DE2523793C2

DE2523793C2 -

Info

Publication number: DE2523793C2
Application number: DE2523793A
Authority: DE
Inventors: Rolf Erik Axel Verner Upplands Baelinge Se Axen; Jerker Olof Porath; Per Jan Erik Uppsala Se Carlsson
Original assignee: Exploaterings Tbf Stockholm Se AB
Current assignee: Exploaterings Tbf Stockholm Se AB
Priority date: 1974-05-30
Filing date: 1975-05-28
Publication date: 1990-01-18
Also published as: GB1506403A; IL47336A0; SE420733B; FR2336415A1; FR2336415B1; JPS517090A; JPS6048703B2; US4048416A; DE2523793A1; SE7407173L; IL47336A; DK240475A

Description

Die Erfindung betrifft Polymere, deren Seitenketten Thiogruppen enthalten, ein Verfahren zur Herstellung dieser Polymere und ihre Verwendung.

Zur Trennung, Reinigung und Isolierung von Bestandteilen biologischer Systeme existieren vielfältige, insbesondere chromatographische Adsorptionsmethoden. Die hierbei in Frage kommenden Bestandteile sind nicht allein Moleküle und Molekülkomplexe, sondern ebenfalls organisierte Biosysteme verschiedener Art, beispielsweise Zellen, subzellulare Partikel und Viren. Ein chromatographischer Verlauf wird auf komplizierte Art durch Wechselwirkungen zwischen Systemen des festen, chromatographischen Mediums und den Bestandteilen in beweglicher Phase bestimmt, wobei die antreibenden Kräfte bei den Wechselwirkungen elektrostatischer, wasserstoffbindender, ladungsüberführender oder hydrophober Natur sind.

Man kann äußerst spezifische Sorptionseffekte erzielen, indem ein Bestandteil in einem System natürlich vorhandener Assoziation-Dissoziation-Gleichgewichte durch Fixieren an einen polymeren Träger immobilisiert wird, und das dieserart erhaltene chromatographische Mittel zur Adsorption von komplementären Bestandteilen ausgenutzt wird. Eine derartige Methodik nennt man Bioaffinitätschromatographie.

Das Beanspruchen einer kovalenten Bindung als Ursache für Sorption und Chromatographie in biochemischem Zusammenhang ist selten zur Anwendung gekommen. Die Gruppenspezifität ist dabei je nach Vorhandensein einer gewissen, funktionellen Gruppe oder Struktur erhältlich. Auch kann mit einem höheren Spezifitätsgrad gerechnet werden, da die Reaktivität funktioneller Gruppen der gleichen Art in komplizierten Biomolekülen aufgrund der sterisch bedingten Mikroumgebung oft variiert.

Das rationale Vorbereiten mehr oder weniger spezifischer Adsorbentien für biochemische Trennungen ist oft mit großen Schwierigkeiten verbunden. Es ist erstrebenswert von hauptsächlich neutralen, stark hydrophilen und für Makromoleküle durchlässigen Trägerpolymeren auszugehen. Das Polymerskelett soll chemisch inert, jedoch mit solchen derivatbildenden Gruppen substituiert sein, die sich unter milden Bedingungen im Wassersystem in möglichst viele Reaktionstypen einbeziehen lassen, beispielsweise Salzbildung, Komplexbildung, Redoxreaktionen, Substitutions- und Additions- sowie Radikalreaktionen. Die derivatbildende Gruppe soll danach als Adsorptionszentrum ausgenutzt werden, oder nach geeigneter Derivatisierung so genutzt werden, daß die Bindungsbrücke das Zentrum für die Wechselwirkung ausmacht, oder die eingeführten Substituenten oder Gruppen in der Substituentenstruktur nach geeigneter und endgültiger Derivatisierung das Zentrum für die Wechselwirkung ausmachen können.

In diesem Zusammenhang sind Thiole präparativ äußerst interessante funktionelle Gruppen, die sogar in wasserhaltigen Systemen unter milden Bedingungen vielfältigen Reaktionen unterliegen. In verschiedenen Reaktionsmechanismen sind Thiolgruppen in Substituenten-, Additions-, Oxydations-, Komplex- und Salzbildungsreaktionen unter Bildung von S-C, S-S, S-O, S-N, S-Metall und S-Metall-C-Strukturen beteiligt. Es sei hierbei außerdem bemerkt, daß Thiolgruppen leicht Reaktionen über Radikalmechanismen unterliegen.

In der biochemischen Separationstechnik haben Agarosegele, insbesondere in Perlenform, als Trägergele eine bedeutende Rolle gespielt. Die rasche Entwicklung der biospezifischen Affinitätschromatographie während der letzten Jahre hat sich fast ausschließlich auf Agarosegele in Perlenform gestützt. Hierbei hat es sich oft als günstig erwiesen, wenn das Zentrum des chromatographischen Mittels für die Wechselwirkung sich auf einem Arm oder Spacer befindet, mit gewissem kleinsten Abstand zum Polymerskelett des Trägerpolymers. Andere hydrophile, hydroxylgruppenhaltige Polymere sind in diesem Zusammenhang ebenfalls in gewissem Maße zur Anwendung gekommen, z. B. vernetztes Dextran.

Thiolgruppensubstituierte Agarosegele wurden von Custrecasas, J. Biol. Chemistry, 245, 3059 (1970) hergestellt aus ω-Alkylderivaten der Agarose durch Reaktion mit Acetyl-Homocystein-Thiolacton. Die thiolierten Produkte wurden nach weiterer Derivatisierung als Adsorbens für Bioaffinitäts-Chromatographie verwendet. Der Herstellungsweg für die Thiolprodukte nach dieser Literaturstelle ist kompliziert und aufgrund der verwendeten Reagentien sehr kostenaufwendig. Außerdem werden Thiolprodukte erhalten, die nur einen geringen Schwefelgehalt besitzen. Brocklehurst et al., Biochem. J. 133, 573 (1973) hat thioliertes Agarosegel durch direkte Kupplung von Glutathion an bromcyanaktiviertes Agarosegel, ohne die Thiogruppe zu schützen, hergestellt. Auch diese Methode ist teuer und führt nur zu Produkten mit niedrigen Schwefelgehalten. Eldjarn et al., Acta Chem. Scand. 17, 2610 (1963) hat thiolierte Gele mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran hergestellt, indem er das Gel durch Behandlung mit Aminoäthylsulfat mit Aminogruppen substituierte und danach mit Acetyl-Homocysterin-Thiolacton reagieren ließ. Nach Behandlung mit bifunktionellem Quecksilberreagenz benutzte man die Produkte zum Isolieren von Thiolproteinen aus Proteinen ohne Thiolgruppen. Diese Produkte sind niemals zu einer kommerziellen Anwendung gelangt.

Aus der DE-OS 20 41 636 sind ebenfalls sulfhydrylgruppenhaltige Polysaccharide mit anderen als den erfindungsgemäßen Seitenketten bekannt. Dabei erfolgt die Sulfhydrierung jedoch aus den halogenoxyalkylierten Produkten, die mit Epoxiden unter Säurekatalyse hergestellt sind. Polysaccharide werden jedoch durch diese sauren Bedingungen negativ beeinflußt, da Veränderungen am Polysaccharidgerüst stattfinden. Dies führt zu Produkten schlechter Qualität, die zusätzlich noch Reste an unerwünschtem Halogen enthalten.

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, Thiopolymere, die die Nachteile des Standes der Technik überwinden, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung zur Verfügung zu stellen. Somit soll das Polymer so hergestellt sein, daß das Polysaccharidgerüst geschont wird und die Halogenatome der für den Aufbau der Seitenkette verwendeten Verbindungen nicht in das Produkt gelangen. Andererseits soll das Produkt einen ausreichend hohen Schwefelgehalt besitzen und so kostengünstig sein, daß ein wirkungsvoller kommerzieller Einsatz der Produkte für eine qualifizierte Chromatographie möglich wird.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Polymer mit Thiogruppen enthaltenden Seitenketten aus einem gelförmigen, wasserunlöslichen Polymeren, ausgewählt aus Agar, Agarose, Cellulose, mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran, Polyvinylalkohol, teilweise hydrolysiertem Copolymer von Vinylacetat und Vinylchlorid oder einem aminosubstituierten Polyacrylamid, bei dem an die Hydroxy- oder Aminogruppe organische Seitenketten der allgemeinen Formel

-CH₂-CH(OH)-CH₂-O-(1,3-Butylen)-O-CH₂-CH(OH)-CH₂-Y
oder
-CH₂-CH(OH)-CH₂-O-(CH₂)₄-O-CH₂-CH(OH)-CH₂-Y
oder
-CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂-Y
oder
-CH₂-CH(X)-CH₂-Y

gebunden sind, wobei jedes X und Y unabhängig voneinander eine Thiosulfatgruppe oder eine Thiolgruppe oder eine Disulfidgruppe sind und wobei im Fall der letzten allgemeinen Formel für die Seitenketten ein nicht als Thiosulfat, Thiol oder Disulfid vorliegender Rest X oder Y Wasserstoff oder Hydroxyl sein kann.

Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polymeren ist dadurch gekennzeichnet, daß ein wasserunlösliches Polymeres, das aus Agar, Agarose, Cellulose, mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran, Polyvinylalkohol, einem teilweise hydrolisierten Copolymer aus Vinylacetat und Vinylchlorid oder einem aminosubstituierten Polyacrylamid ausgewählt ist, in alkalischer Lösung mit Epihalogenhydrin, 1,3-Butandiol-diglycidyl-äther oder 1,4-Butandiol-diglycidyl-äther, Divinylsulfon oder 2,3-Dihalogenpropanol oder mit Allylhalogenid und anschließend Halogen umgesetzt wird, und daß dann das Reaktionsprodukt mit einer wäßrigen Lösung von Thiosulfat, Natriumhydrogensulfid oder Natriumsulfid behandelt wird.

Dabei ist es vorteilhaft, wenn ein Produkt, das mit einer Thiosulfatlösung behandelt wurde, anschließend mit einer Lösung eines die Thiosulfatgruppen zu Thiolgruppen reduzierenden Reagens behandelt wird. Insbesondere können als reduzierende Reagentien 1,4-Dimercaptobutan oder Threo- oder Erythro-1,4-dimercapto-2,3-butandiol eingesetzt werden.

Die Polymeren nach der Erfindung können besonders vorteilhaft zum Reinigen von Wasser von Schwermetall-Ionen und organometallischen Verbindungen, ggf. unter Isolieren derselben, oder auch zum Schutz von biologischen Lösungen gegen mikrobiologisches Wachstum verwendet werden.

Agar- und Agarosederivate mit Seitenketten der Terminalstrukturen -CH(OH)-CH₂(SH), -CH(SH)-CH₂(OH), -CH₂-CH₂(SH), -CH(SH)-CH₃ oder -CH(SH)-CH₂(SH) können, ohne daß man das Gelnetzwerk der Gelperlen zerstört, aus perlenförmigen Agar- und Agarosegelen präpariert werden. Man behandelt die Ausgangsgele zunächst auf bekannte Weise mit Epihalohydrin, 2,3-Dihalopropanol, 1,3-Butandiol-diglycidyläther oder 1,4-Butandiol-diglycidyl-äther, Divinylsulfon oder Allylhalogenid mit darauffolgender Halogenierung in Dihalopropyläther gemäß nachstehendem Reaktionsschema 1, 2, 3 und 4.

Die derartig erhaltenen reaktiven Derivate werden daraufhin mit einer wäßrigen Lösung von NaSH, Na₂S oder Na₂S₂O₃ sowie im letzteren Falle abschließend mit einem geeigneten Reduktionsmittel, beispielsweise 1,4-Dimercaptobutan und dessen Derivaten behandelt, wobei besonders Threo- oder Erythro-1,4-Dimercapto-2,3-Butandiol Vorzüge aufgewiesen haben. Diese Derivate werden nachstehend Dithiothreitol bzw. Dithioerythreitol benannt. Wird Epihalohydrin, Dihalopropanol oder Allyhalogenid angewendet, vollzieht sich eine Überbrückung zwischen dem polymeren Gelnetzwerk und der vorgenannten Terminalstruktur über -O-CH₂-Glieder. Bei der Anwendung der im Anspruch 2 genannten bifunktionellen Oxirane erhält man direkt einen Arm- oder Spacer-Effekt, indem Substituenten langkettiger Natur folgendermaßen ausgebildet werden: -O-CH₂-CH(OH)-CH₂-O-(Alkyl)-O-CH₂-terminale Gruppe. Bei Divinylsulfon ergibt sich als Anbindungsstruktur die -O-CH₂-CH₂-SO₂-terminale Gruppe. Diese Reaktionen können auch auf Polyvinylalkohol, partiell hydrolysiertem Copolymer aus Polyvinylchlorid-Polyvinylacetat, Cellulose und epichlorhydrinquergebundenem Dextran, z. B. Sephadex® der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Upsala, ausgeführt werden, jedoch gleichfalls auf aminogruppensubstituierten Polyacrylamiden.

In gewissen Fällen wünscht man, daß das Polymer permeabel ist, in Gelform, in anderen Fällen ist dies weniger vorteilhaft.

Es hat sich in der Praxis als vorteilhaft erwiesen, um den abgetrennten und auf Lager geführten Produkten eine größere Beständigkeit gegen oxidative Einwirkung zu geben, die Thiopolymere in Form von primär gebildeten Thiosulfatpolymeren oder durch teilweise Oxydation gebildeten Disulfiden, -S-S-, zu lagern und zu verkaufen. Diese Produkte können, zwecks Anwendung in Thiolform, einfacherweise mit einer Lösung aus Dithiothreitol reduziert werden. Eine derartige reduktive Behandlung kann auch bei einem länger gelagerten Thiopolymer angebracht sein.

Die erfindungsgemäßen Thiolgele können bei ungefähr pH 7 mit beispielsweise Jodacetamid und 2,4-Dinitrofluorbenzol alkyliert und aryliert werden. Die Addition von Thiolen an eine C=C-Doppelbindung führt auch zu Thioätherstrukturen. Die nukleophile Addition ist normalerweise träge, viele biologische Verbindungen enthalten jedoch Doppelbindungen, die durch Konjugation oder Vicinalgruppeneffekte aktiviert sind. Schwefeladdukte sind somit von α,β-ungesättigten Aldehyden, Ketonen, Lactonen, Nitrilen und Äthern aus zugänglich. Chinoide Strukturen sind im Zusammenhang mit Naturprodukten antreffbar und die Addition von Thiolen an Chinone ist ein interessanter Fall. In chromatographischer Hinsicht sind die Thioätherstrukturen stabil.

Reaktionen des obigen Typs, die zu stabilen Thioäthern führen, machen die Thiolgele äußerst geeignet für Spezialpräparationen von biospezifischem Adsorbens, Adsorbens für hydrophobe Affinitätschromatographie, Adsorbens mit auf Charge-Transfereffekten basierten Eigenschaften, sowie als Ausgangsgele zur Einführung neuer, chemisch reaktiver funktioneller Gruppen für Chemisorption, kovalente Chromatographie, chemisches Immobilisieren und Modifizieren.

Addition und Kondensation der Thiole an Aldehyde und Ketone führen zur Hemimercaptal-, Mercaptal-, Hemimercaptol- und Mercaptol-Bildung, was ein denkbares Prinzip für reversible Chemisorption ausmacht.

Die verschiedenen Verfahren zur Herstellung von Thiosulfat bzw. Thiolpolymeren gehen aus den nachstehenden Reaktionsformeln hervor.

Reaktionsschema 1A. Herstellung von Thiolagarose mittels Epichlorhydrin und Natriumhydrogensulfid.

Reaktionsschema 1B. Herstellung von Thiolpolymer mittels Epichlorhydrin und Thiosulfat.

Reaktionsschema 2. Herstellung von Thiolagarose mittels 1,4-Butandiol-Diglycidyläther, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol (DTT). Die Thiosulfatverbindung kann dabei abgetrennt und als lagerungsbeständiges Produkt verkauft werden, das einfacherweise zur Thiolherstellung bzw. wie nachstehend zur Herstellung von reaktivem Polymer zum Fixieren von thiolhaltigen Stoffen herangezogen werden.

Reaktionsschema 3. Herstellung von Thiolagarose mittels Divinylsulfon, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol (DTT).

Reaktionsschema 4. Herstellung von Thiolagarose mit Allylbromid, Brom, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol.

Als in diesem Zusammenhang interessante Thio-Verbindungen der verschiedenen Polymere kann man Thioester der Carbonsäuren nennen, die nach konventioneller Technik synthetisiert werden können. Sie unterscheiden sich in vieler Hinsicht von den Estern der Alkohole. Ihre Bedeutung in chromatographischem Zusammenhang ist noch nicht vollständig erwiesen worden. Thioester sind in biologischen Systemen von großer Bedeutung. Sie sind u. a. Hochenergieverbindungen, gute Acylierungsreagentien und die Strukturen aktivieren den α-Kohlenstoff an der Acylgruppe. Immobilisierte Thioester dürften deshalb in verschiedenem biotechnologischem Zusammenhang interessant sein, beispielsweise als in Wasser nicht lösliche Reagentien zur Acylierung von Proteinen.

Sehr interessant ist, daß die Thiole leicht oxydieren. Bei den vielen Oxydationsprodukten spielen Disulfide eine besonders wichtige Rolle. Im Vergleich zu Thiolgruppen sind die Disulfidstrukturen üblicherweise nicht besondes reaktiv, sie können allerdings sogar unter physiologischen Bedingungen Reduktions- und Austauschreaktionen unterlaufen. Die Reduktion von Disulfid kann mit Thiol geschehen und die Thiol-Disulfidaustauschreaktion ist außerordentlich bedeutungsvoll in biologischen Systemen.

Bei der Reduktion von -S-S-Bindungen mit polymerfixierten Thiolgruppen sind allerdings hochsubstituierte Thiolpolymere erforderlich. Diese können vorteilhafterweise angewendet werden, wenn man beispielsweise Disulfidproteine zu Thiolproteinen reduzieren will. Dabei erhält man im Polymer Disulfidbrücken, die durch Reduktion mit z. B. dem vorgenannten Reduktionsmittel Dithiothreitol in die Thiolform zurückgeführt werden können.

Enzyme enthalten des öfteren Thiolgruppen und in vielen Fällen sind eines oder mehrere direkt mit den Aktivitätseigenschaften verknüpft. Gewisse Plasmaproteine wie Albumin und Zeruloplasmin enthalten somit Thiolgruppen. Subzellulare Partikel enthalten proteingebundene Thiolgruppen wie auch andere Typen von Thiolen. Die meisten Proteine enthalten allerdings -S-S-Brücken, die, wie vorgenannt, leicht in Thiole überführt werden können unter Zuhilfenahme von geeigneten hochsubstituierten Thiolpolymeren des beispielsweise in dieser Anmeldung beschriebenen Typus.

Andererseits können Thiolpolymere leicht in Polymere überführt werden mit für die Disulfid-Thiol-Ausbeute stark reaktiven Disulfidgruppen. Wird ein derartiges Polymer mit einem Thiolprotein umgesetzt, erhält man polymeres -S-S-Proteinpolymer. Man kann allerdings, wie nachfolgend erläutert wird, ein Thiolpolymer auch andersartig aktivieren, indem man es leicht an eine thiolhaltige Verbindung fixieren kann.

Thiolpolymere sind, entweder direkt oder nach Überführung auf hierzu geeignete Disulfidstrukturen oder dergleichen, mit Vorteil bei der Chemisorption von Naturproduktmischungen, beispielsweise zur Separation von Proteinen, verwendbar.

Diejenigen Disulfidpolymere, die zu einer raschen und vollständigen Reaktion mit einer Thiolkomponente in der Lösung führen, nennen wir "reaktive" Polymerdisulfidstrukturen. Prinzipiell können diese intern sein und die erhöhte Reaktivität dürfte dann der konformationellen Spannung zuzuschreiben sein, insbesondere der Ringspannung oder, was am wichtigsten erscheint, extern, d. h. des Typus Polymer-S-S-L, wo die Reaktivität durch den Liganden L bedingt wird. Dieser Ligand L muß, damit sich die Reaktion Disulfid-Thiol möglichst vollständig in Gegenrichtung zur Überführung der Thiolgruppe in die Disulfidgruppe vollzieht, derartige Eigenschaften haben, daß beim Aufspalten der S-S-Brücke der zu L gehörende Schwefel durch Tautomerie oder Resonanz in bezug auf die Thiol/Disulfidausbeute auf niedrige Nukleophilität gebracht wird. Als Beispiele für derartige S-S-Verbindungen können gemischte Verbindungen zwischen SH-Polymer und LSH genannt werden, für welche das Gleichgewicht LSH ⇄ L^- = S gilt, wobei die Thionform überwiegt. Ein Beispiel für L ist 2-Thiopyridon. Ein weiteres Beispiel sind S-S-Strukturen, erhalten aus Thiopolymer und Dithiocarbonsäurederivaten, wobei eine Resonanzstruktur die Ursache zur Irreversibilität der Abspaltung sein kann. Als Beispiel wird Tetramethylthiuramdisulfid genannt.

Derartige ligandisierte Thiolpolymere können aus Thiolpolymeren durch Reaktion mit L-S-S-L hergestellt werden, wobei die Reaktion so gesteuert werden kann, daß sie sich auf dem Thiolgel bis praktisch zur stöchiometrischen Umsetzung von Polymer-S-S-L durch Thiol-Disulfidausbeute vollzieht. Die "Triebkraft" beruht hierbei analog dem vorgenannten, auf L betreffs Ausnutzung der Polymer-S-S-L-Reaktion mit einer Thiol-Verbindung in Lösung.

Es wurde gefunden, daß die Ligandisierung von Thiolpolymeren auch direkt durch Behandlung des Thiosulfatesterpolymeren mit L-S-S-L-Reagenz vollzogen werden kann, ohne daß hierbei zuerst eine Reduktion des Thiosulfatesterpolymers zu Thiolpolymer vorgenommen wurde. Dies bedeutet einen erheblichen technischen und ökonomischen Fortschritt, weil hierbei vom lagerungsbeständigen Thiosulfatpolymer ausgegangen werden kann und man in einer einzigen Reaktionsstufe mit praktisch theoretischer Ausbeute das stark reaktive Polymer-S-S-L-Produkt bei Anwendung der beispielsweise vorgenannten Disulfidverbindungen erhalten kann. Ein ganz anderes Verfahren zur Herstellung von Polymerdisulfidliganden der hier vorgesehenen Art z. B. des Typus Polymer-S-S-Prot (wobei Prot=Protein) besteht darin, daß ein Polymer-Sulfenylderivat mit einem Proteinthiol zum Reagieren gebracht wird. Ein derartiges Sulfenylderivat erhält man beispielsweise durch Reaktion zwischen einem Polymer-Thiol und Azodiäthylcarboxylat gemäß der schematischen Formel 1), wonach die Reaktion mit dem Proteinthiol gemäß 2) durchgeführt werden kann:

Äthylcarboxylatgruppen können durch andere Carboxylatgruppen oder durch andere elektronenanziehende Gruppen überhaupt, ersetzt werden. Die Reaktion, wenn es um die Immobilisierung eines Thiol-Proteins geht, besteht also in diesem Fall aus zwei Stufen, wobei zuerst die Aktivierung des Thiolpolymeren zu einem Alkylsulfenylhydrazid vollzogen wird. Dieses ist lagerungsstabil in wäßrigem Milieu und kann daraufhin bei milden Bedingungen sogar bis zu schwach saurem Milieu, z. B. pH=4 oder weniger, mit einer gelösten Thiolverbindung unter Bildung eines Polymer-S-S-Prot oder analogen Produktes umgesetzt werden. In obigen Diskussionen wurde HS-Prot als Beispiel für eine schaltbare Thiol-Verbindung angegeben. Dies darf selbstverständlich nicht eine Begrenzung bedeuten, da die Prozesse mit beliebigen gelösten Thiol-Verbindungen durchgeführt werden können, jedoch auch mit Partikeln wie Zellfragmenten, Viren, vorausgesetzt, daß diese auf der zugänglichen Oberfläche -SH-Gruppen (natürliche oder durch Eingriff hervorgerufene) enthalten.

Die Entwicklung der biospezifischen Technik in der Biochemie ist größtenteils parallel zu der Entwicklung der in Wasser nicht löslichen Enzyme verlaufen. Die üblichen Methoden zum Immobilisieren von Enzymen enthalten kovalente Bindung oder Adsorption an Polymerträger. Eine besonders interessante Möglichkeit ist die obengenannte Immobilisierung des Enzyms durch Disulfidbindung. Diese Bindung läßt sich bei geeigneten, reduzierenden Bedingungen abspalten. Eine Säule aus immobilisiertem Enzym, das nach einiger Zeit seine Aktivität verloren hat, kann daraufhin in situ regeneriert werden durch reduktives Abspalten von inaktiviertem Enzym und eine erneute Schaltung von frischem Enzym kann im Säulenreaktor vorgenommen werden, fortsetzenderweise in situ, nachdem eine neue Aktivierung des Polymers vollzogen wurde.

Ein anderer Typus der reversiblen Immobilisierung des Enzyms, die in letzter Zeit zur Anwendung gekommen ist, gründet sich auf eine hydrophobe Wechselwirkung zwischen Enzym und einem gemischten hydrophil/hydrophoben Trägerpolymer. Eine derartige Immobilisiertechnik hat bedeutende Vorteile, weil man das Enzym, nachdem es ganz oder teilweise seine Aktivität verloren hat, üblicherweise vom Polymer abspalten kann, indem man den Salzgehalt ändert oder das Milieu. Die genannte Abspaltung des inaktivierten Proteins kann zeitweise Schwierigkeiten bereiten. Eine Möglichkeit hierbei ist, dem hydrophilen Polymer die hydrophobe Struktur anzuschließen, beispielsweise eine hydrophobe Struktur von Alkylmercaptanen, über eine Disulfidgruppe zu immobilisieren, und die Abspaltung des Enzymproteins durch Reduktion der Disulfidgruppen geschehen zu lassen und dabei eine gleichzeitige Abspaltung der Enzym-Alkylstruktur zu erhalten.

Es scheint allerdings möglich zu sein, formelmäßig die vorgenannten Methoden zur Immobilisierung von thiolhaltigen Stoffen auf einem Thiopolymer, beispielsweise Thiol- oder Thiosulfidpolymer, folgendermaßen zusammenzufassen: Es gilt zunächst ein reaktives Polymerderivat herzustellen mit der allgemeinen Formel

P-S-Y

wobei PS in den Polymeren P-SH bzw. PS-SO₃Na enthalten ist wie in dieser Anmeldung angegeben wird, während Y eine Gruppe bezeichnet, die so bestimmt ist, daß man durch die Reaktion

P-S-Y + H-S-Prot ⇄ P-S-S-Prot + Z

(wobei H-S-Prot eine thiolhaltige organische Verbindung, z. B. ein Protein oder ein thiolhaltiges Teilchen ist) ein Produkt Z erhält, das nicht nennenswert imstande ist, unter den vorherrschenden Bedingungen die angegebene Reaktion in Gegenrichtung zu treiben. Die Y-Gruppe erfüllt diese Anforderungen auf mindestens zwei verschiedenen Wegen.

a) Gewisse Disulfide des Typus A-S-S-A sind, wie wir festgestellt haben, imstande mit einem Thiosulfat- oder Thiolpolymer zu reagieren unter Bildung eines reaktiven Disulfidpolymers gemäß der allgemeinen Formel (1)

(1) P-S-H + A-S-S-A ⇄ P-S-S-A + Z′

wobei Z′ unmittelbar in ein Thion/Thiolgleichgewicht eingeht, das weit zur Thionform hin verschoben sein muß.

Anstelle des P-S-H-Polymers kann man direkt ein P-S-SO₃Na-Polymer, d. h. ein Thiosulfatpolymer verwenden, also (2)

(2) P-S-SO₃Na + A-S-S-A ⇄ P-S-S-A + Z′′

wobei Z′′ die gebildeten Reaktionsprodukte angibt, welche, wie auch Z, der Reaktion in gegensätzlicher Richtung entzogen werden sollen.

Ferner werden Reaktionen zwischen den reaktiven Disulfidpolymeren und einer gelösten Thiolverbindung, beispielsweise einem thiolhaltigen Protein nach Formel

P-S-S-A + HS-Prot ⇄ P-S-S-Prot + Z

durchgeführt. Das erhaltene Polymer-Protein kann, wie oben genannt, durch ein geeignetes Reduktionsmittel in P-S-H+Prot-Rest abgespalten werden.

b) Azodicarboxylate der Formel R₁-N=N-R₁ geben beim Kontakt mit einem Thiolpolymer ebenfalls aufgrund der elektronenanziehenden Eigenschaften der R₁-Gruppen mit thiolhaltigen Verbindungen stark reaktive Polymere der Formel

d. h. unter Bildung eines Hydrazids in Lösung, das die Reaktion nicht rückwärts führen kann.

Es ist beachtenswert, daß trotz dessen Reaktivität die aktivierten Polymere beider genannter Typen separiert, gewaschen und gelagert werden können, ohne daß sich die Aktivität nennenswert verringert. Die Schaltung von beispielsweise H-Prot kann bei einer späteren Gelegenheit vorgenommen werden. Enzyme, die keine Thiolgruppen, sondern Disulfidstrukturen enthalten, können mit hochsubstituiertem Thiolgel reduziert werden, wonach man die gebildeten Thiole zum Immobilisieren verwendet oder man kann das Enzym durch ein geeignetes Thiolreagens in Lösung mit Thiolgruppen substituieren, die danach zum Immobilisieren benutzt werden. Umsetzungen mit polymergebundenen Thiolgruppen, die zu stabilen Thioätherstrukturen führen, können ebenfalls beim Immobilisieren von Enzymen Anwendung finden, weil das Polymer dadurch mittels geeigneter Reagentien mit neuen funktionellen Gruppen oder Adsorptionszentren versehen werden kann, die direkt oder mit einem geeigneten Reagens kovalent an eine funktionelle Gruppe im Enzym gebunden werden können oder das Enzym adsorbieren.

Beim Immobilisieren eines Enzyms ist nicht nur das Immobilisieren an sich von Bedeutung. Bedeutungsvoll ist oft die beim Einführen derartiger funktioneller Gruppen auf das polymere Netzwerk, die das Enzym zur erhöhten Stabilität anregen oder den Bestandteil im Substrat-Produkt-Inhibitorsystem beeinflussen, erhaltene erhöhte katalytische Aktivität. Da sich Reaktionen mit Thiolgelen unter sehr milden Bedingungen in wäßriger Lösung vollziehen, können derartige zusätzliche Reaktionen auch nach dem Immobilisierprozeß durchgeführt werden.

Eine analoge Methodik kann beim Immobilisieren von Mikroorganismen, Zellen, subzellularen Partikeln, Membranfragmenten, Receptor-Sites angewendet werden.

Die fraglichen Thiolpolymere verwendet man für verschiedene andere Zwecke in biologischem Zusammenhang. Ihre Metall-Komplexbildungs- und Elektronenaustauscheigenschaften können angewendet werden, um Thiolgruppen enthaltende biologische Systeme vor der Selbstoxydation zu schützen, indem man das biologische System zusammen mit Thiolgel aufbewahrt. Es ist bereits bekannt, daß die Autooxydation des Thiols durch gewisse Metallionen wie Cu⁺⁺ und dem entsprechenden Oxydationsprodukt, d. h. Disulfid, katalysiert wird. Kontinuierlicher Elektronenaustausch zwischen gebildetem Disulfid und Thiolgel hält die Thiolkonzentration in der Lösung konstant, bis der Elektronenaustauscher verbraucht ist.

Thiolpolymere können auch als Stützphase bei chemischen Abänderungen von Naturproduktsubstanzen verwendet werden. Die Bindung ans Polymer geschieht dabei durch die hydrolytisch stabile Disulfidbindung, die allerdings nach vorgenommenen Umsetzungen reduktiv abspaltbar sein kann. Da Naturproduktsubstanzen oftmals polyfunktionell sind, führen in homogener Phase durchgeführte Umsetzungen leicht zu intermolekularen Querbindungsreaktionen, die man verhindern könnte, wenn man die Umsetzung in der Polymerphase geschehen läßt. Eine weitere Möglichkeit, die unter milden Bedingungen verlaufende reduktive Abspaltung der Disulfid-Strukturen zu verwenden, ist, die eine Komponente in einem biologischen Assoziations-Dissoziationskomplex über die Disulfidstruktur an ein Thiolgel zu binden, wonach Adsorbat und Ligand zusammen abgespalten werden können. Dies ist besonders wertvoll, da ein spezifischer Assoziations-Dissoziations-Komplex eines heterofunktionellen Moleküls so ausgebildet wird, daß eine gewisse bemerkte biologische Aktivität aufgrund der beanspruchten Komplexbildung nicht nennenswert inhibiert wird.

Viele Metallionen und metallorganische Verbindungen bilden mehr oder weniger stabile Komplexe mit den hier beanspruchten Thiolgelen. Die Thiolgele können somit als in Wasser nicht lösliche Komplexbildner jedoch ebenfalls als Medium für die Chromatographie über Metallkomplex-Gleichgewichte beispielsweise zur Trennung von metallhaltigen Proteinen verwendet werden.

Die Erfindung wird an Hand der nachstehenden Ausführungsbeispiele und der Zeichnungen näher erläutert.

Fig. 1 zeigt die Reduktion von Amyloglykosidase mit Thiolagarosegel als Funktion von pH und

Fig. 2 die Regenerierbarkeit einer Kolonne mit aktiviertem Thiolagarosegel.

Beispiele Beispiel I Herstellung von oxiranaktivierten Agarosegelen mit verschiedenem Substitutionsgrad in bezug auf Oxiranstrukturen a) Mit Epichlorhydrin

3 g gewaschenes und abgesaugtes Agarosegel in Perlenform, 2-6% Agarose, wurden in 2,4 ml 1 M Natriumhydroxydlösung suspendiert. Man tropfte Epichlorhydrin unter Rühren bei Raumtemperatur hinzu und ließ die Temperatur danach bis 60°C ansteigen und rührte das Reaktionsgemisch 2 Std. lang. Das Gel wurde auf Glasfilter mit Wasser bis zur neutralen Reaktion gewaschen. Das Ergebnis ist aus Tabelle 1 ersichtlich.

b) Mit 2,3-Dibrompropanol

Man unternahm Versuche analog dem Verfahren a).

c) Mit 1,4-Butandiol-Diglycidyläther

3 g gewaschenes und abgesaugtes Agarosegel in Perlenform, 2-6% Agarose, wurden in 1,6 ml 2,5 M Natriumhydroxydlösung suspendiert, wonach man 12 mg Natriumborhydrid zusetzte. Das Bisepoxyd wurde tropfenweise unter kräftigem Rühren zugesetzt. Die Reaktionszeit betrug 6 Std. bei Raumtemperatur. Man wusch den Gel auf Glasfilter mit Wasser bis zur neutralen Reaktion, danach mit 20 ml Azeton und abschließend mit Wasser bis das Azeton abgetrieben war.

d) Mit 1,3-Butandiol-Diglycidyläther

Man unternahm die Versuche analog dem Verfahren c).

e) Bestimmung von gelgebundenen Oxiranstrukturen

Eine Gelmenge entsprechend 10-100 µäquiv. Oxiranstrukturen wurde gewaschen und in 10 ml dest. Wasser suspendiert. pH der Suspension wurde auf 7,00 eingestellt, wonach 1,00 ml der Gelsuspension in einen Titrierungsbehälter aus Kunststoff mit Kunststoffpipette überführt wurde. Beim Abpipettieren wurde die Suspension kräftig mit einem Magnetstäbchen umgerührt. 1,00 ml 2 M Natriumthiosulfatlösung mit pH 7,00 wurde der Gelsuspension zugesetzt, daraufhin wurde mit pH-Stat mit 50 m M Salzsäure kontinuierlich titriert. Die Titrierdauer betrug 30-120 Minuten und beruhte auf dem Oxirangehalt des Gels. Während der ganzen Titrierzeit wurde magnetisch umgerührt. Man bestimmte den Feststoff-Gehalt der Gelsuspension durch Abpipettierung von 5,0 ml der Suspension auf einen kleinen Glasfiltertrichter, danach wurde mit Azeton/Wassergemischen und Azeton gewaschen und 24 Std. bei 100°C im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.

Beispiel II Herstellung von divinylsulfonaktivierten Agarosegelen mit verschiedenem Substitutionsgrad in bezug auf Vinylsulfonstrukturen

Sepharose® 6B, ein perlenförmiges Agarosegel, ca. 6% Polysaccharid enthaltend, hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, wurde gewaschen und auf Glasfilter abgesaugt. 10 g des Agarosegels wurden in 10 ml 0,5 M Natriumcarbonatlösung mit pH 11 suspendiert, wonach man Divinylsulfon zusetzte und das System 70 Minuten unter Rühren reagieren ließ. Das Reaktionsprodukt wurde mit Wasser auf Glasfilter gewaschen. Danach analysierte man das Produkt hinsichtlich der Vinylsulfonstrukturen durch Reaktion mit überschüssigem Natriumthiosulfat und Titrierung auf gebildete OH^--Ionen mit Salzsäure nach Verfahren Ie). Die Resultate für die verschiedenen Divinylsulfonmengen sind aus Tabelle II ersichtlich.

Beispiel III Herstellung von 2,3-Dibrompropyläther-Agarosegelen mit variierendem Substitutionsgrad

100 ml gewaschenes und abgesaugtes, epichlorhydrinquergebundenes Agarosegel wurden mit 100 ml 5 M Natriumhydroxydlösung, die mit 500 mg Natriumborhydrid versetzt war, vermischt und danach setzte man der Suspension Allylbromid hinzu. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rückführkühlen bei kräftigem Umrühren während 4 Std. auf 70°C erhitzt. Nach der Reaktion wurde das Gel auf Glasfilter mit Wasser und Alkohol/Wassergemischen samt 96%igem Alkohol und Tetrachlorkohlenstoff gewaschen. Man suspendierte das Gel dann in 100 ml Tetrachlorkohlenstoff und Brom wurde bis zum beständigen Auftreten der Bromfarbe zugesetzt. Das bromierte Gel wurde auf Glasfilter mit Alkohol und Wasser gewaschen. Die Resultate wurden in Tabelle III zusammengefaßt.

Beispiel IV Herstellung von "Bunte Salz"-Agarosegelen mit variierendem Substitutionsgrad a) Herstellung von "Bunte Salz"-Agarosegelen aus epichlorhydrin-, 2,3-dibrompropanol-, 1,4-butandiol-diglycidyläther- und 1,3-butandiol-diglycidyläther-aktivierten Agarosegelen

3 g je abgesaugtes Gel von Ia), Ib), Ic) und Id) wurden mit 0,5 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,25, gewaschen. Man suspendierte das erneut abgesaugte Gel in 3 ml des gleichen Phosphatpuffers und setzte 3 ml 2 M Natriumthiosulfatlösung hinzu. Danach schüttelte man das Reaktionsgemisch 6 Std. bei Raumtemperatur, wonach mit Wasser gewaschen wurde. Ein derartiges Produkt wird "Bunte Salz"-Gel genannt. Die Schwefelanalysen gehen aus Tabelle I hervor.

b) Herstellung von "Bunte Salz"-Agarosegelen aus divinylsulfonaktivierten Agarosegelen

Die Herstellung erfolgt analog der Präparation aus epoxyaktivierten Gelen nach a). Die Schwefelanalysen sind aus Tabelle II ersichtlich.

c) Herstellung von "Bunte Salz"-Agarosegelen aus Dibrompropylätheragarosegelen

5 g aus wäßriger Suspension abgesaugte 2,3-Dibrompropylätheragarose wurden in einer Lösung von 3,75 g Na₂S₂O₃ · 5 H₂O gelöst in 5 ml Wasser suspendiert. Man ließ das Gemisch 5 Std. unter Umrühren bei 95°C reagieren, wonach das Gel auf Glasfilter mit Wasser gewaschen wurde, bis es salzfrei war. Die Schwefelanalyse ist aus Tabelle III ersichtlich.

Beispiel V Herstellung von Thiolagarosegelen mit variierendem Substitutionsgrad hinsichtlich der Thiolstrukturen durch Reduktion von "Bunte Salz"-Gelen mittels Dithiothreitol a) Von "Bunte Salz"-Gelen, erhalten mit Epichlorhydrin, 2,3-Dibrompropanol, 1,4-Butandiol-Diglycidyläther und 1,3-Butandiol-Diglycidyläther

"Bunte Salz"-Gel wurde auf Glasfilter gewaschen und abgesaugt. 3 g des Gels wurden in 0,3 M Natriumbicarbonatlösung auf ein Gesamtvolumen von 6 ml suspendiert. Ausgehend von der beschriebenen Oxirananalyse berechnete man die erforderliche Menge des Reduktionsmittels, Dithiothreitol, das in zumindest doppeltem Überschuß angewendet wurde. Dithiothreitol wurde in 3 ml 1 m M EDTA-Lösung gelöst und bei Raumtemperatur unter Umrühren 30 Minuten reagiert. Man wusch das Produkt auf Glasfilter mit 30 ml 0,1 mM Natriumbicarbonatlösung von 1 M bezogen auf Kochsalz und 1 mM auf EDTA, und wusch anschließend mit 100 ml 1 mM EDTA-Lösung.

Man bestimmte den Substitutionsgrad der Thiolgruppen mit 2,2′-Dipyridyldisulfid gemäß Brocklehurst et al., Biochem. J. 133, 573 (1973), jedoch mit 0,1 M Natriumbicarbonatlösung anstatt Tris-Puffer. Außerdem wurde die Schwefelanalyse vorgenommen und das Ergebnis in Tabelle I angegeben.

In Tabelle I sind die Ergebnisse des Thiolierens von 6%igem Agarosegel zusammengestellt, bei dem Agaroseperlen mit Epichlorhydrin, 2,3-Dibrompropanol, 1,4-Butandiol-Diglycidyläther und 1,3-Butandiol-Diglycidyläther auf verschiedenen Substitutionsgrad aktiviert wurden. Man hat das Oxiran-Gruppen enthaltende Gel mit Natriumthiosulfatlösung behandelt und das "Bunte Salz"-Gel mit Dithiothreitol reduziert. Man bestimmte den Schwefelgehalt im "Bunte Salz"-Gel und das erhaltene, thiolierte Gel und die Thiolgruppen sind mit 2,2′-Dipyridyldisulfid bestimmt worden.

Tabelle I

b) Von "Bunte Salz"-Gelen, erhalten aus divinylsulfonaktivierten Agarosegelen

Die Reduktion mit Dithiothreitol vollzog sich gleichermaßen wie oben unter a). Tabelle II zeigt die Analyseergebnisse vom Thiolieren 6%igen Agarosegels, das mit Divinylsulfon in bezug auf die Vinylsulfonstrukturen auf verschiedenen Substitutionsgrad behandelt wurde. Das aktivierte Gel wurde mit Natriumthiosulfatlösung behandelt und das erhaltene "Bunte Salz"-Gel mit Dithiothreitol reduziert.

Tabelle II

c) Von "Bunte Salz"-Gelen, erhalten aus 2,3-Dibrompropyläther-Agarosegelen

Die Reduktion mit Dithiothreitol erfolgte analog zu a) jedoch mit dreifach überschüssigem Reagenz berechnet auf Br-Analyse und mit einer einstündigen Reaktionsdauer. Die Bromanalysen, Schwefelanalysen und Thiolanalysen sind in Tabelle III aufgestellt zum Thiolieren von 6%igem, mit Epichlorhydrin vernetztem Agarosegel. Die vernetzten Agaroseperlen waren in bezug auf die Allylätherstrukturen mit Allylbromid auf verschiedenen Substitutionsgrad behandelt worden. Allyläthergel wurde mit Brom und 2,3-Dibrompropyläthergel mit Natriumthiosulfatlösung behandelt, wonach man das erhaltene "Bunte Salz"-Gel mit Dithiothreitol reduzierte.

Tabelle III

Beispiel VI Herstellung von Thiolagarosegelen aus oxiranaktivierten Agarosegelen mit Natriumsulfid

3 g des gewaschenen und abgesaugten 6%igen Agarosegels wurden in 2,4 ml 1 M Natriumhydroxyd suspendiert. Man setzte 0,35 ml Epichlorhydrin hinzu und behandelte analog dem Verfahren nach Ia). Der Oxirangehalt wurde auf 850 µäquiv./g trockenes Produkt bestimmt.

Aus Na₂S · 9 H₂O von der Firma Merck, Darmstadt, wurde eine 1 M Lösung aus Natriumsulfid in Wasser hergestellt und 3 g Oxirangel wurden bei Raumtemperatur und unter Rühren 2 Std. mit 15 ml der Natriumsulfidlösung behandelt. Der Thiolgehalt betrug 410 µäquiv./g trockenes Produkt.

Beispiel VII Derivatisieren von thiolierten Agarosegelen in Thioätherstrukturen

Bei nachstehenden Versuchen verwendete man thioliertes Agarosegel, das aus perlenförmigem, 6%igem Agarosegel durch Behandlung mit Epichlorhydrin, Natriumthiosulfat und Dithiothreithol hergestellt war. Der Thiolgruppengehalt betrug 650 µäquiv./g trockenes Produkt.

a) Reaktion mit Jodazetamid

1 g Gel wurde in 2 ml 0,1 M Natriumbicarbonatlösung suspendiert, mit pH 8,4, der 1 mM in bezug auf EDTA, zugesetzt war, um eventuell vorhandene Metallionen zu binden. Dann setzte man 1 ml Äthanol und 15 mg Jodacetamid hinzu und ließ 1 Std. bei Raumtemperatur reagieren. Das Produkt wurde mit Alkohol gewaschen und hatte danach einen Stickstoffgehalt von 584 µMol N/g Trockenprodukt.

b) Reaktion mit Dinitrochlorbenzol

1 g Gel wurde in einem Gemisch von 2 ml 0,1 M Natriumbicarbonatlösung, 1 mM in bezug auf EDTA und 2 ml Äthanol, suspendiert. Danach setzte man 15 mg 2,4-Dinitrochlorbenzol hinzu und ließ 1 Std. bei Zimmertemperatur reagieren. Das Produkt wurde mit Alkohol gewaschen. Die Stickstoffanalyse ergab 964 µMol N/g Trockenprodukt.

c) Reaktion mit Vinyl-2-Chloräthyläther

1 g Gel wurde in einem Gemisch von 25% Äthanol und 75% Wasser suspendiert. Danach setzte man 0,5 ml Vinyl-2-Chloräthyläther hinzu und ließ 2 Std. reagieren. Das Produkt wurde mit Alkohol gewaschen und hatte dann einen Chlorgehalt von 75 µMol Cl/g Trockenprodukt.

d) Reaktion mit Zimtaldehyd

1 g Gel wurde in 2 ml Wasser suspendiert, wonach man 1 ml Äthanol, 0,1 ml Triäthylamin und 0,1 ml Zimtaldehyd zusetzte und 5 Std. reagieren ließ. Gewaschen wurde mit Alkohol und Wasser und das Produkt ergab eine stark positive Reaktion mit Schiffs Reagenz (Aldehydreagenz).

e) Reaktion mit Akrolein

Die Reaktion wurde auf gleiche Art wie nach d) vollzogen, jedoch mit 50 µl Akrolein anstatt Zimtaldehyd. Die Reaktion mit Schiffs Reagenz war positiv.

f) Reaktion mit Benzochinon

2 g Thiolgel wurden in 1 ml 0,2 M Natriumacetatpuffer mit pH 5,6 suspendiert. 32 mg p-Benzochinon wurden in 1 ml Äthanol gelöst und mit der Gelsuspension vermischt. Die Reaktion vollzog sich bei Raumtemperatur unter Umrühren während 5 bis 20 Std. Die Produkte wurden mit Alkohol/Wassergemischen gewaschen.

Die Kupplungsfähigkeit der Benzochinon-Agarosegele wurde gegen N-Acetyl-L-Cystein getestet. Man suspendierte 1 g Chinongel in 1 ml Acetatpuffer mit pH 4,5 und setzte danach 50 mg N-Acetyl-L-Cystein zu. Nach einer Reaktionsdauer von 20 Std. bei Raumtemperatur wurde das Produkt gründlich gewaschen und getrocknet und dann auf Stickstoff analysiert.

Da das Benzochinon erwartungsgemäß mit Alkoholgruppen in der Gelmatrize reagiert, wurden analoge Versuche mit Agarosegel ohne Thiolgruppen vorgenommen. Das Ergebnis der Kupplung von N-Acetyl-L-Cystein an p-benzochinon-aktivierte Agarose und p-benzochinon-aktivierte Thiolagarose ist in Tabelle IV ersichtlich.

Tabelle IV

g) Reaktion mit Testosteron

1 g Gel wurde auf Filter mit einem Gemisch von 90% Äthanol in Wasser gewaschen. Man suspendierte das Gel in 2 ml des vorgenannten Äthanol/Wassergemisches. 50 mg Testosteron wurden der Suspension zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 15 Std. einer γ-Bestrahlung ausgesetzt. Nach dem Waschen stellte sich heraus, daß das Produkt 25 mg derivatisiertes Testosteron pro Gramm Trockenprodukt enthielt.

Man unternahm einen Blindversuch unter Ausschluß eines Lichtspenders. Eine Testosteron-Aufnahme konnte nicht festgestellt werden.

Beispiel VIII Anwendung von Thiolagarose als in Wasser nicht löslicher Komplexbilder a) Reaktion mit p-Chloroquecksilber-Benzoesäure

1 g Thiolagarose wurde in 0,3 M Kochsalzlösung suspendiert und pH auf 7,0 eingestellt. Die Suspension mit einem Gesamtvolumen von 20 ml wurde mit N₂-Gas gesättigt. Eine Lösung von 14,4 mg p-Chloroquecksilber-Benzoesäure in 0,3 M Kochsalzlösung wurde auf pH 7,0 und ein Gesamtvolumen von 10 ml eingestellt, 1,0 ml Gelsuspension wurde mit 1,0 ml der Reagenzlösung bei kontinuierlicher Zufuhr von 0,020 M Natriumhydroxydlösung bei pH 7,0 umgesetzt. Der Verbrauch an Lauge war 580 µäquiv./g Trockenprodukt.

b) Reaktion mit Cu⁺⁺

Man bereitete eine Lösung aus CuSO₄ · 5 H₂O in Wasser, destilliert in einer Quarzanlage, mit einer Cu⁺⁺-Konzentration von 0,125 mg/ml. Eine 3 ml Thiolagarosegel enthaltende Thiolagarosesäule mit einer Durchflutungsfläche von 0,75 cm² wurde mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Thiolagarose war mit Epichlorhydrin, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol hergestellt worden und hatte 500-700 µäquiv. SH-Gruppen/g Trockenprodukt. Cu⁺⁺-Ionen werden mit einem UV-Apparat bei 254 nm und einer Spot-Test-Reaktion mit dem Reagenz o-Tolidin/Ammoniumrhodanid in Azeton nach F. Feigl, Spot Tests in Inorganic Analysis, 5. Auflage, S. 84, registriert. Mit diesem Reagenz kann Kupfer bis zu einer Verdünnung von 1/5 · 10⁶ nachgewiesen werden. Wenn Kupferlauge durch die Thiolkolonne eingepumpt wurde, flossen 25,3 ml der Probelauge durch die Säule, bevor Cu⁺⁺ mittels Spot-Test-Reagenz im Eluat nachgewiesen werden konnte, was einer Aufnahme von 12,6 mg CuSO₄ · 5 H₂O entspricht. Adsorbiertes Kupfersulfat ist mit EDTA versetzbar.

c) Aktivierung von Hg-Papain

Das Enzym Papain enthält eine Thiolgruppe pro Molekül, wobei die Thiolgruppe für die Aktivität erforderlich ist. Das Papain wird oft als Quecksilberpapain geliefert und gelagert, bei dem die reaktive Thiolgruppe als Schutz beim Zubereiten einen Zusatz von HgCl₂ erhalten hat. Quecksilberpapain ist fermentativ inaktiv und wird normalerweise durch Zusatz einer Cystein/EDTA-Lösung aktiviert.

Thiolierte Agarose kann als Aktivator für Quecksilberpapain angewendet werden. Die Aktivität des aktivierten Enzyms zu Benzoyl-L-Arginin-Äthylester oder Kasein berechnet beträgt 80-90% der Aktivität, die bei der Verwendung von einer Lösung Cystein/EDTA als Aktivator erreicht wird.

Beispiel IX Anwendung hochsubstituierter Thiolagarose als Reduktionsmittel a) Methylenblau

Methylenblau bildet rotglänzende Kristalle, die sich leicht in Wasser zu einer blauen Farbe lösen und bei der Reduktion in farbloses Leukomethylenblau übergehen.

In einem Reagenzglas wurde 1 g Thiolagarose, ungefähr 50 µäquiv. Thiolgruppen entsprechend, in 3 ml 0,1 M Natriumbicarbonatlösung, von außerdem 0,3 M in bezug auf Kochsalz und 1 mM in bezug auf EDTA, suspendiert. Die Suspension wurde mit H₂-Gas ausgeglichen und 1 ml, 25 mM, Methylenblau-Lösung zugesetzt. Die Entfärbung vollzog sich in 10-15 Minuten. Der H₂-Gasausfluß wurde während der Reaktion beibehalten.

b) Reduktion der Disulfidverbindung in Chymotrypsin

Man bereitete eine Lösung von Chymotrypsin in 1 mM HCl mit 25 mg/ml. Eine Säule von 15,4 ml mit hochsubstituierter Thiolagarose, die aus 6%iger Agarose durch Behandlung mit Epichlorhydrin, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol hergestellt war, wurde vorbereitet. Der Substitutionsgrad der Thiolgruppen betrug etwa 800 µäquiv./g Trockenprodukt. 1 ml der Chymotrypsinlösung wurde mit 1 ml 0,1 M Natriumbicarbonatlösung vermischt, von außerdem 1 mM in bezug auf EDTA, und mit einer Flußgeschwindigkeit von 15 ml/h durch die Säule geleitet. Das durch die Säule gelaufene Chymotrypsin wurde mit überschüssiger Jodessigsäure umgesetzt und das Reaktionsgemisch mittels Gelfiltration auf Sephadex® G10 von der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, entsalzt. Jodessigsäure reagiert mit Thiolgruppen und Thioäthercarbonsäure von Cystein und ist durch Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse mengenmäßig bestimmbar. Nicht reduziertes Chymotrypsin wurde ebenfalls mit Jodessigsäure behandelt. Die Probe wurde gelfiltriert und der Aminosäureanalyse unterworfen. Das Ergebnis geht aus nachstehender Tabelle hervor:


Gehalt an S-Carboxymethyl-Cystein, µäquiv./25 mg Protein
Chymotrypsin
0
Reduziertes Chymotrypsin	2,5

c) Reduktion der Amyloglykosidase

2,7 ml hochsubstituiertes Thiolagarose gleicher Vorbereitung wie unter b) wurden in eine Kolonne mit einem Durchmesser von 18 mm aufgefüllt. Lösungen von Amyloglykosidase, Sigma Grade II, mit einer Konzentration von 0,1% Gewicht/Volumen wurden in folgenden Puffersystemen bereitet:

50 mM Natriumacetat, pH 3,5
50 mM Natriumphosphat, pH 5,5
50 mM Natriumphosphat, pH 7,5
50 mM Natriumbicarbonat, pH 9,5

Sämtliche Laugen waren außerdem 1 mM in bezug auf EDTA und mit N₂-Gas gesättigt. Man ließ die Enzymlaugen mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/h die Kolonne durchströmen. Man entnahm vier Proben von je 2,5 ml und bestimmte den Gehalt an SH-Gruppen mit 2,2′-Dipyridyldisulfid. Zwei Proben wurden als Blindproben verwendet. Man maß den Thiolgehalt teils unmittelbar, teils nach 2 Std. Die Ergebnisse sind im Diagramm in Fig. 1, die die Reduktion der Amyloglykosidase mit Thiolagarosegel als Funktion des pH-Wertes zeigt, zusammengefaßt. Der Gehalt an Thiolgruppen des reduzierten Enzyms wurde sofort nach dem Passieren durch die Kolonne und nach zweistündigem Aufbewahren der Enzymlösung bestimmt.

Beispiel X Immobilisierung der Enzyme durch Fixieren an Thiolagarose durch Thioldisulfidaustauschreaktionen a) Herstellung von 2-Pyridindisulfidagarose

Perlen aus 2%igem Agarosegel wurden mit Epichlorhydrin vernetzt. 180 g der gewaschenen und abgesaugten Agaroseperlen wurden in 142 ml 1 M Natriumhydroxidlösung suspendiert, die Suspension mit 5 ml Epichlorhydrin versetzt und die Reaktion ließ man 1 Stunde bei 60°C verlaufen. Man wusch das Gel und suspendierte es in 180 ml 0,5 M Phosphatpuffer, 20,5 g NaH₂PO₄ · H₂O, 14,0 g Na₂HPO₄ · 2 H₂O in 0,5 l Lösung. Daraufhin wurden 180 ml einer 2 M Natriumthiosulfatlösung zugesetzt und 6 Std. bei Raumtemperatur reagiert. Man wusch das Produkt mit Wasser und reduzierte mit 216 g Dithiothreitol, gelöst in 180 ml 0,1 M Natriumbicarbonatlösung von außerdem 1 mM in bezug auf EDTA. Das Produkt wurde mit 1 M Kochsalzlösung gewaschen, 1 mM in bezug auf EDTA, ferner mit 1 mM EDTA-Lösung und abschließend mit 50%iger Azeton-Wasserlösung. 4 g Pyridindisulfid wurden in 180 ml 50%iger Azeton/Wasserlösung gelöst und mit dem Gel vermischt, woraufhin man die Reaktion 30 Minuten bei Raumtemperatur verlaufen ließ. Man wusch das Produkt auf Glasfilter mit 50%igem Azeton und schließlich mit 1 mM EDTA-Lösung. Die Analyse ergab, daß der Oxirangehalt nach der Epichlorhydrinbehandlung 80 µäquiv./g Trockenprodukt betrug und der Gehalt an 2-Pyridindisulfidstrukturen, anhand der N-Analyse, 50 µäquiv./g Trockenprodukt ergab.

b) Immobilisieren von Amyloglykosidase

Amyloglykosidase wurde mit hochsubstituierter Thiolagarose, wie oben unter IXc) beschrieben, reduziert. Die Reduktionskolonne hatte eine Länge von 11 cm und enthielt 17 ml aus 2%iger Agarose mit Epichlorhydrin, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol hergestellte Thiolagarose. Der Substitutionsgrad betrug etwa 750 µäquiv./g Trockenprodukt. Die Reduktionskolonne war direkt an eine Kupplungskolonne mit einem Durchmesser von 2,1 cm geschaltet, die 3,2 ml gemäß a) oben hergestellter 2-Pyridindisulfidagarose enthielt.

Eine Lösung von 41,4 mg Amyloglykosidase in 6 ml 0,1 M Natriumbicarbonatlösung, 1 mM in bezug auf EDTA, wurde hergestellt und diese Lösung durch die Reduktionskolonne und die nachfolgende Kupplungskolonne mit einer Geschwindigkeit von 19,7 ml/h gepumpt. Danach wusch man die Kolonne mit folgenden Laugen in genannter Reihenfolge und der angegebenen Strömung:

0,1 M Natriumbicarbonatlösung/1 mM EDTA, 2 Std.
0,1 M Natriumacetatlösung, pH 4,8, 15 Std.
0,1 M Natriumacetatlösung, 1%ig in bezug auf Stärke, 3 Std.
0,01 M Natriumacetatlösung, pH 4,8, 3 Std.

Es erwies sich, daß die Kupplungskolonne eine Aktivität von 0,32 Enzymeinheiten/mg Konjugat aufgenommen hatte. Die eingepumpte Menge Amyloglykosidase-Aktivität war 80 Einheiten, entsprechend 1,25 Einheiten/mg Trockengel. Die Amyloglykosidase-Aktivität wurde gegen Stärke mit 2,4-Dinitrosalicylsäurereagens nach Bernfeld, Methods in Encymology, Band 1, Academic Press, New York, 1955, Seite 149, bestimmt.

Man nahm eine Eichkurve gegenüber Glykose auf und die Enzymeinheit wird als mg pro 3 Minuten gebildeter Glykose angeführt.

Bei einem Kontrollversuch wurden 2 ml Amyloglykosidase-Lösung unmittelbar auf eine Pyridindisulfidkolonne ohne Durchlaufen der Reduktionskolonne eingepumpt. Gewaschen wurde wie oben. Die Pyridindisulfidkolonne nahm keinerlei Aktivität auf.

c) Immobilisieren der a-Amylase

Immobilisieren des Enzyms an Thiolgel kann gleichfalls durch organisch-chemische Einführung der Thiolgruppen ins Enzymmolekül geschehen, wonach diese als Anbindungszentren ausgenutzt werden können. Die Einführung von Thiolstrukturen auf Proteine kann beispielsweise mit Methyl-3-merkapto-propioimidat vollzogen werden.

0,1-1,0 ml α-Amylasesuspension, Sigma Type IA, 25 mg/ml, wurde in 5 ml 0,1 M Natriumbicarbonatlösung gelöst. Die Lösung wurde 10 Minuten lang im H₂-Zelt entlüftet, wonach 1-3 mg Methyl-3-merkapto-propioimidat zugesetzt wurden. Nach 60 Minuten in der H₂-Atmosphäre wurde das Gemisch auf Sephadex® G25 in 0,1 M Natriumbicarbonat mit einer Geschwindigkeit von 60 ml/h gelfiltriert, wobei man niedermolekulare Stoffe entfernte. Etwa 20 ml a-Amylaseaktivität enthaltende Fraktionen vom Gelfiltrieren wurden aufgesammelt und mit 2-Pyridindisulfidagarose vermischt, 4 ml Gel gewaschen mit 0,1 M Natriumbicarbonatlösung. Nach Rühren während 6-15 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Gel auf Glasfilter mit Schaltpuffer gewaschen und darauffolgend in einer Säule mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ml/h wie folgt:

0,1 M Natriumbicarbonatlösung, 0,2 M in bezug auf Kochsalz, 24 Stunden,
0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,9, 0,2 M in bezug auf Kochsalz und 1%ig in bezug auf Stärke, 24 Stunden,
0,02 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,9, 0,01 M in bezug auf Kochsalz, 24 Stunden.

Die Enzymkonjugate mit etwa 1 mg trockenem Konjugat/ml Suspension wurden in der vorgenannten Waschlösung suspendiert und bei +4°C verwahrt.

Einer 1 ml geeignetermaßen verdünnten α-Amylaselösung oder a-Amylaseagarosesuspension wurde 1 ml 1%ige Stärke in 0,02 M Natriumphosphatpuffer zugesetzt, pH 6,9 und 0,01 M in bezug auf Natriumchlorid. Man bestimmte die Menge des reduzierenden Zuckers nach Rühren während 3 Minuten bei 23°C durch Reaktion mit 3,5-Dinitrosalicylsäure wie oben beschrieben. Danach wurde eine Eichkurve gegen Maltose aufgenommen. Die Aktivitätswerte sind in Tabelle 5 zusammengestellt, aus der die Kupplung von a-Amylase, mit Methyl-3-Thiol-propioimidat an Thiolagarose thioliert, die mit 2,2′-Pyridindisulfid aktivierte war, hervorgeht. Die Aktivität wurde gegenüber 1%iger Stärkelösung gemessen.

Tabelle V

Eine dieser Präparationen wurde auf einer Kolonne für kontinuierlichen Abbau von Stärke bei Raumtemperatur während 20 Tagen angewendet, bevor ein Absinken der Aktivität zu merken war.

Bei Erhöhung der Reaktorsäuletemperatur auf 45°C sank die Aktivität rasch ab, so daß nach etwa 2 Tagen noch 50% der Aktivität, nach 5 Tagen jedoch praktisch keine Aktivität mehr vorhanden war. Die Reaktorkolonne kann jedoch in situ durch Einpumpen von 20 mM Dithiothreitollösung in 0,1 M Natriumbicarbonat, Waschen mit 0,1 M Natriumbicarbonatlösung, Durchpumpen von 1,5 mM 2,2′-Dipyridindisulfidlösung in 0,1 M Natriumbicarbonat, Waschen mit 0,1 M Natriumbicarbonatlösung, 1 M in bezug auf Kochsalz und schließlich Durchpumpen einer Lösung aus thiolierter α-Amylase, regeneriert werden. Die Regenerierbarkeit ist aus dem Diagramm in Fig. 2 ersichtlich, die den Prozenten der Initialaktivität als Funktion der Zeitdauer in Tagen mit wiederholten Regenerierungen der Kolonne zeigt.

Beispiel XI Kovalente Chromatographie a) Reinigung der Urease

Urease ist ein Thiolgruppen enthaltendes Enzym. Eine Lösung aus 150 mg Urease, Sigma Type IV, in 50 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer mit pH 7,2 wurde gemäß Xa) durch eine Kolonne mit 2-Pyridindisulfidagarose geleitet. Die Höhe des Gelbettes betrug 22 mm, der Durchmesser 10 mm und die Strömungsgeschwindigkeit 5 ml/h. Die Kolonne war mit Tris-HCl-Puffer vorgewaschen worden und nach Umsetzung mit der Ureaselösung wurde erneut mit dem gleichen Puffer nachgewaschen. Danach wurde die immobilisierte Urease mit einer 50 mM Dithiothreitol-Lösung freigesetzt. Nach Gelfiltrieren des eluierten Enzyms wurde die spezifische Aktivität bestimmt und mit der spezifischen Aktivität der ursprünglichen Enzympräparation verglichen. Dabei erreichte man eine 8,4fache Reinigung.

b) Reinigung von Mercaptoalbumin

Bovines Serumalbumin ist ein Gemisch aus einer Thiolgruppe/Mol enthaltendem Mercaptoalbumin und Non-Mercaptoalbumin, in dem die Thiolgruppe mit Cystein oder Glutathion maskiert ist. Handelsübliche Fraktionen des Albumins enthalten 60-70% in bezug auf Mercaptoalbumin.

Bovines Serumalbumin von der Firma Sigma Chem. Comp., USA, wurde mit aktiver Kohle entfettet. Monomeres Serumalbumin präparierte man durch Gelfiltrierung auf Sephadex® G200. 380 mg des monomeren Albumins mit einem Thiolgehalt von 0,6 Thiolgruppen/Mol in 80 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer mit pH 7,5 und 0,3 M in bezug auf HCl samt 1 mM in bezug auf EDTA wurden auf eine 3,2 × 18 cm 2-Pyridindisulfidkolonne mit einer Geschwindigkeit von 11 ml/h eingeführt. Die Eluierung wurde bis A₂₇₈ < 0,03 fortgesetzt. Kovalent gebundene Stoffe wurden mit 25 mM im Eluierpuffer gelösten Cystein verschoben. Das erhaltene Eluat wurde auf Sephadex® G25 in 0,1 M Natriumacetatpuffer mit pH 5,4 sowie 0,3 M in bezug auf HCl und 1 mM in bezug auf EDTA filtriert. Das Protein enthielt 1,00-1,02 Thiolgruppen/Mol.

Beispiel XII Herstellung von Thiosulfatgelen, Thiolgelen und deren Derivaten, auf Basis von mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran

5 g mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran (Sephadex® G-150 der Firma Pharmacia Fine Chem., Uppsala, Schweden) wurden in 200 ml 0,5 Natriumhydroxydlösung suspendiert. Man versetzte die Suspension mit 250 mg NaBH₄ und 15 ml Epichlorhydrin. Danach wurde umgerührt und die Temperatur im Laufe von 30 Minuten von Raumtemperatur bis 60°C angehoben. Man ließ die Reaktion dann bei 60° 2 Stunden lang fortschreiten. Das Gelprodukt wurde mit Wasser und 0,5 M Natriumphosphatpuffer, pH 7 auf Büchner-Trichter gewaschen. Danach suspendierte man das Gelprodukt in 100 ml 2 M Na₂S₂O₃ und ließ es 20 Stunden lang bei Raumtemperatur unter langsamem Schwenken reagieren. Das erhaltene "Bunte Salz"-Gel wurde mit Wasser gewaschen und mit einer 0,2 M NaHCO₃-Lösung, 1 mM in bezug auf EDTA. Dann reduzierte man das Gel mit 300 mg Dithiothreitol, das in 20 ml einer 0,2 M NaHCO₃/1 mM EDTA-Lösung gelöst worden war.

Die Thiolgruppenanalyse ergab einen Thiolgehalt von 230 µMol/g Trockenprodukt.

Die Thiolgruppen konnten mit 2,2′-Pyridindisulfid bis zu 40% aktiviert werden.

Kupplung des Mercaptoalbumins bei pH 8,0 ergab Albumin-Sephadex-Konjugate mit 2,6 µMol Albumin/g Trockenprodukt.

Das "Bunte Salz"-Gel konnte unmittelbar mit 2,2′-Pyridindisulfid oder Tetramethylthiuramdisulfid aktiviert werden. Diese Produkte konnten beim Konjugieren des Mercaptoalbumins angewendet werden und man erhielt Konjugate mit 4,1 bzw. 2,4 µMol Albumin/g Trockenprodukt.

Beispiel XIII Herstellung von Thiosulfatgelen und Thiolgelen, auf Basis von mit Epichlorhydrin vernetztem Polyvinylalkohol

30 ml mit Epichlorhydrin vernetztes Polyvinylalkoholgel in Perlenform wurden in 24 ml 1 M NaOH-Lösung suspendiert, wonach man 4,5 ml Epichlorhydrin zusetzte. Die Reaktionsbedingungen waren im übrigen die gleichen wie bei der Herstellung des entsprechenden Dextranderivates.

Man behandelte das Gel 20 Stunden lang mit 30 ml 2 M Na₂S₂O₃-Lösung. Danach wurde die Reduktion des Reaktionsproduktes mit 500 mg Dithiothreitol, das in 10 ml 1 M NaHCO₃/1 mM EDTA-Lösung gelöst war, durchgeführt. Die Thiolgruppenanalyse ergab 300 µMol/g Trockenprodukt. Das Gel reagierte mit Anisaldehyd bei pH<1,0 unter Mercaptalbildung. Der Anisaldehyd konnte mit einer wäßrigen Lösung von HgCl₂ freigesetzt werden.

Beispiel XIV Herstellung von auf Cellulose basierendem Thio-Polymeren a) Herstellung von "Bunte Salz"-Cellulose und Thiolcellulose

5 g Cellulosepulver wurden 24 Stunden bei 0° in Stickstoffatmosphäre in 5 M Natriumhydroxydlösung merzerisiert. Man wusch das Produkt auf Filter mit 0,5 M Natriumhydroxydlösung und suspendierte in 25 ml 0,5 M Natriumhydroxydlösung. Dann versetzte man die Suspension mit 250 mg NaBH₄ und 5 ml Epichlorhydrin, rührte und erhitzte 30 Minuten bis 60°. Man ließ die Reaktion danach weitere 60 Minuten bei dieser Temperatur fortschreiten. Das Produkt wurde auf Filter mit Wasser und 0,5 M Natriumphosphatpuffer mit pH 7 gewaschen. Dann behandelte man das Produkt mit 25 ml 2 M Na₂S₂O₃-Lösung 20 Stunden bei Raumtemperatur und unter Rühren. Man wusch das Produkt mit Wasser und 0,2 M NaHCO₃-Lösung, 1 mM in bezug auf EDTA. Die Reduktion wurde mit 300 mg Dithioerythritol, gelöst in 10 ml 1 M NaHCO₃/1 mM EDTA-Lösung vorgenommen. Die Thiolgruppenanalyse ergab 460 µMol/g Trockenprodukt. Thiolcellulosederivate adsorbierten Kupfer oder Quecksilberionen aus stark verdünnter Kupfersulfat- und Quecksilbernitratlösung. Die Metallionen waren mit Dinatrium-EDTA desorbierbar.

b) Herstellung von Cellulose mit vizinalen SH-Gruppen

5 g Cellulosepulver wurde wie oben merzerisiert. Die Suspension der Cellulose in 10 ml 5 M Natriumhydroxydlösung wurde mit 250 mg NaBH₄ versetzt. Danach wurde der Suspension 1 g Allylbromid zugesetzt und das Gemisch unter Umrühren 6 Stunden lang in einem Reaktionsgefäß mit Rückflußkühler auf 70° erhitzt. Danach wurde mit Alkohol/wäßrigen Lösungsgemischen und schließlich mit 96%igem Alkohol gewaschen. Man suspendierte das Celluloseprodukt in 10 ml Tetrachlorkohlenstoff und versetzte die Suspension unter Umrühren mit Brom bis zur beständigen Farbe. Das Produkt wurde mit Alkohol und Wasser gewaschen.

Aus Na₂S · 9 H₂O der Firma Merck, Darmstadt, wurde eine 1 M-Lösung von "Natriumsulfid" in Wasser hergestellt. Obiger bromierter Celluloseäther wurde mit 5 ml der "Natriumsulfid"-Lösung 6 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Man wusch das Produkt mit Wasser, 10^-3 M Salzsäure und Wasser. Der SH-Gruppengehalt des Produktes war 410 µMol/g. Das Cellulosederivat adsorbierte Kupfer- oder Quecksilberionen aus stark verdünnten Kupfersulfat- und salpetersauren Quecksilberoxydlösungen. Etwa 40% des Metallionengehaltes war mit Dinatrium-EDTA desorbierbar. Der Rückstand muß als über viz. SH-Gruppenstrukturen gebunden angesehen werden.

Beispiel XV Herstellung von 2-Pyridindisulfidagarose

20 g gewaschenes und abgesaugtes Agarosegel (2%ig) wurden in 16,5 ml 1 M Natriumhydroxydlösung suspendiert. Danach wurde mit Wasser bis auf 50 ml Totalvolumen aufgefüllt. Man versetzte die Suspension mit 3,1 ml Epichlorhydrin, das man 20 Minuten lang bei Raumtemperatur und danach 2 Stunden lang bei 60°C reagieren ließ. Das Gel wurde auf Filter mit Wasser und einem 0,5 M Phosphatpuffer mit pH 6,3 gewaschen und danach mit 20 ml 2 M Natriumthiosulfatlösung versetzt. Die Reaktionszeit betrug 6 Stunden bei Raumtemperatur. Demnach wusch man das Produkt auf Filter mit 1 M Kochsalzlösung und Wasser. Nach der auf Schwefel bezogenen Analyse des Produktes ergaben sich 1760 µMol S/g Trockenprodukt.

Das Produkt wurde in 50 ml einer 50% Methanol/50% 0,1 M Natriumbicarbonatlösung, 1 mM in bezug auf EDTA, suspendiert, und 1,2 g Pyridindisulfid zugesetzt, wonach man die Reaktion 48 Stunden lang bei 60°C verlaufen ließ. Dann wurde das Produkt auf Filter mit Methanol und Wasser gewaschen und auf Stickstoff analysiert, was 526 µMol N/g Trockenprodukt ergab.

Beispiel XVI Kupplung von Glutathion

Über eine Kolonne von 3,4 ml 2-Pyridindisulfidagarose (aus vorstehendem Beispiel) wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml/h eine Glutathionlösung in 0,1 M Natriumacetat/0,1 mM EDTA mit pH 4,0, eingepumpt. Insgesamt verbrauchte man 43 ml Glutathionlösung. Das Produkt wurde mit 0,1 M NaAcetat-Puffer (pH 4,1), 0,1 M bezogen auf Kochsalz, Wasser und mit 0,1 M Bicarbonatlösung, 1 M bezogen auf Kochsalz sowie mit Wasser gewaschen. Das Produkt wurde auf Glutathion analysiert und ergab ein Gehalt an 415 µMol Glutathion pro trockenes Produkt. Nach Reduktion mit 50 mM Dithiothreitol-Lösung bewies eine Analyse auf Glutathion vollständige Abspaltung desselben.

Beispiel XVII Kupplung von Koenzym A

0,9 g 2-Pyridinsulfidagarose wurde mit 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 4,0 gewaschen und nach Absaugen in 5 ml des genannten Puffers, in diesem Fall sogar 0,1 mM bezogen auf EDTA, suspendiert. 27 mg CoA wurden zugesetzt und die Reaktionszeit betrug 4 Stunden bei 23°C. Danach wurde 5 Stunden lang mit 0,1 M Natriumacetatpuffer, 1 M in bezug auf Kochsalz, 2 Stunden mit Wasser, 24 Stunden mit 0,1 M Natriumbicarbonatlösung, 1 M in bezug auf Kochsalz, sowie 2 Stunden mit Wasser gewaschen.

Die CoA-Aufnahme war 220 µMol/g Trockenprodukt. Das gekuppelte Koenzym kann mit Dithiothreitol vollständig desorbiert werden.

Beispiel XVIII Kupplung der Urease

Man adsorbierte Urease, Sigma, Type IV bis zur Sättigung an 2-Pyridindisulfidagarose mittels 0,1 M Tris-HCl-Puffer von pH 7,2. Nach gründlichem Waschen des Produktes fand man, daß es 360 mg Protein/g Trockenkonjugat enthielt. Das Enzymprotein konnte mit 50 mM Dithiothreitol-Lösung desorbiert werden. Nach dem Gelfiltrieren erhielt man eine Ureasepräparation, deren spezifische Aktivität 6,2mal höher als die der Ausgangspräparation war.

Beispiel XIX Herstellung von Disulfidagarosegel durch Behandlung von Alkylthiosulfatestergel mit Tetramethylthiuramdisulfid

Dieser Versuch wird analog der Präparation des obigen 2-Pyridinsulfidgels durchgeführt. Die Stickstoffanalyse ergab 360 µMol N/g Trockenprodukt.

Beispiel XX Kupplung von Glutathion an Gel gemäß Beispiel V

Hier wird analog der Kupplung an 2-Pyridindisulfidgel vorgegangen. Die Analyse in bezug auf gebundenes Glutathion ergab 230 µMol/g Glutathion/g Trockenprodukt. Nach der Reduktion mit 50 mM Dithiothreitol-Lösung zeigte die Analyse in bezug auf Glutathion eine vollständige Abspaltung.

Beispiel XXI Aktivieren der Thiolagarose mittels Diäthylazodicarboxylat

Bei nachstehenden Versuchen wurde ein aus Perlen 6%iger Agarose erhaltenes Thiolagarosegel gemäß der früher beschriebenen Verfahrensweise verwendet. Das Charakteristische für das Produkt waen 730 µMol SH-Gruppen pro Gramm Trockenprodukt.

a) Aktivierung

5 g abgesaugtes Thiolgel wurden in 5 ml 96%igem Äthanol suspendiert und die Suspension mit 0,5 ml Diäthylazodicarboxylat versetzt. Danach rührte man anderthalb Stunden bei 22°C und wusch mit 50%igem Äthanol, 1 M Kochsalzlösung und Wasser. Der Stickstoffgehalt nach Trocknen im Vakuum bei 100°C, 15 Stunden lang, betrug 1,6%.

b) Kupplung von Glutathion

1 g aktiviertes Gel aus der obigen Stufe a) wurde in 1 ml 1 M Acetatpuffer mit pH 4,5 suspendiert. Danach wurden 20 mg Glutathion zugesetzt und man ließ die Reaktion 4 Stunden bei 22°C verlaufen. Danach wurde das Produkt mit 0,1 M Acetatpuffer, 1 M in bezug auf Kochsalz, mit 0,1 M Bicarbonatlösung, 1 M in bezug auf Kochsalz, mit Wasser und schließlich mit Azeton gewaschen. Die Aminosäureanalyse zeigte einen Glutathiongehalt von 610 µMol/g Trockenprodukt.

Analog dem obigen Versuch, jedoch mit pH 7,0, erhielt man 65 µMol Glutathion/g Trockenprodukt. Nach einmonatiger Lagerung des aktivierten Gels als wäßrige Suspension bei 4°C war die Kupplungsfähigkeit bei pH 7 um 6% gesunken.

Beispiel XXII Sorption und Desorption der Urease im Gel gemäß Beispiel VII

Man führte den Versuch analog dem Beispiel XIa durch, jedoch wurde die Sorption bei pH 6,9 vollzogen. Nach der Desorption mit Dithiothreitol und Gelfiltrieren wurde die spezifische Aktivität des Ureaseproteins bestimmt. Man hatte eine 5,2fache Reinigung erreicht.

Beispiel XXIII Aktivieren der Thiolagarose mittels Diisopropyl-Azodicarboxylat oder Methyl-phenylazoformat sowie nachfolgende Kupplung von Glutathion a) Diisopropyl-Azodicarboxylat

Man vollzog die Aktivierung analog dem Beispiel XXIa). Der Stickstoffgehalt des Produktes war 1,3%.

Die Kupplung von Glutathion wurde analog dem Beispiel XXIb) bei pH 4,5 vollzogen und der Glutathiongehalt betrug 385 µMol/g Trockenprodukt.

b) Methylphenylazoformat

Man aktivierte wie oben. Der Stickstoffgehalt des Produktes war 0,5%.

Die Kupplung von Glutathion vollzog sich wie oben und der Glutathiongehalt betrug 11 µMol/g Trockenprodukt.

Beispiel XXIV Chemisches Modifizieren von disulfidimmobilisiertem Protein (I) durch Kupplung an Protein (II) sowie reduktive Abspaltung von Protein(I)-Protein(II)-Komplexen

Obiges ist bereits mit Protein (I)=Papain und Protein (II)=Chymotrypsin vollzogen worden.

20 mg Papain (0,5 SH/Mol) in 5 ml 0,1 Tris-HCl-Puffer, pH 8,2 wurden mit 5 g in dem genannten Puffer gewaschenem und abgesaugtem, pyridyldisulfidaktiviertem Mercaptohydroxypropyläther-Sepharose-Gel untermischt. Man ließ die Reaktion unter vorsichtigem Rühren 5 Stunden bei Raumtemperatur (+23°C) verlaufen und wusch das entstandene Papain-Sepharose-Konjugat auf Glasfilter mit folgenden Lösungen:

1. 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,2 1 M in bezug auf NaCl, 1 mM bezogen auf EDTA 200 ml,
2. 0,1 M Na-Acetatpuffer, pH 4,5 1 M in bezug auf NaCl, 1 mM bezogen auf EDTA 200 ml,
3. 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 6,5.

Daraufhin wurde das Gel auf Glasfilter abgesaugt und in 15 ml 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 6,5, suspendiert. 15 mg α-Chymotrypsin, 100 µl Cyclohexylisonitril und 100 µl Acetaldehyd wurden zugesetzt und das Reaktionsgemisch durch Rotieren 2 Stunden lang bei +23°C gerührt. Danach wurde das Gelenzymkonjugat auf eine Säule gebracht und mit nachstehenden Lösungen gewaschen:

1. 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 6,5, 2 Stunden, Strömungsgeschwindigkeit 10 ml/h,
2. 0,1 M NaAcetat-Puffer, 1 M NaCl, pH 4, 6 Stunden, Strömungsgeschwindigkeit 10 ml/h,
3. H₂O, 3 Stunden, Strömungsgeschwindigkeit 10 ml/h,
4. 0,1 M NaHCO₃-1 M NaCl, 3 Stunden, Strömungsgeschwindigkeit 10 ml/h,
5. 0,1 M NaHCO₃ 1 M NaCl, 3 Stunden, Strömungsgeschwindigkeit 10 ml/h, und
6. 0,1 M NaHCO₃ 1 mM EDTA, 1 Stunde, Strömungsgeschwindigkeit 10 ml/h.

Man befreite daraufhin das Papain-Chymotrypsinkonjugat vom Gel durch Reduktion mit 20 mM Cystein in 0,1 M NaHCO₃-1 mM EDTA, das durch die Säule eingepumpt wurde. Fraktionen mit einer Absorption bei 280 nm werden gepoolt und auf Sephadex G-7-Kolonne gelfiltriert (dies um überschüssige Reduktionsmittel, entbundenes 2-Thiopyridon zu entfernen). Die dem Papain-Chymotrypsinkonjugat entsprechende Fraktion - nach Molekülgewicht - besitzt sowohl Chymotrypsinaktivität (Hydrolyse-N-Acetyl-L-Tyrosin-Äthylester) als auch Papainaktivität (Hydrolyse N-Benzoyl-Argininäthylester).

Claims

1. Polymer mit Thiogruppen enthaltenden Seitenketten aus einem gelförmigen, wasserunlöslichen Polymeren, ausgewählt aus Agar, Agarose, Cellulose, mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran, Polyvinylalkohol, teilweise hydrolysiertem Copolymer von Vinylacetat und Vinylchlorid oder einem aminosubstituierten Polyacrylamid, bei dem an die Hydroxy- oder Aminogruppe organische Seitenketten der allgemeinen Formel -CH₂-CH(OH)-CH₂-O-(1,3-Butylen)-O-CH₂-CH(OH)-CH₂-Y
oder
-CH₂-CH(OH)-CH₂-O-(CH₂)₄-O-CH₂-CH(OH)-CH₂-Y
oder
-CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂-Y
oder
-CH₂-CH(X)-CH₂-Ygebunden sind, wobei jedes X und Y unabhängig voneinander eine Thiosulfatgruppe oder eine Thiolgruppe oder eine Disulfidgruppe sind und wobei im Fall der letzten allgemeinen Formel für die Seitenketten ein nicht als Thiosulfat, Thiol oder Disulfid vorliegender Rest X oder Y Wasserstoff oder Hydroxyl sein kann.

2. Verfahren zur Herstellung des Polymeren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein wasserunlösliches Polymeres, das aus Agar, Agarose, Cellulose, mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran, Polyvinylalkohol, einem teilweise hydrolisierten Copolymer aus Vinylacetat und Vinylchlorid oder einem aminosubstituierten Polyacrylamid ausgewählt ist, in alkalischer Lösung mit Epihalogenhydrin, 1,3-Butandioldiglycidyl-äther oder 1,4-Butandiol-diglycidyl-äther, Divinylsulfon oder 2,3-Dihalogenpropanol oder mit Allylhalogenid und anschließend Halogen umgesetzt wird, und daß dann das Reaktionsprodukt mit einer wäßrigen Lösung von Thiosulfat, Natriumhydrogensulfid oder Natriumsulfid behandelt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Produkt, das mit einer Thiosulfatlösung behandelt wurde, anschließend mit einer Lösung eines die Thiosulfatgruppen zu Thiolgruppen reduzierenden Reagens behandelt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als reduzierendes Reagens 1,4-Dimercaptobutan oder Threo- oder Erythro-1,4-dimercapto-2,3-butandiol verwendet wird.

5. Verwendung des Polymeren nach Anspruch 1 zum Reinigen von Wasser von Schwermetall-Ionen und organometallischen Verbindungen, ggf. unter Isolieren derselben.

6. Verwendung des Polymeren nach Anspruch 1 zum Schutz von biologischen Lösungen gegen mikrobiologisches Wachstum.