DE2523793A1 - Thiopolymere und derivate sowie verfahren zur herstellung und anwendung derselben - Google Patents
Thiopolymere und derivate sowie verfahren zur herstellung und anwendung derselbenInfo
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Description
A 15 583 28. Mai 1975
Exploaterings Aktiebolaget T.B.F., Box 40 26 2,
S-403 44 Stockholm, Schweden
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Thiopolymere und Derivate sowie Verfahren zur Herstellung und Anwendung derselben
Zur Trennung, Reinigung und Isolierung von Konstituenten biologischer
Systeme liegen vielfache, insbesonders chromatografische, Adsorptionsmethoden vor. Die hierbei in Frage kommenden
Konstituenten sind nicht allein Moleküle und Molekülkomplexe, sondern ebenfalls organisierte Biosysteme verschiedener
Art, beispielsweise Zellen, subzellulare Partikel und
Virus. Ein chromatografischer Verlauf wird auf komplizierte Art durch Wechselwirkungen zwischen Systemen festen, chromatografischen Mediums und den Konstituenten in beweglicher Phase bestimmt, wobei die antreibenden Kräfte bei den Wechselwirkungen elektrostatischer, wasserstoffbindender, ladeüberführender, hydrophober usw. Natur sind.
Virus. Ein chromatografischer Verlauf wird auf komplizierte Art durch Wechselwirkungen zwischen Systemen festen, chromatografischen Mediums und den Konstituenten in beweglicher Phase bestimmt, wobei die antreibenden Kräfte bei den Wechselwirkungen elektrostatischer, wasserstoffbindender, ladeüberführender, hydrophober usw. Natur sind.
Man kann äusserst spezifische Sorptionseffekte erzielen indem ein Konstituent in einem System natürlich vorhandener Assoziation-Dissoziation-Ausgleiche
durch Fixieren an einen polymeren Träger immobilisiert wird, und das dieserart erhaltene
chromatografische Mittel zur Adsorption von komplementären
Konstituenten ausgenutzt wird. Eine derartige Methodik nennt man Bioaffinitätschromatografie.
Konstituenten ausgenutzt wird. Eine derartige Methodik nennt man Bioaffinitätschromatografie.
Das Beanspruchen einer kovalenten Bindung als Grundwahl für
Sorption und Chromatografie in biochemischem Zusammenhang ist
Sorption und Chromatografie in biochemischem Zusammenhang ist
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selten zur Anwendung gekommen. Die Gruppenspezifität ist dabei je nach Enthalt einer gewissen, funktioneilen Gruppe
oder Struktur erhältlich. Auch kann mit einem höheren Spezifitätsgrad gerechnet werden, da die Reaktivität funktioneller
Gruppen der gleichen Art in komplizierten Biomolekülen aufgrund der sterisch bedingten Mikroumgebung oft variiert,
Das rationale Vorbereiten mehr oder weniger spezifische Adsorbenten
für biochemische Trennungen ist oft mit grossen Schwierigkeiten verbunden. Deshalb ist es ratsam von hauptsächlich
neutralen, stark hydrophilen und Makromoleküle durchlässigen Trägerpolymeren auszugehen. Das Polymerskelett soll chemisch
inert, jedoch mit derartigen derivatbildenden Gruppen substituiert sein, die sich unter milden Bedingungen im Wassersystem
in möglichst viele Reaktionstypen einbegreifen lassen,
beispielsweise Salzbildung, Komplexbildung, Redoxreaktionen, Substitutions- und Additions- sowie Radikalreaktionen. Die
derivatbildende Gruppe kann danach als AdsorptionsZentrum
ausgenutzt werden, oder nach geeigneter Derivatisierung so, dass die Bindungsbrücke das Zentrum für die Wechselwirkung
ausmacht, oder den eingeführten Substituenten oder Gruppen in der Substituentenstruktur nach geeigneter und endgültiger
Derivatisierung das Zentrum für die Wechselwirkung ausmachen können.
Thiole sind präparativ äusserst interessante, funktioneile
Gruppen, die sogar in wasserhaltigen Systemen unter milden Bedingungen vielfachen Reaktionen unterliegen. In verschiedenen
Reaktionsmechanismen sind Thiolgruppen in Substitions-, Additions-, Oxydations-, Komplex- und Salzbildungsreaktionen
unter Bildung von S-C3 S-S, S-O, S-N, S-Metall und S-Metall-
-C-Strukturen einbegriffen. Es sei hierbei ausserdem bemerkt, dass Thiolgruppen leicht Reaktionen über Radikalmechanismen
unterliegen.
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In der biochemischen Separationstechnik haben Agarosegele,
insbesondere in Perlenform, als Trägergele eine bedeutende Rolle gespielt. Die rasche Entwicklung der biospezifischen
Affinitätschromatografie während der letzten Jahre hat sich fast ausschliesslich auf Agarosegele in Perlenform gestützt.
Hierbei hat sich oft als günstig erwiesen, wenn das Zentrum des chromatografischen Mittels für die Wechselwirkung sich
auf einem Arm oder Spacer befindet, mit gewissem kleinsten Abstand zum Polymerskelett des Trägerpolymers. Andere,
hydrophile, hydroxylgruppenhaltige Polymere sind in diesem Zusammenhang ebenfalls in gewissem Masse zur Anwendung gekommen,
z.B. quergebundenes Dextran.
Thiolgruppensubstituierte Agarosegele wurden von Custrecasas, J.Biol. Chemistry, 245, 3059 (1970) hergestellt, aus ω-Alkylderivaten
der Agarose durch Reaktion mit Azetyl-Homocysteine-Thiolakton. Die thiolierten Produkte wurden nach weiterer
Derivatisierung als Absorbent für Bioaffinitäts-Chromatografie
verwendet. Brocklehurst et.al., Biochem.J.133, 573
(1973) hat thiolierten Agarosegel durch direkte Schaltung von Glutathion an bromzyanaktivierten Agarosegel, ohne die
Thiogruppe zu schützen, hergestellt. Eldjarn et.al., Acta
Chem.Scand., 17 2610 (1963) hat thiolierte Gele aus epichlorhydrinquergebundenem
Dextran hergestellt indem er den Gel durch Behandlung mit Aminoäthylsulfat mit Aminogruppen substituierte
und danach mit Azetyl-Homocystein-Thiolakton reagieren liess. Nach Behandlung mit bifunktionellem Quecksilberreagenz
benutzte man die Produkte zum Isolieren von Thiolproteinen aus Proteinen ohne Thiolgruppen.
Agare- und Agarosederivate mit Seitenketten der Terminalstrukturen
-CH(OH)-CH2(SH), -CH(SH)-CH2(OH), -CH2-CH2(SH),
-CH(SH)-CHo oder -CH(SH)-CH0(SH) können ohne dass man das
Gelnetzwerk der Gelperlen zerstört aus perlenförmigen Agare- und Agarosegelen präpariert werden. Man behandelt die Aus-
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gangsgele zunächst auf bekannte Weise mit Epihalohydrin, 233-
-Dihalopropanol, bifunktionellen Oxiranen, Divinylsulfon oder Allylhalogenid mit darauffolgender Halogenierung in Dihalopropyläther
gemäss nachstehendem Reaktionsschema 1,2,3 und
Die derartig erhaltenen reaktiven Derivate werden daraufhin mit einer wässrigen Lösung des NaSH oder Na2S2O sowie im
letzteren Falle abschliessend mit einem geeigneten Reduktionsmittel,
beispielsweise 1,4-Dimerkaptobutan und dessen Derivaten
behandelt, wobei besonders Threo- oder Erytro-1,4-Dimerkapto-2,3-Butandiol
Vorzüge aufgewiesen haben. Diese Derivate werden nachstehend Dithiothreitol bzw. Dithioerythreitol
benannt. Wird Epihalohydrin, Dihalopropanol oder Allylhalogenid angewendet, vollzieht sich eine lieber brückung
zwischen dem polymeren Gelnetzwerk und der vorgenannten Terminalstruktur über -0-CH2-Glieder. Bei der Anwendung von
geeigneten bifunktionellen Oxiranen erhält man direkt einen Arm- oder Spacer-Effekt, indem Substituenten langkettiger
Natur beispielsweise folgendermassen ausgebildet werden:
-O-CH2-CH(OH)-CH2-O-(Alkyl)-O-CH2-terminale Gruppe. Bei Divinylsulfon
ergibt sich als Anbindungsstruktur die -0-CH2-
-CH2-SO2-terminale Gruppe. Bei Anwendung von geeignet C-alkylierten
Epihalohydrinen, Dihalopropanolen, Bisoxiranen,
Vinylsulfonen oder Ally!halogeniden erhält man C-alkylierte
Terminalstrukturen. Diese Reaktionen können auch auf anderen hydrophilen, hydroxylgruppenhaltigen Polymeren, beispielsweise
Polyvinylalkohol, partiell hydrolysiertem Kopolymer aus Polyvinylchlorid-Polyvinylazetat, Cellulose und epichlorhydrinquergebundenem
Dextran, z.B.Sephadex^—' der Firma Pharmacia
Fine Chemicals3 Upsala, ausgeführt werden, jedoch
gleichfalls auf Aminogruppen enthaltenden Polymeren, z.B. aminogruppensubstituierten Polyakrylamiden.
In gewissen Fällen wünscht man, dass der Polymer permeabel ist, in Gelform, in anderen Fällen ist dies weniger erstre-
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benswert.
Es hat sich in der Praxis als vorteilhaft erwiesen, dass man, um den abgetrennten und auf Lager geführten Produkten eine
grössere Beständigkeit gegen oxydative Einwirkung zu geben, die Thiopolymere in Form von primär gebildeten Thiosulfatpolymeren
oder durch teilweise Oxydation gebildeten Disulfiden, -S-S-, zu lagern und zu verkaufen. Diese Produkte können,
zwecks Anwendung in Thiolform, einfacherweise mit einer Lösung aus Dithiothreitol reduziert werden. Eine derartige
reduktive Behandlung kann auch bei einem langer gelagerten Thiopolymer angebracht sein.
Thiolgele können bei ungefähr pH 7 mit beispielsweise Jodazetamid
und 2,4-Dinitrofluorbenzen alkyliert werden. Die
Addition von Thiolen an C=C-Doppelbindung führt auch zu Thioätherstrukturen.
Die nukleophile Addition ist normalerweise träge, viele biologische Verbindungen enthalten jedoch Doppelbindungen,
durch Konjugierung oder Vizinalgruppeneffekte aktiviert. Schwefeladdukte sind somit von α,ß-ungesättigten
Aldehyden, Ketonen, Laktonen, Nitrilen und Äthern auszugänglich. Chinoide Strukturen sind im Zusammenhang mit Naturprodukten
antreffbar und die Addition von Thiolen an Chinone ist ein interessanter Fall, Im chromatografischen Zusammenhang
sind die Thioätherstrukturen stabil.
Reaktionen des obigen Typus, die zu stabilen Thioäthern führen, machen die Thiolgele für Spezialpreparationen von
biospezifischem Adsorbent,Adsorbent für hydrophobe Affinitätschromatografie.
Adsorbent mit auf Charge-Transfereffekte basierten Eigenschaften usw., sowie als Ausgangsgele zur Introduktion
neuer, chemisch reaktiver, funktioneller Gruppen für Chemiesorption, kovalente Chromatografie, chemisches
Immobilisieren und Modifizieren, äusserst geeignet.
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Addition und Kondensation der Thiole an Aldehyde und Ketone führen zur Hemimerkaptal-, Merkaptal-, Hemimerkaptol- und
Merkaptol-Bildung, was einen denkbaren Prinzip für reversible Chemisorption ausmacht.
OH
P-CH2-SHtR-CHO >
P-CH2-S-CH.
Die verschiedenen Verfahren zur Herstellung von Thiosulfat bzw.
Thiolpolymeren gehen aus nachstehenden Reaktionsformeln hervor.
NaSH ?H P-OHtCH0-CH-CH0Cl >
P-O-CH0-CH-CH0 -—>
P-O-CH0-CH-CH0-SH.
V 2 2V2 2 2
Reaktionsschema 1A. Herstellung von Thiolagarose mittels Epichlorohydrin
und Natriumwasserstoffsulfid.
OH
P-O-CH0-CH-CH0—
P-O-CH0-CH-CH0S0O0Na,
\ / l l 2 2 3
Reaktionsschema 1B. Herstellung von Thiopolymer mittels Epichlorohydrin
und Thiosulfat.
P-OHtCH0-CH-CH0-O-(CH0),,-0-CH0-CH-CH0 >
P-O-CH0-CH-CH0-O-
X0X V OH
Na9S9Oo
-(CH2)^-O-CH2-CH-CH2 — P-O-CH2-CrI-CH2-O-(CH2)^-O-CH2-CH-
-(CH2)^-O-CH2-CH-CH2 — P-O-CH2-CrI-CH2-O-(CH2)^-O-CH2-CH-
xo/ Oh Oh
-ch2-s2o3 -na+
p-o-ch0-ch-ch0-o-(ch2)^-o-ch2-ch-ch2-sh.
Oh " Oh
Reaktionsschema 2. Herstellung von Thiolagarose mittels 1,4-
-Butandiol-Diglyzidyläther, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol
(DTT). Die Thiosulfatverbindung kann dabei abgetrennt und als lagerungsbeständiges Produkt verkauft werden, das einfacherweise
zur Thio!herstellung bzw. wie nachstehend zur Herstellung
von reaktivem Polymer zum Fixieren von thiolhaltigen Stoffen herangezogen werden kann.
Na9S0O0
P-OHtCH2 = CH-SO2-CH=CH2 >
P-O-CH2-CH2-SO2-CH=CH2 — >
P-O-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-S2O3 -Na+ P-O-CH2-CH2-SO0-CH2-CH2-
-SH. 509850/102 0
Reaktionsschema 3. Herstellung von Thiolagarose mittels
Divinylsulfon, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol (DTT)
P-OHtBr-CH2-CH=OH2 ■ » P-O-CH2-CH=CH2
P-O-CH2-CH-CH2-Br "****°* ->
P-O-CH2-CH -CH
S°"N
Br2
Br
P-O-CH2-CH-CH2-SH.
RH
RH
Reaktionsschema 4. Herstellung von Thiolagarose mit Allylbromid,
Brom, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol.
Als in diesem Zusammenhang interessante Thio-Verbindungen der verschiedenen Polymere kann man Thioester der Carbonsäuren
nennen, die nach konventioneller Technik synthetisiert werden können. Sie unterscheiden sich in vieler Hinsicht von
den Estern der Alkohole. Ihre Bedeutung in chromatografischem Zusammenhang ist noch nicht vollständig erwiesen worden.
Thioester sind in biologischen Systemen von grosser Bedeutung. Sie sind u.a. Hochenergieverbindungen, gute Azylierungsreagenzen
und die Strukturen aktivieren α-Kohle an die Azylgruppe» Immobilisierte Thioester dürften deshalb in verschiedenem
biotechnischen Zusammenhang interessant sein, beispielsweise als im V/asser nicht lösliche Reagenzen zur Azylierung von
Proteinen.
Sehr interessant ist3 dass Thiole leicht oxydieren. Bei den
vielen Oxydationsprodukten spielen Disulfide eine besonders wichtige Rolle. Im Vergleich zu Thiolgruppen sind die DisulfidStrukturen
üblicherweise nicht besonders reaktiv, sie können allerdings sogar unter physiologischen Bedingungen
Reduktions- und Austauschreaktionen unterlaufen. Die Reduk-
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tion von Disulfid kann mit Thiol geschehen und die Thiol-
-Disulfidaustauschreaktion ist ausserordentlich bedeutungsvoll
in biologischen Systemen.
R-SH + R'-S-S-R' <r2r R-S-S-R1 + R'-SH
R-SH + R-S-S-R'4=z^ R-S-S-R + R'--SH
2 R-SH + R'-S-S-R1 4=^ R-S-S-R + 2 R'-SH
Bei der Reduktion von -S -S-Bindungen mit polymerfixierten
Thiolgruppen sind allerdings hochsubstituierte Thiolpolymere erforderlich. Diese können vorteilhafterweise angewendet
werden wenn man beispielsweise Disulfidproteine zu Thiolproteinen reduzieren will. Dabei erhält man im Polymer Disulfidbrücken,
die durch Reduktion mit z.B. dem vorgenannten Reduktionsmittel Dithiothreitol in die Thiolform zurückgeführt
werden können.
Enzyme enthalten des öfteren Thiolgruppen und in vielen Fällen sind eines oder mehrere direkt mit den Aktivitätseigenschaften
verknüpft. Gewisse Plasmaproteine wie Albumin und Zeruloplasmin enthalten somit Thiolgruppen. Subzellulare
Partikel enthalten proteingebundene Thiolgruppen wie auch andere Typen von Thiolen. Die meisten Proteine enthalten
allerdings -S-S-Brückena die, wie vorgenannt, leicht auf
Thiole überführt werden können unter Zuhilfenahme von geeigneten hochsubstituierten Thiolpolymeren des beispielsweise in
dieser Anmeldung beschriebenen-Typus.
Andererseits können Thiolpolymere leicht auf Polymere überführt werden mit für die Disulfid-Thiol-Ausbeute stark reaktiven
Disulfidgruppen. Wird ein derartiges Polymer mit einem
Thiolprotein reagiert-, erhält man polymeres -S-S-Proteinpolymer.
Man kann allerdings wie nachfolgend erläutert wird, ein Thiolpolymer auch andersartig aktivieren, in dem man ihn
leicht an eine ^hiolhaltige Verbindung fixieren kann.
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Thiolpolymere sind, entweder direkt oder nach Ueberführung
auf hierzu geeignete Disulfidstrukturen oder dergleichen, mit Vorteil bei der Chemiesorption von Naturproduktmischungen,
beispielsweise zur Separation von Proteinen, verwendbar.
Diejenigen Disulfidpolymere, die zu einer raschen und vollständigen
Reaktion mit einer Thiolkomponente in der Lösung führen, nennen wir "reaktive" Polymerdisulfidstrukturen.
Prinzipiell können diese intern sein und die erhöhte Reaktivität dürfte solchenfalls der konformationellen Spannung zuzuführen
sein, insbesondere der Ringspannung oder, was am wichtigsten erscheint, externe, d.h. des Typus Polymer-S-S-L,
wo die Reaktivität durch die Ligande L bedingt wird. Diese Ligande L muss, damit sich die Reaktion Disulfid-Thiol möglichst
vollständig gegen die Ueberführung von Thiolgruppe auf Disulfidgruppe vollzieht, derartige Eigenschaften haben,
dass beim Aufspalten der S-S-Brücke der zum L gehörende Schwefel durch Tautomerie oder Resonanz in Bezug auf die
Thiol/Disulfidausbeute auf niedrige Nukleophilität gebracht
wird. Als Beispiele für derartige S-S-Verbindungen können gemischte Verbindungen zwischen SH-Polymer und LSH genannt
werden, für welche der Ausgleich LSHi=^L" = S gilt, wobei
die Thionform überwiegt. Ein Beispiel für L ist 2-Thiopyridon. Ein weiteres Beispiel sind S-S-Strukturen, erhalten aus
Thiopolymer und Dxthxocarbonsaurederivaten, wobei eine Resonanzstruktur
die Ursache zur Irreversibilität der Abspaltung sein kann. Als Beispiel wird Tetramethylthxuramdisulfid
genannt.
Derartige ligandisierte Thiolpolymere können aus Thiolpolymeren
durch Reaktion mit L-S-S-L hergestellt werden, wobei die Reaktion so gesteuert werden kann, dass sie sich auf dem
Thiolgel bis praktisch zur stochiometrisehen Umsetzung von
Polymer-S-S-L durch Thiol-Disulfidausbeute vollzieht. Die
"Treibkraft" beruht hierbei analog dem vorgenannten, auf L
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betreffs Ausnutzen der Polymer-S-S-L-Reaktion mit einer Thiol-
-Verbindung in Lösung.
Wir haben allerdings gefunden, dass die Ligandisierung von Thiolpolymeren auch direkt durch Behandlung des Thiosulfatesterpolymeren
mit L-S-S-L-Reagenz vollzogen werden kann, ohne dass hierbei vorerst eine Reduktion des Thiosulfatesterpolymers
zu Thiolpolymer vorgenommen wurde. Dies bedeutet einen erheblichen technischen und ökonomischen Fortschritt,
weil hierbei vom lagerungsbeständigen Thiosulfatpolymer ausgegangen werden kann und man in einer einzigen Reaktionsstufe
mit praktisch theoretischer Ausbeute das stark reaktive PoIymer-S-S-L-Produkt
bei Anwendung von beispielsweise vorgenannter Disulfidverbindungen erhalten kann. Ein ganz anderes Verfahren
zur Herstellung von Polymerdisulfidliganden der hier vorgesehenen Art z.B. des Typus Polymer-S-S-Prot (wobei
Prot = Protein) besteht darin, dass ein Polymer-SuIfeny!derivat
mit einem Proteinthiol zum Reagieren gebracht wird. Ein derartiges SuIfenylderivat erhält man beispielsweise durch
Reaktion zwischen einem Polymer-Thiol und Azodiäthylcarboxylat
gemäss der schematischen Formel 1) wonach die Reaktion
mit dem Proteinthiol gemäss 2) durchgeführt werden kann:
1) P-SHtC2H5OOC-N=N-COOC2H5
P-S-N-N-COOC2H5
COOc2H5
2) P-S-N-N~COOC2H5+Prot-SH P-S-S-Prot+C^OOC-NH-NH-
COOC0Hn
Äthylcarboxylatgruppen können durch andere Carboxylatgruppen
oder mit anderen elektronenattrahierenden Gruppen überhaupt, ersetzt werden. Die Reaktion, wenn es um die Immobilisierung
eines Thiol-Proteins geht, besteht also in diesem Fall aus zwei Stufen, wobei zuerst die Aktivierung des Thiolpolymeren
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zu einem Alkylsulfenylhydrazid vollzogen wird. Dieses ist
lagerungsstabil in wässrigem Milieu und kann daraufhin bei
milden Bedingungen sogar bis zu schwach saurem Milieu, z.B. pH = 4 oder wenigera mit einer gelösten Thiolverbindung unter
Bildung eines Polymer~S-S-Prot oder analogen Produktes reagiert werden. In obigen Diskussionen wurde HS-Prot als
Beispiel für eine schaltungsbare Thiol-Verbindung angegeben. Dies darf selbstverständlich nicht eine Begrenzung bedeuten,
da die Prozesse mit beliebigen gelösten Thiol-Verbindungen durchgeführt werden können, jedoch auch mit Partikeln wie
Zellenfragmente, Virus u.a., vorausgesetzt dass diese auf der zugänglichen Oberfläche -SH-Gruppen (natürliche oder durch
Eingriff hervorgerufene) enthalten.
Die Entwicklung der biospezifischen Technik in der Biochemie
ist grösstenteils parallel zu der Entwicklung der in Wasser nicht löslichen Enzymen verlaufen. Die üblichen Methoden
zum Immobilisieren von Enzymen enthalten kovalente Bindung oder Adsorption zu Polymerträger. Eine besonders interessante
Möglichkeit ist die obengenannte Immobilisierung des Enzyms durch Disulfidbindung. Diese Bindung lässt sich bei
geeigneten, reduzierenden Bedingungen abspalten. Eine Säule aus immobilisiertem Enzym, das nach einiger Zeit seine Aktivität
verloren hat, kann daraufhin in situ regeneriert werden durch reduktives Abspalten von inaktiviertem Enzym und
erneute Schaltung von frischem Enzym kann im Säulenreaktor vorgenommen werden, fortsetzenderweise in situ, nachdem eine
neue Aktivierung des Polymers vollzogen wurde.
Ein anderer Typus der reversiblen Immobilisierung des Enzyms, die in letzter Zeit zur Anwendung gekommen ist, gründet sich
auf eine hydrophobe Interaktion zwischen Enzym und einem gemischten hydrophil/hydrophoben Trägerpolymer. Eine derartige
Immobilisiertechnik hat bedeutende Vorteile, weil man das Enzym, nachdem es ganz oder teilweise seine Aktivität ver-
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loren hat, üblicherweise vom Polymer abspalten kann, indem
man den Salzhalt ändert oder das Milieu (siehe z.B. die schwedische Patentanmeldung Nr. 7410550-3). Die genannte
Abspaltung des inaktivierten Proteins kann zeitweise Schwierigkeiten bereiten. Eine Möglichkeit hierbei ist, dem
hydrophilen Polymer die hydrophobe Struktur anzuschliessen, beispielsweise eine hydrophobe Struktur von Alkylmercaptanen,
über eine Disulfidgruppe immobilizieren, und die Abspaltung
des Enzymproteins durch Reduktion der Disulfidgruppen geschehen lassen und dabei eine gleichzeitige Abspaltung
der Enzym-Alkylstruktur erhalten.
Es scheint allerdings möglich zu sein, formelmässig die vorgenannten
Methoden zur Immobilisierung von thiolhaltigen Stoffen auf einem Thiopolymer, beispielsweise Thiol- oder
Thiosulfxdpolymer, folgendermassen zusammenzufassen: Es
gilt zunächst ein reaktives Polymerderivat herzustellen mit der allgemeinen Formel
P-S-Y
wobei PS in den Polymeren P-SH bezw. PS-SO3Na enthalten ist
wie in dieser Anmeldung angegeben wird, während Y eine Gruppe nennt0 die so bestimmt ist, dass man durch die Reaktion
P-S-Y + H-S-Protf-=^ P-S-S-Prot + Z
(wobei H-S-Prot eine thiolhaltige organische Verbindung, z.B. ein Protein oder ein thiolhaltiges Teilchen ist) ein
Produkt Z erhält, das nicht nennenswert imstande ist unter vorherrschenden Bedingungen die angegebene Reaktion in Gegenrichtung
zu treiben. Die Y-Gruppe erfüllt diese Anforderungen auf mindestens zwei verschiedenen Wegen.
a) Gewisse Disulfide des Typus A-S-S-A sind, wie wir festgestellt haben, imstande mit einem Thiosulfat- oder Thiolpolymer
zu reagieren unter Bildung eines reaktiven Disulfidpolymers gemäss der allgemeinen Formel (1)
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(1) P-S-H + A-S-S-AV=S1P-S-S-A + Z'
wobei Z' unmittelbar in einen Thion/Thiolgleichgewicht eingeht,
das lang zur Thionform verschoben sein muss.
Anstelle des P-S-H-Polymers kann man direkt ein P-S-SO^Na
Polymer, d.h. ein Thiosulfatpoiymer verwenden, also (2)
(2) P-S-SO3Na + A-S-S-A«=±P-S-S-A + Z"
wobei Z'' die gebildeten Reaktionsprodukte angibt, welche,
wie auch Z, der Reaktion in gegensätzlicher Richtung entzogen wBrden sollen.
Ferner werden Reaktionen zwischen den reaktiven Disulfidpolymeren
und einer gelösten Thiolverbindung, beispielsweise einem thiolhaltigen Protein nach Formel
P-S-S-A + HS-Prot<i^=* P-S-S-Prot + Z
durchgeführt. Das erhaltene Polymer-Protein kann, wie oben
genannt, durch ein geeignetes Reduktionsmittel in P-S-H + Prot-Rest abgespalten werden.
b) Azodicarboxylate der Formel R.. -N=R-R.. geben beim Kontakt
mit einem Thiolpolymer ebenfalls aufgrund der elektronenanziehenden Eigenschaften der R.-Gruppen, zu thiolhaltigen
Verbindungen stark reaktive Polymere der Formel P-S-H + R1N=N-R1 ^P-S-N-NH-R1,
d.h. unter Bildung eines jj/ydrazid in Lösung, das die Reaktion
nicht rückwärts führen kann.
Es ist beachtenswert, dass trotz dessen Reaktivität die aktivierten
Polymere beider genannter Typen separiert, gewaschen und auf Lager geführt werden können, ohne dass sich die Aktivität
nennenswert verringert. Die Schaltung von beispielsweise H-Prot kann bei einer späteren Gelegenheit vorgenommen
werden. Enzyme, die keine Thiolgruppen, sondern Disulfid-
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strukturen enthalten, können mit hochsubstituiertem Thiolgel reduziert werden, wonach man die gebildeten Thiole zum Immobilisieren
verwendet oder man kann das Enzym durch geeignete Thiolreagenz in Lösung mit Thiolgruppen substituieren, die
danach zum Immobilisieren benutzt werden. Umsetzungen mit polymergebundenen Thiolgruppen, die zu stabilen Thioätherstrukturen
führen, können ebenfalls beim Immobilisieren von Enzymen Anwendung finden, weil das Polymer dadurch mittels
geeigneter Reagenz mit neuen funktionellen Gruppen oder adsorbenten Zentra versehen werden kann, die direkt oder mit
geeigneter Reagenz kovalent an eine funktionelle Gruppe im Enzym gebunden werden können oder das Enzym adsorbieren.
Beim Immobilisieren eines Enzyms ist nicht nur das Immobilisieren an sich von Bedeutung. Bedeutungsvoll ist oft die
beim Einführen derartiger funktioneller Gruppen auf das polymere Netzwerk, die das Enzym zur erhöhten Stabilität anregen
oder den Konstituent im Substrat-Produkt-Inhibitorsystem beeinflussen; erhaltene5 erhöhte katalytische Aktivität. Da
sich Reaktionen mit Thiolgelen unter sehr milden Bedingungen in wässriger Lösung vollziehen, können derartige additionelle
Reaktionen auch nach dem Immobilisierprozess durchgeführt rwerden.
Eine analoge Methodik kann beim Immobilisieren von Mikroorganismen,
Zellen, subzellularen Partikeln, Membranfragmenten, Receptor-Sites u.a. angewendet werden.
Die fraglichen Thiolpolymere verwendet man für verschiedene
andere Zwecke in biologischem Zusammenhang, Ihre Metall-Komplexbilde-
und Elektronenaustauscheigenschaften können angewendet werden um Thiolgruppen enthaltende biologische Systeme
vor der Selbstoxydation zu schützen, in dem man das biologische System zusammen mit Thiolgel verwahrt. Es ist
bereits bekannt, dass die Autooxydation des Thiols durch ge-.
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wisse Metallionen wie CU und dem entsprechenden Oxydationsprodukt, d.h. Disulfid, katalysiert wird. Kontinuierlicher
Elektronenaustausch zwischen gebildetem Disulfid und Thiolgel
hält die Thiolkonzentration in der Lösung konstant, bis der Elektronenaustauscher verbraucht ist.
Thiolpolymere können auch als Stützphase bei chemischen Abänderungen
von Naturproduktsubstanzen verwendet werden. Die Bindung ans Polymer geschieht dabei durch die hydrolytisch ··
stabile Disulfidbindung, die allerdings nach vorgenommenen Umsetzungen reduktiv abspaltbar sein kann. Da Naturproduktsubstanzen
oftmals polyfunktioneil sind, führen in homogener
Phase hergestellte Umsetzungen leicht zu intermolekulare Querbindungsreaktionen, die man verhindern könnte wenn man
die Umsetzung in der Polymerphase geschehen lässt. Eine weitere Möglichkeit, die unter milden Bedingungen verlaufende
reduktive Abspaltung der Disulfid-Strukturen zu verwenden ist, die eine Komponente in einem biologischen Assoziations-Dissoziationskomplex
über die Disulfidstruktur an ein Thiolgel zu binden, wonach Adsorbat und Ligande zusammen abgespalten
werden können. Dies ist besonders wertvoll, da ein spezifischer Assoziations-Dissoziations-Komplex eines heterofunktionellen
Moleküls so ausgebildet wird, dass eine gewisse bemerkte biologische Aktivität aufgrund der beanspruchten
Komplexbildung nicht nennenswert inhibiert wird.
Viele Metallionen und metallorganische Verbindungen bilden mehr oder weniger stabile Komplexe mit den hier aktuellen
Thiolgelen. Thiolgele können somit als in Wasser nicht lösliche Komplex-bilde Tj jedoch ebenfalls als Medium für Chromatografie
über Metallkomplex-Ausgleiche beispielsweise zur Trennung von metallhaltigen Proteinen verwendet werden.
Die Erfindung wird anhand nachstehender Ausführungsbeispiele und beigefügten Zeichnungen näher erläutert.
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Fig. 1 zeigt die Reduktion von Amyloglykosidase mit Thiolagarosegel
als Funktion von pH und
Fig. 2 die Regenerierbarkeit einer Kolonne mit aktiviertem Thiolagarosegel.
Beispiel I. Herstellung von oxiranaktivierten Agarosegelen mit verschiedenem Substitutionsgrad in Bezug auf Oxiranstrukturen.
3 g gewaschener und abgesaugter Agarosegel in Perlenform,
2-6% Agarose, wurden in 2,4 ml 1M Natriumhydroxydlösung suspendiert.
Man tropfte Epichlorhydrin unter Rühren bei Raumtemperatur hinzu und liess die Temperatur danach bis 60 C
ansteigen und rührte das Reaktionsgemisch 2 Std. lang. Der Gel wurde auf Glasfilter mit Wasser bis zur neutralen Reaktion
gewaschen. Das Ergebnis ist aus Tabelle 1 ersichtlich.
Man unternahm Versuche analog dem Verfahren a)„
3 g gewaschener und abgesaugter Agarosegel in Perlenform, 2-6% Agarose, wurden in 1,6 ml 2,5 M Natriumhydroxydlösung
suspendiert, wonach man 12 mg Natriumborhydrid zusetzte.
Das Bisepoxyd wurde tropfenweise unter kräftigem Rühren zugesetzt.
Die Reaktionszeit betrug 6 Stdn bei Raumtemperatur. Man wusch den Gel auf Glasfilter mit Wasser bis zur
neutralen Reaktion, danach mit 20 ml Azeton und abschliessend mit Wasser bis das Azeton abgetrieben war.
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d) Mit^liS-Butandiol-DiglYcidYläther.
Man unternahm die Versuche analog dem Verfahren c).
e) Bggtimmung_von_gelgebundenen_Oxiranstrukturen.
Eine Gelmenge entsprechend 10-100 yäquiv. Oxiranstrukturen
wurde gewaschen und in 10 ml dest. Wasser suspendiert. pH der Suspension wurde auf 7,00 eingestellt, wonach 1,00 ml
der Gelsuspension in einen Titrierungsbehälter aus Kunststoff mit Kunststoffpipette überführt wurde. Beim Abpipettieren
wurde die Suspension kräftig mit einem Magnetstäbchen umgerührt. 1,00 ml 2 M Natriumthiosulfatlösung mit pH 7300
wurde der Gelsuspension zugesetzt, daraufhin wurde mit pH-Stat mit 5OmM Salzsäure kontinuirlich titriert. Die
Titrierdauer betrug 30-120 Minuten und beruhte auf dem Oxiranenthalt des Gels. Während der ganzen Titrierzeit wurde
magnetisch umgerührt. Man bestimmte den Feststoff-Gehalt der Gelsuspension durch Abpipettierung von 5,0 ml der Suspension
auf einen kleinen Glasfiltertrichter, danach wurde mit Azeton/Wassergemischen und Azeton gewaschen und 24 Stdn
bei 100 C im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.
BeispielII. Herstellung von divinylsulfonaktivierten Agarose
gelen mit verschiedenein Substitutionsgrad in Bezug auf Vinylsulfonstrukturen.
(R)
Sepharose^6B5 ein perlenförmiger Agarosegel, ca 6% PoIysaccharid
enthaltend, hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals Uppsala, wurde gewaschen und auf Glasfilter abgesaugt. 10g
des Agarosegels wurden in 10 ml 0,5 M Natriumcarbonatlösung mit pH 11 suspendiert j wonach man Divinylsulfon zusetzte und
das System 70 Minuten unter Rühren reagieren liess. Das Reaktionsprodukt
wurde mit Wasser auf Glasfilter gewaschen. Danach analysierte man das Produkt hinsichtlich der Vinylsulfonstrukturen
durch Reaktion mit überschüssigem Natriumthiosulfat und Titrierung auf gebildete OFI -Ionen mit Salz-
5098 507 10 20
säure nach Verfahren I e). Die Resultate für die verschiedenen Divinylsulfonmengen sind aus Tabelle II ersichtlich.
Beispiel III. Herstellung von 2,3~Dibrompropyläther-Agarosegelen mit variierendem Substitutionsgrad.
100 ml gewaschener und abgesaugter>
epichlorhydrinquergebundener Agarosegel wurden mit 100 ml 5 M Natriumhydroxydlösung,
die mit 500 mg Natriumborhydrid versetzt war, vermischt und
danach setzte man der Suspension Allylbromid hinzu. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rückführkühlen bei kräftigem
Umrühren während M- Stdn auf 7 0°C erhitzt. Nach der Reaktion
wurde der Gel auf Glasfilter mit Wasser und Alkohol/Wassergemischen
samt 96%-igem Alkohol und Kohlenstofftetrachlorid gewaschen. Man suspendierte den Gel dann in 100 ml Kohlenstofftetrachlorid
und Brom der verbliebenen Bromfarbe zugesetzt. Der bromierte Gel wurde auf Glasfilter mit Alkohol
und Wasser gewaschen. Die. Resultate wurden in Tabelle III zusammengefasst-
Beispiel IV, Herstellung von "Bunte Salz"-Agarosegelen mit
variierendem Substitutionsgrad.
Herstellung jvqn_"Bun^^
i.-2 il-dibromgro^
i.-2 il-dibromgro^
-bu^anjiiol-digly^
3 g je abgesaugtem Gel von Ia), Ib), Ic) und Id) wurden mit 0,5 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,25, gewaschen. Man suspen dierte den erneut abgesaugte Gel in 3 ml des gleichen Phosphatpuffers und setzte 3 ml 2 M Natriumthiosulfatlösung hinzu. Danach schüttelte man das Reaktionsgemisch 6 Stdn bei Raumtemperatur, wonach mit Wasser gewaschen wurde. Ein derartiges Produkt wird !;Bunte Salz"-Gel genannt. Die Schwefelanalysen gehen aus Tabelle I hervor.
3 g je abgesaugtem Gel von Ia), Ib), Ic) und Id) wurden mit 0,5 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,25, gewaschen. Man suspen dierte den erneut abgesaugte Gel in 3 ml des gleichen Phosphatpuffers und setzte 3 ml 2 M Natriumthiosulfatlösung hinzu. Danach schüttelte man das Reaktionsgemisch 6 Stdn bei Raumtemperatur, wonach mit Wasser gewaschen wurde. Ein derartiges Produkt wird !;Bunte Salz"-Gel genannt. Die Schwefelanalysen gehen aus Tabelle I hervor.
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b) Herstellung^ypn_"Buntp,Salz/'-Agar osegelen, aus divinylsul-
Die Herstellung erfolgt analog der Präparation aus epoxyaktivierten
Gelen nach a)„ Die Schwefelanalysen sind aus Tabelle
II ersichtlich.
c) Herstellung_von_"Burte .Salz"zAgarosegelen_aus_Dibromp_rogYl;
§ther§garosegelen.
5 g aus wässriger Suspension abgesaugter 2,3-Dibrompropylätheragarose
wurden in einer Lösung von 3,7 5 g Na2S2Ü„ . 5H„0
gelöst in 5 ml Wasser suspendiert. Man liess das Gemisch 5 Stdn unter Umrühren bei. 95 C reagieren, wonach der Gel auf
Glasfilter mit Wasser gewaschen wurde, bis er salzfrei war. Die Schwefelanalyse ist aus Tabelle III ersichtlich.
Beispiel V. Herstellung von Thiolagarosegelen mit variierendem Substitutionsgrad hinsichtlich der Thio!strukturen durch
Reduktion von "Bunte S^Iz"-Gelen mittels Dithiothreitol.
"Buite Salz"-Gel wurde auf Glasfilter gewaschen und abgesaugt.
3 g des Gels wurden in 0,3 M Natriumbicarbonatlösung auf ein
Gesamtvolumen von 6 ml suspendiert. Ausgehend von der beschriebenen Oxirananalyse berechnete man die erforderliche
Menge des Reduktionsmittels, Dithiothreitol, das in zumindest doppeltem Ueberschuss angewendet wurde. Dithiothreitol wurde
in 3 ml 1 m M EDTA-Lösung gelöst und bei Raumtemperatur unter Umrühren 30 Minuten reagiert. Man wusch das Produkt auf
Glasfilter mit 30 ml 0a1 mM Natriumbicarbonatlösung von 1 M
bezogen auf Kochsalz und 1 mM auf EDTA, und wusch abschliessend mit 100 ml 1mM EDTA-Lösung.
Man bestimmte den Substitutionsgrad der Thiolgruppen mit
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2 j2f-Dipyridyldisulfid gemäss Brocklehurst et al., Biochem. J,
133S 573 (1973), jedoch mit 0,1 M Natriumbicarbonatlösung
anstatt Tris-Puffer. Ausserdem wurde die Schwefelanalyse vorgenommen und das Ergebnis in Tabelle I angegeben.
In Tabelle I sind die Ergebnisse des Thiolierens von 6%-igem
Agarosegel zusammengestellt, bei dem Agaroseperlen mit Epichlorhydrin
2,3-Dibrompropanol, 1 ,4-But and iol--Dig lye idy lather
und 15 3-Butandiol-Diglycidyläther auf verschiedenen Substitu-·
tionsgrad aktiviert wurden. Man hat den Oxiran-Gruppen enthaltenden Gel mit Natriumthiosulfatlösung behandelt und den
"Bunte Salz"-Gel mit Dithiothreitol reduziert. Man bestimmte den Schwefelgehalt im "Bunte Salz"-Gel und der erhaltene,
thiolierte Gel und die Thiolgruppen sind mit 2,2'-Dipyridyldisulfid
bestimmt worden.
Oxiranaktivierung "Bunte Salz"- Thiolgel Thiolgel päquiv-
ml Reagenz/3 g Gel Gel ymol S/g ymol S/g Thiolgruppe/g
trockenes trockenes trockenes Produkt
Produkt Produkt
Epichlorohydrin 0,4-5 1260 690 660 !; 0,15 34-0 220 170
!1 0,075 70 55 50
1,4-Bütanediol-
diglycidyläther 5 1500 850 860
1,4-Butanediol-
diglycidyläther 1,2 740 370 4-10
1,4-Butanediol-
diglycidyläther 0,3 240 105 110
1,3-Butanediol-
diglycidyläther 1,2 690 350 390 2,3-Dibromopropanol
0,3 900 - 440
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Die Reduktion mit Dithiothreitol vollzog sich gieichermassen
wie oben unter a). Tabelle II zeigt die Analyseergebnisse vom Thiolieren 6%-igen Agarosegels, den mit Divinylsulfon in
Bezug auf die Vinylsulfonstrukturen auf verschiedenen Substitutions gr ad behandelt wurde. Der aktivierte Gel wurde mit
Natriumthiosulfatlösung behandelt und der erhaltene ''Bunte Salz:i-Gel mit Dithiothreitol reduziert.
Divinylsulfonaktivierung, ml DVS/10 g Agarosegel
0,05
0,1
0,25
0,5
1,0
_____ Thiol inhalt,
yäquiv./g yäquiv./g
trockenes trockenes Produkt Produkt
Vinylsulfoninhalt
yäquiv./g
Gel
Produkt
7.4 170 172
13 2 8 0 2 8 2
28 610 526
43 900 825
64 1260 1080
äther-Agarosegelen.
Die Reduktion mit Dithiothreitol erfolgte analog zu a) jedoch mit dreifach überschüssigem Reagenz berechnet auf Br-Analyse
und mit einer einstündigen Reaktionsdauer. Die Bromanalysen, Schwefelanalysen und Thiolanalysen sind in
Tabelle III aufgestellt zum Thiolieren von 6%-igem, mit Epichlorhydrin
quergebundenen Agarosegel. Die quergebundenen
Agaroseperlen waren in Bezug auf die Allylätherstrukturen
mit Allylbromid auf verschiedenen Substitutionsgrad behandelt worden. Allyläthergel wurde mit Brom und 2,3-Dibrompropyl-
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äthergel mit Natriumthiosulfatlösung behandeltP wonach man
den erhaltenen '''Bunte Salz"-Gel mit Dithiothreitol reduzierte .
Tabelle III | 20 | 2 .,3· ■Dibromopro- | Thiolagarose.j | Thiolagarose, |
Allylbromid- | 10 | pyläthera.garose , | mäquiv, Thiol- | mMol Br/g |
reaktbn, ml | 5 | mMol BrVg | gruppen/g | trockenes |
Allylbromid/ | 2 | trockenes Produkt | trockenes | Produkt |
100 ml Agarοse | Produkt | |||
gel | 3,5 | 2,1 | ||
2,0 | 1,5 | |||
0,3 | 0,7 | 0,15 | ||
0,5 | 0,4 | |||
Beispiel VI. Herstellung von Thiolagarosegelen aus oxiran-· aktivierten Agarosegelen mit Natriumsulfid.
3 g des gewaschenen und abgesaugten 6%-igen Agarosegels wurden
in 234 ml 1 M Natriumhydroxyd suspendiert. Man setzte
0,35 ml Epichlorhydrin hinzu und behandelte analog dem Verfahren
nach Ia). Der Oxirangehalt wurde auf 850 yäquiv./g trockenes Produkt bestimmt.
Aus Na „ S . 9H9O von dar Firma Merck, Darmstadt5 wurde eine
1 M Lösung aus Natriumsulfid in Wasser hergestellt und 3 g Oxirangel wurden bei Raumtemperatur und unter Rühren 2 Stdn
mit 15 ml der Natriumsulfidlösung behandelt. Der Thiolgehalt
betrug 410 uäquiv./g trockenes Produkt.
Beispiel VII. Derivatisieren von thiolierten Agarosegelen in
Thioätherstrukturen.
Bei nachstehenden Versuchen verwendete man thiolierten Aga-
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rosegel, der aus perlenförmigem, 6%-igem Agarosegel durch Behandlung
mit Epichlorhydrin, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol
hergestellt war. Der Thiolgruppengehalt betrug 6 yäquiv./g trockenes Produkt.
1 g Gel wurde in 2 ml 0,1 M Natriumbicarbonatlösung suspendiert, mit pH 8,4, der 1 mM in Bezug auf EDTA, zugesetzt war
um eventuell vorhandene Metallionen zu binden. Dann setzte man 1 ml Äthanol und 15 mg Jodazetamid hinzu und liess 1 Std.
bei Raumtemperatur reagieren. Das Produkt wurde mit Alkohol gewaschen und hatte danach einen Stickstoffhalt von 58 4 yMol
N/g Trockenprodukt.
b) R§§ktion_mit_Dinitrochlorbenzen.
ία
P ^WsAV-CH0-SH + IV") (J p -VWVwCH2-S-
P ^WsAV-CH0-SH + IV") (J p -VWVwCH2-S-
1 g Gel wurde in einem Gemisch von 2 ml 0,1 M Natriumbikarbonatlösung,
1 mM in Bezug auf EDTA und 2 ml Äthanol, suspendiert. Danach setzte man 15 mg 2,4-Dinitrochlorbenzen
hinzu und liess 1 Std. bei Zimmertemperatur reagieren. Das
Produkt wurde mit Alkohol gewaschen. Die Stickstoffanalyse
ergab 964 pMol N/g Trockenprodukt«
1 g Gel wurde in einem Gemisch von 2 5% Äthanol und 75% Wasser suspendiert. Danach setzte man 0,5 ml Vinyl-2-Chloräthylather
hinzu und liess 2 Stdn reagieren. Das Produkt wurde mit Alkohol gewaschen und hatte dann einen Chlorhalt
von 75 μΜοΙ Cl/g Trockenprodukt.
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.24
d) R§a:ktion_-mit_ZimtalciehYd.
P--'Vvv--CH2~SH+C6H5 "CH=CH-CHO >P
CH2 CHO
1 g Gel wurde in 2 ml Wasser suspendiert, wonach man 1 ml
Äthanol.., 0,1 ml Triäthylamin und 0,1 ml Zimtaldehyd zusetzte
und 5 Stdn reagieren liess. Gewaschen wurde mit Alkohol und
Wasser und das Produkt ergab eine stark positive Reaktion mit Schiffs Reagenz (Aldehydreagenz).
e) R§§ktion_mit_AkrQlein.
Die Reaktion wurde auf gleiche Art wie nach d) vollzogen, jedoch mit 50 μΐ Akrolein anstatt Zimtaldehyd. Die Reaktion
mit Schiffs Reagenz war positiv.
2 g Thiolgel wurden in 1 ml 0,2 M Natriumazetatpuffer mit
pH 5,6 suspendiert. 32 mg p-Benzochinon wurden in 1 ml Äthanol gelöst und mit der Gelsuspension vermischt. Die
Reaktion vollzog sich bei Raumtemperatur unter Umrühren während 5 bzw. 20 Stdn. Die Produkte wurden mit Alkohol/
Wassergemischen gewaschen.
Die Schaltungsfähigkext der Benzochinon-Agarosegele wurde gegen N-Azetyl-L-Cystein getestet. Man suspendierte 1 g
Chinongel in 1 ml Azetapuffer mit pH 4,5 und setzte danach 50 mg N-Azetyl-L-Cystein zu. Nach einer Reaktionsdauer von
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20 Stdn bei Raumtemperatur wurde das Produkt gründlich gewaschen
und getrocknet und dann auf Stickstoff analysiert.
Da das Benzochinon erwartungsgemass mit Alkoholgruppen in
der Gelmatrize reagiert, wurden analoge Versuche mit Agarosegel ohne Thiolgruppen vorgenommen. Das Ergebnis der Schaltung
von N-Azetyl~L-Cystein an p-benzochinon~aktivierte Agarose und p-benzochinon-aktivierte Thiolagarose ist in Tabelle
IV ersichtlich.
Tabelle IV | Reaktionsdauer (Benzochinon-- behandlung) |
0 | N% | Analyse |
Polymer | 5 | 0 | ,029 | N-Azetyl-L-Zystein ViMol/g (aus der N- Analyse berechnet) |
2 0 | 0 | ,113 | ||
Agarose | 5 | 0 | ,410 | 70 |
Agarose | 20 | ,633 | 280 | |
Thiolagarose | 44 0 | |||
Thiolagarose | ||||
1 g Gel wurde auf Filter mit einem Gemisch von 90% Äthanol in Wasser gewaschen. Man suspendierte den Gel in 2 ml des
vorgenannten Äthanol/Wassergemisches. 50 mg Testosteron wurden der Suspension zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde
dann 15 Stdn einer γ-Bestrahlung ausgesetzt. Nach dem Waschen stellte sich heraus, dass das Produkt 25 mg derivatisiertes
Cortison pro Gramm Trockenprodukt enthielt.
Man unternahm einen Blankversuch unter Ausschluss eines Lichtspenders. Eine Cortison-Aufnähme konnte nicht festgestellt
werden.
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Beispiel VIII. Anwendung von Thiolagarose als in Wasser
nicht löslicher Komplexbilder.
_Sit_E ".."CtUlSP-SQ-USS]SS ilber-Benzoesäure
1 g Thiolagarose wurde in 0,3 M Kochsalzlösung suspendiert und pH auf 7,0 eingestellt. Die Suspension mit einem Gesamtvolumen
von 20 ml wurde mit N2-GaS gesättigt. Eine
Lösung von 1M-, M- mg p-Chloroquecksilber-Benzoesäure in 0,3 M
Kochsalzlösung wurde auf pH 7,0 und ein Gesamtvolumen von 10 ml eingestellt, 1a0 ml Gelsuspension wurde mit 1,0 ml
der Reagenzlösung bei kontinuerlicher Zufuhr von 0,020 M
Natriumhydroxydlösung bei pH 7,0 reagiert= Der Verbrauchan Lauge war 580 uäquiv=/g Trockenprodukt.
Man bereitete eine Lösung aus CuSOu . 5H9O in Wasser, destilliert
in einer Quarzanlage, mit einer Cu -Konzentration von 0,125 mg/ml. Eine 3 ml Thiolagarosegel enthaltende
Thiolagarosesäule mir einer Durchflutungsflache von 0,7
cm wurde mit destilliertem Wasser gewaschen. Dxe Thiolagarose
war mit Epichlorhydrin, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol
hergestellt worden und hatte 500-700 yäquiv. SH-Gruppen/g Trockenprodukt» Cu -Ionen werden mit einem
UV-Apparat bei 2 54 nm und einer Spot-Test-Reaktion mit Reagenz
von o-Tolidin/Ammoniumrhodanid in Azeton nach F. Feigl,
Spot Tests in Inorganic Analysis, 5. Auflage3 S. 84, registriert.
Mit diesem Reagenz kann Kupfer bis zu einer Verdünnung
von 1/5.10 nachgewiesen werden. Wenn Kupferlauge durch die Thiolkolonne eingepumpt wurde, flössen 25,3 ml der
Probelauge durch die Säule, bevor Cu mittels Spot-Test-Reagenz im Aluat nachgewiesen werden konnte 3 was einer Aufnahme
von 1236 mg CuSO1 . 5H2O entspricht. Adsorbiertes
Kupfersulfat ist mit EDTA versetzbar.
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Das Enzym Papain enthält eine Thiolgruppe pro Molekül, wobei
die Thiolgruppe für die Aktivität erforderlich ist. Das Papain wird oft als Quecksilberpapain geliefert und gelagert,
bei dem die reaktive Thiolgruppe als Schutz beim Zubereiten einen Zusatz von HgCl2 erhalten hat. Quecksilber
papain ist fermentativ inaktiv und wird normalerweise durch Zusatz einer Cystein/EDTA--Lösung aktiviert.
Thiolierte Agarose kann als Aktivator für Quecksilberpapain angewendet werden. Die Aktivität des aktivierten Enzyms zu
Benzoyl-L-Arginin-Äthylester oder Kasein berechnet beträgt
80-90% der Aktivität, die bei der Verwendung von einer Lösung Cystein/EDTA als Aktivator erreicht wird.
Beispiel IX. Anwendung hochsubstituierter Thiolagarose als Reduktionsmittel.
Methylenblau bildet rotglänzende Kristalle, die sich leicht in Wasser zu einer blauen Farbe lösen und bei der Reduktion
in farbloses Leukomethylenblau übergehen.
In einem Reagenzglas wurde 1 g Thiolagarose, ungefähr 50 yäquiv. Thiolgruppen entsprechend, in 3 ml 0,1 M Natriumwasserstoff
carbonatlösung, von ausserdem 0,3 M in Bezug auf
Kochsalz und 1 mM in Bezug auf EDTA, suspendiert. Die Suspension wurde mit H2~Gas ausgeglichen und 1 ml, 25 mM, Methylenblau-Lösung
zugesetzt. Die Entfärbung vollzog sich in ΙΟΙ 5 Minuten. Der H2"-Gasausfluss wurde während der Reaktion
beibehalten.
b) S§^yktion_der_Disulf idverbindung_in_Chy_motrYp_sin.
Man bereitete eine Lösung von Chymotrypsin in 1 mM HCl mit 25 mg/ml. Eine Säule von 15,U ml mit hochsubstituierter
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Thiolagarose5 die aus 6%-iger Agarose durch Behandlung mit
Epichlorhydrin, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol hergestellt
war, wurde vorbereitet. Der Substitutionsgrad der
Thiolgruppen betrug etwa 800 uäquiv./g Trockenprodukt.
1 ml der Chymotrypsinlösung wurde mit 1 ml 0s1 M Natriumwasserstoff
carbonatlösung vermischt, von ausserdem 1 mM in Bezug
auf EDTA, und mit einer Flussgeschwindigkeit von 15 ml/h
durch die Thiolsäule geleitet. Das die Thiolsäule bereits durchgeströmte Chymotrypsin wurde mit überschüssiger Jodessigsäure
reagiert und das Reaktionsgemisch mittels Gelfil-
tration auf Sephadex G10 von der Firma Pharmacia Fine Chemicals,
Uppsala, entsalzt. Jodessigsäure reagiert mit Thiolgruppen und Thioäthercarbonsäure von Cystein und ist durch
Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse mengenmässig bestimmbar. Nicht reduziertes Chymotrypsin wurde ebenfalls mit Jodessigsäure
behandelt. Die Probe wurde gelfiltriert und der Aminosäureanalyse unterworfen. Das Ergebnis geht aus nachstehender
Tabelle hervor:
Gehalt an S-Carboxymethyl-Cystein,
1iäquiv./25 mg Protein
Chymotrypsin 0
Reduziertes Chymotrypsin 255
2,7 ml hochsubstituierte Thiolagarose gleicher Vorbereitung wie unter b) wurden in eine Kolonne mit einem Durchmesser
von 18 mm aufgefüllt. Lösungen von AmylogIykosidase, Sigma
Grade II, mit einer Konzentration von 0,1% Gewicht/Volumen
wurden in folgenden Puffersystemen bereitet: 50
mM Natriumazetat pH 3,5 50 mM Natriumfosfat pH 5,5
50 mM Natriumfosfat pH 7,5 50 mM Natriumbikarbonat pH 9,5
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Sämtliche Laugen waren ausserdem 1 mM in Bezug auf EDTA und
mit N2-GaS gesättigt. Man liess die Enzymlaugen mit einer
Geschwindigkeit von 10 ml/h die Kolonne durchströmen. Man
entnahm vier Proben von je 2,5 ml und bestimmte den Gehalt an SH-Gruppen mit 2521-Dipyridyldisulfid. Zwei Proben wurden
als Blankproben verwendet. Man mass den Thiolgehalt teils unmittelbar, teils nach 2 Stdn. Die Ergebnisse sind
im Diagramm in Fig. 1, die die Reduktion der Amyloglykosidase
mit Thiolagarosegel als Funktion des pH-Wertes zeigt, zusammengefasst. Der Gehalt an Thiolgruppen des reduzierten
Enzyms wurde sofort nach dem Passieren durch die Kolonne und nach zweistündigem Aufbewahren der Enzymlösung bestimmt.
Beispiel X. Immobilisierung der Enzyme durch Fixieren an Thiolagarose durch Thioldisulfidaustauschreaktionen.
Perlen aus 2%-igem Agarosegel wurden mit Epichlorhydrin quergebunden. 180 g der gewaschenen und abgesaugten Agaroseperlen
wurden in 142 ml 1 M Natriumhydroxydlösung suspendiert, die Suspension mit 5 ml Epichlorhydrin versetzt und die Reaktion
liess man 1 Stunde bei 60 C verlaufen. Man wusch den Gel und suspendierte ihn in 180 ml 0,5 M Fosfatpuffer, 20,5 g
NaH2PO1+ . H2O, 14,0 g Na2HPO4 . 2H2O in 0,5 1 Lösung.
Daraufhin wurden 180 ml einer 2 M Natriumthiosulfatlösung zugesetzt
und 6 Stdn bei Raumtemperatur reagiert. Man wusch das Produkt mit Wasser und reduzierte mit 216 g Dithiothreitol,
gelöst in 180 ml 0,1 M Natriumwasserstoffcarbonatlösung
von ausserdem 1 mM in Bezug auf EDTA. Das Produkt wurde mit 1 M Kochsalzlösung gewaschen, 1 mM in Bezug auf EDTA, ferner
mit 1 mM EDTA-LÖsung und abschliessend mit 50%-iger Azeton-Wasser lösung. 4 g Pyridindisulfid wurden in 180 ml 50%-iger
Azeton/Wasserlösung gelöst und mit dem Gel vermischt, woraufhin
man die Reaktion 30 Minuten bei Raumtemperatur verlaufen liess. Man wusch das Produkt auf Glasfilter mit 50%-igem
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30
Azeton und schliesslich πι it 1 mM EDTA-Lösung. Die Analyse
erwiess dass der Oxirangehalt nach der Epichlorbehandlung
80 uäquiv./g Trockenprodukt betrug und der Gehalt an 2-Pyridindisulfidstrukturen,
anhand dar N-Analyse, 50 yäquiv./g
Trockenprodukt ergab.
b) i?PB9.bilisieren__von_
Amyloglykosidase wurde mit hochsubstituierter Thiolagarose wie oben unter IXc) beschrieben, reduziert. Die Reduktionskolonne hatte eine Länge von 11 cm und enthielt 17 ml aus 2%-iger Agarose mit Epielilorhydrin, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol hergestellte Thiolagarose. Der Substitutionsgrad betrug etwa 7 50 laäquiv./g Trockenprodukt. Die Reduktionskolonne war direkt an eine Kupplungskolonne mit einem Diameter von 2,1 cm geschaltet, die 3,2 ml gemäss a) oben hergestellter 2-Pyridindisulfidagarose enthielt.
Amyloglykosidase wurde mit hochsubstituierter Thiolagarose wie oben unter IXc) beschrieben, reduziert. Die Reduktionskolonne hatte eine Länge von 11 cm und enthielt 17 ml aus 2%-iger Agarose mit Epielilorhydrin, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol hergestellte Thiolagarose. Der Substitutionsgrad betrug etwa 7 50 laäquiv./g Trockenprodukt. Die Reduktionskolonne war direkt an eine Kupplungskolonne mit einem Diameter von 2,1 cm geschaltet, die 3,2 ml gemäss a) oben hergestellter 2-Pyridindisulfidagarose enthielt.
Eine Lösung von 41,4 mg Amyloglykosidase in 6 ml 0,1 M Natriumwasser
stoffcarbonatlösung, 1 mM in Bezug auf EDTA, wurde
hergestellt und diese Lösung durch die Reduktionskolonne und die nachfolgende Kupplungskolonne mit einer Geschwindigkeit
von 19,7 ml/h gepumpt. Danach wusch man die Schaltungskolonne
mit folgenden Laugen in genannter Reihenfolge und der angegebenen Strömung :·
0,1 M Natriumwasserstoffcarbonatlösung/1 mM EDTA, 2 Stdn
0,1 M Natriumazetatlösung, pH 4,8, 15 Stdn 0,1 M Natriumazetatlösung, 1%-ig in Bezug auf Stärke,
3 Stdn O3OI M Natriumazetatlösung, pH 4,8, 3 Stdn
Es erwies sich, dass die Kupplungskolonne eine Aktivität von 0,32 Enzymeinheiten/mg Konjugat aufgenommen hatte. Die ein-
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gepumpte Menge Amyloglykosidase-Aktivität war 8 0 Einheiten,
entsprechend 1,25 Einheiten/mg Trockengel. Die Amyloglykosidase-Aktivität
wurde gegen Stärke mit 2 , !+--Dinitrosalizylsäurereagenz nach Bernfeld, Methods in Enzymology, Band 1, Academic
Press, New York, 19 55;, Seite 149, bestimmt.
Man nahm eine Eichkurve gegenüber Glykose auf und die Enzymeinheit
wird als mg pro 3 Minuten gebildeter Glykose angeführt
.
Bei einem Kontrollversuch wurden 2 ml Amyloglykosidase-Lösung
unmittelbar auf eine Pyridindisulfidkolonne ohne Durchlaufen der Reduktionskolonne eingepumpt. Gewaschen wurde
wie oben. Die Pyridindisulfidkolonne nahm keinerlei Aktivität auf.
Reduktor
^T
E.
SH
SH
Adsorbator
+ E
SH
2S =
Immobilisieren des Enzyms an Thiolgel kann gleichfalls
durch organisch-chemische Introduktion der Thiolgruppen ins
Enzymmolekül geschehen, wonach diese als Anbindungβζentra
ausgenutzt werden können» Die Introduktion von Thiolstrukturen auf Proteine kann beispielsweise mit Methyl-3-merkapto
propioimidat vollzogen werden.
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NH
HS-CH2-CH2-C
NH Il
0-CH3
O3I-I3O ml α-Amylasesuspension, Sigma Type IA5 25 mg/ml3
wurde in 5 ml 0,1 M Natriumwasserstoffcarbonatlösung gelöst.
Die Lösung wurde 10 Minuten lang im H9-ZeIt entlüftet wonach
1-3 mg Methyl-3-merkapto-propioimidat zugesetzt wurden.
Nach 60 Minuten in der H0-Atmosphäre wurde das Gemisch auf
R
Sephadex " G25 in 031 M Natriumwasserstoffcarbonat mit einer Geschwindigkeit von 6 0 ml/h gelfiltriert, wobei man niedermolekulare Stoffe entfernte. Etwa 2Q ml ot-Amylaseaktivität enthaltende Fraktionen vom Gelfiltrieren wurden aufgesammelt und mit 2-Pyridindisulfidagarose vermischt } 4 ml Gel gewaschen mit 0,1 M Natriumwasserstoffcarbonatlösung. Nach Rühren während 6-15 Stunden bei Raumtemperatur wurde der Gel auf Glasfilter mit Schaltpuffer gewaschen und darauffolgend in einer Säule mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ml/h wie :folgt:
Sephadex " G25 in 031 M Natriumwasserstoffcarbonat mit einer Geschwindigkeit von 6 0 ml/h gelfiltriert, wobei man niedermolekulare Stoffe entfernte. Etwa 2Q ml ot-Amylaseaktivität enthaltende Fraktionen vom Gelfiltrieren wurden aufgesammelt und mit 2-Pyridindisulfidagarose vermischt } 4 ml Gel gewaschen mit 0,1 M Natriumwasserstoffcarbonatlösung. Nach Rühren während 6-15 Stunden bei Raumtemperatur wurde der Gel auf Glasfilter mit Schaltpuffer gewaschen und darauffolgend in einer Säule mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ml/h wie :folgt:
031 M Natriumwasserstoffcarbonatlösung3 O52 M in Bezug
auf Kochsalz, 24 Stunden, • O31 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,9, 0,2 M in Bezug
auf Kochsalz und 1%-ig in Bezug auf Stärke,
24 Stunden,
0,02 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,93 0,01 M in Bezug auf Kochsalz, 24 Stunden
0,02 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,93 0,01 M in Bezug auf Kochsalz, 24 Stunden
Die Enzymkonjugate mit etwa 1 mg trockenem Konjugat/ml Suspension
wurden in der vorgenannten Waschlösung suspendiert und bei +4 C verwahrt.
Einer 1 ml geeignetermassen verdünnten a-Amylaselösung oder
ot-Amylaseagarosesuspension wurde 1 ml 1%-ige Stärke in 0,02
M Natriumphosphatpuffer zugesetzt, pH 6,9 und 0D01 M in Bezug
auf Natriumchlorid. Man bestimmte die Menge des redu-
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zierenden Zuckers nach Rühren während 3 Minuten bei 23 C unter Anwendung einer 3,S-Dinitrosalizylsäurereakticxi wie oben beschrieben.
Danach wurde eine Eichkurve gegen Kaitose aufgenommen. Die Aktivitätswerte sind in Tabelle 5 zusammengestellt,
aus der die Schaltung von a^Amylase., mit Methyl-3-Thiol-propioimidat
an Thiolagarose thioliert^ die mit 2,2'-Pyridindisulfid
aktivierte war, hervorgeht. Die Aktivität wurde gegenüber 1%-iger Stärkelösung gemessen.
Tabelle V | Enzymgehalt im Konjugat, mg/g |
Aktivität, mg Maltose/mg a-Amylase/3 Min. |
Relative Aktivität % |
Katalysator | - | 480 | „ |
a-Amylase | 85 | 92 | 19,2 |
a-Amylaseagarose | 24 | 2 3 5 | 4 9 |
;" | 18,5 | 7 0 5 | 43 |
15 | 2 2 5 | 47 | |
! | |||
Eine dieser Präparationen wurde auf einer Kolonne für kontinuierlichen Abbau von Stärke bei Raumtemperatur während 20
Tagen angewendet, bevor ein Absinken der Aktivität zu merken war.
Bei Erhöhung der Reaktorsäuletemperatur auf 45°C sank die Aktivität rasch ab, sodass nach etwa 2 Tagen noch 50% der
Aktivität, nach 5 Tagen jedoch praktisch keine Aktivität mehr vorhanden war. Die Reaktorkolonne kann jedoch in situ
dUi>ch Einpumpen von 20 mM Dithiothreitollösung in 0,1 M
Natriumwasserstoffcarbonats Waschen mit 03·1 Μ Natriumwasserstoffcarbonat
lösung, Durchpumpen von 1,5 mM 2 ,2'-Dipyridindisulfidlösung
in 0,1 M Natriumwasserstoffcarbonat, Waschen mit 0,1 M Natriumwasserstoffcarbonatlösung, 1 M in Bezug auf
Kochsalz und schliesslich durchpumpen einer Lösung aus thio-
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lierter α-Amylase, regeneriert werden. Die Regenerierbarkeit
ist aus dem Diagramm in Fig. 2 ersichtlich;, die den Prozenten
der Initialaktivität als Funktion der Zeitdauer in Tagen mit wiederholten Regenerierungen der Kolonne zeigt.
Beisp5.el XI. Kovalente Chromatograf i.
a) Reinigung_der_yrease ·
Urease ist ein Thiolgruppen enthaltendes Enzym. Eine Lösung aus 150 mg Urease, Sigma Type IV, in 50 ml O/l M Tris-HCl-Puffer
mit pH 7,2 wurde gemäss Xa) durch eine Kolonne mit 2-Pyridiiidisulfidagarose geleitet. Die Höhe des Gelbettes
betrug 22 mms der Diameter 10 mm und die Strömungsgeschwindigkeit
5 ml/h. Die Kolonne war mit Tris-HCl-Puffer vorgewaschen
worden und nach Umsetzung mit der Ureaselösung wurde erneut mit dem gleichen Puffer nachgewaschen. Danach wurde
die immobilisierte Urease mit einer 50 mM Dithiothreitol-Lösung verschoben. Nach Gelfiltrieren des eluierten Enzyms
wurde die spezifische Aktivitet bestimmt und mit der spezifischen
Aktivitet der ursprünglichen Enzympräparation verglichen. Dabei erreichte man eine 8,4-malige Reinigung.
ι- E-SH 7>
■
(Thiolhaltiges Protein)
-E τ S =
o o
übe'rschuss R-SH
+ E-SH + R-S-S-R
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b) Reinigung_von_Mercagtoalbumin.
Bovines Serumalbumin ist ein Gemisch aus einer Thiolgruppe/ Mol enthaltendem Mercaptoalbumin und Non-Mercaptoalbumin, in
dem die Thiolgruppe mit Cystein oder Glutathion maskiert ist. Handelsübliche Fraktionen des Albumins enthalten 60-70% in
Bezug auf Mercaptoalbumin.
Bovines Serumalbumin von der Firma Sigma Chem. Comp., USA, wurde mit aktiver Kohle entfettet. Monomeres Serumalbumin
präparierte man durch GeIfiltrierung auf Sephadex G 200. 380 mg des monomeren Albumins mit einem Thiolgehalt von 0,6
Thiolgruppen/Mol in 80 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer mit pH 7,5
und 0,3 M in Bezug auf HCl samt 1 mM in Bezug auf EDTA wurden
auf eine 3,2 χ 18 cm 2-Pyridindisulfidkolonne mit einer
Geschwindigkeit von 11 ml/h eingeführt. Die Eluierung wurde bis A278
< 0,03 fortgesetzt. Kovalent gebundene Stoffe wurden mit 25 mM im Eluierpuffer gelösten Cystein verschoben.
Das erhaltene Eluat wurde auf Sephadex G 2 5 in 0,1 M Natriumazetatpuffer mit pH 5,4 sowie 0,3 M in Bezug auf HCl
und 1 mM in Bezug auf EDTA filtriert. Das ausgebeutete Protein enthielt 1,00 - 1,0 2 Thiolgruppen/Mol.
Beispie] XII. Herstellung von Thiolsulfatgelen, Thiolgelen
und deren Derivaten, basiert auf epichlorhydrinquergebundenes Dextran.
•p
5 g epichlorhydrinquergebundenes Dextran (Sephadex G-150
der Firma Pharmacia Fine Chem., Uppsala, Schweden) wurden in 200 ml 0,5 Natriumhydroxydlösung suspendiert. Man versetzte
die Suspension mit 250 mg NaBH1^ und 15 ml Epichlorhydrin.
Danach wurde umgerührt und die Temperatur im Laufe von 30 Minuten von Raumtemperatur bis 600C angehoben. Man liess
die Reaktion dann bei 60° 2 Stunden lang fortschreiten. Das Gelprodukt wurde mit Wasser und 0,5 M Natriumphosphatpuffer,
pH 7 auf Büchner-Trichter gewaschen. Danach suspendierte man
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das Gelprodukt in 100 ml 2 M Na2S2O3 und liess es 20 Stunden
lang bei Raumtemperatur -inter langsamen Schwenken reagieren» Der ausgebeutete "Bunte Salz'!-6el wurde mit Wasser gewaschen
und mit einer 0,2 M NaKCO„-Lösung, 1 mM in Bezug auf EDTA.
Dann reduzierte man den Gel mit 300 mg Dithiothreitol, das in 20 ml einer 0,2 M NaHCOg/1 mM EDTA-Lösung gelöst worden
war«
Die Thiolgruppenanalyse ergab einen Thiolgehalt von 230 μΜοΙ/g Trockenprodukt.,
Die Thiolgruppen konnten mit 2,2'-Pyridindisulfid bis zu 10%
aktiviert werden.
Schaltung des Mercaptoalbumins bei pH 8,0 ergab Albumin-Sephadex-Konjugate
mit 2,6 yMol Albumin/g Trockenprodukt.
Der '"Bunte Salz"-Gel konnte unmittelbar mit 2 , 2 ' -Pyridindisulf
id oder Tetramethylthiuramdisulfid aktiviert werden.
Diese Produkte konnten beim Konjugieren des Mercaptoalbumins angewendet werden und man erhielt Kon jugate mit M-, 1 bzw. 2,4
μΜοΙ Albumin/g Trockenprodukt·
Beispiel XIII. Herstellung von Thiosulfatgelen und Thiolgelen, basiert auf epichlorhydrinquergebundenem Polyvinylalkohol.
3 0 ml epichlorquergebundener Polyvinylalkoholgel in Perlenform
wurden in 24 ml 1 M NaOH-Lösung suspendiert, wonach man
4S5 ml Epichlorhydrin zusetzte. Die Reaktionsbedingungen
waren im übrigen die gleichen wie bei der Herstellung des entsprechenden Dextranderivates.
Man behandelte den Gel 20 Stunden lang mit 30 ml 2 M Na2S2O3-Lösung.
Danach wurde die Reduktion des Reaktionsproduktes
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mit 500 mg Dithiothreitol, das in 10 ml 1 M NaHCOg/1 mM
EDTA-Lösung gelöst war2 durchgeführt. Die Thiolgruppenanalyse
ergab 300 μΜοΙ/g Trockenprodukt. Der Gel reagierte
mit Anisaldehyd bei pH < 1,0 unter Mercaptalbildung. Das Anisaldehyd konnte mit einer wässrigen Lösung des HgC^ abgeschoben
werden.
Beispiel XIV. Herstellung von auf Cellulose basierten Thio-Polymeren.
a) li§£§£§ilüQS_Y°n_/!B\in1:^
5 g Cellulosepulver wurden 24- Stunden bei 0° in Stickstoffatmosphäre
in 5 M Natriumhydroxydlösung merzerisiert. Man
wusch das Produkt auf Filter mit 0,5 M Natriumhydroxydlösung und suspendierte in 25 ml 0,5 M Natriumhydroxydlösung. Dann
versetzte man die Suspension mit 250 mg NaBK1, und 5 ml Epichlorhydrin,
rührte und erhitzte 30 Minuten bis 60 · Man liess die Reaktion danach weitere 6 0 Minuten bei dieser
Temperatur fortschreiten. Das Produkt wurde auf Filter mit Wasser und 0,5 M Natriumphosphatpuffer mit pH 7 gewaschen.
Dann behandelte man das Produkt mit 25 ml 2 M Na2S2O3-Lösung
20 Stunden bei Raumtemperatur und unter Rühren. Man wusch das Produkt mit Wasser und 0,2 M MaHCO„-Lösung, 1 mM in Bezug
auf EDTA. Die Reduktion wurde mit 300 mg Dithioerythritol, gelöst in 10 ml 1 M NaHCO3/1 mM EDTA-Lösung vorgenommen. Die
Thiogruppenanalyse ergab 460 yMol/g Trockenprodukt. Thiolcellulosederivate
adsorbierten Kupfer oder Quecksilberionen aus stark verdünnter Kupfersulfat" und Quecksilbernitratlösung.
Die Metallionan waren mit Dinatrium-EDTA desorbierbar.
b) Herstellung_vgn_Cellulose_mit-vizinalen_3H-Grug2e2■
5 g Cellulosepulver vmrde wie oben merzerisiert- Die Suspension
der Cellulose in 1Π ml 5 M Natriumhydroxydlösung wurde
mit 2 50 mg NaBH4 versetzt= Danach wurde der Suspension 1 g
509850/1020
Allylbromid zugesetzt und das Gemisch unter Umrühren 6 Stunden
lang in einem Peaktionsgefäss mit Rückflusskühler auf
70 erhitzt. Danach wurde mit Alkohol/wässrigen Lösungsgemischen und schliesslich mit 9 6%-igem Alkohol gewaschen.
Man suspendierte das Celluloseprodukt in 10 ml Kohlenstofftetrachlorid
und versetzte die Suspension unter Umrühren mit Brom bis zur beständigen Farbe. Das Produkt wurde mit Alkohol und Wasser gewaschen.
a2u . 9HO der Firma Merck, Darmstadt3 wurde eine 1 M-Lösung
von "Natriumsulfid" in Wasser hergestellt. Obiger
bromierter Celluloseäther wurde mit 5 ml der "Natriumsulf id'"-Lösung
6 Stunden bei Raumtemperatur behandelt= Man wusch das Produkt mit Wasser, 1C M Salzsäure und Wasser, Der SH-Gruppengehalt
des Produktes war 410 μΜοΙ/g. Das Cellulosederivat
adsorbierte Kupfer- oder Quecksilberionen aus stark verdünnten Kupfersulfat und salpetersauren Quecksilberoxydlösungen.
Etwa 40% des iletallionengehaltes war mit Dinatrium-EDTA desorbierbar. Der Rückstand muss als über viz. SH-Gruppenstrukturen
gebunden angesehen werden.
Beispiel XV. Herstellung von 2-Pyridindisulfidagarose.
20 g gewaschener und abgesaugter Agarosegel (2%-ig) wurden
in 1635 ml 1 M Natriumhydroxydlösung suspendiert. Danach
wurde mit Wasser bis auf 50 ml Totalvolumen aufgefüllt. Man versetzte die Suspension mit 3,1 ml Epichlorhydrin, das man
20 Minuten lang bei Raumtemperatur und danach 2 Stunden lang bei 60 C reagieren liess, Der Gel wurde auf Filter mit Wasser und einem 0,5 M Phosphatpuffer mit pH 633 gewaschen und
danach mit 20 ml 2 1' Natriumthiosulfatlösung versetzt. Die
Reaktionszeit betrug 6 Stunden bei Raumtemperatur. Demnach wusch man das Produkt auf Filter mit 1 M Kochsalzlösung und
Wasser. Nach der auf Schwefel bezogenen Analyse des Produktes ergaben sich 17tö yliol 3/g Trockenprodukt.
509850/1020
Das Produkt wurde in 50 ml einer 50% Methanol/50% 0,1 M
Natriumbicarbonatlösung, 1 mM in Bezug auf EDTA, suspendiert,
und 1,2 g Pyridindisulfid zugesetzt, wonach man die
Reaktion 48 Stunden lang bei 60°C verlaufen liess. Dann
V7urde das Produkt auf Filter mit Methanol und Wasser gewaschen und auf Stickstoff analysiert, was 526 μΜοΙ N/g
Trockenprodukt ergab.
Beispiel XVI. Glutathionschaltung .
Ueber eine Kolonne von 3,M- ml 2-Pyridindisulfidagarose (aus
vorstehendem Beispiel) wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml/h eine Glutathionlösung in 031 M Natriumazetat/0
,1 mM EDTA mit pil 4,0, eingepumpt. Insgesamt verbrauchte
man 43 ml Glutathionlösung. Das Produkt wurde mit 0,1 M NaAc-Puffer (pH 4,1), 0,1 M bezogen auf Kochsalz, Wasser und
mit 0,1 M Bicarbonatlösung, 1 M bezogen auf Kochsalz sowie
mit Wasser gewaschen. Das Produkt wurde auf Glutathion analysiert und ergab ein Gehalt an 415 yMol Glutathion pro
trockenes Produkt. Nach Reduktion mit 50 mM Dithiothreitol-Lösung bewies eine Analyse auf Glutathion vollständige Abspaltung
desselben.
Beispiel XVII. Schaltung des Koenzym A.
G,9 g 2'Pyridinsulfidagarose, wurde mit 0,1 M Natriumazetatpuffer
3 pH 4,0 gewaschen und nach Absaugen in 5 ml des genannter.
Puffers, in diesem Fall sogar 0,1 mM bezogen auf EDTA5 suspendiert. 27 mg CoA wurden zugesetzt und die Reaktionszeit
betrug 4 Stunden bei 2 3 C. Danach wurde 5 Stunden lang mit 031 M Natriumazetatpuffer, 1 M in Bezug auf Kochsalz,
2 Stunden mit Wasser-, 24 Stunden mit 031 M Natriumbicarbonatlösung,
1 M in Bezug auf Kochsalz, sowie 2 Stunden mit Wasser gewaschen.
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HO
Die CoA-Aufnähme war 22 0 μΜοΙ/g Trockenprodukt- Das geschaltete
Koenzym kann mit Dithiothreitol vollständig desorbiart werden=
Beispiel XVIII. Schaltung der Urease.
Man adsorbierte Urease, Sigma, Type IV bis zur Sättigung an 2--Pyridindisulfidagarose mittels 0,1 M Tris-HCl-Puffer von
pH 7j2. Nach gründlichem Waschen des Produktes fand man, dass es 360 mg Protein/g Trockenkonjugat enthielt. Das Enzymprotein
konnte mit 50 mM Dithiothreitol-Lösung desorbiert
werden. Nach dem Gelfiltrieren erhielt man eine Ureasepräparationj
deren spezifische Aktivität 6,2 mal höher als die der Ausgangspräparation war,
Beispiel XIX. Herstellung von Disulfidagarosegel durch Behandlung mit Alkylthiosulfatestergel mit Tetramethylthiuramidisulfid.
Dieser Versuch wird analog der Präparation des obigen 2-Pyridinsulfidgels
durchgeführt, Die Stickstoffanalyse ergab
360 μΜοΙ N/g Trockenprodukt. '
Beispiel XX. Schaltung von Glutathion an Gel gemäss Beispiel V.
Hier wird analog der Schaltung an 2-Pyridindisulfidgel gehandelt.
Die Analyse in Bezug auf gebundene Glutathion ergab 230 μΜοΙ/g Glutathion/g Trockenprodukt. Nach der Reduktion
mit 50 mM Dithiothreitol-Lösung zeigte die Analyse in Bezug auf Glutathion eine vollständige Abspaltung«
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Beispiel XXI. Aktivieren der Thiolagarose mittels Diäthylazodxcarboxylat.
Bei nachstehenden Versuchen wurde ein aus Perlen 6%-iger
Agarose erhaltener Thiolagarosegel gemäss der früher beschriebenen Verfahrensweise verwendet. Das Charakteristische für
das Produkt waren 730 μΜοΙ SH-Gruppen pro Gramm Trockenprodukt,
a) Aktivierstufe.
5 g abgesaugter Thiolgel wurden in 5 ml 96%-igem Äthanol suspendiert
und die Suspension mit 0,5 ml Diäthylazodicarboxylat versetzt. Danach rührte man anderhalb Stunden bei 22 C und
wusch mit 50%-igexn Äthanol, 1 M Kochsalzlösung und Wasser. Der Stickstoffgehalt nach Trocknen im Vakuum bei 100 C, 15
Stunden lang, betrug 1,6%.
1 g aktivierter Gel aus der obigen Stufe a) wurde in 1 ml 1 M Azetatpuffer mit pH t,5 suspendiert. Danach wurden 20 mg
Glutathion zugesetzt und man liess die Reaktion 4 Stunden bei
22 C verlaufen. Danach wurde das Produkt mit 0D1 M Azetatpuffer,
1 M in Bezug auf Kochsalz, mit 0,1 M Bicarbonatlösung: 1 M in Bezug auf Kochsalz, mit Wasser und schliesslich mit
Azeton gewaschen. Die Aminosäureanalyse zeigte einen Glutathiongehalt
von 610 μΜοΙ/g Trockenprodukt.
Analog dem obigen Versuch jedoch mit pH 7,0 als SchaltungspH erhielt man 65 μΜοΙ Glutathion/g Trockenprodukt. Nach
einer monatlichen Lagerung des aktivierten Gels als wässrige Suspension bei 4°C war die Schaltungsfähigkeit bei pH 7 um
6% gesunken.
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Beispiel XXII. Sorption und Desorption der Urease im Gel gemäss Beispiel VII.
Man führte den Versuch, analog dem Beispiel 4 durch, jedoch
wurde die Sorption bei pH 639 vollzogen. Nach der Desorption
mit Dithiothreitol und Gelfiltrieren wurde die spezifische
Aktivität des Ureaseproteins bestimmt. Man hatte eine Reinigung von 5,2 mal erreicht.
Beispiel XXIII,. Aktivieren der Thiolagarose mittels Diisopropjyl-Azodicarboxylat
oder Methyl-phenylazof ormat sowie nachfolgende Glutathionschaltung.
Man vollzog die Aktivierung analog dem Beispiel XXI a) . Der Stickstoffgehalt des Produktes war 1>
3% „
Die Glutathionschaltung wurde analog dem Beispiel XXIb) bei pH 4,5 vollzogen und der Glutathiongehalt betrug 385 μΜοΙ/g
Trockenprodukt.
b 5 MethjjlEhen^lazof ormat *
Man aktivierte wie oben» Der Stickstoffgehalt des Produktes war Q,5 %«
Die Glutathionschaltung vollzog sich wie oben und der Glutathiongehalt
betrug 11 yMol/g Trockenprodukt.
Beispiel XXIV. Chemisches Modifizieren von disulfidimmobilisiertem Protein (I) durch Schaltung an Protein (II) sowie
reduktive Abspaltung von Protein(I)-Protein(II)-Komplexen.
Obiges ist bereits mit Protein (I) = Papain und Protein (II) = Chymotrypsin vollzogen worden.
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20 mg Papain (0,5 SH/Mol) in 5 ml 0,1 Tris-HCi-Puffer, pH
8,2 wurden mit 5 g in genanntem Puffer gewaschenem un abgesaugten , pyridyldisulfidaktivi ertem Mercaptohydroxypropyläther-Sepharose-Gel
untermischt. Man liess die Reaktion unter vorsichtigem
Rühren 5 Stunden bei Raumtemperatur (+23 C) verlaufen und wusch das entstandene Papain-Sepharose-Konjugat
auf Glasfilter mit folgenden Lösungen:
1) 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,2 1 M in Bezug auf NaCl,
1 mM bezogen auf EDTa 200 ml,
2) 0,1 M Na-Azetatpuffer3 pH 4,5 1 M in Bezug auf NaCl,
1 mM bezogen auf EDTA 200 ml,
3) 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 6,5.
Daraufhin wurde der Gel auf Glasfilter abgesaugt und in 15
ml 051 M Na-Phosphatpuffer, pH 6,5, suspendiert. 15 mg a-Chymotrypsin,
100 ul Cyclohexylisonitril und 100 μΐ Azetaldehyd wurden zugesetzt und das Reaktionsgemisch durch Rotieren
2 Stunden lang bei +23 C gerührt. Danach wurde das GeI-enzymkonjugat
auf eine Säule eingelassen und mit nachstehenden Lösungen gewaschen:
1) 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 6,5, 2 Stunden, Strömungsgeschwindigkeit
10 ml/h,
2) 0,1 M NaAc-Puffer., 1 M NaCl, pH 4, 6 Stunden. Strömungsgeschwindigkeit
10 ml/h,
3) H^O, 3 Stunden, Strömungsgeschwindigkeit 10 ml/h,
4) 0,1 M NaHCO3-I M NaCl, 3 Stunden, Strömungsgeschwindigkeit
10 ml/h,
5) 0,1 M NaHCO3 1 M NaCl, 3 Stunden, Strömungsgeschwindigkeit
10 ml/h, und
6) 0,1 M NaHCO3 1 mM EDTA, 1 Stunde, Strömungsgeschwindigkeit
10 ml/h.
Man befreite daraufhin das Papain-Chymotrypsinkonjugat vom Gel durch Reduktion mit 2 0 mM Cystein in 0,1 M NaHCO3-I mM
EDTA das durch die Säule eingepumpt wurde i Fraktionen mit einer Absorption bei 280 nm werden gepoolt und auf Sephadex
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G-7-Kolonne gelfiltriert (dies um überschüssige Reduktionsmittels
entbundenes 2-Thiopyridon usw. zu entfernen). Die dem Papain--Chymotrypsinkonjugat entsprechende Fraktion - nach
Molekülgewicht zu urteilen - besitzt sov-70hl Chymotrypsinaktivität
(Hydrolyse-N--Azetyl-L-Teposin-Ä-chylester) als auch
Papainaktivität (Hydrolyse N-Benzoyl-Argininäthylester).
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Claims (1)
- Patentansprüchee Produkt zu Separationszwecken, Ionenaustauschzwecke als Basenmaterial zur Herstellung verschiedener Derivate u.a. zu Separationszwecken, für Adsorption oder Immobilisieren verschiedener spez. biochemisch interessanter Stoffe sowie Enzymen, Inhibitoren oder Partikel, zur Durchführung von Redox-Reaktionen oder dergleichen wie auch aus deren Derivaten bestehender Produkte, dadurch gekennzeichnet j dass sie aus einem in Wasser nicht löslichen, hydroxyl- oder aminogruppenhaltigen Polymer bestehen, das mit organischen Seitenketten von je einer oder mehreren Thiosulfatgruppen (-S0O- -Gruppen) enthaltenen Seitengruppen oder den Derivaten derartiger Gruppen, substituiert ist.2. Produkt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das Polymer ein Gel ist.3. Produkt nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet , dass das Polymer eine Agare oder ein Agarederivat ist.4. Produkt nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet , dass das Polymer ein Polyvinylalkohol ist.5. Produkt nach Anspruch 1 -2, dadurch gekennzeichnet 3 dass das Polymer eine Cellulose ist.6. Produkt nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet , dass das Polymer ein quergebundenes PoIysaccharid, beispielsweise Dextran, ist.7. Produkt nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet , dass das Polymer ein aminogruppen-substi-509850/1020tuiertes Polyacrylamid ist,8. Polymer nach Anspruch 1-7, dadurch gekenn zeichnet 3 dass die substituierten organischen Seitenketten folgende allgemeine Formel haben.Z ZR-C-C-R'
ι t
X Ywobei R CH9, CH9-CH9-SO-, oder CH9-CH (OH) -CH9-O-R9-O-CH9 ist3 R9 feine gerade oder verzweigte Alkylengruppe ist, Z für H und/oder eine Alkylgr-uppe steht, R' H5 Alkyl, Alkenyl oder Aryl ist, und X OH3 H oder S O3" ist, wenn Y S90q ist oder X S3O3" bedeutet, wenn Y OH, H oder S2O3" ist.9 ο Polymer nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet j dass es folgende Formel hat:P-O-CH2-CH(OH)-CH2-S2O3".10. Polymer nach Anspruch 1-8, dadurch gekenn zeichnet , dass es folgende Formel hat;P-O-CH2-CHCOH)-CH2-O-(CH2)^-CH2-CHCOH)-CH2-S2O3".11 . Polymer nach Anspruch 1-8, dadurch gekenn zeichnet , dass es folgende Formel hat:P-O-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-S2O3".12. Produkt nach Anspruch 1-8, dadurch ge kenn zeichnet , dass es fol ende Formel hat:P-O-CH2-CH(S2O,509850/102013. Polymer nach Anspruch 1-11, dadurch gekenn zeichnet , dass die darin angegebenen S2O3 -Gruppen ganz oder teilweise auf -SH-Gruppen überführt oder durch diese ersetzt wurden.14. Polymer nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , dass die -SH-Gruppen ganz oder teilweise auf "S-S-(Disulfid-)--Gruppen überführt wurden.15. Polymer nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Thiosulfatgruppen ganz oder teilweise auf -SH-Gruppen überführt oder mit diesen ersetzt wurden.16. Produkt, das aus einem Produkt nach Anspruch 1-13 hergeleitet wurde mit der· allgemeinen FormelP-C-V
O JL jwobei P-S- dem Rest von einem Polymerthiosulfat nach Anspruch 1-12 oder einem Polymerthiol nach Anspruch 13 entspricht, und wobei Y eine Gruppe bedeutet, die dem Produkt eine markante Reaktivität gegenüber einer organischen Thiolverbindung oder einen Thiolgruppen enthaltenden Partikel der Formel H-S-P1 aufweist, dadurch gekennzeichnet , dass das Produkt P-S-Y beim Kontakt mit einem thiolhaltigen Produkt vorgenannter Art eine Reaktion des TypusP-S-Y + H-S-P' > P-S-S-P' + Y1"gibt, wobei Yf einer in gegensätzlicher Richtung verlaufenden Reaktion entzogen wird., entweder indem das Gleichgewicht Y' 4-^-> Yn weit zu Yw verschoben ist oder indem Y' selbst ausserstande ist, mit dem aktivierten Gel zu reagieren.509850/102017. Produkt nach Anspruch 16, dadurch gekenn zeichnet, dass Y die Struktur— Ohat, wobei R durch Verschiebung des Gleichgewichtes in der Reaktion zwischen der Thiolthionform -SR^-S=R zur Thionform hin, gekennzeichnet ist.18. Produkt nach Anspruch 17, dadurch gekenn zeichnet , dass Y die Formel-S-C-N(A)0
H 2hat, wobei A eine Alkyl-Gruppe bezeichnet, d.h. in das Molekül Tetra-Alkyl-Thiuramdisulfid(A)2-N-C(S)-S-S-C(S)-N-(A)2
eingeht.19. Produkt nach Anspruch 16, dadurch gekenn zeichnet , dass Y die Struktur-M(E)-N(H)-E
hat, wobei E eine elektronenattrahxerende Gruppe bezeichnet,20. Produkt nach Anspruch 16 und 19, dadurch gekennzeichnet , dass Y die Struktur-N(COOA)-N(H)-COOA'
wobei A und AT unter sich gleiche oder verschiedene Alkyl-509850/1020gruppen sind.21. Polymer, hergeleitet von einem Produkt nach Anspruch 16, durch die FormelP-S-S-P'gekennzeichnet, wobei H+S+P' eine organische thiolhaltige Substanz;» beispielsweise ein thiolhaltiges Protein, Peptid^ Aminosäure, Amin, Nucleotid usw. oder ein derartige Gruppen enthaltendes Partikel ist.22. Verfahren zur Herstellung von Produkten nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer zunächst mit einem Reagenz mit zumindest zwei bifunktionellen Gruppen so aktiviert wird, dass zumindest eine der reaktiven funktioneilen Gruppen in jedem Molekül mit dem Polymer verbunden wird und eine bedeutende Anzahl der übrigen in nicht reagierter jedoch aktiver Form verbleiben, wonach das dermassen aktivierte Polymer nach Abwaschen des überschüssigen Reagenzen mit einer Lösung eines Thiosulfats reagiert wird.23. Verfahren zur Herstellung von einem Produkt nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Aktiviermittel ein Epihalohydrin in alkalischer Lösung oder eine Substanz> die in alkalischer Lösung auf diese Substanz als Dxbrompropanol übergeht, angewendet wird.24. Verfahren zur Herstellung eines Produktes nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Aktiviermittel ein Bisepoxid in alkalischer Lösung oder eine Substanz, die unter1 den vorhandenen Bedingungen in diese Verbindung übergeht, angewendet wird.509850/102025. Verfahren zur Herstellung eines Produkts nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Aktiviermittel Divinylsulfon oder dessen Derivate in alkalischer Lösung angewendet werden.26. Verfahren zur Herstellung eines Produktes nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer zunächst mit Allyibromid reagiert wird, wonach Brom an das erhaltene Allyl-Polymer addiert wird und man das dermassen erhaltene Produkt mit einer Thiosulfatlösung umsetzt.27. Verfahren zum Ueberfuhren von Produkten nach Anspruch 13 und 15 auf Thiolpolymere, dadurch gekennzeichnet 3 dass das Thiosulfatpolymer mit einer Lösung aus einem Stoff> der fähig ist -S0CU -Gruppen in -SH-Gruppen zu überführen, behandelt.28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet 5 dass die Ueberführung von Thiosulfat an Thiol mit einer Lösung aus I3 1+ Dimercaptobutan oder dessen Derivaten vorsichgeht.29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet j dass für die Reduktion eine Lösung aus Threo- oder Erytro-1,4-dimercapto-2,3-butandiol5 s.go Dithiothreitol bzw. Dithioerytroitol3 angex«?endet wird =30. Verfahren zur Herstellung von Thiolverbindungen nach Anspruch 13 und 15, dadurch g:e kennzeichnet, dass der nach Anspruch 23-26 aktivierte Gel unmittelbar mit einer Lösung aus Natriumsulfhydrat behandelt wird,31 ο Verfahren zur Herstellung von Produkten nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass509850/ 1020Thiolpclymere einem geeigneten Oxydationsmittel ausgesetzt werden.32. Verfahren zur Herstellung von Produkten nach Anspruch 16 und 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Thiosulfatpolymer in Suspension oder Kolonne unmittelbar mit einer Lösung aus 2-2'-Pyridindisulfid reagiert wird, wonach das Produkt bis zur Freiheit von überschüssigem Reagenz und löslichen Reaktionsprodukten gewaschen wird.33. Verfahren zur Herstellung von Produkten nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Thiosulfat- oder Thiolpolymer in Suspension oder Kolonne mit einer Lösung aus einem Tetraalkyl-Thiuramdisulfid, insbesondere Tetramethyl·-Thiuramdisulfid reagiert wird, wonach das Produkt frei von überschüssigem Reagenz und löslichen Reaktionsprodukten gewaschen wird.34. Verfahren zur Herstellung von Produkten nach Anspruch 19 und 2O3 dadurch gekennzeichnet, dass das Thiosulfatpolymer zunächst nach Anspruch 27-29 auf Thiolpolymer überführt, wonach dieses mit einer angemessenen Azodicarboxylat-Lösung, beispielsweise einer Lösung aus Azodiäthylcarboxylat reagiert und das Polymer danach abgetrennt und gewaschen wird.35. Verfahren zur Herstellung eines Polymers mit der Struktur nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass ein Polymer nach Anspruch 16-20 mit einer Lösung des kovalent zu bindenden Stoffes (HS-P'), der anzunehmend erweise -SH--Gruppen enthält, reagiert, oder wenn es eine Disulfidgruppe derselben enthält, zunächst durch Kontakt mit einem höhersubstituierten -SH-Polymer nach Anspruch 13 oder 15 in Thiolgruppen überführt wird, wonach man das509850/102 0Polymer separiert und wäscht.36. Verfahren zur Rückgewinnung des Thio!polymers aus einem Polymer des Typus P-S-S-P* nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet 3 dass man das Polymer einer reduzierenden Lösung nach Anspruch 27-29 aussetzt, wobei die S-S-Bindung aufgebrochen und ein Thiolpolymer erhalten wird, das nach Aktivieren erneut zum Fixieren der Gruppe B angewendet werden kann.37. Verfahren zur Herstellung von Substitutionsprodukten aus Thiolverbindungen nach Anspruch 13 oder 15S x-jobei H in der -SH-Gruppe durch derartige Radikale ersetzt worden ist, die auf an sich bekannte Weise auf gelöste Thiole eingeführt werden können, dadurch gekennzeichnet, dass die Thiolpolymere Reaktionen unterworfen werden, analog den in Lösung angewendeten, wobei die Reaktionen mit den SH-Gruppen des Polymers ohne nennenswerte Abänderung der physikalischen Struktur des Polymers verlaufen.38. Verfahren zur Chemiesorptionsseparation von thiol- oder disulfidhaltigen Produkten, dadurch gekennzeichnet, dass man Thiol-Disulfidaustauschreaktionen mit Disulfid- bzw. Thiclpolymeren in der chromatografischen Technologie anwendet.39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass derartige Substituenten im Polymer gewählt werden, die die Anwendung des Polymers bei ehromatografisehen Separationsprozessen ermöglichen.40. Verfahren zum Reinigen von Wasser besonders aus kleineren Gehalten an schweren. Metallionen oder metallorganischen Verbindungen unter Zuhilfenahme von Polymeren nach Anspruch 13 oder 150 dad u r ch gekennzeich-509850/ 1020net, dass das Wasser mit dem Thiolpolymer in Verbindung gebracht wird, wobei der Metallion praktisch quantitativ gebunden wird, wonach das Polymer nach Erhalt des erforderten Sättigungsgrades die Regenerierung des Polymers durch Behandlung mit einer Lösung eines für Metallionen starken Komplexbilders durchgeführt werden kann.41. Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet , dass entweder die eine oder beide Stufen kontinuierlich auf einer Kolonne vollzogen werden.42. Verfahren nach Anspruch 40 und 41, dadurch gekennzeichnet , dass das Wasser kommunales Leitungs- oder geeignet vorgereinigtes Abwasser ist.43. Verfahren nach Anspruch 40-42, dadurch gekennzeichnet , dass die abgetrennten Metallionen der Art sind, die in saurem, neutralen oder schwach alkalischem Wasser schwerlösliche Sulfide ergeben.44. Verfahren zum Schützen von biologischen Lösungen gegen mikrobiologischem Zuwachs mit Thio!polymeren nach Anspruch 13 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung in Kontakt mit dem Thiolpolymer gebracht wird, wobei der mikrobiologische Zuwachs durch die reduzierenden und/oder metallkomplexbildenden Eigenschaften des Polymers verhindert wird5 ohne dass das biologische System durch einen gelösten, mehr oder weniger schwer zu trennenden Zuwachsinhibitor verschmutzt wird.45. Verfahren zur Anwendung von Thiopolymeren nach Anspruch 1-13 und 15 für Separationszwecke, dadurch gekennzeichnet , dass man deren Ionenaustauscheigenschaften ausnutzt.509850/ 1020252379a'46 . Verfahren zur Anwendung von Thiosulfatpolymeren nach Anspruch 1-15 zu Separationszweckens dadurch gekennzeichnet , dass man sie in einem Redox-System anwendet.1+7= Verfahren zu?n Immobilisieren thiolhaltiger Proteine oder thioproteinhaltigor Partikel in Polymeren nach Anspruch 13 und 15 j dadurch gekennzeichnet, dass man eine Thiol-Disulfidaustauschreaktion ausnutzt.48. Verfahren beim Immobilisieren nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung oder Suspension zunächst der reduzierenden Wirkung auf eventuelle -S-S-Bindungen mit einem stark substituierten Thiolgel aussetzt, wonach man das thiolhaltige Produkt mit einem Disulfidpolymer reagieren lässt.49. Verfahren zur Anwendung von Polymerprodukten nach Anspruch 16-20 als Stützphase für eine derartige kcvalente Modifizierung einer organischen Verbindung wie z.B. Peptid, Protein-., Saccharid oder Polynucleotide, im Falle sie in Lösung vollzogen würde;, zu intermolekularen Querbindungsreaktionen führen würde.j dadurch gekennzeichnet, dass die organische Substanz entweder unmittelbar, falls sie SH-Gruppen enthält, oder nach Reduktion, falls sie -S-S-Gruppen enthält, oder durch Thiolieren, falls sie keine oder keine ausreichende Menge dieser Gruppen enthält, in einer Sulfid/Disulfid-Austauschreaktion auf ein Polymer nach Anspruch 16-20 immobilisiert wird, wonach die chemische Reaktion auf der immobilisierten organischen Verbindung vollzogen wird, welche dann nach Abwaschen der Reagenz vom Polymer durch Reduktion der S~S~Bindung, z.B. mit Dithiothreitol, befreit wird.50. Verfahren zur Herstellung von Adsorptionskomplexen509850/ 1020zwischen einem Protein·, einem Saccharid oder einem Polynucleotid samt einer biospezifischen, komplementären Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass entweder das Protein, das Saccharid oder Polynucleotid oder ebenfalls die komplementäre Substanz über Disulfidbindung an Thiolpolymere konjugiert wird, wonach im ersten Falle die Komplement ar sub st an ζ auf das polymergebundene Protein, usw. adsorbiert, oder im zweiten Falle das Protein usw. auf die polymergebundene Komplementarsubstanz adsorbiert wird, wonach die gebildeten Komplexe durch Zusatz eines geeigneten Reduktionsmittels nach Anspruch 2 8 oder 29 vom Polymer abgespalten werden können.51. Verfahren zur Ueberführung von Disulfidbindungen auf Polymere nach Anspruch 14 oder 21 oder andere organische Verbindungen 3 vorzugsweise des Typus Protein, Peptid, Aminosäure, Amin, Nucleotid oder Partikel, enthaltend derartige Verbindungen an Thiolgruppen, dadurch gekennzeichnet , dass 1,4-Dimercaptobutan oder deren Derivat, Dithiothreitol oder Dithioerythreitol als Reagenz angewendet wird.509850/ 1020SiLeerseite
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