートとは、ａ）両性イ
オンモノマーの直接的な共重合で両性イオン選択吸着体を得るもの、ｂ）存在す
る多孔性重合体選択吸着分離担体上に両性イオン基を導入するもの（二つの異な
ったルートが考案されている）、そして ｃ）選択吸着分離担体上への両性イオ
ンモノマーをグラフト重合するものである。3つのルートで作ったどの両性イオ
ン選択吸着体も、多くの異なったタンパク質やペプチドに対して例証したように
、生体高分子を大変穏やかなそしてほぼ水溶液的条件で、静電的相互作用に基づ
いて分離することが出来る。
にそれとは離れて同定できるペンダント状に存在させているものを調整する基本
的には３つの異なったやり方を開示し、また、生体高分子の分析や精製の為の新
しい分離カラムクロマトグラフ的プロセスにおけるこれらの選択吸着物質の有用
性を示した。本発明にしたがっての三つの異なった合成ルートとは、ａ）両性イ
オンモノマーの直接的な共重合で両性イオン選択吸着体を得るもの、ｂ）存在す
る多孔性重合体選択吸着分離担体上に両性イオン基を導入するもの（二つの異な
ったルートが考案されている）、そして ｃ）選択吸着分離担体上への両性イオ
ンモノマーをグラフト重合するものである。3つのルートで作ったどの両性イオ
ン選択吸着体も、多くの異なったタンパク質やペプチドに対して例証したように
、生体高分子を大変穏やかなそしてほぼ水溶液的条件で、静電的相互作用に基づ
いて分離することが出来る。
【００３０】 図の概説 図１は、A)後述の例２−４に従って行われた活性化と官能基導入反応、および
B)本分野の熟達した人達に知られている化学反応に基づいた両性イオン官能基導
入反応の図説であり、これらは、本発明を実際行うに有用な両性イオン選択吸着
体をもたらすものである。
B)本分野の熟達した人達に知られている化学反応に基づいた両性イオン官能基導
入反応の図説であり、これらは、本発明を実際行うに有用な両性イオン選択吸着
体をもたらすものである。
【００３１】 図２ａとｂは光重合した非芳香族両性イオン基を持った両性イオン一体型選択
吸着体の走査電子顕微鏡写真を示す（２ａと２ｂとは各々の写真に棒線で示すよ
うに倍率が異なる。）。
吸着体の走査電子顕微鏡写真を示す（２ａと２ｂとは各々の写真に棒線で示すよ
うに倍率が異なる。）。
【００３２】 この一体型選択吸着体は３体積の４３％SPEと５７％TEGDMAを含むモノマーに
、7体積の、メタノールと１％ベンゾインメチルエーテル（モノマー重量に対し
て）混合物を混ぜ、３６０ｎmで1時間光重合したものである。
、7体積の、メタノールと１％ベンゾインメチルエーテル（モノマー重量に対し
て）混合物を混ぜ、３６０ｎmで1時間光重合したものである。
【００３３】 図３は例５で後に開示される様に、SPE:TEGDMA比を変えて調製したSPE−TEGDM
A共重合ベースの一体型分離担体に対する、水での 背圧 対 流速を示す。
A共重合ベースの一体型分離担体に対する、水での 背圧 対 流速を示す。
【００３４】 図４は、後述の例６に従って調整されたSPE−TEGDMA共重合の一体型分離担体
の、リゾチーム保持の移動相イオン強度依存性を示す。
の、リゾチーム保持の移動相イオン強度依存性を示す。
【００３５】 図５は、後述の例９で述べられているカラムでの、一部精製されたタンパク質
抽出物で、未知の量の生物学的に活性な抗細菌ペプチドの精製を示す。
抽出物で、未知の量の生物学的に活性な抗細菌ペプチドの精製を示す。
【００３６】 図６は、後述の例１０で示されている様に、合成ペプチドA（上の線）とB（下
の線）の精製に関する。 図７は、本発明の両性イオンカラムでのミオグロビン（１）、オブアルブミン（
２）、チトクロームC（３）、およびリゾチーム（４）の分離を示す。
の線）の精製に関する。 図７は、本発明の両性イオンカラムでのミオグロビン（１）、オブアルブミン（
２）、チトクロームC（３）、およびリゾチーム（４）の分離を示す。
【００３７】 図８は、タンパク質混合物（ミオグロビン、α-キモトリプシノーゲンA、チト
クロームC、およびリゾチーム（左から右の順に）、各0.5mg/ml）5μl注入した
ときの本発明によるカラムでの分離を示す。
クロームC、およびリゾチーム（左から右の順に）、各0.5mg/ml）5μl注入した
ときの本発明によるカラムでの分離を示す。
【００３８】 図９は、本発明による一体型グラフト重合体で、たんぱく質のオブアルブミン
（１）、コンアルブミン（２）、α-キモトリプシノーゲンA（３）、およびチト
クロームC（４）の分離を示す。
（１）、コンアルブミン（２）、α-キモトリプシノーゲンA（３）、およびチト
クロームC（４）の分離を示す。
【００３９】 実験 試料と手法 以下の一般的な方法と実験試料を以下に記述の実験では用いた。
【００４０】 ａ）試薬と溶液 両性イオンモノマーであるN,N-ジメチル-N-メタクリルオキシエチル-N-(3-サ
ルフォプロピル)アンモニウムベタイン（SPE）はRaschig AG,ドイツから手に入
れ、更なる精製はなしで使用した。エチレンジメタクリレート(EDMA，90％)は、
Fluka AG, Buchs,スイスから購入し、一方、トリエチレングリコールジメタクリ
レート（TEGDMA）とベンゾインメチルエーテル(99%)はAldrich, Steinheim,ドイ
ツから入手し、メタノールはＨＰＬＣ用分析済みのグレード（J.T Baker, Deven
ter,オランダ）であった。
ルフォプロピル)アンモニウムベタイン（SPE）はRaschig AG,ドイツから手に入
れ、更なる精製はなしで使用した。エチレンジメタクリレート(EDMA，90％)は、
Fluka AG, Buchs,スイスから購入し、一方、トリエチレングリコールジメタクリ
レート（TEGDMA）とベンゾインメチルエーテル(99%)はAldrich, Steinheim,ドイ
ツから入手し、メタノールはＨＰＬＣ用分析済みのグレード（J.T Baker, Deven
ter,オランダ）であった。
【００４１】 クロマトグラフィー実験の探査子として用いたタンパク質は全てSigma社から
購入した。図８を作成するために用いた合成ペプチドは分子量2712g/mol(a)と26
69g/mol(b)を持つと決められ、ペプチドの純度はHPLCでそれぞれ＞95％および＞
97％と検定された。そのペプチドの一次構造は、下の配列に下線を引いた、一つ
のアミノ酸（それぞれフェニールアラニンとシステイン）に関してのみ異なって
いる。 Ala-Gly-Thr-Lys-Pro-Gln-Gly-Lys-Pro-Ala-Ser-Asn-Leu-Val-Glu-Phe-Val-Phe-
Ser-Leu-Phe-Lys-Lys- Cys-Asn [a] Ala-Gly-Thr-Lys-Pro-Gln-Gly-Lys-Pro-Ala-Ser-Asn-Leu-Val-Glu-Cys-Val-Phe-
Ser-Leu-Phe-Lys-Lys- Cys-Asn [b] 図９を作る為に用いた生体ペプチドの準備は、Laboratory of Microbaial Gen
e Technology, NLH, As,ノルウエーからの 粗抽出物として入手し、それをセフ
ァデックス陽イオン交換樹脂(Pharmacia、スウェーデン)の後、疎水的な相互作
用による精製を経ての粗い精製を行った。試料は最終的には７０％エタノール水
溶液の中で得た。
購入した。図８を作成するために用いた合成ペプチドは分子量2712g/mol(a)と26
69g/mol(b)を持つと決められ、ペプチドの純度はHPLCでそれぞれ＞95％および＞
97％と検定された。そのペプチドの一次構造は、下の配列に下線を引いた、一つ
のアミノ酸（それぞれフェニールアラニンとシステイン）に関してのみ異なって
いる。 Ala-Gly-Thr-Lys-Pro-Gln-Gly-Lys-Pro-Ala-Ser-Asn-Leu-Val-Glu-Phe-Val-Phe-
Ser-Leu-Phe-Lys-Lys- Cys-Asn [a] Ala-Gly-Thr-Lys-Pro-Gln-Gly-Lys-Pro-Ala-Ser-Asn-Leu-Val-Glu-Cys-Val-Phe-
Ser-Leu-Phe-Lys-Lys- Cys-Asn [b] 図９を作る為に用いた生体ペプチドの準備は、Laboratory of Microbaial Gen
e Technology, NLH, As,ノルウエーからの 粗抽出物として入手し、それをセフ
ァデックス陽イオン交換樹脂(Pharmacia、スウェーデン)の後、疎水的な相互作
用による精製を経ての粗い精製を行った。試料は最終的には７０％エタノール水
溶液の中で得た。
【００４２】 ｂ）光重合 SPE-co-TEGDMA一体型共重合体やSPE-co-EDMA一体型共重合体は一般的にSPEモ
ノマーとベンゾイン メチルエーテル（光重合開始剤）をメタノールに溶かし、
次に架橋剤（TEGDMA或いはEDMA）を加えることにより調製する。それぞれの重合
混合物は１０分間超音波処理され、ヘリウムで１０分清掃する。ガラスカラム（
150或いは250mmの長さで内径2.3mm）はシリル化処理で表面処理し、ペンダント
状3-メタクリロイロプロピル表面結合基を内表面に生ずる様にする。光重合は垂
直に封をしたガラスカラムを置いて、Spectrolinker XL 1500 UV (Spectronics
Corp., Westbury, ニューヨーク)にて、8ケの15Ｗ蛍光ブラックランプ（F15T8/B
LB;GTE Sylvania）を用いて、波長365nmが主なUV光を作り、60分照射して行った
。比較のため走査電顕（SEM）解析用の参照試料は、プロプロピレンチューブ（
内径4mm）の中で重合した。
ノマーとベンゾイン メチルエーテル（光重合開始剤）をメタノールに溶かし、
次に架橋剤（TEGDMA或いはEDMA）を加えることにより調製する。それぞれの重合
混合物は１０分間超音波処理され、ヘリウムで１０分清掃する。ガラスカラム（
150或いは250mmの長さで内径2.3mm）はシリル化処理で表面処理し、ペンダント
状3-メタクリロイロプロピル表面結合基を内表面に生ずる様にする。光重合は垂
直に封をしたガラスカラムを置いて、Spectrolinker XL 1500 UV (Spectronics
Corp., Westbury, ニューヨーク)にて、8ケの15Ｗ蛍光ブラックランプ（F15T8/B
LB;GTE Sylvania）を用いて、波長365nmが主なUV光を作り、60分照射して行った
。比較のため走査電顕（SEM）解析用の参照試料は、プロプロピレンチューブ（
内径4mm）の中で重合した。
【００４３】 重合が完了した後、それぞれのカラムはフィッティングを付け、LC（液体クロ
マトグラフィー）システムにつなぎ、一体分離担体の中にまだ残っている可溶性
化合物は移動相に水を用いて洗浄した。
マトグラフィー）システムにつなぎ、一体分離担体の中にまだ残っている可溶性
化合物は移動相に水を用いて洗浄した。
【００４４】 ｃ）クロマトグラフィー タンパク質のクロマトグラフィーは二つのLDC（Laboratory Data Conrol, Riv
iera Beach, フロリダ）ConstrametricポンプとLDC Constrametric 可変波長UV
検出器で構成したHPLCシステムを用いて行われた。試料はRheodyne(Cotati,カル
ホルニア)のループ型試料注入器で、内部の濡れる部分がpoly(ether-ether-keto
ne)で作られているものを使って、注入され、データはHewlett Packard(Palo Al
to,カルホルニア)HP3396Aインテグレーターを用いて収集した。モデルタンパク
質の分離はそれぞれの図に示してある条件に従って行った。ペプチド精製クロマ
トグラフィーはSpectra-Physics(Mountain View,カルホルニア)SpectraSYSTEM P
400,にSpectrafocus光学走査型検出器をつけて、行った。
iera Beach, フロリダ）ConstrametricポンプとLDC Constrametric 可変波長UV
検出器で構成したHPLCシステムを用いて行われた。試料はRheodyne(Cotati,カル
ホルニア)のループ型試料注入器で、内部の濡れる部分がpoly(ether-ether-keto
ne)で作られているものを使って、注入され、データはHewlett Packard(Palo Al
to,カルホルニア)HP3396Aインテグレーターを用いて収集した。モデルタンパク
質の分離はそれぞれの図に示してある条件に従って行った。ペプチド精製クロマ
トグラフィーはSpectra-Physics(Mountain View,カルホルニア)SpectraSYSTEM P
400,にSpectrafocus光学走査型検出器をつけて、行った。
【００４５】 ｄ）両性イオン重合体の特徴検査 走査型電顕での観察に先立って、重合体試料は標準的なアルミの試料台に付け
られた硬い炭素箔の上に置かれた。試料は約20nmの金をスパッターコーティング
（Edwards S150A Sputter Coating Unit, Edward High Vacuum,自動チルトと回
転装置付き）の組み合わせを利用して行った。 全ての試料の顕微分析は、S-36
0 iXP SEM(Leica Cambridge Ltd., Cambridge, イギリス)で、LaB6-モード、5kV
、100pAプローブ電流、０°チルト角で行った。
られた硬い炭素箔の上に置かれた。試料は約20nmの金をスパッターコーティング
（Edwards S150A Sputter Coating Unit, Edward High Vacuum,自動チルトと回
転装置付き）の組み合わせを利用して行った。 全ての試料の顕微分析は、S-36
0 iXP SEM(Leica Cambridge Ltd., Cambridge, イギリス)で、LaB6-モード、5kV
、100pAプローブ電流、０°チルト角で行った。
【００４６】 SとN含量は、両性イオンの組成を評価する為に、Leco SC432(Leco, St. Josep
h,ミシガン)を用いて、粉砕した試料の元素分析で行った。
h,ミシガン)を用いて、粉砕した試料の元素分析で行った。
【００４７】 本発明をここに更に添付した例を参考に述べるが、これらは、実際に示す為で
あり、添付した特許請求項の範囲を制限することを意識したものではない。以下
に、あるいは本申請書中の他に場所に記述した全ての参考例がこれによって、参
考としてこの中に含まれるものである。
あり、添付した特許請求項の範囲を制限することを意識したものではない。以下
に、あるいは本申請書中の他に場所に記述した全ての参考例がこれによって、参
考としてこの中に含まれるものである。
【００４８】 例１；２-ジメチルアミノエタンスルフォン酸(DMAES)の合成 2-臭化エチルスルフォン酸のNa塩(10.88g;0.05ml)を250mlのE-フラスコ中100m
lの水で溶解した。ジメチルアミン（12.40g;0.11mol）をその上記の溶液に加え
、その混液を室温で45分間放置し、その後18時間リフラックス条件下70-80℃で
反応させた。その溶液を40℃に冷やした後、約2gの粒状チャコールを加え、その
混液はリフラックス濃縮器なしで、15分間煮沸した。その混液を室温まで冷やし
、チャコールを落ち着かせて後、溶液の上澄みをその後弱い吸引下でろ過した（
Whatman GF/A）。更なる精製を、その溶液を、Dowex350 UPN(Dow Chemical, Mid
land,ミシガン)のＨ+型にしたスルホン酸強陽イオン交換樹脂を詰めた150mmｘ内
径40mmのガラスカラムに、流速約2ml/minで通すことで行った。その精製した溶
液は沸騰水/エタノールで2回沈殿させ、真空オーブンで50℃、24時間乾燥させた
。DMAESの純度は、1H NMR(400MHz, Bruker)にて、D2OD2Oを溶媒に使い測定した
（δ=2.3ppm[2H,-CH2-];δ=2.5ppm[2H,-CH2-];δ=1.9ppm[6H,(CH3)2-N]）。
lの水で溶解した。ジメチルアミン（12.40g;0.11mol）をその上記の溶液に加え
、その混液を室温で45分間放置し、その後18時間リフラックス条件下70-80℃で
反応させた。その溶液を40℃に冷やした後、約2gの粒状チャコールを加え、その
混液はリフラックス濃縮器なしで、15分間煮沸した。その混液を室温まで冷やし
、チャコールを落ち着かせて後、溶液の上澄みをその後弱い吸引下でろ過した（
Whatman GF/A）。更なる精製を、その溶液を、Dowex350 UPN(Dow Chemical, Mid
land,ミシガン)のＨ+型にしたスルホン酸強陽イオン交換樹脂を詰めた150mmｘ内
径40mmのガラスカラムに、流速約2ml/minで通すことで行った。その精製した溶
液は沸騰水/エタノールで2回沈殿させ、真空オーブンで50℃、24時間乾燥させた
。DMAESの純度は、1H NMR(400MHz, Bruker)にて、D2OD2Oを溶媒に使い測定した
（δ=2.3ppm[2H,-CH2-];δ=2.5ppm[2H,-CH2-];δ=1.9ppm[6H,(CH3)2-N]）。
【００４９】 例２；エポキシ基によるハイドロキシエチル官能基粒子の活性化 直径12μmのSpheron 300架橋多孔性重合体ビーズ（2-ヒドロキシエチルメタク
リレートを活性基とした製品；Chemapol, Brno,チェコ共和国より購入）を100ml
の摺り首付きフラスコ中,30mlの50%NaOH水溶液にけん濁させ、均一なけん濁が得
られるまで室温で約1時間攪拌した。得られたけん濁液は10℃以下で18時間放置
し、その後、10mlのジオキサンをフラスコ中に添加し、室温で30分間ゆっくり攪
拌した。25mlのエピクオールヒドリンと15mlのジオキサンの混合液をフラスコ中
に入れ、40℃で2時間、さらに60℃で2時間ゆっくり攪拌し、活性化が起こる様に
した。こうして活性化された粒子は、ガラスフィルターでろ過し、大量のMilli-
Q水で中性になるまで洗い、その後、メタノール(3x100ml)、アセトン（3x100ml
）で洗い、最後に真空オーブンで40℃、18時間乾燥させた。
リレートを活性基とした製品；Chemapol, Brno,チェコ共和国より購入）を100ml
の摺り首付きフラスコ中,30mlの50%NaOH水溶液にけん濁させ、均一なけん濁が得
られるまで室温で約1時間攪拌した。得られたけん濁液は10℃以下で18時間放置
し、その後、10mlのジオキサンをフラスコ中に添加し、室温で30分間ゆっくり攪
拌した。25mlのエピクオールヒドリンと15mlのジオキサンの混合液をフラスコ中
に入れ、40℃で2時間、さらに60℃で2時間ゆっくり攪拌し、活性化が起こる様に
した。こうして活性化された粒子は、ガラスフィルターでろ過し、大量のMilli-
Q水で中性になるまで洗い、その後、メタノール(3x100ml)、アセトン（3x100ml
）で洗い、最後に真空オーブンで40℃、18時間乾燥させた。
【００５０】 例３；エポキシ活性化ハイドロキシエチル粒子の両性イオン官能基導入 図１Aは、本例で開示された官能基導入反応を図で示したもので、例２による
ハイドロキシル基含有選択吸着分離担体の活性化法に基づいている。この原理を
実際行うにあたり、DMAES（2g;0.013mol;例１により調製）を50ml試験管中0.2mM
のリン酸緩衝水溶液（pH8）20mlに溶かした。この混液をその後5M NaOHで攪拌下
pH8に調節した。例２に従い調整した2gのエポキシ活性化重合体ビーズを、ゆる
やかな攪拌下、その溶液に加え、50℃で90時間反応させた。反応させたビーズは
その後水、メタノール、アセトンでゆるい吸引下ガラスフィルター上で洗い、最
後に真空オーブン中50℃で18時間乾燥させた。これらの粒子はその後長さ150mm
、4mm内径のカラムに充填し、例１１で開示された様にタンパク質の分離に使用
された。
ハイドロキシル基含有選択吸着分離担体の活性化法に基づいている。この原理を
実際行うにあたり、DMAES（2g;0.013mol;例１により調製）を50ml試験管中0.2mM
のリン酸緩衝水溶液（pH8）20mlに溶かした。この混液をその後5M NaOHで攪拌下
pH8に調節した。例２に従い調整した2gのエポキシ活性化重合体ビーズを、ゆる
やかな攪拌下、その溶液に加え、50℃で90時間反応させた。反応させたビーズは
その後水、メタノール、アセトンでゆるい吸引下ガラスフィルター上で洗い、最
後に真空オーブン中50℃で18時間乾燥させた。これらの粒子はその後長さ150mm
、4mm内径のカラムに充填し、例１１で開示された様にタンパク質の分離に使用
された。
【００５１】 例４：エポキシ基含有共重合モノマーで調製された重合体粒子の両性イオン官
能基導入 本例の反応は、図１Aの２番目の部分で示されている官能基導入反応で図示で
き、24%（w/w）2,3-エポキシプロピル メタクリレート（GMA）、16%エチレン ジ
メタクリレート（EDMA）、54%シクロヘキサノール、および6% 1-ドデカノールを
含む一体型樹脂前駆混合物から調製される多孔性重合体粒子で、実際に試された
。10分間ヘリウムでのパージで脱気されていたこの混合物に、シールをしたガラ
ス管の型の中で60℃、16時間で起こされる重合体化の前に短時間0.4%（w/w）の
α-α'-アゾイソブチロニトリルを加えた。出来あがった一体型重合体構造はそ
の後ガラスを壊して型から取り出し、約2-3mm角の立方体片に刻み、それから、2
4時間メタノールでソックスレー抽出を行った。抽出された一体型樹脂の角片は
乾燥し、乳鉢で注意深く擦りつぶし、そして乾燥ふるいにかけた。200メッシュ
（74μm）より小さな粒子分画を、反応温度を40℃に例外的にした他は例３に述
べた手順、に従って官能基導入に使った。こうして調製した粒子の見かけの親水
性は、物質を水に濡らす事で評価した、そして、その物質は、DMAESと反応させ
られなかったエポキシ基を持つはじめの物質の際立った疎水的振る舞いと比べ、
両性イオン基を官能基導入した後は、顕著な親水性を持っていると結論した。表
１に示した元素分析は窒素原子と硫黄原子が分離担体にほぼ１：１の化学量論的
な比で結合していることを明確にした。その物質は従って両性イオン的であり、
取り込まれた両性イオン基の量は、反応時間の関数として増加した。
能基導入 本例の反応は、図１Aの２番目の部分で示されている官能基導入反応で図示で
き、24%（w/w）2,3-エポキシプロピル メタクリレート（GMA）、16%エチレン ジ
メタクリレート（EDMA）、54%シクロヘキサノール、および6% 1-ドデカノールを
含む一体型樹脂前駆混合物から調製される多孔性重合体粒子で、実際に試された
。10分間ヘリウムでのパージで脱気されていたこの混合物に、シールをしたガラ
ス管の型の中で60℃、16時間で起こされる重合体化の前に短時間0.4%（w/w）の
α-α'-アゾイソブチロニトリルを加えた。出来あがった一体型重合体構造はそ
の後ガラスを壊して型から取り出し、約2-3mm角の立方体片に刻み、それから、2
4時間メタノールでソックスレー抽出を行った。抽出された一体型樹脂の角片は
乾燥し、乳鉢で注意深く擦りつぶし、そして乾燥ふるいにかけた。200メッシュ
（74μm）より小さな粒子分画を、反応温度を40℃に例外的にした他は例３に述
べた手順、に従って官能基導入に使った。こうして調製した粒子の見かけの親水
性は、物質を水に濡らす事で評価した、そして、その物質は、DMAESと反応させ
られなかったエポキシ基を持つはじめの物質の際立った疎水的振る舞いと比べ、
両性イオン基を官能基導入した後は、顕著な親水性を持っていると結論した。表
１に示した元素分析は窒素原子と硫黄原子が分離担体にほぼ１：１の化学量論的
な比で結合していることを明確にした。その物質は従って両性イオン的であり、
取り込まれた両性イオン基の量は、反応時間の関数として増加した。
【００５２】
【表１】
【００５３】 例５：ＳＰＥとＴＥＧＤＭＡの直接光重合による両性イオン一体型選択吸着体
N,N-ジメチル-N-メタクリルオキシエチル-N-(3-サルフォプロピル)アンモニウ
ムベタイン（SPE）は結晶状のモノマーであり水にはすぐに溶解するが、しかし
、架橋用モノマーEDMAやトリエチレングリコール ジメタクリレート（TEGDMA）
、あるいはまたけん濁液のポロゲン（訳注；反応中、周囲が重合体反応して、そ
の中に残る有機物で、後に洗い出され、そこに分子サイズの孔を形成するもの、
本発明の多くの場合はメタノールなど）や型での重合体化に使用される殆どの有
機溶媒にも、不溶である。一方、架橋モノマーEDMAやTEGDMAは水に溶けず、この
ことがSPEも架橋剤も同時に溶かすことのできる孔形成溶媒を探すことにおいて
も、最終の重合体中にマクロな孔を得るにも、両立の問題をもたらした。我々は
ついにメタノールが、沈殿の為両立の問題を賭けることもなく、型の中に入るす
べての化合物の為の溶媒となりうることを発見した。
N,N-ジメチル-N-メタクリルオキシエチル-N-(3-サルフォプロピル)アンモニウ
ムベタイン（SPE）は結晶状のモノマーであり水にはすぐに溶解するが、しかし
、架橋用モノマーEDMAやトリエチレングリコール ジメタクリレート（TEGDMA）
、あるいはまたけん濁液のポロゲン（訳注；反応中、周囲が重合体反応して、そ
の中に残る有機物で、後に洗い出され、そこに分子サイズの孔を形成するもの、
本発明の多くの場合はメタノールなど）や型での重合体化に使用される殆どの有
機溶媒にも、不溶である。一方、架橋モノマーEDMAやTEGDMAは水に溶けず、この
ことがSPEも架橋剤も同時に溶かすことのできる孔形成溶媒を探すことにおいて
も、最終の重合体中にマクロな孔を得るにも、両立の問題をもたらした。我々は
ついにメタノールが、沈殿の為両立の問題を賭けることもなく、型の中に入るす
べての化合物の為の溶媒となりうることを発見した。
【００５４】 この発見により、水溶性のSPEモノマーと0.1gの光重合開始剤ベンゾインエー
テルを7.0gのメタノールに溶かし、次にTEGDMAを加えることで、一連のSPE-TEGD
MA-共重合一体型樹脂を調製した。SPEとTEGDMAの重量合計はどの実験でも3.0gと
し、その時SPE:TEGDMAの重量比は、４つの異なった調製で、13:87、23:77、33:6
7および43:57とした。これらの混合物はそれぞれ超音波槽（Bransonic 221）に
１０分浸し、その後低流速のヘリウムガスで１０分間パージして、溶融酸素を除
いた。脱気された混合物は、次に別のガラスカラム(50或いは250mmの長さで内径
2.3mm)に詰められた。ガラスの内表面は表面に重合体化できるアンカー基を形成
する既知の手法に従って3-メタクリルオキシ-プロピルトリメトキシシランで処
理した。カラムの中身は次に、光照射源としての8本の15W蛍光ブラックランプ（
F15T8/BLB;GTE Sylvania）のあるSpectrolinker XL 1500 UV(Spectronics Corp.
, Westbury, NY)の中に、シールしたカラムを垂直に立てて置き、60分間光重合
に供した。ＳＥＭ分析の為の参照試料は、4mmの内径のポリプロピレンチューブ
内で、同じようなやり方で重合体化し、比較の目的で使用した。重合体化が完結
した後、それぞれのカラムには、フィッティング（カラムの両端に液を導入する
パーツ等を言う（訳注））を付け、LC（液体クロマトグラフィー（訳注））シス
テムにつなぎ、一体型樹脂の中にまだ残っている可溶性化合物を水で洗い流し、
その後に、カラムは例１２に示すように、生体高分子の分離分離担体としていつ
でも評価できるようにした。
テルを7.0gのメタノールに溶かし、次にTEGDMAを加えることで、一連のSPE-TEGD
MA-共重合一体型樹脂を調製した。SPEとTEGDMAの重量合計はどの実験でも3.0gと
し、その時SPE:TEGDMAの重量比は、４つの異なった調製で、13:87、23:77、33:6
7および43:57とした。これらの混合物はそれぞれ超音波槽（Bransonic 221）に
１０分浸し、その後低流速のヘリウムガスで１０分間パージして、溶融酸素を除
いた。脱気された混合物は、次に別のガラスカラム(50或いは250mmの長さで内径
2.3mm)に詰められた。ガラスの内表面は表面に重合体化できるアンカー基を形成
する既知の手法に従って3-メタクリルオキシ-プロピルトリメトキシシランで処
理した。カラムの中身は次に、光照射源としての8本の15W蛍光ブラックランプ（
F15T8/BLB;GTE Sylvania）のあるSpectrolinker XL 1500 UV(Spectronics Corp.
, Westbury, NY)の中に、シールしたカラムを垂直に立てて置き、60分間光重合
に供した。ＳＥＭ分析の為の参照試料は、4mmの内径のポリプロピレンチューブ
内で、同じようなやり方で重合体化し、比較の目的で使用した。重合体化が完結
した後、それぞれのカラムには、フィッティング（カラムの両端に液を導入する
パーツ等を言う（訳注））を付け、LC（液体クロマトグラフィー（訳注））シス
テムにつなぎ、一体型樹脂の中にまだ残っている可溶性化合物を水で洗い流し、
その後に、カラムは例１２に示すように、生体高分子の分離分離担体としていつ
でも評価できるようにした。
【００５５】 SPEとTEGDMAを共重合して得た両性イオン一体型選択吸着体は高いレベルの多
孔性と高い流体透過性が特徴であった。SEM顕微写真はマクロな多孔性構造が形
成されて居ることを示し、1〜3μｍの間の直径と見られる殆ど球状のクラスター
を横切って広い孔のチャンネルが形成されている；図２を参照。多孔性SPE-TEGD
MA-共重合ベースの両性イオン一体型樹脂（図３を参照）の高い流体透過性は、
その顕著な親水性と合わせ持って、大きな生体分子のクロマトグラフィー分離に
適している事を示した。
孔性と高い流体透過性が特徴であった。SEM顕微写真はマクロな多孔性構造が形
成されて居ることを示し、1〜3μｍの間の直径と見られる殆ど球状のクラスター
を横切って広い孔のチャンネルが形成されている；図２を参照。多孔性SPE-TEGD
MA-共重合ベースの両性イオン一体型樹脂（図３を参照）の高い流体透過性は、
その顕著な親水性と合わせ持って、大きな生体分子のクロマトグラフィー分離に
適している事を示した。
【００５６】 例６：SPEとEDMAの直接的な光重合による両性イオン一体型選択吸着体 重要な例外として架橋剤にEDMAがTEGDMAに代わって、一体型分離カラムの多く
は例５に記載された手順に従って調製された。ここで使われた重合カクテルは47
%SPEと53%EDMA(w/w)の混合物が重量％で32％、1%ベンゾイン メチル エーテル（
モノマーの重量に対して）を加えたメタノールを重量％で68％含むものであった
。塩基性で疎水的なタンパク質リゾチーム（0.5mg/ml、5μlループで注入）の保
持時間は、内径2.3mm、長さ250mmのカラムで、全て緩衝水溶液を用いて、イオン
強度の関数として、図４に示してある。例５で調製されたSPE-TEGDMA-共重合両
性イオン一体型選択吸着体と類似して、このSPE- EDMA-共重合 両性イオン一体
型選択吸着体は高い流体透過性をはっきりした見かけ上の親水性と共に持ってい
た。大きな生体分子のクロマトグラフによる分離に、それら、が適していること
が、例１２に関連した実験で少ないが行なわれている。
は例５に記載された手順に従って調製された。ここで使われた重合カクテルは47
%SPEと53%EDMA(w/w)の混合物が重量％で32％、1%ベンゾイン メチル エーテル（
モノマーの重量に対して）を加えたメタノールを重量％で68％含むものであった
。塩基性で疎水的なタンパク質リゾチーム（0.5mg/ml、5μlループで注入）の保
持時間は、内径2.3mm、長さ250mmのカラムで、全て緩衝水溶液を用いて、イオン
強度の関数として、図４に示してある。例５で調製されたSPE-TEGDMA-共重合両
性イオン一体型選択吸着体と類似して、このSPE- EDMA-共重合 両性イオン一体
型選択吸着体は高い流体透過性をはっきりした見かけ上の親水性と共に持ってい
た。大きな生体分子のクロマトグラフによる分離に、それら、が適していること
が、例１２に関連した実験で少ないが行なわれている。
【００５７】 例７：ポリ(TRIM)による一体型グラフト基材の調製 両性イオンモノマーのグラフト重合の為の基質となるよう目論まれた選択吸着
担物質が、60%の2,2,4-トリメチルペンタン：トルエン ４：１を含むポロゴン混
合物中に40%（w/w）トリメチロールプロパン トリメタクリレート（TRIM）を含
む重合カクテルを用いて、一体型樹脂として調製された。このカクテルに対し1%
(w/w)ベンゾイン メチル エーテルを重合開始剤として加えた。光重合はそれ以
後、例５の手順に従って行なわれ、主な例外は、50mmの長さのカラムが使われ、
メタノールが洗浄ステップで使われたことである。出来た一体型選択吸着分離担
体は、例８で示すように、その多孔性構造の上に、SPE両性イオンモノマーをグ
ラフト重合させ両性イオン選択吸着体を合成するのに使われた。
担物質が、60%の2,2,4-トリメチルペンタン：トルエン ４：１を含むポロゴン混
合物中に40%（w/w）トリメチロールプロパン トリメタクリレート（TRIM）を含
む重合カクテルを用いて、一体型樹脂として調製された。このカクテルに対し1%
(w/w)ベンゾイン メチル エーテルを重合開始剤として加えた。光重合はそれ以
後、例５の手順に従って行なわれ、主な例外は、50mmの長さのカラムが使われ、
メタノールが洗浄ステップで使われたことである。出来た一体型選択吸着分離担
体は、例８で示すように、その多孔性構造の上に、SPE両性イオンモノマーをグ
ラフト重合させ両性イオン選択吸着体を合成するのに使われた。
【００５８】 例８：ポリ(TRIM)基材上への両性イオンポリマー層のグラフト結合 例７からのポリ(TRIM)一体型選択吸着分離担体の多孔システムの上に両性イオ
ンモノマーをグラフト付加することが、10%（w/w）SPE両性イオンモノマーと0.1
%（w/w）過硫酸カリウム水溶液を一体型カラムに導入することでできる。グラフ
ト溶液は試料インジェクターにつけた1.25mlのループで作った貯留器から、流速
0.2mlでカラムに送り込む。カラムがグラフト溶液で一杯になると、カラムをシ
ールし、グラフト反応を70℃2時間続けさせる。反応完結後、カラムはポンプと
つなぎ、一体型選択吸着体から残ったモノマーやグラフト結合しなかったホモポ
リマーを取り除くために、蒸留水100ml、つぎに0.25M NaCl 25mlにて洗い流した
。この手順で出来たカラムは例１３で開示されているタンパク質分離に使われた
。本例で一体型選択吸着体を選んだのは、これらの分離担体基材を調製するのが
容易いやり方である為で、本発明を実際行うのに適した両性イオン層を導入する
グラフト反応がこのような修飾を受けた分離担体基材に限られることを暗に意味
するものではない。
ンモノマーをグラフト付加することが、10%（w/w）SPE両性イオンモノマーと0.1
%（w/w）過硫酸カリウム水溶液を一体型カラムに導入することでできる。グラフ
ト溶液は試料インジェクターにつけた1.25mlのループで作った貯留器から、流速
0.2mlでカラムに送り込む。カラムがグラフト溶液で一杯になると、カラムをシ
ールし、グラフト反応を70℃2時間続けさせる。反応完結後、カラムはポンプと
つなぎ、一体型選択吸着体から残ったモノマーやグラフト結合しなかったホモポ
リマーを取り除くために、蒸留水100ml、つぎに0.25M NaCl 25mlにて洗い流した
。この手順で出来たカラムは例１３で開示されているタンパク質分離に使われた
。本例で一体型選択吸着体を選んだのは、これらの分離担体基材を調製するのが
容易いやり方である為で、本発明を実際行うのに適した両性イオン層を導入する
グラフト反応がこのような修飾を受けた分離担体基材に限られることを暗に意味
するものではない。
【００５９】 例９： SPE- EDMA-共重合 一体型両性イオン選択吸着体を用いた、バクテリ
ア産生ペプチドの精製 例６で調製した両性イオン選択吸着体の適用性は、既知の手順に従ってセファ
デックスでの陽イオン交換そして疎水相互作用クロマトグラフィーによって部分
的に精製されたペプチド精製の最後の精製に試験的に用いた。この粗精製ペプチ
ドは主にLactobacillus sp.からの抗菌性ペプチドであり、疎水的で塩基性を性
質として持っている。通常手に入る基材を使っての、これらのペプチドに対する
現在ある最適な最終的な精製方式は、70%までのイソプロパノールを溶出溶液と
する逆相クロマトグラフィーである。SPE-EDMA-共重合一体型選択吸着体に70%水
エタノール溶液として注入した時の、部分的に精製した抗菌性ペプチド抽出液10
0μlの精製を示すクロマトグラムを図５に示す。純水から0.1Mリン酸緩衝液、pH
7、までの10分の直線グラディエント（訳注：直線的に溶出液の組成をこの場合
であれば、純水から100%の当該リン酸緩衝液に連続的に溶媒組成を変えて行く溶
出法）を、流速0.7ml/分で溶出液として使用した。図８のクロマトグラムは、そ
れぞれ214,280nmでUV分光検出でモニターしたものである。ピークの同定は、カ
ラムから溶出した分画の抗菌活性のモニターを、その(分画の)数分の１を、指標
となる菌を含む寒天プレートに載せ、既知の手順に従って、成長阻害を記録する
バイオアッセイで行なった。強い抗菌活性がクロマトグラムの最後の溶出ピーク
に相当する分画に見られた。UV吸光度からは、明らかに活性のないかなりの量の
タンパク質或いはペプチドが死体積(訳注：インジェクト後、クロマトグラム上
、カラム内の樹脂以外が占める体積に相当する保持体積の所)に近い所に溶出さ
れている。
ア産生ペプチドの精製 例６で調製した両性イオン選択吸着体の適用性は、既知の手順に従ってセファ
デックスでの陽イオン交換そして疎水相互作用クロマトグラフィーによって部分
的に精製されたペプチド精製の最後の精製に試験的に用いた。この粗精製ペプチ
ドは主にLactobacillus sp.からの抗菌性ペプチドであり、疎水的で塩基性を性
質として持っている。通常手に入る基材を使っての、これらのペプチドに対する
現在ある最適な最終的な精製方式は、70%までのイソプロパノールを溶出溶液と
する逆相クロマトグラフィーである。SPE-EDMA-共重合一体型選択吸着体に70%水
エタノール溶液として注入した時の、部分的に精製した抗菌性ペプチド抽出液10
0μlの精製を示すクロマトグラムを図５に示す。純水から0.1Mリン酸緩衝液、pH
7、までの10分の直線グラディエント（訳注：直線的に溶出液の組成をこの場合
であれば、純水から100%の当該リン酸緩衝液に連続的に溶媒組成を変えて行く溶
出法）を、流速0.7ml/分で溶出液として使用した。図８のクロマトグラムは、そ
れぞれ214,280nmでUV分光検出でモニターしたものである。ピークの同定は、カ
ラムから溶出した分画の抗菌活性のモニターを、その(分画の)数分の１を、指標
となる菌を含む寒天プレートに載せ、既知の手順に従って、成長阻害を記録する
バイオアッセイで行なった。強い抗菌活性がクロマトグラムの最後の溶出ピーク
に相当する分画に見られた。UV吸光度からは、明らかに活性のないかなりの量の
タンパク質或いはペプチドが死体積(訳注：インジェクト後、クロマトグラム上
、カラム内の樹脂以外が占める体積に相当する保持体積の所)に近い所に溶出さ
れている。
【００６０】 例１０：SPE-EDMA-共重合一体型両性イオン選択吸着体を用いた合成ペプチド
の分離 例９に示されたものとよく似た分離を、分子量2,712g/mol(A) と2,669g/mol(
B)で、以下のアミノ酸配列で記述されるのペアーの抗菌ペプチドで行った。 Ala-Gly-Thr-Lys-Pro-Gln-Gly-Lys-Pro-Ala-Ser-Asn-Leu-Val-Glu-Phe-Val-Phe-
Ser-Leu-Phe-Lys-Lys-Cys-Asn (A) Ala-Gly-Thr-Lys-Pro-Gln-Gly-Lys-Pro-Ala-Ser-Asn-Leu-Val-Glu-Cys-Val-Phe-
Ser-Leu-Phe-Lys-Lys-Cys-Asn (B) 両ペプチドは、強い塩基性（pI9.9）で、上記の配列に示すように、一つのア
ミノ酸のみが異なる（それぞれ、フェニールアラニンとシステイン）。例９で用
いられたのと同一のカラムに、純水から0.1Mリン酸緩衝液,pH7までの直線グラデ
ィエント、10分、流速0.7ml/分を溶出液とし、1%トリフルオロ酢酸水溶液中に、
ペプチドAおよびBをそれぞれ0.68および0.8mg/mlを含む20μlの溶液を注入した
。検出はそれぞれ、214および280nmでのUV分光法で行った。両方のペプチドがSP
Eを基剤とした樹脂で保持され、図6に示す様に、温和な条件を用いて溶出するこ
とが出来た。
の分離 例９に示されたものとよく似た分離を、分子量2,712g/mol(A) と2,669g/mol(
B)で、以下のアミノ酸配列で記述されるのペアーの抗菌ペプチドで行った。 Ala-Gly-Thr-Lys-Pro-Gln-Gly-Lys-Pro-Ala-Ser-Asn-Leu-Val-Glu-Phe-Val-Phe-
Ser-Leu-Phe-Lys-Lys-Cys-Asn (A) Ala-Gly-Thr-Lys-Pro-Gln-Gly-Lys-Pro-Ala-Ser-Asn-Leu-Val-Glu-Cys-Val-Phe-
Ser-Leu-Phe-Lys-Lys-Cys-Asn (B) 両ペプチドは、強い塩基性（pI9.9）で、上記の配列に示すように、一つのア
ミノ酸のみが異なる（それぞれ、フェニールアラニンとシステイン）。例９で用
いられたのと同一のカラムに、純水から0.1Mリン酸緩衝液,pH7までの直線グラデ
ィエント、10分、流速0.7ml/分を溶出液とし、1%トリフルオロ酢酸水溶液中に、
ペプチドAおよびBをそれぞれ0.68および0.8mg/mlを含む20μlの溶液を注入した
。検出はそれぞれ、214および280nmでのUV分光法で行った。両方のペプチドがSP
Eを基剤とした樹脂で保持され、図6に示す様に、温和な条件を用いて溶出するこ
とが出来た。
【００６１】 例１１：エポキシ活性化ハイドロキシエチル粒子から調製された両性イオン選
択吸着体でのタンパク質分離 例３で調製された両性イオン選択吸着体のカラムを、溶出液を純水から0.1M N
aClまで直線的に変えるグラディエントで、流速1ml/分、10分間、検出を280nmの
UV分光法で、4つの選ばれたモデルタンパク質（ミオグロビン、オバルブミン、
チトクロームC、およびリゾチーム）の分離に用いた。その結果を図７に開示す
る。全てのタンパク質の溶出は、純水から0.1M NaClまでのグラディエントで形
成される全くの水溶性溶出液で達成された。とりわけ、リゾチームのピークはシ
ャープで対照的である。
択吸着体でのタンパク質分離 例３で調製された両性イオン選択吸着体のカラムを、溶出液を純水から0.1M N
aClまで直線的に変えるグラディエントで、流速1ml/分、10分間、検出を280nmの
UV分光法で、4つの選ばれたモデルタンパク質（ミオグロビン、オバルブミン、
チトクロームC、およびリゾチーム）の分離に用いた。その結果を図７に開示す
る。全てのタンパク質の溶出は、純水から0.1M NaClまでのグラディエントで形
成される全くの水溶性溶出液で達成された。とりわけ、リゾチームのピークはシ
ャープで対照的である。
【００６２】 例１２： SPE-EDMA-共重合両性イオン一体型樹脂でのタンパク質分離 多くの指標タンパク質が、水を溶出液に使い、例６で調製されたSPE-EDMA-共
重合両性イオン選択吸着体に、別に注入された。図８のクロマトグラムは、それ
ぞれ0.5mg/mlのミオグロビン、α-キモトリプシノーゲン、チトクロームC,およ
びリゾチームを含むタンパク質混合物が、唯一のイオン性成分として2.5mMリン
酸緩衝液(pH7)をもつ全くの水系溶出液を用いて、10分以内に分離できることを示
している。最も強く保持されるタンパク質を溶出するに必要なイオン強度は、従
って、通常の陽イオン交換樹脂にタンパク質を（分離に）かける為に、普通使わ
れるイオン強度と同じ範囲である[Deutscher, M. P.(編),Guide to Protein Pur
ification（タンパク質精製へのガイド）(Meth. Enzymol., Vol.182),Academic
Press, 1990]。両性イオン分離モードはそれゆえに、分離の際の塩析により沈殿
することを防ぎ、また、タンパク質の生物活性を保つ為に、優位である。更に、
タンパク質は、生理的なｐH範囲の低イオン強度の水系緩衝液で全て溶出するの
で、この手法は大量分画（preparative）モード分離に優位である。テストした
カラムに含まれる両性イオン基の高い量を考えると、SPE-EDMA-共重合両性イオ
ン選択吸着体とタンパク質の間の相互作用は、普通の陽イオン交換或いは陰イオ
ン交換樹脂（別々に、或いは、連結式にして、或いは、樹脂を混ぜて、或いは、
混合モードの配置で用いて）での相互作用より、相当弱い性質である。SPE-EDMA
-共重合両性イオン一体型樹脂はまた、（その高い等電点と強い疎水性の為に分
離が特に難しいと知られている）塩基性酵素のリゾチームに、とても対称的なピ
ークを示す。この分離は、例えば、陽イオンと陰イオン交換基が同じ分離担体の
空間的に離れた所にある、Kurganovらが示した、混合モードの分離担体で必要と
なった様に、溶出液にpH5からpH8の pH勾配と1Mのイオン強度を一緒にして使う
などの、極端な溶出条件を採らなくても、達成できる。(Kurganov, A.A.;Davank
ov, V.A.; Unger, K.K., J. Chromatogr.,1991,548,p.212 および、今回参考と
した図５)
重合両性イオン選択吸着体に、別に注入された。図８のクロマトグラムは、それ
ぞれ0.5mg/mlのミオグロビン、α-キモトリプシノーゲン、チトクロームC,およ
びリゾチームを含むタンパク質混合物が、唯一のイオン性成分として2.5mMリン
酸緩衝液(pH7)をもつ全くの水系溶出液を用いて、10分以内に分離できることを示
している。最も強く保持されるタンパク質を溶出するに必要なイオン強度は、従
って、通常の陽イオン交換樹脂にタンパク質を（分離に）かける為に、普通使わ
れるイオン強度と同じ範囲である[Deutscher, M. P.(編),Guide to Protein Pur
ification（タンパク質精製へのガイド）(Meth. Enzymol., Vol.182),Academic
Press, 1990]。両性イオン分離モードはそれゆえに、分離の際の塩析により沈殿
することを防ぎ、また、タンパク質の生物活性を保つ為に、優位である。更に、
タンパク質は、生理的なｐH範囲の低イオン強度の水系緩衝液で全て溶出するの
で、この手法は大量分画（preparative）モード分離に優位である。テストした
カラムに含まれる両性イオン基の高い量を考えると、SPE-EDMA-共重合両性イオ
ン選択吸着体とタンパク質の間の相互作用は、普通の陽イオン交換或いは陰イオ
ン交換樹脂（別々に、或いは、連結式にして、或いは、樹脂を混ぜて、或いは、
混合モードの配置で用いて）での相互作用より、相当弱い性質である。SPE-EDMA
-共重合両性イオン一体型樹脂はまた、（その高い等電点と強い疎水性の為に分
離が特に難しいと知られている）塩基性酵素のリゾチームに、とても対称的なピ
ークを示す。この分離は、例えば、陽イオンと陰イオン交換基が同じ分離担体の
空間的に離れた所にある、Kurganovらが示した、混合モードの分離担体で必要と
なった様に、溶出液にpH5からpH8の pH勾配と1Mのイオン強度を一緒にして使う
などの、極端な溶出条件を採らなくても、達成できる。(Kurganov, A.A.;Davank
ov, V.A.; Unger, K.K., J. Chromatogr.,1991,548,p.212 および、今回参考と
した図５)
【００６３】 例１３： SPEをグラフト結合したTRIM一体型樹脂での、タンパク質分離 例８のTRIMをベースとした一体型選択吸着分離担体の上にSPEをグラフト結合
させ調整された一体型の両性イオン選択吸着体を、試験プローブとして、酸性タ
ンパク質のオブアルブミンおよびコンアルブミン、そして塩基性タンパク質のα
-キモトリプシノーゲンAおよびサイトクロームCを含むタンパク質テスト混合物
を、それぞれ1mg/ml含む試料20μlとしてカラムに注入して、分離カラムとして
使用した。溶出液は、グラディエントで、注入後0〜2分間は、100%水、そして、
2-12分は水から0.15M NaClO4に、流速0.5ml/分としてポンプで送った。検出は、
280nmのUV分光法で行った。
させ調整された一体型の両性イオン選択吸着体を、試験プローブとして、酸性タ
ンパク質のオブアルブミンおよびコンアルブミン、そして塩基性タンパク質のα
-キモトリプシノーゲンAおよびサイトクロームCを含むタンパク質テスト混合物
を、それぞれ1mg/ml含む試料20μlとしてカラムに注入して、分離カラムとして
使用した。溶出液は、グラディエントで、注入後0〜2分間は、100%水、そして、
2-12分は水から0.15M NaClO4に、流速0.5ml/分としてポンプで送った。検出は、
280nmのUV分光法で行った。
【００６４】 図９に示されているように、同じクロマトグラムに酸性と塩基性タンパク質が
分離されていることは、陰イオン交換或いは陽イオン交換基のみが含まれるイオ
ン交換選択吸着体では、なし得られなかった。曲線の対称的な形は、グラフト結
合させた両性イオン選択吸着体へのタンパク質の非特異的吸着が大変低いことを
示しており、クロマトグラフィー的な保持過程において優位な動態を持つことを
暗示している。その基材の構成物の一部として両性イオンモノマーを持つ（例１
２参照）或いは、その表面に両性イオンペンダント基が反応された粒子状選択吸
着体（例１１参照；溶出条件を比較すると、過塩素イオンは塩素イオンに較べて
明らかにより効果的であるが）であるSPE-EDMA-共重合選択吸着体と較べて、こ
のグラフト結合選択吸着体では、高い溶出強度が必要であったということは、グ
ラフト結合した両性イオン鎖のタンパク質に対する利用率が増加したことを示す
、それはグラフト結合鎖が溶液に伸びでいることによることが最も確からしく、
グラフト層の架橋もないことも合いまっている。例１１−１３から明らかなよう
に、タンパク質に向き合った両性イオン分離選択吸着体の保持強度は、ａ）重合
体化混合反応物の中に両性イオンモノマーが含まれ、重合体選択吸着分離担体を
形成し、従って更なる官能基導入反応もない両性イオン選択吸着体となるか、或
いはｂ）両性イオン基で選択吸着分離担体表面を官能基導入するか、或いはｃ）
選択吸着分離担体表面に色々な長さの両性イオングラフト体を結合させるか、或
いはそれらの色々な組み合わせにするかで、広い範囲で変化できる。
分離されていることは、陰イオン交換或いは陽イオン交換基のみが含まれるイオ
ン交換選択吸着体では、なし得られなかった。曲線の対称的な形は、グラフト結
合させた両性イオン選択吸着体へのタンパク質の非特異的吸着が大変低いことを
示しており、クロマトグラフィー的な保持過程において優位な動態を持つことを
暗示している。その基材の構成物の一部として両性イオンモノマーを持つ（例１
２参照）或いは、その表面に両性イオンペンダント基が反応された粒子状選択吸
着体（例１１参照；溶出条件を比較すると、過塩素イオンは塩素イオンに較べて
明らかにより効果的であるが）であるSPE-EDMA-共重合選択吸着体と較べて、こ
のグラフト結合選択吸着体では、高い溶出強度が必要であったということは、グ
ラフト結合した両性イオン鎖のタンパク質に対する利用率が増加したことを示す
、それはグラフト結合鎖が溶液に伸びでいることによることが最も確からしく、
グラフト層の架橋もないことも合いまっている。例１１−１３から明らかなよう
に、タンパク質に向き合った両性イオン分離選択吸着体の保持強度は、ａ）重合
体化混合反応物の中に両性イオンモノマーが含まれ、重合体選択吸着分離担体を
形成し、従って更なる官能基導入反応もない両性イオン選択吸着体となるか、或
いはｂ）両性イオン基で選択吸着分離担体表面を官能基導入するか、或いはｃ）
選択吸着分離担体表面に色々な長さの両性イオングラフト体を結合させるか、或
いはそれらの色々な組み合わせにするかで、広い範囲で変化できる。
【００６５】 例１４：両性イオン分離体でのタンパク質回収率の測定 タンパク質とクロマトグラフィー固定相を形成する選択吸着体との間の非特異
的な相互作用は、クロマトグラムに重大なテイリング（訳注；ピークの後半部分
が引っ張られるように広がり、非対称となることを言う）やピークの歪みを与え
、また、分離分画モードでは、無傷のタンパク質の実質的な生産性（回収性）が
落ちる。リゾチームは適当な大きさをした、疎水的で、高い塩基性のタンパク質
であり、従って分離分離担体の生体適合性の探査分子としてとても適している（
Muller, W., J. Chromatogr., 1990, 510, 133-140）。それゆえ、例６に従っ
て調製されたSPE-EDMA-共重合両性イオン一体型選択吸着体に対し、例１２で行
ったのと同様な条件で、一つの実験が行なわれ、分離後、例１２で探査分子とし
て使われたタンパク質の回収率が決定された。かなり親水性のあるタンパク質、
チトクロームCは９６％と分かったが、リゾチームの回収率は、全てが水系の溶
出液であることと、その高い疎水的特徴にもかかわらず、８５％に達した。これ
らの両性イオン固定相の好ましい疎水的な性質は、例９および１０で示されたよ
うに、合成ペプチドの分離に際し、テイリングが相対的にない事でも明らかであ
った。これらのペプチドは小さく、高い疎水性を持っている、従って、クロマト
グラフィー選択吸着体上に剥き出しになっている疎水的な部分があれば、強く“
貼り付く”ことが知られているのである。
的な相互作用は、クロマトグラムに重大なテイリング（訳注；ピークの後半部分
が引っ張られるように広がり、非対称となることを言う）やピークの歪みを与え
、また、分離分画モードでは、無傷のタンパク質の実質的な生産性（回収性）が
落ちる。リゾチームは適当な大きさをした、疎水的で、高い塩基性のタンパク質
であり、従って分離分離担体の生体適合性の探査分子としてとても適している（
Muller, W., J. Chromatogr., 1990, 510, 133-140）。それゆえ、例６に従っ
て調製されたSPE-EDMA-共重合両性イオン一体型選択吸着体に対し、例１２で行
ったのと同様な条件で、一つの実験が行なわれ、分離後、例１２で探査分子とし
て使われたタンパク質の回収率が決定された。かなり親水性のあるタンパク質、
チトクロームCは９６％と分かったが、リゾチームの回収率は、全てが水系の溶
出液であることと、その高い疎水的特徴にもかかわらず、８５％に達した。これ
らの両性イオン固定相の好ましい疎水的な性質は、例９および１０で示されたよ
うに、合成ペプチドの分離に際し、テイリングが相対的にない事でも明らかであ
った。これらのペプチドは小さく、高い疎水性を持っている、従って、クロマト
グラフィー選択吸着体上に剥き出しになっている疎水的な部分があれば、強く“
貼り付く”ことが知られているのである。
【図１】 A)後述の例２−４に従って行われた活性化と官能基導入の反応、およびB)本分
野の熟達した人達に知られている化学反応に基づいた両性イオン官能基導入反応
の図説であり、これらは、本発明を実際行うに有用な両性イオン選択吸着体をも
たらすものである。
野の熟達した人達に知られている化学反応に基づいた両性イオン官能基導入反応
の図説であり、これらは、本発明を実際行うに有用な両性イオン選択吸着体をも
たらすものである。
【図２】 （ａ）と（ｂ）は光重合した非芳香族両性イオン基を持った両性イオン一体型
選択吸着体の走査電子顕微鏡写真（2aと２ｂに記した二つの異なった倍率で、そ
れぞれの写真にバーで表示している）である。
選択吸着体の走査電子顕微鏡写真（2aと２ｂに記した二つの異なった倍率で、そ
れぞれの写真にバーで表示している）である。
【図３】 SPE：TEGDMA比を変えて調製したSPE−TEGDMA共重合ベースのモノリスの水にお
ける背圧と流速との関係を示すグラフである。
ける背圧と流速との関係を示すグラフである。
【図４】 SPE−TEGDMA共重合モノリスの、移動相イオン強度のリゾチーム保持依存性を
示すグラフである。
示すグラフである。
【図５】 未知の量の生物学的に活性な抗細菌ペプチドを含む一部精製されたタンパク質
抽出物の精製を示すグラフである。
抽出物の精製を示すグラフである。
【図６】 例１０で示されている、合成ペプチドA（上の線）とB（下の線）の精製に関す
るグラフである。
るグラフである。
【図７】 本発明による両性イオンカラムでのミオグロビン（１）、オブアルブミン（２
）、チトクロームC（３）、およびリゾチーム（４）の分離を示すグラフである
。
）、チトクロームC（３）、およびリゾチーム（４）の分離を示すグラフである
。
【図８】 本発明によるコラムを用い、ミオグロビン、α-キモトリプシノーゲンA、チト
クロームC、およびリゾチーム（左から右の順に）を各々0.5mg/ml含むタンパク
質混合物を5μl注入したときの分離を示すグラフである。
クロームC、およびリゾチーム（左から右の順に）を各々0.5mg/ml含むタンパク
質混合物を5μl注入したときの分離を示すグラフである。
【図９】 本発明のグラフト重合したモノリスによる、たんぱく質、オブアルブミン（１
）、コンアルブミン（２）、α-キモトリプシノーゲンA（３）、およびチトクロ
ームC（４）の分離を示すグラフである。
）、コンアルブミン（２）、α-キモトリプシノーゲンA（３）、およびチトクロ
ームC（４）の分離を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 30/88 Ｇ０１Ｎ 30/88 Ｅ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4D017 AA09 BA07 CA13 CA17 DA03 EA05 4G066 AC14C AC17C AD01B AD06B AD13B AD15B AE10B CA54 DA11 EA01 FA07
Claims (13)
- 【請求項１】 溶出クロマトグラフィーにおける固定相として使用されるに
適した選択吸着体であって、コアーが有機樹脂で構成され、表面に共有結合した
多数の非芳香族両性イオン基を有するもの。 - 【請求項２】 請求項１に記載の選択吸着体において、 多孔質の分離担体を備えていることを特徴とするもの。
- 【請求項３】 請求項１又は請求項２に記載の選択吸着体において、 上記両性イオン非芳香族基は、分離担体の表面に、非芳香族両性イオン基を含
むモノマーの重合により、好ましくはグラフト重合により結合していることを特
ちぅとするもの。 - 【請求項４】 請求項３に記載の選択吸着体において、 上記両性イオン非芳香族基は、分離担体の構造全体に、適切なジビニル架橋モ
ノマーと共に非芳香族両性イオングループ基を含むモノマーを重合させることで
結合していることを特徴とするもの。 - 【請求項５】 請求項１又は請求項２に記載の選択吸着体において、 上記両性イオン非芳香族基は、分離担体をアルキル化官能基で活性化させ、該
分離担体上に非芳香族両性イオン基を形成するようにω-ジアルキルアミノアル
キルスルホン酸と反応させることによって、該分離担体に結合していることを特
徴とするもの。 - 【請求項６】 請求項１又は請求項２に記載の選択吸着分離担体において、 上記有機樹脂の表面が、反応性官能基であるエポキシ或いは塩化アルキルや臭
化アルキルの様なハロゲン化アルキルを取り込むことで、アミノアルキルスルホ
ン酸のアミノ基をアルキル化し、その反応で選択吸着分離担体上に共有結合した
両性イオン非芳香族基を形成することができるように活性化されていることを特
徴とするもの。 - 【請求項７】 請求項１又は請求項２に記載の選択吸着分離担体において、 上記有機樹脂の表面が、ハイドロキシアルキル、カルボン酸、カルボン酸クロ
ライド、カルボン酸ブロマイド、カルボン酸無水物、カルボン酸エステル、アル
キルオキソニウム、エポキシ、塩化アルキル、臭化アルキル、ジアゾアルキル、
或いはカルボン酸イミダゾリド或いはトリアゾリドの様な活性化アミドの様な反
応性官能基を取り込むことで、スルホベタイン両性イオンの4級アンモニウム基
とスルホン基をつないでいるアルキル鎖に存在する水酸基とエステルあるいはエ
ーテル結合を形成することができるように活性化され、これにより、活性化した
選択吸着分離担体の表面に非芳香族両性イオン基を横方向に共有結合することを
特徴とするもの。 - 【請求項８】 請求項１〜８のいずれか一つに記載の選択吸着分離担体にお
いて、 上記分離担体は重合した一体物であることを特徴とするもの。 - 【請求項９】 請求項１〜９のいずれか一つに記載の選択吸着分離担体にお
いて、 上記両性イオン基が、ω-スルホアルキルトリアルキルアンモニア（スルホベ
タイン）基であることを特徴とするもの。 - 【請求項１０】 両性イオンのイオン交換クロマトグラフィーにより、タン
パク質や核酸の様な特定の生体高分子を精製する方法であって、以下のステップ
ａ〜ｆ含み、 ａ）水溶液中の生体高分子のおよその総電荷を、当該溶液のｐＨの関数として決
定する、 ｂ）ステップａ）で得た情報を、上記生体高分子が両性イオンのイオン交換カラ
ムと適切な強い相互作用を持つｐＨとイオン強度を選択する為に用いる、 ｃ）ステップｂ）で得た情報を、上記生体高分子が溶出するｐＨとイオン強度を
選択する為に用いる、 ｄ）当該生体高分子を含み且つステップｂ）で選ばれたｐＨとイオン強度を持つ
溶液を、両性イオン選択吸着分離担体からなるカラムに入れる、 ｅ）ステップｄ）のカラムを、ステップｃ）で選ばれたｐＨとイオン強度の溶出
溶液による溶出に供する、 ｆ）当該生体高分子を回収する、 上記カラムが請求項１〜請求項９のいずれか一つに記載の両性イオン非芳香族
基を持つ選択吸着分離担体を含むものであることを特徴とするもの。 - 【請求項１１】 請求項１０に記載の方法において、用いる最大イオン強度
は0.25Mであることを特徴とするもの。 - 【請求項１２】 請求項１０又は請求項１１に記載の方法において、 上記溶出溶液の溶媒が１０％より少ない量の有機溶媒を混合した水からなるこ
とを特徴とするもの。 - 【請求項１３】 請求項１〜請求項９のいずれか一つに記載の選択吸着分離
担体を備えている、両性イオンのイオン交換クロマトグラフィーでの使用に適し
たイオン交換カラム。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9803838-3 | 1998-11-09 | ||
| SE9803838A SE9803838D0 (sv) | 1998-11-09 | 1998-11-09 | A chromatography method and a column material useful in said method |
| PCT/SE1999/002032 WO2000027496A1 (en) | 1998-11-09 | 1999-11-09 | A chromatography method and a column material useful in said method |
Publications (2)
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