JP2003514655A - 核酸構造を有する化合物を含むサンプル由来の物質の選択的除去方法 - Google Patents

核酸構造を有する化合物を含むサンプル由来の物質の選択的除去方法

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Abstract

(57)【要約】 一方が所望の物質であり、両方ともが同じリガンド構造に対し親和性を有し、そして物質(Ｉ)が物質(II)よりも小さいサイズを有する、物質(II)から物質(Ｉ)を分離することにより、核酸構造を含む所望の物質を精製する方法。当該方法は、(i)物質ＩおよびIIを液体中に含んでいること；(ii)当該液体を、物質Ｉを高選択的に吸着する吸着剤と接触させること；(iii)所望の物質を回収すること、を含む。当該吸着剤が、(ａ)物質ＩおよびIIに結合可能であるリガンド構造を有し、物質Ｉに接近可能な、内部部分、および(ｂ)物質IIを吸着せず、物質IIによるよりも物質Ｉによるほうが容易に通過する外側表面層を有する。核酸ベクターの回収および／または精製のための、複数の荷電性アミノ基で機能化した特定陰イオン交換体の使用。使用するマトリクスは、(Ａ)基準陰イオン交換体に比して少なくとも１つの選択の標準タンパク質に対し増加した溶出イオン強度を有するか、(Ｂ)アミノ基から２−３炭素の距離に水酸基またはアミノ窒素を有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、核酸構造を含む所望の物質の精製方法に関し、第一物質(Ｉ)および
第二物質(II)を含む液体サンプルを、物質Ｉが物質IIに比してより強い分配傾向
を有する分離媒体に接触させることを含む。
【０００２】 分配ステップの後、精製されるものに応じて、物質Ｉを吸着剤から回収し、お
よび／または物質IIを液体から回収する。最終的に、それら物質の何れかまたは
両方を更に精製し得る。核酸構造を有する物質の場合、２つの主な原理が、従前
、使用されていた： １．分離媒体は、物質ＩおよびIIが種々の結合能または脱着能を有する強固に結
合したリガンド構造を有する。典型的には、リガンド構造は、陰イオン交換基で
あり、その分離は、イオン交換、例えば、イオン交換クロマトグラフィー(ＩＥ
Ｃ)に基づく。幾つかの基となる刊行物には、Cohn W.E.(in: Nucleic acids, Vo
l 1 pp 211-241 (1955), Chargaff & Davidsson (eds), Academic Press, New Y
ork)；Hall et al (J. Mol. Biol. 6 (1963) 115-127)；Bendich et al (J. Am.
Chem. Soc. 77 (1955) 3671-3673)；およびTaussig et al (J. Chromatog. 24
(1957) 448-449)がある。
【０００３】 ２．当該分離媒体には孔があり、その孔内において物質IIの輸送よりも部質Ｉの
輸送が容易となり得るサイズである。当該分離は、ゲル濾過(ＧＦ)として行う。
幾つかの基となる文献には、Hjerten(Biochim. Biophys. Acta 79 (1964) 393-)
；およびBengtsson et al (Biochim. Biophys. Acta 119 (1967) 399-)；Oeberg
et al (Arch. Biochem. Biophys. 119 (1967) 504-509)；およびLoeb (Biochim
. Biophys. Acta 157 (1968) 424-426)がある。
【０００４】 種々の分離機能を有する内部部分および外側表面層を有する分離媒体(例えば
、それぞれ、陰イオン交換基および非陰イオン交換基)は、従前から述べられて
おり、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質などの分離が示唆されている。WO9839
094(Amersham Pharmacia Biotech AB)およびWO9839364(Amersham Pharmacia Bio
tech AB)参照。これら刊行物は、以下で考察する不都合を克服する為に、核酸精
製のための機能を有する複数の層が存在する分離媒体をどのように使用するかを
開示するものではない。プラスミド、ウイルスなどのような核酸ベクターの精製
およびそれらに付随する特定の問題について考察するものでもない。
【０００５】 従前技術の幾つかの不都合な点 過去３０年間のこの分野で無数の報告が刊行されているにもかかわらず、未だ
に、陰性荷電核酸を、お互いからおよびタンパク質のような他の陰性荷電構成成
分から分離するという困難な課題が残っている。
【０００６】 これは、焦点が研究室での処理から大スケールの処理へと変わったという事実
に一部起因する。そのため、生成コストを最小とするために、最小の処理ステッ
プにおいて高収率および高純度を達成する処理を有することが重要となる。例に
は、合成オリゴヌクレオチドを含む種々の種類のアンチセンスドラッグ(antisen
se drug)、組換え的に生成した核酸、例えばウイルスおよびプラスミドを含む核
酸ベクターのようなもの、および組換えタンパク質がある。
【０００７】 核酸構造を含む化合物の場合、個々の処理ステップは、立体配座的変化および
不可逆性変性／崩壊、すなわち、除去が困難な汚染物質の形成の危険性を増大し
得る。これは、核酸ベクター、例えばプラスミドに特に当てはまる。例えば、共
有結合的閉環状(CCC)プラスミド(スーパーコイル)は開環型に容易に変化し得、
それは、治療効率が低い。
【０００８】 核酸構造を有する物質は、陰イオン交換体に強力に結合し、脱着には、生成物
、特にプラスミドのような核酸ベクターに有害となり得る条件を必要とする。強
力な結合、脱着用の穏やかな条件での高い容量に合わせた陰イオン交換物質の使
用に有利となり得る。
【０００９】 本発明の目的 第一の目的は、核酸構造を含む物質の精製の方法であって、(ａ)操作の容易化
、(ｂ)所望の物質の純度および収率の増大および(ｃ)含まれるステップ数の減少
に関し、改善される方法を提供することである。副次的な目的は、プラスミドお
よびウイルスのような核酸ベクターに関する同種の改善を行うことである。
【００１０】 第二の目的は、吸着−脱着ステップおよび他のステップに起因する変性を最小
とすることである。副次的な目的は、立体配座の変化を最小とし、共有結合的閉
環状ベクター(CCC)を開環状ベクター(OC)へ変化する危険性を最小とすることで
ある。他の副次的な目的は、最終生成物の吸着／脱着を避けるか、または穏やか
な条件で脱着が、特に核酸ベクターの場合に、生じる修飾を提供することである
。
【００１１】 第三の目的は、インビボ治療として使用されるプラスミド調製物の製造を促進
する改善方法を提供することである。これは、関連方法が治療的に許容される純
度、それは時折CCC/OC＞８０％、好ましくは＞９５％；RNA＜１％、好ましくは
＜０．６％；エンドトキシン＜４０EU/mg；クロモソームDNA＜１％、好ましくは
＜０．６％；タンパク質＜１μg/mg(好ましくは処置される患者に異種的なタン
パク質)である、プラスミド調製物を提供することを意味する。すべての割合は
、w/wである。
【００１２】 本発明 我々はこの度、吸着剤が、物質IIの吸着剤マトリクスの内部部分への通過を妨
げるシールディング層(ロック、リッド)を保有するならば、序文部分で述べた核
酸精製のための分離方法が改善され得ることを発見した。
【００１３】 我々はまた、特に核酸ベクターの場合、陰イオン交換リガンドが選択され、 (ａ)混合型相互作用、例えば、水素結合または他の、荷電−荷電相互作用と組合
せた電子供与体−受容体相互作用および／または (ｂ)温和なアルカリｐＨ値でｐＨスイッチ(ｐＨを増大させる)することにより陰
イオン交換リガンドを脱荷電(decharging)し得ることによる、より穏やかな脱着
条件 を提供するならば利点となることを発見した。
【００１４】 本発明の最初の観点は、種々のサイズを有するが精製される物質と同じリガン
ド構造に対し親和性を有する、物質から核酸構造を含む物質を精製する方法であ
る。換言すれば、その方法は、サイズが異なるが共通のリガンド構造に対し親和
性を有するお互い(物質Ｉおよび物質II)から２つの物質の分離を意味する。
【００１５】 そのため、その方法は、 i)物質ＩおよびIIを液体中に含んでいる(サンプル)こと； ii)当該液体を、物質IIに比して物質Ｉを高選択的に吸着する吸着剤と接触させ
ること； iii)物質Ｉとして吸着剤からおよび／または物質IIとして水性液体から所望の物
質を回収すること； 必要ならば、ステップ(iii)で回収した物質の何れかまたは両方を更に精製する
こと、 のステップを含む。
【００１６】 本発明の方法の特徴は、使用する分離媒体が、 (ａ)物質ＩおよびIIの両方に結合可能であるリガンド構造を有し、物質Ｉに接近
可能な、内部部分 (ｂ)実質的に物質IIを吸着せず、物質IIによるよりも物質Ｉによるほうが容易に
通過する外側表面層 を有することである。
【００１７】 これは、当該外側表面層は、対流性マス輸送(mass transport)によりサンプル
中の物質に接近可能であり、当該マトリクスの内部部分は、拡散性マス輸送を介
してのみ接近可能であることを意味する。そのため、外側表面層は、拡散性環境
から対流性環境を制限する境界層として考えられ得る。
【００１８】 外側表面層は、多孔性粒子の外側表面に、または粒子もしくはマクロ孔とミク
ロ孔の両方を含むモノリス内のマクロ孔の表面に、位置し得る。少なくとも外側
表面層における当該孔は、物質Ｉと物質IIのそれぞれに対する見かけの分子サイ
ズ(流体力学的半径)の間の見かけの分子サイズに相当する化合物の流入の分子サ
イズカットオフ値を有する。これは、典型的に、外側表面層の孔が１μｍ未満で
あることを意味する。当該内部部分は、外側表面層の孔と同じである分子カット
オフ値を有する孔を有し得るか、これらの孔よりも大きいか小さい孔を有する。
当該内部部分はまた、これら孔サイズの組合せを含み得る。
【００１９】 「物質ＩおよびIIの両方に結合し得るリガンド構造を有する」という表現は、
物質のそれぞれが、リガンド構造に接近したならばリガンド構造に結合し得るこ
とを意味する。ビーズへの結合に対する物質Ｉと物質IIとの間の選択性の相違は
、外側表面層の孔サイズが主に要因となり、リガンド構造に関する親和性の相違
は要因とはならない。
【００２０】 「物質IIに比して物質Ｉが容易に通過する」という表現は、物質Ｉが外側表面
層を通して物質IIよりも実質的に早く輸送されることを意味する。これには、物
質IIが外側層から完全に排除されることを含む。
【００２１】 「実質的に物質IIを吸着しない外側表面層」という表現は、少なくとも当該層
の表面が本質的に吸着リガンド構造を有しないことを意味する。
【００２２】 外側表面層はまた、反発構造(repelling structure)、例えば、物質ＩおよびI
Iと同じ電荷の構造を含み得、物質IIの場合、疎水性構造は、疎水性構造に不適
合な親水的特徴を有する。反発構造は、外側表面層を介する輸送の選択性を改善
し得る。ＷＯ９８３９３６４(Amersham Pharmacia Biotech AB)参照。
【００２３】 サンプル サンプルは、種々の源から誘導され得、様々な方法で調製され得る。それは、
血液サンプル、組織サンプル、培養細胞などから誘導され得る。それは、細胞ラ
イゼート型であり得る。それはまた、粒子物質を取り除くための遠心分離、濾過
、超遠心分離、透析など、タンパク質、核酸の特定画分、濃縮、脱塩などを行う
処理サンプルであり得る。そのため、 (ａ)吸着剤における核酸の捕捉および／または分画前にサンプルタンパク質を沈
殿させること、 (ｂ)特定ＤＮＡ画分を単離するならば、ＲＮＡを沈殿すること、 (ｃ)サンプルをイオン交換体などに適用する場合、脱塩および／または希釈する
ことによりイオン強度を減少させること が共通の手順(practice)である。
【００２４】 他の方法もまた、邪魔な物質を取り除くため、適用し得る。多くの場合、本発
明で使用するサンプルには、本質的に粒子物質はない。プラスミドの精製の場合
、サンプル中の汚染物質の含有量は、典型的にはタンパク質３０ｍｇ／ｍｌ以下
、ＲＮＡ２５ｍｇ／ｍｌ以下である。エンドトキシン含有量は、ｍｌあたり２０
０ＥＵを超え、典型的にはｍｌあたり４００００ＥＵを超える。総核酸含有量に
比例して、プラスミドは、３％(ｗ／ｗ)以上の量が存在し得る。特定の精製処理
および開始物質の目的に依存して、当該レベルは、有意に低くなり得る。所望の
物質が幾つか他の種類の核酸ベクター、例えばウイルスである場合、同様の値が
適用される。
【００２５】 サンプルは典型的には水性である。
【００２６】 物質ＩおよびIIならびに見かけの分子サイズカットオフ値 物質ＩおよびIIの少なくとも１つは核酸構造を有する。残りの物質は、用いる
リガンド構造にも結合し得る構造を含む限り、ある幾つか他の化合物であり得る
。これは、他の物質が、タンパク質／ポリペプチド、エンドトキシンまたは脂質
、界面活性剤、細胞またはその一部などであり得ることを意味する。当該物質の
何れかまたはその両方は、１つまたはそれ以上の構成成分が核酸構造を含み、一
方、１つまたはそれ以上の他の構成成分が他の構造を含む、複合体または集合で
あり得る。本発明の重要な変形型において、物質ＩおよびIIの両方は核酸構造を
含む(オリゴ-またはポリヌクレオチド構造)。酸構造(オリゴ-またはポリヌクレ
オチド構造)。物質ＩまたはIIのそれぞれが化合物の混合物であり得る。
【００２７】 核酸構造を有する物質の特定例は、天然および合成ＤＮＡおよびＲＮＡであり
、配列中に２またはそれ以上のヌクレオチド連結を有するそのフラグメントおよ
び誘導体を含む。直鎖状および環状型の核酸、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、
ゲノムＤＮＡなどが含まれる。また更なる例は、ウイルス(バクテリオファージ
を含む)のような核酸ベクターおよびプラスミドである。プラスミドは直鎖状ま
たは環状であり得る。環状型は開環状(ＯＣ)型および共有結合的閉環状(ＣＣＣ)
型、すなわちスーパーコイル型を含む。
【００２８】 物質の見かけの分子サイズは、(ａ)その分子量、および(ｂ)適用条件下のその
形態により決定される。そのため、見かけのサイズは、ｐＨ、イオン強度、塩型
および温度の変化に基づき変化し得る。これは、高分子量核酸およびタンパク質
のような生体高分子に当てはまる(true for)。物質ＩおよびIIの見かけのサイズ
を有する内部部分および外側表面層内の孔サイズのマッチにより、種々の内部部
分およびロックの分子サイズ排除挙動を試験することが容易となる。また、種々
のサイズの排除分離媒体に関する物質のサイズ排除挙動から結論が導くことが可
能である。サイズ排除の通常知識からクロマトグラフィーが適用される。
【００２９】 外側表面層の分子サイズカットオフ値を適当にセットすることにより、本発明
のステップ(ii)は、サンプル中の物質を、分子サイズカットオフ値未満の上記見
かけサイズの物質をそれぞれ含む２つの画分への分離を促進する。そのため、本
発明により、環状型ＤＮＡから直鎖型ＤＮＡを分離すること、共有結合的閉環状
型から開環状型を分離すること、プラスミドからＲＮＡを分離すること、ゲノム
ＤＮＡからプラスミドを分離すること、プラスミドからプラスミドを分離するこ
と、エンドトキシンからプラスミドを分離することなどが可能となると認識し得
る。典型的に、プラスミドの精製に最も有用な分子サイズカットオフ値は、有用
なスーパーコイルプラスミドのための見かけの分子サイズに相当する間隔、すな
わち、間隔１−１０ｋｂｐ(キロ塩基対)である。これは、カットオフ値が、より
大きな分子が内部部分を通過し得る場合により大きくなり得、例えば、その間隔
は、１から４０ｋｂｐを含む核酸ベクターに相当し得ることを排除しない。
【００３０】 本発明の好ましい形態では、外側表面層の分子サイズカットオフ値は、所望の
物質が液体中(物質II)に保持されるように、すなわち、マトリクスの内部部分中
に何らの有意な程度で輸送されないように、セットされる。この原理から、所望
の物質が物質IIであり、ウイルスまたはプラスミドのような核酸ベクターならば
、不都合となることが判る。主な不都合の１つは、所望の物質を、収率を減少し
物質の変性／崩壊を生じ得る吸着／脱着処理する必要はないことである。
【００３１】 高分子量ゲノムＤＮＡと核酸ベクターとを識別可能となる分子サイズカットオ
フ値にセットし得ると認識し得る。最も小さいもの(最も小さい見かけの分子量
サイズ)は、マトリクス内部部分に結合し、その一方、最も大きいものは、液体
中に保持されたままとなる。
【００３２】 リガンド構造 リガンド構造(リガンド)自体は、物質ＩおよびIIの両方に対し親和性を有する
。少なくとも１つの物質は核酸構造を含むため、殆どの見かけのリガンド構造は
、陽性荷電基を含む(陰イオン交換基)。陰イオン交換基は、原理的に任意の陰性
荷電種に結合する。それにゆえ、これらの種のリガンド構造は、本発明において
、核酸構造を含む物質からの任意の陰性荷電種の分離に用いられ得る。唯一の要
件は、見かけの分子サイズの相違が十分に大きいことである。
【００３３】 １つのマトリクスおよび同一マトリクスは、２つまたはそれ以上の種々のリガ
ンドを、例えば陰イオン交換リガンドを含み得る。
【００３４】 陰イオン交換基の実例は、スペーサーを介しベースマトリクスに連結する第一
級、第二級、第三級および第四級アンモニウム基である。例示は、−Ｎ＋Ｒ１Ｒ ２ Ｒ３であり、この場合、Ｒ１−３は、水素および／または炭化水素基である。
当該スペーサーは、遊離原子価の−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３基に結合する。Ｒ１−３中
の炭素鎖において、１またはそれ以上の位置でエーテル酸素(−Ｏ−)またはチオ
エーテル硫黄(−Ｓ−)または第二級、第三級もしくは第四級アンモニウム基(−
Ｎ＋Ｒ４Ｒ５−)が介在し得る。当該炭素鎖はまた、１またはそれ以上の−ＯＲ
６または第一級、第二級、第三級もしくは第四級アンモニウム基(−Ｎ＋Ｒ７Ｒ
８Ｒ９)で置換され得、この場合、Ｒ４−９は水素または炭化水素基である。Ｒ
１−９基は、同一であるかまたは異なり得る。炭化水素基は、飽和、不飽和また
は芳香族、および／または直鎖状、分枝状もしくは環状であり得る。Ｒ１−９は
、水素またはＣ１−１０、好ましくはＣ１−６、好ましくはアルキル基である炭
化水素基から典型的に選択される。Ｒ１−９は、二つ一組となり得、適当ならば
、含有Ｒ基が結合する原子を含む５または６員環を形成する。
【００３５】 好ましい陰イオン交換リガンドは、結合しおよび／または温和なアルカリｐＨ
値でｐＨスイッチ(ｐＨを増大させる)により脱荷電し得る物質と相互作用する混
合型を提供する。脱荷電能は、陰イオン荷電リガンドが、第一級、第二級および
第三級アンモニウム基を含み、好ましくはこれらはｐＫａ＜１０．５または＜１
０．０を有し、すなわち、典型的には第一級、第二級アンモニウム基を含むこと
を意味する。最も好ましいと考えられており、実験の一部の手順を減少する変形
型では、本質的にすべての陰イオン交換基がこの基準を満たすべきである。
【００３６】 「陰イオン交換リガンドが、結合する物質と相互作用する混合型を提供する」
という表現は、少なくとも２種の、しかし共同的な、結合する物質と相互作用す
る部位を提供し得るリガンドについて言及している。これらの部位の１つは、リ
ガンドと目的物質との間の引力型荷電−荷電相互作用を提供する。第二部位は、
水素結合を含む電子供与体−受容体相互作用を典型的に提供する。
【００３７】 電子供与体−受容体相互作用は、遊離対の電子を有する電気陰性原子が、ドナ
ーとして作用し、ドナーの電子対の受容体として作用する電子欠失原子に結合す
ることを意味する。Karger et al., An Introduction into Separation Science
, John Wiley & Sons (1973) page 42参照。ドナー原子／基の例示は、 (ａ)水酸基、エーテル、カルボニル、およびエステル(−Ｏ−および−ＣＯ−Ｏ
−)およびアミドのような、遊離対の電子を有する酸素 (ｂ)チオエーテル(−Ｓ−)のような遊離電子対を有する硫黄 (ｃ)アミン、スルホンアミドを含むアミド、シアノのような遊離対の電子を有す
る窒素 (ｄ)ハロゲン(フッ素、塩素、臭素およびヨウ素)、および (ｅ)ｓｐ−およびｓｐ２−混成軌道炭素原子 である。典型的な受容体原子／基は、金属イオン、シアノ、ニトロ中の窒素など
のような電子欠失原子または基であり、水酸基およびカルボキシ中のＨＯ−、ア
ミドおよびアミン中の−ＮＨ−、チオール中のＨＳ−などのような電気陰性原子
に結合する水素を含む。
【００３８】 ドナーまたは受容体原子／基と陽性荷電原子との間の距離は、典型的に１−７
原子であり、好ましくは２、３、４および５原子である。
【００３９】 適当な陰イオン交換リガンド構造の例は、第一級、第二級および第三級アンモ
ニウム基を含み典型的には芳香性または不飽和性構造を含まないものの間で見ら
れ得る。特に好ましい基は、１、２またはそれ以上のヒドロキシル基、またはア
ンモニウム基のアミノ窒素から２または３原子の距離に位置する少なくとも１つ
の炭素原子における、第一級、第二級または第三級アミノ窒素を有する。これら
２または３原子は、典型的にはｓｐ３−混成軌道炭素原子である。１つまたはそ
れ以上のこれらの水酸基およびアミノ窒素は、スペーサー中に存在し得るか、ま
たは存在し得ない。ＷＯ９７２９８２５(Amersham Pharmacia Biotech AB, = US
6,090,288)参照。それは、引用により本明細書に加える。スペーサーの末端(太
字)を含むその典型的なリガンド構造は、
【化１】 である。
【００４０】 特定目的のリガンド構造は、マトリクスに結合すると、通常の基準陰イオン交
換体に比して増加イオン強度で物質を吸着することができるものである。殆どの
場合、これは、好ましい陰イオン交換体が、通常の基準陰イオン交換体に比して
増加した溶出イオン強度を示すことを意味する。これは、上記定義のようなアン
モニウムリガンド構造を有する陰イオン交換体(I)のためのｐＨ２−１４の範囲
における最大溶出イオン強度が、タンパク質トランスフェリン、オバルブミン１
、オバルブミン２、β−ラクトグロブリン１およびβ−ラクトグロブリン２のう
ちの少なくとも１つの脱着のためのイオン交換基(ＣＨ３)３Ｎ＋−(＝Ｑ−基；
同一マトリクス、第四級窒素原子からと当該マトリクスへとで同一結合基、陰イ
オン交換体(Ｉ)に関する同一レベルのリガンド濃度および同一ｐＨで測定する)
を伴う第四級陰イオン交換体(II)に必要な溶出イオン強度よりも高く、好ましい
場合１２５％以上、多くの場合１４０％以上、例えば２００％以上である方法で
現され得る。ＷＯ９７２９８２５(Amersham Pharmacia Biotech AB)参照。
【００４１】 他の選択基準に従い、適当な陰イオン交換体は、Ｑ−交換体(−ＣＨ２ＣＨ(Ｏ
Ｈ)ＣＨ２Ｎ＋(ＣＨ３)３)について得られる相当するブレークスルー(breakthro
ugh)容量の３００％以上または５００％以上または１０００％以上のような２０
０％以上である基準タンパク質：オバルブミン、コナルブミン、ウシ血清アルブ
ミン、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、リゾチーム、ＩｇＧ、ダ
イズトリプシンインヒビター(ＳＴＩ)の少なくとも１つのためのｐＨ範囲２−１
２の何れかで最大ブレークスルー容量を有するものの間で見られ得る。支持マト
リクス、置換度、対イオンなどは、本質的に、上記考察と同じ意味である。基準
陰イオン交換体は、Q Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech AB, U
ppsdala, Sweden)である。この基準陰イオン交換体は、リガンドおよびスペーサ
ーアーム構造が
【化２】 である強力な陰イオン交換体である。
【００４２】 塩化物イオン容量は、０．１８−０．２５mmol/mlゲルである。ベースマトリ
クスは、ビーズ型のエピクロルヒドリン架橋アガロースである。当該ビーズは、
４５−１６５μｍの間隔の直径を有する。球状タンパク質の排除限界は、４×１
０６である。
【００４３】 更に、1999年11月22日付け出願のＳＥ出願番号SE9904197-2に基づく国際特許
出願(Amersham Pharmacia Biotech AB)参照。これらの国際特許出願は引用によ
り本明細書に加える。
【００４４】 他のリガンド構造は、物質Ｉの核酸構造の少なくとも一部に相補的な核酸構造
から選択され得る。当該相補性は、適用する結合条件下、リガンド構造と物質Ｉ
との間で十分にハイブリダイゼーションし得る。この種のリガンド構造は、物質
IIがまた、少なくとも部分的に本質的に物質IIにおけるものと同一である核酸構
造を有することを必要とする。ポリ−Ｕおよび核酸結合タンパク質が例である。
【００４５】 物質ＩおよびIIがまた、核酸構造および他の陰性荷電基以外の構造を有する場
合、これらに結合するリガンド構造はまた、本発明の分離媒体により物質Ｉを選
択的に捕捉することに使用され得る。
【００４６】 当該リガンド構造は、典型的に、本分野に既知のスペーサーを介しマトリクス
に共有結合的に連結する。当該スペーサーは、陰イオン交換吸着に通常利用され
るｐＨ条件下、すなわちｐＨ２−１４で加水分解的に安定である、有機構造であ
り得る。当該スペーサーは、シラン、カルボン酸エステル(−ＣＯＯ−)またはカ
ルボン酸アミド(−ＣＯＮＨ−)のような加水分解的に不安定な構造を典型的に欠
失している。当該スペーサーは、好ましくは、直線状、分枝状、または環状の、
飽和または不飽和炭化水素鎖である。当該鎖において、所望により、エーテル酸
素(−Ｏ−)またはチオエーテル硫黄(−Ｓ−)および／またはアミノ窒素(−Ｎ＋
Ｒ１０Ｒ１１−)が１またはそれ以上の位置で介在し、１またはそれ以上の−Ｎ
＋Ｒ１２Ｒ１３Ｒ１４−基または−ＯＲ１５基により置換されている。Ｒ１０− １５ は、上記考察の他のＲ基と同じ規則に従い選択される。リガンド構造はまた
、連結が、吸着／脱着に使用される条件に耐え得るかぎり、非共有結合的に結合
し得る。ＷＯ９７２９８２５(Amersham Pharmacia Biotech AB)での考察のよう
に、第一級、第二級または第三級アミンリガンドの挿入は、任意の有意な量の第
四級アンモニウム構造を生じない方法により容易に行われる。
【００４７】 マトリクスの内部部分 マトリクスのこの一部は、典型的には、クロマトグラフィーのような親和性吸
着内で通常使用されるのと同じ型である。上記考察のように、内部部分は、マク
ロ孔およびミクロ孔の両方を含み得る。
【００４８】 内部部分は、好ましくは、親水性であり、不溶性および多かれ少なかれ水中で
膨張性であるポリマー型である。親水性ポリマーは、典型的に、水酸基、アミノ
、カルボキシ、エステル、低級アルキルのエーテル(例えば、(−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ
−)ｎＨ、(−ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)Ｏ−)ｎＨ、およびエチレンオキシドおよびプ
ロピレンオキシドのコポリメライゼートである基(例えばPluronics(登録商標)(
ｎは０を超える整数、例えば１、２、３から１００までである))のような極性基
を典型的に有する。親水性となるように誘導された疎水性ポリマーはまた、この
定義に含まれる。適当なポリマーは、ポリヒドロキシポリマーであり、例えば、
アガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、プルランなどのようなポリ
サッカライド、およびポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ(ヒド
ロキシアルキルビニルエーテル)、ポリ(ヒドロキシアルキルアクリレート)およ
びポリメタクリレート(例えば、ポリグリシジルメタクリレート)、ポリビニルア
ルコールおよびスチレンおよびジビニルベンゼンに基づくポリマー、ならびに上
記ポリマーに相当する２つまたはそれ以上のモノマーが含まれるコポリマーが含
まれる。水に可溶性のポリマーは、例えば、架橋することにより、および吸着を
介し不溶性マトリクスに結合または共有結合することにより、不溶性となるよう
に誘導し得る。親水性基は、ＯＨに変換され得る基を提示するモノマーの重合化
により、または最終ポリマーの親水性化により、例えば、親水性ポリマーのよう
な適当な化合物の吸着により、疎水性ポリマーに(例えば、モノビニルおよびジ
ビニルベンゼンのコポリマーに)導入され得る。
【００４９】 内部部分はまた、シリカ、酸化ジルコニウム、グラファイト、酸化タンタルな
どのような無機物質に基づき得る。
【００５０】 内部部分は、シラン、エステル、アミド基およびシリカ自体に存在する基のよ
うな加水分解的に不安定な基を好ましくは欠いている。
【００５１】 本発明の特に興味ある実施態様では、内部部分は、不規則形態であり、または
１−１０００μｍ、好ましくは５−１０００μｍの範囲のサイズの球状ビーズ型
である。
【００５２】 内部部分はまた、多孔性モノリス型であり得る。
【００５３】 リガンド構造は、冒頭「リガンド構造」で上記提案したような本分野に既知の
方法により内部部分へ導入される。
【００５４】 リガンド構造に必要な置換度(リガンド構造の密度)は、リガンド型、マトリク
スの種類、回収される化合物などに依存する。通常、０．０１−１ｍｍｏｌのよ
うな０．００１−４ｍｍｏｌ／ｍｌマトリクスの範囲が選択される。アガロース
ベースのマトリクスの場合、その密度は、通常、０．１−０．３ｍｍｏｌ／ｍｌ
マトリクスの範囲内である。デキストランベースのマトリクスの場合、その範囲
は、０．５−０．６ｍｍｏｌ／ｍｌマトリクスにまで拡張し得る。
【００５５】 前述の段落で示した範囲は、塩化物イオンに結合する完全陽子供与型(fully p
rotonated form)内のマトリクスについての容量に関連する(refer)。「ｍｌマト
リクス」は、水で飽和したマトリクスについて言及する。外側表面層は、これら
の範囲で算出されるマトリクスに含まれる。
【００５６】 外側表面層 外側表面層は、液体サンプルが通過しなければならない。水性液体の場合、こ
れは、外側表面層が、内部部分で考察したものと同種の親水性ポリマーで作成さ
れるべきことを意味する。
【００５７】 外側表面層を作成する種々の方法が存在する。
【００５８】 Ｉ．むきだし型の多孔性粒子の表面または粒子のマクロ孔もしくは親水性ポリマ
ーを伴うマクロ孔およびミクロ孔の両方を有するモノリスの表面の被覆。 親水性ポリマーの見かけの分子サイズは、内部の部分に向う孔を有意に通過し
得ないように選択すべきである。好ましくは、親水性ポリマーは、上記のように
親水性基を含み、例えば、可溶性型のポリサッカライド(デキストラン、アガロ
ース、デンプン、セルロースなど)のようなポリヒドロキシポリマーである。当
該リガンド構造は、ロックの作成前または後の何れかに内部部分に導入され得る
。この方法により作成される外側表面層の種々の物質の浸透性は、被覆に用いる
溶液中のポリマーの濃度およびサイズにより制御される。その後の外側表面層被
覆は、層内および内部部分への架橋により安定化され得る。この方法は、ＷＯ９
８３９０９４(Amersham Pharmacia Biotech AB)に詳細に記載されている。
【００５９】 II．前記冒頭内部部分で考察した型の、むきだし親水性ベースマトリクスから
出発、および次いでリガンド構造を、リガンド構造を欠失している外側表面層の
ままのマトリクスの内部部分への特異的導入。出発マトリクスの多孔性を、物質
Ｉがマトリクス内で物質IIに比して輸送が促進されるように好ましくは選択し、
すなわち、内部部分と外側表面層の孔サイズが本質的に同じとする。この種の方
法は、ＷＯ９８３９３６４(Amersham Pharmacia Biotech AB)に存在している。
【００６０】 本発明中で使用するロック媒体は、液体よりも高いまたは低い密度を有する粒
子／ビーズの型であり得る(例えば、マトリクス粒子あたり１つまたはそれ以上
の密度制御粒子を導入することにより)。この種のマトリクスは、流動床または
拡散床(expanded bed)クロマトグラフィーならびに非パック化カラムの種々のバ
ッチ型クロマトグラフィー技術、例えば、攪拌タンク中の簡単なバッチ吸着の大
スケール操作で本質的に適用可能である。この種の技術は、ＷＯ９２１８２３７
(Amersham Pharmacia Biotech AB)およびＷＯ９２／００７９９(Kem-En-Tek/Upf
ront Chromatography)で述べられており、使用される粒子のロックを導入するこ
とにより本発明の観念に容易に適合させ得る。
【００６１】 処理条件 本発明の処理を行う条件は、原理的には、通常の吸着技術、例えば、陰イオン
交換クロマトグラフィーと同じである。
【００６２】 陽性荷電リガンド構造の場合、これは、マトリクスが最初に適当なｐＨに平衡
化され、この場合、リガンド構造は陽性荷電し、吸着に許容される最大イオン強
度が十分低いことを意味する。これは、典型的に、イオン強度が、物質、陰イオ
ン交換体および他の条件などの特定の組合せのための溶出イオン強度未満である
ことを意味する。次いで当該サンプルを適用する。吸着後、液相およびマトリク
スの何れかまたはその両方を更に物質ＩおよびIIに関し、それぞれ処理する。マ
トリクスからの物質Ｉの脱着は、物質Ｉが溶出するまでマトリクスと接触する液
体のイオン強度を増加することにより行う。特に、リガンド構造が第一級、第二
級または第三級アミン基の陽子供与型であり、および／または物質Ｉが核酸であ
る場合、吸着は、好ましくはｐＨを増加することにより促進される(assist)。脱
着の他の方法は、液体中の可溶性リガンド類似体、すなわち、物質Ｉへの結合で
リガンド構造物と競争し得る構造類似体を含む。液体中の構造物中断化合物の存
在もまた、脱着を促進し得る。これは、特に、リガンド構造が、リガンド構造の
荷電第一級、第二級または第三級窒素から２または３原子の距離の炭素原子の１
またはそれ以上の水酸基またはアミノ基を含む場合に、適用される。既知構造の
中断試薬は、グアニジンおよび尿素である。またＷＯ９７２９８２５(Amersham
Pharmacia Biotech AB)参照。
【００６３】 上記脱着原理は、特定のリガンド構造および物質Ｉに適当となるように合わさ
れ得る。
【００６４】 マトリクスと接触する液体の組成を、ｐＨおよび／または塩および／または他
の脱着剤の濃度に関する段階勾配(step wise gradient)または連続的勾配の何れ
かにより物質Ｉの脱着を行うため、変化させることができる。可能ならば、１ス
テップで変化させるのが最も簡単である。連続勾配および２またはそれ以上のス
テップを含む段階勾配は、物質Ｉが１またはそれ以上の更なる物質と共にマトリ
クスに結合する場合に、主に使用する。これらの場合、脱着勾配は、種々の条件
において物質の脱着され、それにより、回収される物質Ｉの純度が改善されるよ
うに使用され得る。
【００６５】 上記のように、物質ＩまたはIIの何れかは、例えば、いわゆるポリッシュ(pol
ishing)すること、および／または中間精製ステップにより、更に精製され得る
。脱着後、物質Ｉは、所望の物質を捕捉するためまたは汚染物質を捕捉するため
の何れかの更なる補足ステップにより更に精製され得る。物質IIは、精製型が望
ましいならば、また、更なる捕捉ステップを行い得る。他の精製／ポリッシュス
テップの必要性は、所望の物質の純度要求(purity demand)がインビボ治療のよ
うに高いならば典型的に適用される。その更なるステップは、物質ＩまたはIIに
よる陰イオン交換体、陽イオン交換体、逆相マトリクス、ＨＩＣマトリクス(疎
水性相互作用クロマトグラフィーマトリクス)などへ／それらからの吸着／脱着
を含み得る。サイズ排除クロマトグラフィー(size exclusion chromatography)
およびヒドロキシアパタイトの吸着／脱着もまた使用し得る。また、ロックベー
スの親和性マトリクスを使用するステップの前に、１またはそれ以上の上記吸着
／脱着ステップが存在する。
【００６６】 上記の定義のような所望の物質の大スケールの場合、マトリクス物質、リガン
ドならびに吸着／分離媒体の脱着、再生および再使用を行い得る結合化学を選択
することが最も重要である。再使用は、ステップ(iii)後の再生および吸着剤に
よる平衡化から典型的に開始し、その後に、吸着剤をサンプルの新規バッチとス
テップ(ii)で定義のように接触させる。再生および平衡化は、本分野に既知のよ
うに行う。特定の変形型において、これら２ステップが同時に起こり得る。この
種の、分離媒体の循環使用は、典型的に、再生ステップの前または後の何れかの
クリーニングステップを必要とする。クリーニングステップは、各サイクルに、
もしくは２番目、３番目、４番目、５番目などのサイクルに、または適当と思わ
れるときはいつでも存在し得る。
【００６７】 本発明の第二の別の観点は、核酸ベクターの回収および／または精製のための
、上記第一級、第二級および第三級アンモニウム基を有し、 (ａ)上記定義のような増加した溶出イオン強度で吸着し得、および／または (ｂ)アンモニウム基からｓｐ３−混成軌道炭素原子２または３個の距離に１、２
またはそれ以上の水酸基および／またはアミノ窒素を有する、 分離媒体の使用である。
【００６８】 本発明の観点では、増加したイオン強度での吸着能、リガンドおよびスペーサ
ーの種類、多孔性のようなマトリクスの特徴、マトリクス材料などを上記のよう
に定義する。当該マトリクスは完全に機能化(functionalized)するか、または上
記のように内部内のみを機能化し得る。言及する当該アミノ窒素は、好ましくは
、下位概念を伴う第一級、第二級または第三級アミノ窒素および本発明の第一の
態様で考察したような好ましいものである。
【００６９】 この別観点は、１、２またはそれ以上の水酸基および／またはアミノ窒素が、
陽性荷電アミン窒素原子からｓｐ３−混成軌道炭素原子２または３個の距離に存
在する陰イオン交換体が、陰イオン交換体への物質の結合を促進するという以前
の我々の発見に基づいている。ＷＯ９７２９８７２５(Amersham Pharmacia Biot
ech AB)参照。我々は、これは、核酸ベクターを扱うときに不都合となると認識
している。上記参照。
【００７０】 この観点の我々の変形型は、第一の観点で定義した精製方法である。
【００７１】 他の変形型では、分離媒体は、外側表面層を欠失している(ロックを含む)。こ
の変形型のリガンド構造を有するベースマトリクスは、上記内部部分と同じ構成
物であり得る。この変形型は、例えばＷＯ９９１６８６９(Amersham Pharmacia
Biotech AB)に記載するような分離媒体を通常の捕捉ステップで使用する。ベク
ターを伴うＲＮＡのような汚染種は、選択的に吸着し脱着する。当該全処理は、
ロック分離媒体を使用する処理のための上記のような更なる精製ステップを含み
得る。
【００７２】 両方の変形型では、核酸ベクターを含むサンプルは、タンパク質および／また
は核酸を回収するため、当分野に既知のように処理され得る。
【００７３】 例えば、ＷＯ９９１６８６９(Amersham Pharmacia Biotech AB)およびOllivie
r and Stadler, Gene Therapy of Cancer (editors Walden et al), Plenum pre
ss, New York (1998) 487-492および英国特許出願９９２７９０４．４および相
当する国際特許出願参照。
【００７４】 本発明は更に添付の特許請求の範囲で定義される。今回、本発明が証明され、
多くの特許実施例で解説される。
【００７５】 実施例 合成 実施例１．粒子においてロックを伴う粒子型の陰イオン交換体 Ａ．アリル化架橋アガロース粒子(アリル化ベースマトリクス) Porath et al(J. Chromatog. 60 (1971) 167-77およびUS3,959,251)によりNaOH
の存在下、エピクロロヒドリンとアガロースとの間の反応により調節される架橋
アガロース(９０μｍ粒子)を、ベースとしてＮａＯＨを伴うアリルグリシジルエ
ーテルにより、アリルレベル(ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２−)０
．１８−０．３０ｍｍｏｌｅ／ｍｌに反応させた。このベースマトリクスは、Se
pharose 4B FF(Amersham Pharmacia Biotech AB)と同様な多孔性を有する。
【００７６】 Ｂ．アリル化架橋アガロース粒子上のロックの導入 アリル含有物０．２９ｍｍｏｌ／ｍｌゲルを有するＡの真空排出アリル粒子(vac
uum drained allylated particle)２５ｇを、プロペラスターラーを装着した１
００ｍｌビーカー中の無水酢酸ナトリウム０．６ｇおよび脱イオン水５０ｍｌと
共に負荷した(charge)。臭素０．１８ｍｌを早く攪拌しつつ滴下した。
【００７７】 次いで、臭素化ゲルを多量の脱イオン水で洗浄し、ガラスフィルター漏斗で真
空排出した。ゲルおよび水を三首丸底フラスコに負荷した。水を総重量５０ｇの
水とゲルに添加した。
【００７８】 次いで、水酸化ナトリウム２ｇおよびホウ化水素ナトリウム０．０３ｇを添加
し、温度６０℃に上昇させた。２１ｈ後、チオグリセロール６ｇを、可能な非加
水分解化エポキシドを中性化するため添加した。反応混合物を６０℃で更に４ｈ
攪拌した。反応は、水でガラスフィルター漏斗のゲルを洗浄することにより停止
させた。少量の酢酸をガラスフィルター漏斗に直接添加し、スラリーを僅かに酸
性とした。多量の脱イオン水による最後の洗浄を行った。
【００７９】 残存するアリル含有物は０．２１ｍｍｏｌ／ｍｌと測定された。
【００８０】 Ｃ．アリル化架橋アガロース粒子から調製したロックビーズにおける陰イオン交
換リガンドの導入 上記Ｂからの真空排出粒子１５ｍｌ、無水酢酸ナトリウム０．６３ｇおよび１０
０ｍｌ脱イオン水を、プロペラスターラーを装着した２５０ｍｌビーカーに負荷
した。
【００８１】 臭素(０．２０ｍｌ)を早く攪拌しつつ滴下した。
【００８２】 ゲルを多量の脱イオン水で洗浄した。ガラスフィルター漏斗における真空排出
の後、当該ゲルを、既にＴＲＩＳ２２．５ｇ(ＮＨ２Ｃ［ＣＨ２ＯＨ］３)および
水２２．５ｇを含む１００ｍｌ丸底フラスコに負荷した。
【００８３】 当該反応は、一晩２２．５ｈで６０℃で行った。
【００８４】 次いで、ゲルを僅かなベッド体積の水で洗浄し、その後、ｐＨを約７に調節し
た。多量の水を用いる更なる洗浄ステップを行った。
【００８５】 材料を、小さな破壊したビーズを除くため、ふるい４５μｍにかける。当該ふ
るいに残った物質を、クロマトグラフィー実験でパッキングしたカラムとして使
用した。
【００８６】 総塩化物イオン容量は、０．０８(０．０７６)ｍｍｏｌ／ｍｌゲルと測定され
た。
【００８７】 実施例２．Ｔｒｉｓリガンドで機能化するロック(むきだしのマトリクス)のない
基準マトリクス Ａ．アリル化架橋アガロース粒子(アリル化ベースマトリクス) このベースマトリクスを実施例１Ａと同じ方法で調製した。アリルリガンド密度
は、０．２６ｍｍｏｌ／ｍｌゲルと測定された。
【００８８】 Ｂ．Ｔｒｉｓの結合(tris(ヒドロキシメチル)アミン) 実施例２Ａからの真空排出アリルゲル１０ｍｌ、硫酸ナトリウム１．２ｇおよ
び脱イオン水５０ｍｌを、プロペラスターラーを装着した１００ｍｌビーカー中
で混合した。臭素を、スラリーが永続的に黄色に変わるまで早く攪拌しつつ滴下
した。
【００８９】 ゲルを多量の水で洗浄した。ガラスフィルター漏斗における真空排出の後、当
該ゲルを、既にＴｒｉｓ１５ｇおよびイオン交換水１５ｇを含むハンギング・マ
グネット・スターラーを有する三首２５ｍｌ Bellcoフラスコに移した。当該反
応を６０℃で一夜行った。
【００９０】 反応混合物のｐＨを希塩酸で７に調節した。多量の水(１００ｍｌを超える)を
用い洗浄ステップを行った。
【００９１】 リガンド密度(Ion Exchange Capacity)を有する最終生成物は０．１７ｍｍｏ
ｌ／ｍｌであった。
【００９２】 クロマトグラフィー 実施例３．精製プラスミドを用いるクロマトグラフ実験 Ｉ．材料 分離媒体：実施例１のロック粒子(分離媒体Ａ)および実施例２のロックのない粒
子(分離媒体Ｂ)。 プラスミド調製物：プラスミドPXL 2784(サイズ＝６．３ｋｂｐ)を保有するE. c
oliを、Birnboim(Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7 (1979) 1513-1523;
およびBirnboim, Meth. Enzymol 100 (1983) 243-255)の標準的アルカリリシス
法により溶菌させた。当該サンプルはＲＮＡｓｅで処理した。精製プラスミドＰ
ＸＬ３０９６(２．５ｋｂｐ)を、本質的ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ーを用い精製し、その一方、ＰＸＬ２７８４(６．３ｋｂｐ)を、ＲＮＡｓｅ処置
を目的とするQiagen Kit(Qiagen)を用い、ここUppsalaで調製した。 平衡緩衝液(Ａ)：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０ 溶出緩衝液(Ｂ)：緩衝液Ａ、ｐＨ８．０中の１Ｍ ＮａＣｌ
【００９３】 II．分離媒体ＡまたはＢ(ベッド体積２．４ｍｌ)を含むカラムＨＲ １０／３(Am
ersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)を流速３０ｃｍ／ｈで平衡化
した。次いで、新たに調製し、透明にした、アルカリライゼート(プラスミドＤ
ＮＡ約５０−８０μｇを含む、２ｍｌ)を適用した。次いで、カラムを：(ｉ)非
結合物質を溶出する３ＣＶの平衡緩衝液および、(ii)結合物質を溶出する３ＣＶ
の緩衝液Ｂで洗浄した。カラムから得られる画分を直接プールした。必要と思わ
れるとき、カラムを、２ＣＶの１Ｍ ＮａＯＨで洗浄し、その後、３ＣＶの水で
洗浄した。
【００９４】 III．電気泳動分析 これは、“サブマリン”電気泳動アセンブリ(GNA-100, 8ウェル, 5×1 mm)およ
びＥＰＳ５００／４００パワーサプライ(Amersham Pharmacia Biotech AB)を用
い、１％アガロースゲル(核酸用)で行った。標準的ＴＢＥ緩衝液を電気泳動に用
いた。当該ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＵＶランプにより視覚化した。
【００９５】 結果 分離媒体Ａ。ロックを伴う陰イオン交換体粒子における精製プラスミドのクロマ
トグラフィー。精製プラスミドＰＸＬ３０９６(２．５ｋｂｐ)およびＰＸＬ２７
８４(６．３ｋｂｐ)各約７０μｇを、上記概略の手順に従いロック粒子でクロマ
トグラフした。結果は、これら２つのプラスミドはカラムに結合せず、これは、 ロックの多孔性またはポリマーシールドにより、陰イオン交換粒子の荷電外部
または内部表面へのこれら高分子の拡散が阻止されることを示している。実際に
は、プラスミドは、空隙容量(void volume)のカラム中に溶出し、ロック媒体は
、受動性分子ふるい(passive molecular sieve)として作用する。
【００９６】 分離媒体Ｂ。ロックのない陰イオン交換粒子における精製プラスミドのクロマト
グラフィー。上記実験を、同一実験条件の下、実施例２に従いロックのない粒子
を使い繰り返した。結果から、両プラスミドをこの分離媒体に結合することが示
された。これは、当該プラスミドが少なくとも陰イオン交換体の荷電外側表面に
接近するからである。当該結果はまた、結合プラスミドの段階溶出により少なく
とも２サブフラクション中へ分離されることを示す。これらサブフラクションの
性質はまだ確立されておらず、将来の調査のトピックとなる。
【００９７】 そのため、これらの結果は、媒体構成体におけるロック観念が「現実の状態」
で働き、生化学における最も困難な分離問題の１つを解決するという強力な証明
を提供する。
【００９８】 実施例４．ロック媒体における透明アルカリライゼート(ＣＡＬ)のクロマトグラ
フィー これは、種々の実験条件下、で行った。透明を目的とする場合、得られた結果
は、３つの分かれたセクションで示される。
【００９９】 Ｉ．脱塩の効果 ６．３ｋｂプラスミドを含む透明アルカリライゼート(ＣＡＬ)(サンプルＡ)２
ｍｌを、更なる処置をまったくせずにカラムに適用し、実施例３の「実験」で概
略した手順に従い溶出した。当該実験は、脱塩ＣＡＬ １０ｍｌ(脱塩の間の希釈
のため粗プラスミド抽出物約５ｍｌに相当する)(サンプルＢ)を用い繰り返した
。脱塩は、一定圧を生ずる窒素ガスを用い攪拌セル中のＰＭ１０膜(Amicon, U.S
.A.)で行った。使用した物質は、平衡および溶出緩衝液を除き実施例３と同じで
あった。
【０１００】 平衡緩衝液(Ａ)：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０ 溶出緩衝液(Ｂ)：緩衝液Ａ、ｐＨ８．０中の１Ｍ ＮａＣｌ
【０１０１】 結果 プラスミドは、いずれの場合も、非結合画分中に溶出した。結合画分が、広い
ピークとして溶出した(５−１０カラム体積(ＣＶ))。Ａ２６０の回収は、約８０
％であった。ゲル電気泳動パターンは、実施例３に記載のように得られた。III
は、何れの場合も、非結合画分が排他的にプラスミドを含み、その一方で結合画
分はＲＮＡ不純物を含むことを示す。サンプルＢの非結合画分は、脱塩するとプ
ラスミドは損傷するため、明らかにストリーキングバンドを示した。サンプルＡ
の非結合画分は、ＲＮＡの減少吸着容量の結果、サンプル中の高塩濃度のため可
能な限り少量のＲＮＡを含むと思われた。以下の結論は、上記の得られた結果か
ら形成される： １．非結合画分は、プラスミドＤＮＡを含み、その一方、結合画分はＲＮＡを含
む。 ２．結合画分は広範ピーク中に溶出する。広範囲のピークは、ロックにより作成
される分散バリアーに起因する。 ３．サンプルの脱塩は、ＲＮＡおよび他の不純物に対する媒体の吸着容量を増大
する必要があり得る。 ４．Ａ２６０での回収は約８０％であり、それは、幾つかの不純物が強力に結合
し、完全に溶出するためにはクリーニングステップ、例えば、１Ｍ ＮａＯＨを
用い洗浄することが必要であり得る。
【０１０２】 II．ｐＨの影響 実施例１で使用するリガンドを含む陰イオン交換媒体は、おおよそｐＨ５．５
−７．０で殆ど陰イオン性のタンパク質に「最適な結合強度」を有する。それは
また、ｐＨ９．０あたりでは実質的に非荷電である。ＷＯ９７２９８２５参照。
そのゆえ、おおよそｐＨ９．０またはそれよりも高いｐＨでこの吸着剤から結合
分子の効果的脱着が予測される。それゆえ、以下の実験を行い、プラスミドＤＮ
Ａの上記発見の正確性を確立／拒絶した。サンプルおよび使用する緩衝液を除き
、クロマトグラフ実験は、実施例３．IIIと同じであった。
【０１０３】 サンプル：透明化粗アルカリライゼート(ｐＨ＝５．３)。脱塩せず。 平衡緩衝液(Ａ)：５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．５。 溶出緩衝液(Ｂ)：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．１。
【０１０４】 結果 クロマトグラムおよびゲル電気泳動パターンに基づき、溶出したプラスミドは
、非結合画分における従前の実験および結合画分中のＲＮＡと同様となった(約
１０ＣＶにおいて)。Ａ２６０の回収は約８０％である。
【０１０５】 結論 １．予測されるように、ちょうど陰イオン性タンパク質の場合のように、不純物
は、ｐＨ８．０よりもｐＨ５．５でより強力に結合した。これは、使用する分離
媒体は、ｐＨ５．５および可能である限りｐＨ６．５であってもＲＮＡ(および
可能な限り他の不純物)についてより高い吸着容量を有することを示し得る。 ２．ゆっくりとした脱着動力学は、ｐＨ５．５からｐＨ９のイオン交換体のゆっ
くりとした滴定(titration)に反映し得る。この場合、結合画分は望ましくない
不純物を含むため、０．５Ｍ ＮａＯＨでカラムを洗浄することにより当該処理
をスピードアップすることが出来る。これは、強力な結合溶液でさえ溶出し得る
という更なる利点を有する。
【０１０６】 III．非機能性化外側表面層の効果(ロック) この実験における物質および手順は実施例３と同様であった。 分離媒体：実施例２に従う。すなわち、ロックのない媒体。 サンプル：透明化アルカリライゼート(ｐＨを６．４に調節)５ｍｌ。脱塩せず。 平衡緩衝液(Ａ)：２０ｍＭ リン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．４。 平衡緩衝液(Ｂ)：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ Ｍ Ｎ
ａＣｌ、ｐＨ９．２。 手順：実施例３参照。 結合および非結合画分を、実施例３に記載のようにゲル電気泳動により分析した
。
【０１０７】 結果 非結合画分は、約１５ＣＶ中に広範ピークとして溶出した。非結合画分は、排
他的にプラスミドＤＮＡを含み、その一方、結合画分は、プラスミドＤＮＡとＲ
ＮＡの両方を含んでいた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ロルフ・バリィルンド スウェーデン、エス−759 49ウプサラ、 ラバールベルガータン23番 (72)発明者 レナート・ソーデルバリィ スウェーデン、エス−755 98ウプサラ、 エクシャガーナ、クルセンバリィ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA11 HA03 4D017 AA09 AA20 BA07 BA20 CA01 CA05 CA12 CA13 CA14 CB01 DA01

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 一方が所望の物質であり、両方ともが同じリガンド構造に対
    し親和性を有し、そして物質(Ｉ)が物質(II)よりも小さいサイズを有する、物質
    (II)から物質(Ｉ)を相互に分離することにより、核酸構造を含む所望の物質を精
    製する方法であって、 (i)物質ＩおよびIIを液体中に含んでいること(サンプル)； (ii)当該液体を、物質IIに比して物質Ｉを高選択的に吸着する吸着剤と接触させ
    ること； (iii)物質Ｉとして吸着剤からまたは物質IIとして水性液体から所望の物質を回
    収すること； (iv)必要ならば、ステップ(iii)で回収した物質を更に精製すること、 のステップからなり、 当該吸着剤が、 (ａ)物質ＩおよびIIに結合可能であるリガンド構造を有し、物質Ｉに接近可能な
    、内部部分 (ｂ)実質的に物質IIを吸着せず、物質IIによるよりも物質Ｉによるほうが容易に
    通過する外側表面層 を有することを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 外側表面層は物質Ｉが通過可能であるが、物質IIは通過可能
    ではないことを特徴とする請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 リガンド構造が陽性荷電基を含むことを特徴とする請求項１
    −２の何れかの方法。
  4. 【請求項４】 陽性荷電基が第一級、第二級または第三級アンモニウム基で
    あることを特徴とする請求項３の方法。
  5. 【請求項５】 物質Ｉおよびリガンド構造が、少なくとも部分的に相補的で
    ありそれによってステップ(ii)において相互にハイブリダイゼーション可能とな
    る核酸構造を含むことを特徴とする請求項１−４の何れかの方法。
  6. 【請求項６】 外側表面層が実質的にリガンド構造を有しないことを特徴と
    する請求項１−５の何れかの方法。
  7. 【請求項７】 物質IIが所望の物質であることを特徴とする請求項１−６の
    何れかの方法。
  8. 【請求項８】 物質Ｉが所望の物質であることを特徴とする請求項１−７の
    何れかの方法。
  9. 【請求項９】 物質ＩおよびIIの両方が核酸構造を含むことを特徴とする請
    求項１−８の何れかの方法。
  10. 【請求項１０】 精製される物質が核酸ベクターであることを特徴とする請
    求項１−９の何れかの方法。
  11. 【請求項１１】 当該ベクターがプラスミドであることを特徴とする請求項
    １０の方法。
  12. 【請求項１２】 当該ベクターがウイルスであることを特徴とする請求項１
    ０の方法。
  13. 【請求項１３】 陰イオン交換リガンドが第一級、第二級または第三級アン
    モニウム基であり、水性サンプルからの核酸ベクターの回収および／または精製
    のために増加した溶出イオン強度を示す陰イオン交換体であって、 この場合、増加した溶出イオン強度は、 陰イオン交換体のｐＨ２−１４の範囲における最大溶出イオン強度は、イオン交
    換基(ＣＨ３)３Ｎ＋−(＝Ｑ−基)；同一マトリクス、第四級窒素原子から当該マ
    トリクスへの同一結合基、陰イオン交換体(Ｉ)に関する同一レベルのリガンドを
    伴う第四級陰イオン交換体(II)に必要とされ、タンパク質トランスフェリン、オ
    バルブミン１、オバルブミン２、β−ラクトグロブリン１およびβ−ラクトグロ
    ブリン２のうちの少なくとも１つの脱着と同一のｐＨで測定された溶出イオン強
    度よりも高く、好ましい場合１２５％以上、多くの場合１４０％以上、例えば２
    ００％以上であることを意味する、 陰イオン交換体の使用。
  14. 【請求項１４】 水性サンプルからの核酸ベクターの回収および／または精
    製のための、複数の第一級、第二級または第三級アンモニウム基であって、アン
    モニウム基の窒素原子からｓｐ３−混成軌道炭素原子２または３個の距離に１、
    ２またはそれ以上の水酸基および／またはアミノ窒素を有する当該アンモニウム
    基を有する陰イオン交換体の使用。
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