DE2523793A1

DE2523793A1 - Thiopolymere und derivate sowie verfahren zur herstellung und anwendung derselben

Info

Publication number: DE2523793A1
Application number: DE19752523793
Authority: DE
Inventors: Rolf Erik Axel Verner Axen; Per Jan Erik Carlsson; Jerker Olof Porath
Original assignee: Exploaterings TBF AB
Current assignee: Exploaterings TBF AB
Priority date: 1974-05-30
Filing date: 1975-05-28
Publication date: 1975-12-11
Also published as: GB1506403A; IL47336A0; SE420733B; FR2336415A1; FR2336415B1; JPS517090A; JPS6048703B2; US4048416A; SE7407173L; IL47336A; DK240475A; DE2523793C2

Description

A 15 583 28. Mai 1975

Exploaterings Aktiebolaget T.B.F., Box 40 26 2,
S-403 44 Stockholm, Schweden

Thiopolymere und Derivate sowie Verfahren zur Herstellung und Anwendung derselben

Zur Trennung, Reinigung und Isolierung von Konstituenten biologischer Systeme liegen vielfache, insbesonders chromatografische, Adsorptionsmethoden vor. Die hierbei in Frage kommenden Konstituenten sind nicht allein Moleküle und Molekülkomplexe, sondern ebenfalls organisierte Biosysteme verschiedener Art, beispielsweise Zellen, subzellulare Partikel und
Virus. Ein chromatografischer Verlauf wird auf komplizierte Art durch Wechselwirkungen zwischen Systemen festen, chromatografischen Mediums und den Konstituenten in beweglicher Phase bestimmt, wobei die antreibenden Kräfte bei den Wechselwirkungen elektrostatischer, wasserstoffbindender, ladeüberführender, hydrophober usw. Natur sind.

Man kann äusserst spezifische Sorptionseffekte erzielen indem ein Konstituent in einem System natürlich vorhandener Assoziation-Dissoziation-Ausgleiche durch Fixieren an einen polymeren Träger immobilisiert wird, und das dieserart erhaltene chromatografische Mittel zur Adsorption von komplementären
Konstituenten ausgenutzt wird. Eine derartige Methodik nennt man Bioaffinitätschromatografie.

Das Beanspruchen einer kovalenten Bindung als Grundwahl für
Sorption und Chromatografie in biochemischem Zusammenhang ist

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selten zur Anwendung gekommen. Die Gruppenspezifität ist dabei je nach Enthalt einer gewissen, funktioneilen Gruppe oder Struktur erhältlich. Auch kann mit einem höheren Spezifitätsgrad gerechnet werden, da die Reaktivität funktioneller Gruppen der gleichen Art in komplizierten Biomolekülen aufgrund der sterisch bedingten Mikroumgebung oft variiert,

Das rationale Vorbereiten mehr oder weniger spezifische Adsorbenten für biochemische Trennungen ist oft mit grossen Schwierigkeiten verbunden. Deshalb ist es ratsam von hauptsächlich neutralen, stark hydrophilen und Makromoleküle durchlässigen Trägerpolymeren auszugehen. Das Polymerskelett soll chemisch inert, jedoch mit derartigen derivatbildenden Gruppen substituiert sein, die sich unter milden Bedingungen im Wassersystem in möglichst viele Reaktionstypen einbegreifen lassen, beispielsweise Salzbildung, Komplexbildung, Redoxreaktionen, Substitutions- und Additions- sowie Radikalreaktionen. Die derivatbildende Gruppe kann danach als AdsorptionsZentrum ausgenutzt werden, oder nach geeigneter Derivatisierung so, dass die Bindungsbrücke das Zentrum für die Wechselwirkung ausmacht, oder den eingeführten Substituenten oder Gruppen in der Substituentenstruktur nach geeigneter und endgültiger Derivatisierung das Zentrum für die Wechselwirkung ausmachen können.

Thiole sind präparativ äusserst interessante, funktioneile Gruppen, die sogar in wasserhaltigen Systemen unter milden Bedingungen vielfachen Reaktionen unterliegen. In verschiedenen Reaktionsmechanismen sind Thiolgruppen in Substitions-, Additions-, Oxydations-, Komplex- und Salzbildungsreaktionen unter Bildung von S-C₃ S-S, S-O, S-N, S-Metall und S-Metall- -C-Strukturen einbegriffen. Es sei hierbei ausserdem bemerkt, dass Thiolgruppen leicht Reaktionen über Radikalmechanismen unterliegen.

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In der biochemischen Separationstechnik haben Agarosegele, insbesondere in Perlenform, als Trägergele eine bedeutende Rolle gespielt. Die rasche Entwicklung der biospezifischen Affinitätschromatografie während der letzten Jahre hat sich fast ausschliesslich auf Agarosegele in Perlenform gestützt. Hierbei hat sich oft als günstig erwiesen, wenn das Zentrum des chromatografischen Mittels für die Wechselwirkung sich auf einem Arm oder Spacer befindet, mit gewissem kleinsten Abstand zum Polymerskelett des Trägerpolymers. Andere, hydrophile, hydroxylgruppenhaltige Polymere sind in diesem Zusammenhang ebenfalls in gewissem Masse zur Anwendung gekommen, z.B. quergebundenes Dextran.

Thiolgruppensubstituierte Agarosegele wurden von Custrecasas, J.Biol. Chemistry, 245, 3059 (1970) hergestellt, aus ω-Alkylderivaten der Agarose durch Reaktion mit Azetyl-Homocysteine-Thiolakton. Die thiolierten Produkte wurden nach weiterer Derivatisierung als Absorbent für Bioaffinitäts-Chromatografie verwendet. Brocklehurst et.al., Biochem.J.133, 573 (1973) hat thiolierten Agarosegel durch direkte Schaltung von Glutathion an bromzyanaktivierten Agarosegel, ohne die Thiogruppe zu schützen, hergestellt. Eldjarn et.al., Acta Chem.Scand., 17 2610 (1963) hat thiolierte Gele aus epichlorhydrinquergebundenem Dextran hergestellt indem er den Gel durch Behandlung mit Aminoäthylsulfat mit Aminogruppen substituierte und danach mit Azetyl-Homocystein-Thiolakton reagieren liess. Nach Behandlung mit bifunktionellem Quecksilberreagenz benutzte man die Produkte zum Isolieren von Thiolproteinen aus Proteinen ohne Thiolgruppen.

Agare- und Agarosederivate mit Seitenketten der Terminalstrukturen -CH(OH)-CH₂(SH), -CH(SH)-CH₂(OH), -CH₂-CH₂(SH), -CH(SH)-CHo oder -CH(SH)-CH₀(SH) können ohne dass man das Gelnetzwerk der Gelperlen zerstört aus perlenförmigen Agare- und Agarosegelen präpariert werden. Man behandelt die Aus-

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gangsgele zunächst auf bekannte Weise mit Epihalohydrin, 2₃3- -Dihalopropanol, bifunktionellen Oxiranen, Divinylsulfon oder Allylhalogenid mit darauffolgender Halogenierung in Dihalopropyläther gemäss nachstehendem Reaktionsschema 1,2,3 und

Die derartig erhaltenen reaktiven Derivate werden daraufhin mit einer wässrigen Lösung des NaSH oder Na₂S₂O sowie im letzteren Falle abschliessend mit einem geeigneten Reduktionsmittel, beispielsweise 1,4-Dimerkaptobutan und dessen Derivaten behandelt, wobei besonders Threo- oder Erytro-1,4-Dimerkapto-2,3-Butandiol Vorzüge aufgewiesen haben. Diese Derivate werden nachstehend Dithiothreitol bzw. Dithioerythreitol benannt. Wird Epihalohydrin, Dihalopropanol oder Allylhalogenid angewendet, vollzieht sich eine lieber brückung zwischen dem polymeren Gelnetzwerk und der vorgenannten Terminalstruktur über -0-CH₂-Glieder. Bei der Anwendung von geeigneten bifunktionellen Oxiranen erhält man direkt einen Arm- oder Spacer-Effekt, indem Substituenten langkettiger Natur beispielsweise folgendermassen ausgebildet werden: -O-CH₂-CH(OH)-CH₂-O-(Alkyl)-O-CH₂-terminale Gruppe. Bei Divinylsulfon ergibt sich als Anbindungsstruktur die -0-CH₂- -CH₂-SO₂-terminale Gruppe. Bei Anwendung von geeignet C-alkylierten Epihalohydrinen, Dihalopropanolen, Bisoxiranen, Vinylsulfonen oder Ally!halogeniden erhält man C-alkylierte Terminalstrukturen. Diese Reaktionen können auch auf anderen hydrophilen, hydroxylgruppenhaltigen Polymeren, beispielsweise Polyvinylalkohol, partiell hydrolysiertem Kopolymer aus Polyvinylchlorid-Polyvinylazetat, Cellulose und epichlorhydrinquergebundenem Dextran, z.B.Sephadex^—' der Firma Pharmacia Fine Chemicals₃ Upsala, ausgeführt werden, jedoch gleichfalls auf Aminogruppen enthaltenden Polymeren, z.B. aminogruppensubstituierten Polyakrylamiden.

In gewissen Fällen wünscht man, dass der Polymer permeabel ist, in Gelform, in anderen Fällen ist dies weniger erstre-

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benswert.

Es hat sich in der Praxis als vorteilhaft erwiesen, dass man, um den abgetrennten und auf Lager geführten Produkten eine grössere Beständigkeit gegen oxydative Einwirkung zu geben, die Thiopolymere in Form von primär gebildeten Thiosulfatpolymeren oder durch teilweise Oxydation gebildeten Disulfiden, -S-S-, zu lagern und zu verkaufen. Diese Produkte können, zwecks Anwendung in Thiolform, einfacherweise mit einer Lösung aus Dithiothreitol reduziert werden. Eine derartige reduktive Behandlung kann auch bei einem langer gelagerten Thiopolymer angebracht sein.

Thiolgele können bei ungefähr pH 7 mit beispielsweise Jodazetamid und 2,4-Dinitrofluorbenzen alkyliert werden. Die Addition von Thiolen an C=C-Doppelbindung führt auch zu Thioätherstrukturen. Die nukleophile Addition ist normalerweise träge, viele biologische Verbindungen enthalten jedoch Doppelbindungen, durch Konjugierung oder Vizinalgruppeneffekte aktiviert. Schwefeladdukte sind somit von α,ß-ungesättigten Aldehyden, Ketonen, Laktonen, Nitrilen und Äthern auszugänglich. Chinoide Strukturen sind im Zusammenhang mit Naturprodukten antreffbar und die Addition von Thiolen an Chinone ist ein interessanter Fall, Im chromatografischen Zusammenhang sind die Thioätherstrukturen stabil.

Reaktionen des obigen Typus, die zu stabilen Thioäthern führen, machen die Thiolgele für Spezialpreparationen von biospezifischem Adsorbent,Adsorbent für hydrophobe Affinitätschromatografie. Adsorbent mit auf Charge-Transfereffekte basierten Eigenschaften usw., sowie als Ausgangsgele zur Introduktion neuer, chemisch reaktiver, funktioneller Gruppen für Chemiesorption, kovalente Chromatografie, chemisches Immobilisieren und Modifizieren, äusserst geeignet.

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Addition und Kondensation der Thiole an Aldehyde und Ketone führen zur Hemimerkaptal-, Merkaptal-, Hemimerkaptol- und Merkaptol-Bildung, was einen denkbaren Prinzip für reversible Chemisorption ausmacht.

OH

P-CH₂-SHtR-CHO > P-CH₂-S-CH.

Die verschiedenen Verfahren zur Herstellung von Thiosulfat bzw. Thiolpolymeren gehen aus nachstehenden Reaktionsformeln hervor.

NaSH ?^H P-OHtCH₀-CH-CH₀Cl > P-O-CH₀-CH-CH₀ -—> P-O-CH₀-CH-CH₀-SH.

V ^{2 2}V^{2 2 2}

Reaktionsschema 1A. Herstellung von Thiolagarose mittels Epichlorohydrin und Natriumwasserstoffsulfid.

OH

P-O-CH₀-CH-CH₀— P-O-CH₀-CH-CH₀S₀O₀Na, \ / ^{l l} 2 2 3

Reaktionsschema 1B. Herstellung von Thiopolymer mittels Epichlorohydrin und Thiosulfat.

P-OHtCH₀-CH-CH₀-O-(CH₀),,-0-CH₀-CH-CH₀ > P-O-CH₀-CH-CH₀-O-

^X0^X V OH

Na₉S₉Oo
-(CH₂)^-O-CH₂-CH-CH₂ — P-O-CH₂-CrI-CH₂-O-(CH₂)^-O-CH₂-CH-

^xo^/ Oh Oh

-ch₂-s₂o₃ ^-na⁺ p-o-ch₀-ch-ch₀-o-(ch₂)^-o-ch₂-ch-ch₂-sh.

Oh " Oh

Reaktionsschema 2. Herstellung von Thiolagarose mittels 1,4- -Butandiol-Diglyzidyläther, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol (DTT). Die Thiosulfatverbindung kann dabei abgetrennt und als lagerungsbeständiges Produkt verkauft werden, das einfacherweise zur Thio!herstellung bzw. wie nachstehend zur Herstellung von reaktivem Polymer zum Fixieren von thiolhaltigen Stoffen herangezogen werden kann.

Na₉S₀O₀ P-OHtCH₂ = CH-SO₂-CH=CH₂ > P-O-CH₂-CH₂-SO₂-CH=CH₂ — >

P-O-CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂-S₂O₃ ^-Na⁺ P-O-CH₂-CH₂-SO₀-CH₂-CH₂-

-SH. 509850/102 0

Reaktionsschema 3. Herstellung von Thiolagarose mittels Divinylsulfon, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol (DTT)

P-OHtBr-CH₂-CH=OH₂ ■ » P-O-CH₂-CH=CH₂

P-O-CH₂-CH-CH₂-Br "****°* -> P-O-CH₂-CH -CH

^S°"^N

Br₂

Br

P-O-CH₂-CH-CH₂-SH.
RH

Reaktionsschema 4. Herstellung von Thiolagarose mit Allylbromid, Brom, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol.

Als in diesem Zusammenhang interessante Thio-Verbindungen der verschiedenen Polymere kann man Thioester der Carbonsäuren nennen, die nach konventioneller Technik synthetisiert werden können. Sie unterscheiden sich in vieler Hinsicht von den Estern der Alkohole. Ihre Bedeutung in chromatografischem Zusammenhang ist noch nicht vollständig erwiesen worden. Thioester sind in biologischen Systemen von grosser Bedeutung. Sie sind u.a. Hochenergieverbindungen, gute Azylierungsreagenzen und die Strukturen aktivieren α-Kohle an die Azylgruppe» Immobilisierte Thioester dürften deshalb in verschiedenem biotechnischen Zusammenhang interessant sein, beispielsweise als im V/asser nicht lösliche Reagenzen zur Azylierung von Proteinen.

Sehr interessant ist₃ dass Thiole leicht oxydieren. Bei den vielen Oxydationsprodukten spielen Disulfide eine besonders wichtige Rolle. Im Vergleich zu Thiolgruppen sind die DisulfidStrukturen üblicherweise nicht besonders reaktiv, sie können allerdings sogar unter physiologischen Bedingungen Reduktions- und Austauschreaktionen unterlaufen. Die Reduk-

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tion von Disulfid kann mit Thiol geschehen und die Thiol- -Disulfidaustauschreaktion ist ausserordentlich bedeutungsvoll in biologischen Systemen.

R-SH + R'-S-S-R' <r2r R-S-S-R¹ + R'-SH

R-SH + R-S-S-R'4=z^ R-S-S-R + R'--SH 2 R-SH + R'-S-S-R¹ 4=^ R-S-S-R + 2 R'-SH

Bei der Reduktion von -S -S-Bindungen mit polymerfixierten Thiolgruppen sind allerdings hochsubstituierte Thiolpolymere erforderlich. Diese können vorteilhafterweise angewendet werden wenn man beispielsweise Disulfidproteine zu Thiolproteinen reduzieren will. Dabei erhält man im Polymer Disulfidbrücken, die durch Reduktion mit z.B. dem vorgenannten Reduktionsmittel Dithiothreitol in die Thiolform zurückgeführt werden können.

Enzyme enthalten des öfteren Thiolgruppen und in vielen Fällen sind eines oder mehrere direkt mit den Aktivitätseigenschaften verknüpft. Gewisse Plasmaproteine wie Albumin und Zeruloplasmin enthalten somit Thiolgruppen. Subzellulare Partikel enthalten proteingebundene Thiolgruppen wie auch andere Typen von Thiolen. Die meisten Proteine enthalten allerdings -S-S-Brücken_a die, wie vorgenannt, leicht auf Thiole überführt werden können unter Zuhilfenahme von geeigneten hochsubstituierten Thiolpolymeren des beispielsweise in dieser Anmeldung beschriebenen-Typus.

Andererseits können Thiolpolymere leicht auf Polymere überführt werden mit für die Disulfid-Thiol-Ausbeute stark reaktiven Disulfidgruppen. Wird ein derartiges Polymer mit einem Thiolprotein reagiert-, erhält man polymeres -S-S-Proteinpolymer. Man kann allerdings wie nachfolgend erläutert wird, ein Thiolpolymer auch andersartig aktivieren, in dem man ihn leicht an eine ^hiolhaltige Verbindung fixieren kann.

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Thiolpolymere sind, entweder direkt oder nach Ueberführung auf hierzu geeignete Disulfidstrukturen oder dergleichen, mit Vorteil bei der Chemiesorption von Naturproduktmischungen, beispielsweise zur Separation von Proteinen, verwendbar.

Diejenigen Disulfidpolymere, die zu einer raschen und vollständigen Reaktion mit einer Thiolkomponente in der Lösung führen, nennen wir "reaktive" Polymerdisulfidstrukturen. Prinzipiell können diese intern sein und die erhöhte Reaktivität dürfte solchenfalls der konformationellen Spannung zuzuführen sein, insbesondere der Ringspannung oder, was am wichtigsten erscheint, externe, d.h. des Typus Polymer-S-S-L, wo die Reaktivität durch die Ligande L bedingt wird. Diese Ligande L muss, damit sich die Reaktion Disulfid-Thiol möglichst vollständig gegen die Ueberführung von Thiolgruppe auf Disulfidgruppe vollzieht, derartige Eigenschaften haben, dass beim Aufspalten der S-S-Brücke der zum L gehörende Schwefel durch Tautomerie oder Resonanz in Bezug auf die Thiol/Disulfidausbeute auf niedrige Nukleophilität gebracht wird. Als Beispiele für derartige S-S-Verbindungen können gemischte Verbindungen zwischen SH-Polymer und LSH genannt werden, für welche der Ausgleich LSHi=^L" = S gilt, wobei die Thionform überwiegt. Ein Beispiel für L ist 2-Thiopyridon. Ein weiteres Beispiel sind S-S-Strukturen, erhalten aus Thiopolymer und Dxthxocarbonsaurederivaten, wobei eine Resonanzstruktur die Ursache zur Irreversibilität der Abspaltung sein kann. Als Beispiel wird Tetramethylthxuramdisulfid genannt.

Derartige ligandisierte Thiolpolymere können aus Thiolpolymeren durch Reaktion mit L-S-S-L hergestellt werden, wobei die Reaktion so gesteuert werden kann, dass sie sich auf dem Thiolgel bis praktisch zur stochiometrisehen Umsetzung von Polymer-S-S-L durch Thiol-Disulfidausbeute vollzieht. Die "Treibkraft" beruht hierbei analog dem vorgenannten, auf L

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betreffs Ausnutzen der Polymer-S-S-L-Reaktion mit einer Thiol- -Verbindung in Lösung.

Wir haben allerdings gefunden, dass die Ligandisierung von Thiolpolymeren auch direkt durch Behandlung des Thiosulfatesterpolymeren mit L-S-S-L-Reagenz vollzogen werden kann, ohne dass hierbei vorerst eine Reduktion des Thiosulfatesterpolymers zu Thiolpolymer vorgenommen wurde. Dies bedeutet einen erheblichen technischen und ökonomischen Fortschritt, weil hierbei vom lagerungsbeständigen Thiosulfatpolymer ausgegangen werden kann und man in einer einzigen Reaktionsstufe mit praktisch theoretischer Ausbeute das stark reaktive PoIymer-S-S-L-Produkt bei Anwendung von beispielsweise vorgenannter Disulfidverbindungen erhalten kann. Ein ganz anderes Verfahren zur Herstellung von Polymerdisulfidliganden der hier vorgesehenen Art z.B. des Typus Polymer-S-S-Prot (wobei Prot = Protein) besteht darin, dass ein Polymer-SuIfeny!derivat mit einem Proteinthiol zum Reagieren gebracht wird. Ein derartiges SuIfenylderivat erhält man beispielsweise durch Reaktion zwischen einem Polymer-Thiol und Azodiäthylcarboxylat gemäss der schematischen Formel 1) wonach die Reaktion mit dem Proteinthiol gemäss 2) durchgeführt werden kann:

1) P-SHtC₂H₅OOC-N=N-COOC₂H₅ P-S-N-N-COOC₂H₅

COOc₂H₅

2) P-S-N-N~COOC₂H₅+Prot-SH P-S-S-Prot+C^OOC-NH-NH-

COOC₀H_n

Äthylcarboxylatgruppen können durch andere Carboxylatgruppen oder mit anderen elektronenattrahierenden Gruppen überhaupt, ersetzt werden. Die Reaktion, wenn es um die Immobilisierung eines Thiol-Proteins geht, besteht also in diesem Fall aus zwei Stufen, wobei zuerst die Aktivierung des Thiolpolymeren

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zu einem Alkylsulfenylhydrazid vollzogen wird. Dieses ist lagerungsstabil in wässrigem Milieu und kann daraufhin bei milden Bedingungen sogar bis zu schwach saurem Milieu, z.B. pH = 4 oder weniger_a mit einer gelösten Thiolverbindung unter Bildung eines Polymer~S-S-Prot oder analogen Produktes reagiert werden. In obigen Diskussionen wurde HS-Prot als Beispiel für eine schaltungsbare Thiol-Verbindung angegeben. Dies darf selbstverständlich nicht eine Begrenzung bedeuten, da die Prozesse mit beliebigen gelösten Thiol-Verbindungen durchgeführt werden können, jedoch auch mit Partikeln wie Zellenfragmente, Virus u.a., vorausgesetzt dass diese auf der zugänglichen Oberfläche -SH-Gruppen (natürliche oder durch Eingriff hervorgerufene) enthalten.

Die Entwicklung der biospezifischen Technik in der Biochemie ist grösstenteils parallel zu der Entwicklung der in Wasser nicht löslichen Enzymen verlaufen. Die üblichen Methoden zum Immobilisieren von Enzymen enthalten kovalente Bindung oder Adsorption zu Polymerträger. Eine besonders interessante Möglichkeit ist die obengenannte Immobilisierung des Enzyms durch Disulfidbindung. Diese Bindung lässt sich bei geeigneten, reduzierenden Bedingungen abspalten. Eine Säule aus immobilisiertem Enzym, das nach einiger Zeit seine Aktivität verloren hat, kann daraufhin in situ regeneriert werden durch reduktives Abspalten von inaktiviertem Enzym und erneute Schaltung von frischem Enzym kann im Säulenreaktor vorgenommen werden, fortsetzenderweise in situ, nachdem eine neue Aktivierung des Polymers vollzogen wurde.

Ein anderer Typus der reversiblen Immobilisierung des Enzyms, die in letzter Zeit zur Anwendung gekommen ist, gründet sich auf eine hydrophobe Interaktion zwischen Enzym und einem gemischten hydrophil/hydrophoben Trägerpolymer. Eine derartige Immobilisiertechnik hat bedeutende Vorteile, weil man das Enzym, nachdem es ganz oder teilweise seine Aktivität ver-

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loren hat, üblicherweise vom Polymer abspalten kann, indem man den Salzhalt ändert oder das Milieu (siehe z.B. die schwedische Patentanmeldung Nr. 7410550-3). Die genannte Abspaltung des inaktivierten Proteins kann zeitweise Schwierigkeiten bereiten. Eine Möglichkeit hierbei ist, dem hydrophilen Polymer die hydrophobe Struktur anzuschliessen, beispielsweise eine hydrophobe Struktur von Alkylmercaptanen, über eine Disulfidgruppe immobilizieren, und die Abspaltung des Enzymproteins durch Reduktion der Disulfidgruppen geschehen lassen und dabei eine gleichzeitige Abspaltung der Enzym-Alkylstruktur erhalten.

Es scheint allerdings möglich zu sein, formelmässig die vorgenannten Methoden zur Immobilisierung von thiolhaltigen Stoffen auf einem Thiopolymer, beispielsweise Thiol- oder Thiosulfxdpolymer, folgendermassen zusammenzufassen: Es gilt zunächst ein reaktives Polymerderivat herzustellen mit der allgemeinen Formel

P-S-Y

wobei PS in den Polymeren P-SH bezw. PS-SO₃Na enthalten ist wie in dieser Anmeldung angegeben wird, während Y eine Gruppe nennt0 die so bestimmt ist, dass man durch die Reaktion P-S-Y + H-S-Protf-=^ P-S-S-Prot + Z

(wobei H-S-Prot eine thiolhaltige organische Verbindung, z.B. ein Protein oder ein thiolhaltiges Teilchen ist) ein Produkt Z erhält, das nicht nennenswert imstande ist unter vorherrschenden Bedingungen die angegebene Reaktion in Gegenrichtung zu treiben. Die Y-Gruppe erfüllt diese Anforderungen auf mindestens zwei verschiedenen Wegen.

a) Gewisse Disulfide des Typus A-S-S-A sind, wie wir festgestellt haben, imstande mit einem Thiosulfat- oder Thiolpolymer zu reagieren unter Bildung eines reaktiven Disulfidpolymers gemäss der allgemeinen Formel (1)

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(1) P-S-H + A-S-S-AV=S¹P-S-S-A + Z'

wobei Z' unmittelbar in einen Thion/Thiolgleichgewicht eingeht, das lang zur Thionform verschoben sein muss.

Anstelle des P-S-H-Polymers kann man direkt ein P-S-SO^Na Polymer, d.h. ein Thiosulfatpoiymer verwenden, also (2)

(2) P-S-SO₃Na + A-S-S-A«=±P-S-S-A + Z"

wobei Z'' die gebildeten Reaktionsprodukte angibt, welche, wie auch Z, der Reaktion in gegensätzlicher Richtung entzogen wBrden sollen.

Ferner werden Reaktionen zwischen den reaktiven Disulfidpolymeren und einer gelösten Thiolverbindung, beispielsweise einem thiolhaltigen Protein nach Formel P-S-S-A + HS-Prot<i^=* P-S-S-Prot + Z

durchgeführt. Das erhaltene Polymer-Protein kann, wie oben genannt, durch ein geeignetes Reduktionsmittel in P-S-H + Prot-Rest abgespalten werden.

b) Azodicarboxylate der Formel R.. -N=R-R.. geben beim Kontakt mit einem Thiolpolymer ebenfalls aufgrund der elektronenanziehenden Eigenschaften der R.-Gruppen, zu thiolhaltigen Verbindungen stark reaktive Polymere der Formel P-S-H + R₁N=N-R₁ ^P-S-N-NH-R₁,

d.h. unter Bildung eines jj/ydrazid in Lösung, das die Reaktion nicht rückwärts führen kann.

Es ist beachtenswert, dass trotz dessen Reaktivität die aktivierten Polymere beider genannter Typen separiert, gewaschen und auf Lager geführt werden können, ohne dass sich die Aktivität nennenswert verringert. Die Schaltung von beispielsweise H-Prot kann bei einer späteren Gelegenheit vorgenommen werden. Enzyme, die keine Thiolgruppen, sondern Disulfid-

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strukturen enthalten, können mit hochsubstituiertem Thiolgel reduziert werden, wonach man die gebildeten Thiole zum Immobilisieren verwendet oder man kann das Enzym durch geeignete Thiolreagenz in Lösung mit Thiolgruppen substituieren, die danach zum Immobilisieren benutzt werden. Umsetzungen mit polymergebundenen Thiolgruppen, die zu stabilen Thioätherstrukturen führen, können ebenfalls beim Immobilisieren von Enzymen Anwendung finden, weil das Polymer dadurch mittels geeigneter Reagenz mit neuen funktionellen Gruppen oder adsorbenten Zentra versehen werden kann, die direkt oder mit geeigneter Reagenz kovalent an eine funktionelle Gruppe im Enzym gebunden werden können oder das Enzym adsorbieren.

Beim Immobilisieren eines Enzyms ist nicht nur das Immobilisieren an sich von Bedeutung. Bedeutungsvoll ist oft die beim Einführen derartiger funktioneller Gruppen auf das polymere Netzwerk, die das Enzym zur erhöhten Stabilität anregen oder den Konstituent im Substrat-Produkt-Inhibitorsystem beeinflussen; erhaltene₅ erhöhte katalytische Aktivität. Da sich Reaktionen mit Thiolgelen unter sehr milden Bedingungen in wässriger Lösung vollziehen, können derartige additionelle Reaktionen auch nach dem Immobilisierprozess durchgeführt rwerden.

Eine analoge Methodik kann beim Immobilisieren von Mikroorganismen, Zellen, subzellularen Partikeln, Membranfragmenten, Receptor-Sites u.a. angewendet werden.

Die fraglichen Thiolpolymere verwendet man für verschiedene andere Zwecke in biologischem Zusammenhang, Ihre Metall-Komplexbilde- und Elektronenaustauscheigenschaften können angewendet werden um Thiolgruppen enthaltende biologische Systeme vor der Selbstoxydation zu schützen, in dem man das biologische System zusammen mit Thiolgel verwahrt. Es ist bereits bekannt, dass die Autooxydation des Thiols durch ge-.

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wisse Metallionen wie CU und dem entsprechenden Oxydationsprodukt, d.h. Disulfid, katalysiert wird. Kontinuierlicher Elektronenaustausch zwischen gebildetem Disulfid und Thiolgel hält die Thiolkonzentration in der Lösung konstant, bis der Elektronenaustauscher verbraucht ist.

Thiolpolymere können auch als Stützphase bei chemischen Abänderungen von Naturproduktsubstanzen verwendet werden. Die Bindung a_ns Polymer geschieht dabei durch die hydrolytisch ·· stabile Disulfidbindung, die allerdings nach vorgenommenen Umsetzungen reduktiv abspaltbar sein kann. Da Naturproduktsubstanzen oftmals polyfunktioneil sind, führen in homogener Phase hergestellte Umsetzungen leicht zu intermolekulare Querbindungsreaktionen, die man verhindern könnte wenn man die Umsetzung in der Polymerphase geschehen lässt. Eine weitere Möglichkeit, die unter milden Bedingungen verlaufende reduktive Abspaltung der Disulfid-Strukturen zu verwenden ist, die eine Komponente in einem biologischen Assoziations-Dissoziationskomplex über die Disulfidstruktur an ein Thiolgel zu binden, wonach Adsorbat und Ligande zusammen abgespalten werden können. Dies ist besonders wertvoll, da ein spezifischer Assoziations-Dissoziations-Komplex eines heterofunktionellen Moleküls so ausgebildet wird, dass eine gewisse bemerkte biologische Aktivität aufgrund der beanspruchten Komplexbildung nicht nennenswert inhibiert wird.

Viele Metallionen und metallorganische Verbindungen bilden mehr oder weniger stabile Komplexe mit den hier aktuellen Thiolgelen. Thiolgele können somit als in Wasser nicht lösliche Komplex-bilde Tj jedoch ebenfalls als Medium für Chromatografie über Metallkomplex-Ausgleiche beispielsweise zur Trennung von metallhaltigen Proteinen verwendet werden.

Die Erfindung wird anhand nachstehender Ausführungsbeispiele und beigefügten Zeichnungen näher erläutert.

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Fig. 1 zeigt die Reduktion von Amyloglykosidase mit Thiolagarosegel als Funktion von pH und

Fig. 2 die Regenerierbarkeit einer Kolonne mit aktiviertem Thiolagarosegel.

Beispiele

Beispiel I. Herstellung von oxiranaktivierten Agarosegelen mit verschiedenem Substitutionsgrad in Bezug auf Oxiranstrukturen.

3 g gewaschener und abgesaugter Agarosegel in Perlenform, 2-6% Agarose, wurden in 2,4 ml 1M Natriumhydroxydlösung suspendiert. Man tropfte Epichlorhydrin unter Rühren bei Raumtemperatur hinzu und liess die Temperatur danach bis 60 C ansteigen und rührte das Reaktionsgemisch 2 Std. lang. Der Gel wurde auf Glasfilter mit Wasser bis zur neutralen Reaktion gewaschen. Das Ergebnis ist aus Tabelle 1 ersichtlich.

Man unternahm Versuche analog dem Verfahren a)„

3 g gewaschener und abgesaugter Agarosegel in Perlenform, 2-6% Agarose, wurden in 1,6 ml 2,5 M Natriumhydroxydlösung suspendiert, wonach man 12 mg Natriumborhydrid zusetzte. Das Bisepoxyd wurde tropfenweise unter kräftigem Rühren zugesetzt. Die Reaktionszeit betrug 6 Stdn bei Raumtemperatur. Man wusch den Gel auf Glasfilter mit Wasser bis zur neutralen Reaktion, danach mit 20 ml Azeton und abschliessend mit Wasser bis das Azeton abgetrieben war.

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d) Mit^liS-Butandiol-DiglYcidYläther.

Man unternahm die Versuche analog dem Verfahren c).

e) Bggtimmung_von_gelgebundenen_Oxiranstrukturen.

Eine Gelmenge entsprechend 10-100 yäquiv. Oxiranstrukturen wurde gewaschen und in 10 ml dest. Wasser suspendiert. pH der Suspension wurde auf 7,00 eingestellt, wonach 1,00 ml der Gelsuspension in einen Titrierungsbehälter aus Kunststoff mit Kunststoffpipette überführt wurde. Beim Abpipettieren wurde die Suspension kräftig mit einem Magnetstäbchen umgerührt. 1,00 ml 2 M Natriumthiosulfatlösung mit pH 7₃00 wurde der Gelsuspension zugesetzt, daraufhin wurde mit pH-Stat mit 5OmM Salzsäure kontinuirlich titriert. Die Titrierdauer betrug 30-120 Minuten und beruhte auf dem Oxiranenthalt des Gels. Während der ganzen Titrierzeit wurde magnetisch umgerührt. Man bestimmte den Feststoff-Gehalt der Gelsuspension durch Abpipettierung von 5,0 ml der Suspension auf einen kleinen Glasfiltertrichter, danach wurde mit Azeton/Wassergemischen und Azeton gewaschen und 24 Stdn bei 100 C im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.

BeispielII. Herstellung von divinylsulfonaktivierten Agarose gelen mit verschiedenein Substitutionsgrad in Bezug auf Vinylsulfonstrukturen.

(R)

Sepharose^6B₅ ein perlenförmiger Agarosegel, ca 6% PoIysaccharid enthaltend, hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals Uppsala, wurde gewaschen und auf Glasfilter abgesaugt. 10g des Agarosegels wurden in 10 ml 0,5 M Natriumcarbonatlösung mit pH 11 suspendiert j wonach man Divinylsulfon zusetzte und das System 70 Minuten unter Rühren reagieren liess. Das Reaktionsprodukt wurde mit Wasser auf Glasfilter gewaschen. Danach analysierte man das Produkt hinsichtlich der Vinylsulfonstrukturen durch Reaktion mit überschüssigem Natriumthiosulfat und Titrierung auf gebildete OFI -Ionen mit Salz-

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säure nach Verfahren I e). Die Resultate für die verschiedenen Divinylsulfonmengen sind aus Tabelle II ersichtlich.

Beispiel III. Herstellung von 2,3~Dibrompropyläther-Agarosegelen mit variierendem Substitutionsgrad.

100 ml gewaschener und abgesaugter> epichlorhydrinquergebundener Agarosegel wurden mit 100 ml 5 M Natriumhydroxydlösung, die mit 500 mg Natriumborhydrid versetzt war, vermischt und danach setzte man der Suspension Allylbromid hinzu. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rückführkühlen bei kräftigem Umrühren während M- Stdn auf 7 0°C erhitzt. Nach der Reaktion wurde der Gel auf Glasfilter mit Wasser und Alkohol/Wassergemischen samt 96%-igem Alkohol und Kohlenstofftetrachlorid gewaschen. Man suspendierte den Gel dann in 100 ml Kohlenstofftetrachlorid und Brom der verbliebenen Bromfarbe zugesetzt. Der bromierte Gel wurde auf Glasfilter mit Alkohol und Wasser gewaschen. Die. Resultate wurden in Tabelle III zusammengefasst-

Beispiel IV, Herstellung von "Bunte Salz"-Agarosegelen mit variierendem Substitutionsgrad.

Herstellung jvqn_"Bun^^
i.-2 il-dibromgro^

-bu^anjiiol-digly^
3 g je abgesaugtem Gel von Ia), Ib), Ic) und Id) wurden mit 0,5 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,25, gewaschen. Man suspen dierte den erneut abgesaugte Gel in 3 ml des gleichen Phosphatpuffers und setzte 3 ml 2 M Natriumthiosulfatlösung hinzu. Danach schüttelte man das Reaktionsgemisch 6 Stdn bei Raumtemperatur, wonach mit Wasser gewaschen wurde. Ein derartiges Produkt wird ^!;Bunte Salz"-Gel genannt. Die Schwefelanalysen gehen aus Tabelle I hervor.

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b) Herstellung^ypn_"Buntp,Salz/'-Agar osegelen, aus divinylsul-

Die Herstellung erfolgt analog der Präparation aus epoxyaktivierten Gelen nach a)„ Die Schwefelanalysen sind aus Tabelle II ersichtlich.

c) Herstellung_von_"Burte .Salz"zAgarosegelen_aus_Dibromp_rogYl; §ther§garosegelen.

5 g aus wässriger Suspension abgesaugter 2,3-Dibrompropylätheragarose wurden in einer Lösung von 3,7 5 g Na2S2Ü„ . 5H„0 gelöst in 5 ml Wasser suspendiert. Man liess das Gemisch 5 Stdn unter Umrühren bei. 95 C reagieren, wonach der Gel auf Glasfilter mit Wasser gewaschen wurde, bis er salzfrei war. Die Schwefelanalyse ist aus Tabelle III ersichtlich.

Beispiel V. Herstellung von Thiolagarosegelen mit variierendem Substitutionsgrad hinsichtlich der Thio!strukturen durch Reduktion von "Bunte S^Iz"-Gelen mittels Dithiothreitol.

"Buite Salz"-Gel wurde auf Glasfilter gewaschen und abgesaugt. 3 g des Gels wurden in 0,3 M Natriumbicarbonatlösung auf ein Gesamtvolumen von 6 ml suspendiert. Ausgehend von der beschriebenen Oxirananalyse berechnete man die erforderliche Menge des Reduktionsmittels, Dithiothreitol, das in zumindest doppeltem Ueberschuss angewendet wurde. Dithiothreitol wurde in 3 ml 1 m M EDTA-Lösung gelöst und bei Raumtemperatur unter Umrühren 30 Minuten reagiert. Man wusch das Produkt auf Glasfilter mit 30 ml 0_a1 mM Natriumbicarbonatlösung von 1 M bezogen auf Kochsalz und 1 mM auf EDTA, und wusch abschliessend mit 100 ml 1mM EDTA-Lösung.

Man bestimmte den Substitutionsgrad der Thiolgruppen mit

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2 j2^f-Dipyridyldisulfid gemäss Brocklehurst et al., Biochem. J, 133_S 573 (1973), jedoch mit 0,1 M Natriumbicarbonatlösung anstatt Tris-Puffer. Ausserdem wurde die Schwefelanalyse vorgenommen und das Ergebnis in Tabelle I angegeben.

In Tabelle I sind die Ergebnisse des Thiolierens von 6%-igem Agarosegel zusammengestellt, bei dem Agaroseperlen mit Epichlorhydrin 2,3-Dibrompropanol, 1 ,4-But and iol--Dig lye idy lather und 15 3-Butandiol-Diglycidyläther auf verschiedenen Substitu-· tionsgrad aktiviert wurden. Man hat den Oxiran-Gruppen enthaltenden Gel mit Natriumthiosulfatlösung behandelt und den "Bunte Salz"-Gel mit Dithiothreitol reduziert. Man bestimmte den Schwefelgehalt im "Bunte Salz"-Gel und der erhaltene, thiolierte Gel und die Thiolgruppen sind mit 2,2'-Dipyridyldisulfid bestimmt worden.

Tabelle I

Oxiranaktivierung "Bunte Salz"- Thiolgel Thiolgel päquiv-

ml Reagenz/3 g Gel Gel ymol S/g ymol S/g Thiolgruppe/g

trockenes trockenes trockenes Produkt

Produkt Produkt

Epichlorohydrin 0,4-5 1260 690 660 ^!; 0,15 34-0 220 170 ^!1 0,075 70 55 50

1,4-Bütanediol-

diglycidyläther 5 1500 850 860

1,4-Butanediol-

diglycidyläther 1,2 740 370 4-10

1,4-Butanediol-

diglycidyläther 0,3 240 105 110 1,3-Butanediol-

diglycidyläther 1,2 690 350 390 2,3-Dibromopropanol

0,3 900 - 440

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Die Reduktion mit Dithiothreitol vollzog sich gieichermassen wie oben unter a). Tabelle II zeigt die Analyseergebnisse vom Thiolieren 6%-igen Agarosegels, den mit Divinylsulfon in Bezug auf die Vinylsulfonstrukturen auf verschiedenen Substitutions gr ad behandelt wurde. Der aktivierte Gel wurde mit Natriumthiosulfatlösung behandelt und der erhaltene ''Bunte Salz^:i-Gel mit Dithiothreitol reduziert.

Tabelle II

Divinylsulfonaktivierung, ml DVS/10 g Agarosegel

0,05

0,1

0,25

0,5

1,0

_____ Thiol inhalt,

yäquiv./g yäquiv./g

trockenes trockenes Produkt Produkt

Vinylsulfoninhalt

yäquiv./g

Gel

Produkt

7.4 170 172

13 2 8 0 2 8 2

28 610 526

43 900 825

64 1260 1080

äther-Agarosegelen.

Die Reduktion mit Dithiothreitol erfolgte analog zu a) jedoch mit dreifach überschüssigem Reagenz berechnet auf Br-Analyse und mit einer einstündigen Reaktionsdauer. Die Bromanalysen, Schwefelanalysen und Thiolanalysen sind in Tabelle III aufgestellt zum Thiolieren von 6%-igem, mit Epichlorhydrin quergebundenen Agarosegel. Die quergebundenen Agaroseperlen waren in Bezug auf die Allylätherstrukturen mit Allylbromid auf verschiedenen Substitutionsgrad behandelt worden. Allyläthergel wurde mit Brom und 2,3-Dibrompropyl-

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äthergel mit Natriumthiosulfatlösung behandelt_P wonach man den erhaltenen '''Bunte Salz"-Gel mit Dithiothreitol reduzierte .

Tabelle III	20	2 .,3· ■Dibromopro-	Thiolagarose.j	Thiolagarose,
Allylbromid-	10	pyläthera.garose ,	mäquiv, Thiol-	mMol Br/g
reaktbn, ml	5	mMol BrVg	gruppen/g	trockenes
Allylbromid/	2	trockenes Produkt	trockenes	Produkt
100 ml Agarοse			Produkt
gel	3,5	2,1
2,0	1,5
0,3	0,7	0,15
0,5	0,4

Beispiel VI. Herstellung von Thiolagarosegelen aus oxiran-· aktivierten Agarosegelen mit Natriumsulfid.

3 g des gewaschenen und abgesaugten 6%-igen Agarosegels wurden in 2₃4 ml 1 M Natriumhydroxyd suspendiert. Man setzte 0,35 ml Epichlorhydrin hinzu und behandelte analog dem Verfahren nach Ia). Der Oxirangehalt wurde auf 850 yäquiv./g trockenes Produkt bestimmt.

Aus Na „ S . 9H₉O von dar Firma Merck, Darmstadt₅ wurde eine 1 M Lösung aus Natriumsulfid in Wasser hergestellt und 3 g Oxirangel wurden bei Raumtemperatur und unter Rühren 2 Stdn mit 15 ml der Natriumsulfidlösung behandelt. Der Thiolgehalt betrug 410 uäquiv./g trockenes Produkt.

Beispiel VII. Derivatisieren von thiolierten Agarosegelen in Thioätherstrukturen.

Bei nachstehenden Versuchen verwendete man thiolierten Aga-

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rosegel, der aus perlenförmigem, 6%-igem Agarosegel durch Behandlung mit Epichlorhydrin, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol hergestellt war. Der Thiolgruppengehalt betrug 6 yäquiv./g trockenes Produkt.

1 g Gel wurde in 2 ml 0,1 M Natriumbicarbonatlösung suspendiert, mit pH 8,4, der 1 mM in Bezug auf EDTA, zugesetzt war um eventuell vorhandene Metallionen zu binden. Dann setzte man 1 ml Äthanol und 15 mg Jodazetamid hinzu und liess 1 Std. bei Raumtemperatur reagieren. Das Produkt wurde mit Alkohol gewaschen und hatte danach einen Stickstoffhalt von 58 4 yMol N/g Trockenprodukt.

b) R§§ktion_mit_Dinitrochlorbenzen.

ία
P ^WsAV-CH₀-SH + IV") (J ^p -VWVwCH₂-S-

1 g Gel wurde in einem Gemisch von 2 ml 0,1 M Natriumbikarbonatlösung, 1 mM in Bezug auf EDTA und 2 ml Äthanol, suspendiert. Danach setzte man 15 mg 2,4-Dinitrochlorbenzen hinzu und liess 1 Std. bei Zimmertemperatur reagieren. Das Produkt wurde mit Alkohol gewaschen. Die Stickstoffanalyse ergab 964 pMol N/g Trockenprodukt«

1 g Gel wurde in einem Gemisch von 2 5% Äthanol und 75% Wasser suspendiert. Danach setzte man 0,5 ml Vinyl-2-Chloräthylather hinzu und liess 2 Stdn reagieren. Das Produkt wurde mit Alkohol gewaschen und hatte dann einen Chlorhalt von 75 μΜοΙ Cl/g Trockenprodukt.

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.24

d) R§a_:ktion__-mit_ZimtalciehYd.

P--'Vvv--CH₂~SH+C₆H₅ "CH=CH-CHO >P

CH₂ CHO

1 g Gel wurde in 2 ml Wasser suspendiert, wonach man 1 ml Äthanol.., 0,1 ml Triäthylamin und 0,1 ml Zimtaldehyd zusetzte und 5 Stdn reagieren liess. Gewaschen wurde mit Alkohol und Wasser und das Produkt ergab eine stark positive Reaktion mit Schiffs Reagenz (Aldehydreagenz).

e) R§§ktion_mit_AkrQlein.

Die Reaktion wurde auf gleiche Art wie nach d) vollzogen, jedoch mit 50 μΐ Akrolein anstatt Zimtaldehyd. Die Reaktion mit Schiffs Reagenz war positiv.

2 g Thiolgel wurden in 1 ml 0,2 M Natriumazetatpuffer mit pH 5,6 suspendiert. 32 mg p-Benzochinon wurden in 1 ml Äthanol gelöst und mit der Gelsuspension vermischt. Die Reaktion vollzog sich bei Raumtemperatur unter Umrühren während 5 bzw. 20 Stdn. Die Produkte wurden mit Alkohol/ Wassergemischen gewaschen.

Die Schaltungsfähigkext der Benzochinon-Agarosegele wurde gegen N-Azetyl-L-Cystein getestet. Man suspendierte 1 g Chinongel in 1 ml Azetapuffer mit pH 4,5 und setzte danach 50 mg N-Azetyl-L-Cystein zu. Nach einer Reaktionsdauer von

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20 Stdn bei Raumtemperatur wurde das Produkt gründlich gewaschen und getrocknet und dann auf Stickstoff analysiert.

Da das Benzochinon erwartungsgemass mit Alkoholgruppen in der Gelmatrize reagiert, wurden analoge Versuche mit Agarosegel ohne Thiolgruppen vorgenommen. Das Ergebnis der Schaltung von N-Azetyl~L-Cystein an p-benzochinon~aktivierte Agarose und p-benzochinon-aktivierte Thiolagarose ist in Tabelle IV ersichtlich.

Tabelle IV	Reaktionsdauer (Benzochinon-- behandlung)	0	N%	Analyse
Polymer	5	0	,029	N-Azetyl-L-Zystein ViMol/g (aus der N- Analyse berechnet)
	2 0	0	,113
Agarose	5	0	,410	70
Agarose	20		,633	280
Thiolagarose				44 0
Thiolagarose

1 g Gel wurde auf Filter mit einem Gemisch von 90% Äthanol in Wasser gewaschen. Man suspendierte den Gel in 2 ml des vorgenannten Äthanol/Wassergemisches. 50 mg Testosteron wurden der Suspension zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 15 Stdn einer γ-Bestrahlung ausgesetzt. Nach dem Waschen stellte sich heraus, dass das Produkt 25 mg derivatisiertes Cortison pro Gramm Trockenprodukt enthielt.

Man unternahm einen Blankversuch unter Ausschluss eines Lichtspenders. Eine Cortison-Aufnähme konnte nicht festgestellt werden.

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Beispiel VIII. Anwendung von Thiolagarose als in Wasser nicht löslicher Komplexbilder.

_Sit_E ".."CtUlSP-SQ-USS]SS ilber-Benzoesäure

1 g Thiolagarose wurde in 0,3 M Kochsalzlösung suspendiert und pH auf 7,0 eingestellt. Die Suspension mit einem Gesamtvolumen von 20 ml wurde mit N₂-GaS gesättigt. Eine Lösung von 1M-, M- mg p-Chloroquecksilber-Benzoesäure in 0,3 M Kochsalzlösung wurde auf pH 7,0 und ein Gesamtvolumen von 10 ml eingestellt, 1_a0 ml Gelsuspension wurde mit 1,0 ml der Reagenzlösung bei kontinuerlicher Zufuhr von 0,020 M Natriumhydroxydlösung bei pH 7,0 reagiert= Der Verbrauchan Lauge war 580 uäquiv=/g Trockenprodukt.

Man bereitete eine Lösung aus CuSO_u . 5H₉O in Wasser, destilliert in einer Quarzanlage, mit einer Cu -Konzentration von 0,125 mg/ml. Eine 3 ml Thiolagarosegel enthaltende Thiolagarosesäule mir einer Durchflutungsflache von 0,7

cm wurde mit destilliertem Wasser gewaschen. Dxe Thiolagarose war mit Epichlorhydrin, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol hergestellt worden und hatte 500-700 yäquiv. SH-Gruppen/g Trockenprodukt» Cu -Ionen werden mit einem UV-Apparat bei 2 54 nm und einer Spot-Test-Reaktion mit Reagenz von o-Tolidin/Ammoniumrhodanid in Azeton nach F. Feigl, Spot Tests in Inorganic Analysis, 5. Auflage₃ S. 84, registriert. Mit diesem Reagenz kann Kupfer bis zu einer Verdünnung von 1/5.10 nachgewiesen werden. Wenn Kupferlauge durch die Thiolkolonne eingepumpt wurde, flössen 25,3 ml der Probelauge durch die Säule, bevor Cu mittels Spot-Test-Reagenz im Aluat nachgewiesen werden konnte ₃ was einer Aufnahme von 12₃6 mg CuSO₁ . 5H₂O entspricht. Adsorbiertes Kupfersulfat ist mit EDTA versetzbar.

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Das Enzym Papain enthält eine Thiolgruppe pro Molekül, wobei die Thiolgruppe für die Aktivität erforderlich ist. Das Papain wird oft als Quecksilberpapain geliefert und gelagert, bei dem die reaktive Thiolgruppe als Schutz beim Zubereiten einen Zusatz von HgCl₂ erhalten hat. Quecksilber papain ist fermentativ inaktiv und wird normalerweise durch Zusatz einer Cystein/EDTA--Lösung aktiviert.

Thiolierte Agarose kann als Aktivator für Quecksilberpapain angewendet werden. Die Aktivität des aktivierten Enzyms zu Benzoyl-L-Arginin-Äthylester oder Kasein berechnet beträgt 80-90% der Aktivität, die bei der Verwendung von einer Lösung Cystein/EDTA als Aktivator erreicht wird.

Beispiel IX. Anwendung hochsubstituierter Thiolagarose als Reduktionsmittel.

Methylenblau bildet rotglänzende Kristalle, die sich leicht in Wasser zu einer blauen Farbe lösen und bei der Reduktion in farbloses Leukomethylenblau übergehen.

In einem Reagenzglas wurde 1 g Thiolagarose, ungefähr 50 yäquiv. Thiolgruppen entsprechend, in 3 ml 0,1 M Natriumwasserstoff carbonatlösung, von ausserdem 0,3 M in Bezug auf Kochsalz und 1 mM in Bezug auf EDTA, suspendiert. Die Suspension wurde mit H₂~Gas ausgeglichen und 1 ml, 25 mM, Methylenblau-Lösung zugesetzt. Die Entfärbung vollzog sich in ΙΟΙ 5 Minuten. Der H₂"-Gasausfluss wurde während der Reaktion beibehalten.

b) S§^yktion_der_Disulf idverbindung_in_Chy_motrYp_sin. Man bereitete eine Lösung von Chymotrypsin in 1 mM HCl mit 25 mg/ml. Eine Säule von 15,U ml mit hochsubstituierter

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Thiolagarose₅ die aus 6%-iger Agarose durch Behandlung mit Epichlorhydrin, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol hergestellt war, wurde vorbereitet. Der Substitutionsgrad der Thiolgruppen betrug etwa 800 uäquiv./g Trockenprodukt. 1 ml der Chymotrypsinlösung wurde mit 1 ml 0_s1 M Natriumwasserstoff carbonatlösung vermischt, von ausserdem 1 mM in Bezug auf EDTA, und mit einer Flussgeschwindigkeit von 15 ml/h durch die Thiolsäule geleitet. Das die Thiolsäule bereits durchgeströmte Chymotrypsin wurde mit überschüssiger Jodessigsäure reagiert und das Reaktionsgemisch mittels Gelfil-

tration auf Sephadex G10 von der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, entsalzt. Jodessigsäure reagiert mit Thiolgruppen und Thioäthercarbonsäure von Cystein und ist durch Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse mengenmässig bestimmbar. Nicht reduziertes Chymotrypsin wurde ebenfalls mit Jodessigsäure behandelt. Die Probe wurde gelfiltriert und der Aminosäureanalyse unterworfen. Das Ergebnis geht aus nachstehender Tabelle hervor:

Gehalt an S-Carboxymethyl-Cystein, 1iäquiv./25 mg Protein

Chymotrypsin 0

Reduziertes Chymotrypsin 2₅5

2,7 ml hochsubstituierte Thiolagarose gleicher Vorbereitung wie unter b) wurden in eine Kolonne mit einem Durchmesser von 18 mm aufgefüllt. Lösungen von AmylogIykosidase, Sigma Grade II, mit einer Konzentration von 0,1% Gewicht/Volumen wurden in folgenden Puffersystemen bereitet: 50 mM Natriumazetat pH 3,5 50 mM Natriumfosfat pH 5,5 50 mM Natriumfosfat pH 7,5 50 mM Natriumbikarbonat pH 9,5

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Sämtliche Laugen waren ausserdem 1 mM in Bezug auf EDTA und mit N₂-GaS gesättigt. Man liess die Enzymlaugen mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/h die Kolonne durchströmen. Man entnahm vier Proben von je 2,5 ml und bestimmte den Gehalt an SH-Gruppen mit 2₅2¹-Dipyridyldisulfid. Zwei Proben wurden als Blankproben verwendet. Man mass den Thiolgehalt teils unmittelbar, teils nach 2 Stdn. Die Ergebnisse sind im Diagramm in Fig. 1, die die Reduktion der Amyloglykosidase mit Thiolagarosegel als Funktion des pH-Wertes zeigt, zusammengefasst. Der Gehalt an Thiolgruppen des reduzierten Enzyms wurde sofort nach dem Passieren durch die Kolonne und nach zweistündigem Aufbewahren der Enzymlösung bestimmt.

Beispiel X. Immobilisierung der Enzyme durch Fixieren an Thiolagarose durch Thioldisulfidaustauschreaktionen.

Perlen aus 2%-igem Agarosegel wurden mit Epichlorhydrin quergebunden. 180 g der gewaschenen und abgesaugten Agaroseperlen wurden in 142 ml 1 M Natriumhydroxydlösung suspendiert, die Suspension mit 5 ml Epichlorhydrin versetzt und die Reaktion liess man 1 Stunde bei 60 C verlaufen. Man wusch den Gel und suspendierte ihn in 180 ml 0,5 M Fosfatpuffer, 20,5 g NaH₂PO₁₊ . H₂O, 14,0 g Na₂HPO₄ . 2H₂O in 0,5 1 Lösung. Daraufhin wurden 180 ml einer 2 M Natriumthiosulfatlösung zugesetzt und 6 Stdn bei Raumtemperatur reagiert. Man wusch das Produkt mit Wasser und reduzierte mit 216 g Dithiothreitol, gelöst in 180 ml 0,1 M Natriumwasserstoffcarbonatlösung von ausserdem 1 mM in Bezug auf EDTA. Das Produkt wurde mit 1 M Kochsalzlösung gewaschen, 1 mM in Bezug auf EDTA, ferner mit 1 mM EDTA-LÖsung und abschliessend mit 50%-iger Azeton-Wasser lösung. 4 g Pyridindisulfid wurden in 180 ml 50%-iger Azeton/Wasserlösung gelöst und mit dem Gel vermischt, woraufhin man die Reaktion 30 Minuten bei Raumtemperatur verlaufen liess. Man wusch das Produkt auf Glasfilter mit 50%-igem

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30

Azeton und schliesslich πι it 1 mM EDTA-Lösung. Die Analyse erwies_s dass der Oxirangehalt nach der Epichlorbehandlung 80 uäquiv./g Trockenprodukt betrug und der Gehalt an 2-Pyridindisulfidstrukturen, anhand dar N-Analyse, 50 yäquiv./g

Trockenprodukt ergab.

b) i?PB9.bilisieren__von_
Amyloglykosidase wurde mit hochsubstituierter Thiolagarose wie oben unter IXc) beschrieben, reduziert. Die Reduktionskolonne hatte eine Länge von 11 cm und enthielt 17 ml aus 2%-iger Agarose mit Epielilorhydrin, Natriumthiosulfat und Dithiothreitol hergestellte Thiolagarose. Der Substitutionsgrad betrug etwa 7 50 laäquiv./g Trockenprodukt. Die Reduktionskolonne war direkt an eine Kupplungskolonne mit einem Diameter von 2,1 cm geschaltet, die 3,2 ml gemäss a) oben hergestellter 2-Pyridindisulfidagarose enthielt.

Eine Lösung von 41,4 mg Amyloglykosidase in 6 ml 0,1 M Natriumwasser stoffcarbonatlösung, 1 mM in Bezug auf EDTA, wurde hergestellt und diese Lösung durch die Reduktionskolonne und die nachfolgende Kupplungskolonne mit einer Geschwindigkeit von 19,7 ml/h gepumpt. Danach wusch man die Schaltungskolonne mit folgenden Laugen in genannter Reihenfolge und der angegebenen Strömung :·

0,1 M Natriumwasserstoffcarbonatlösung/1 mM EDTA, 2 Stdn 0,1 M Natriumazetatlösung, pH 4,8, 15 Stdn 0,1 M Natriumazetatlösung, 1%-ig in Bezug auf Stärke,

3 Stdn O₃OI M Natriumazetatlösung, pH 4,8, 3 Stdn

Es erwies sich, dass die Kupplungskolonne eine Aktivität von 0,32 Enzymeinheiten/mg Konjugat aufgenommen hatte. Die ein-

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gepumpte Menge Amyloglykosidase-Aktivität war 8 0 Einheiten, entsprechend 1,25 Einheiten/mg Trockengel. Die Amyloglykosidase-Aktivität wurde gegen Stärke mit 2 , !+--Dinitrosalizylsäurereagenz nach Bernfeld, Methods in Enzymology, Band 1, Academic Press, New York, 19 55_;, Seite 149, bestimmt.

Man nahm eine Eichkurve gegenüber Glykose auf und die Enzymeinheit wird als mg pro 3 Minuten gebildeter Glykose angeführt .

Bei einem Kontrollversuch wurden 2 ml Amyloglykosidase-Lösung unmittelbar auf eine Pyridindisulfidkolonne ohne Durchlaufen der Reduktionskolonne eingepumpt. Gewaschen wurde wie oben. Die Pyridindisulfidkolonne nahm keinerlei Aktivität auf.

Reduktor

^T

E.

SH

Adsorbator

+ E

SH

2S =

Immobilisieren des Enzyms an Thiolgel kann gleichfalls durch organisch-chemische Introduktion der Thiolgruppen ins Enzymmolekül geschehen, wonach diese als Anbindungβζentra ausgenutzt werden können» Die Introduktion von Thiolstrukturen auf Proteine kann beispielsweise mit Methyl-3-merkapto propioimidat vollzogen werden.

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NH

HS-CH₂-CH₂-C

NH Il

0-CH₃

O₃I-I₃O ml α-Amylasesuspension, Sigma Type IA₅ 25 mg/ml₃ wurde in 5 ml 0,1 M Natriumwasserstoffcarbonatlösung gelöst. Die Lösung wurde 10 Minuten lang im H₉-ZeIt entlüftet wonach 1-3 mg Methyl-3-merkapto-propioimidat zugesetzt wurden.

Nach 60 Minuten in der H₀-Atmosphäre wurde das Gemisch auf

R
Sephadex " G25 in 0₃1 M Natriumwasserstoffcarbonat mit einer Geschwindigkeit von 6 0 ml/h gelfiltriert, wobei man niedermolekulare Stoffe entfernte. Etwa 2Q ml ot-Amylaseaktivität enthaltende Fraktionen vom Gelfiltrieren wurden aufgesammelt und mit 2-Pyridindisulfidagarose vermischt _} 4 ml Gel gewaschen mit 0,1 M Natriumwasserstoffcarbonatlösung. Nach Rühren während 6-15 Stunden bei Raumtemperatur wurde der Gel auf Glasfilter mit Schaltpuffer gewaschen und darauffolgend in einer Säule mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ml/h wie :folgt:

0₃1 M Natriumwasserstoffcarbonatlösung₃ O₅2 M in Bezug

auf Kochsalz, 24 Stunden, • O₃1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,9, 0,2 M in Bezug auf Kochsalz und 1%-ig in Bezug auf Stärke,

24 Stunden,
0,02 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,9₃ 0,01 M in Bezug auf Kochsalz, 24 Stunden

Die Enzymkonjugate mit etwa 1 mg trockenem Konjugat/ml Suspension wurden in der vorgenannten Waschlösung suspendiert und bei +4 C verwahrt.

Einer 1 ml geeignetermassen verdünnten a-Amylaselösung oder ot-Amylaseagarosesuspension wurde 1 ml 1%-ige Stärke in 0,02 M Natriumphosphatpuffer zugesetzt, pH 6,9 und 0_D01 M in Bezug auf Natriumchlorid. Man bestimmte die Menge des redu-

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zierenden Zuckers nach Rühren während 3 Minuten bei 23 C unter Anwendung einer 3,S-Dinitrosalizylsäurereakticxi wie oben beschrieben. Danach wurde eine Eichkurve gegen Kaitose aufgenommen. Die Aktivitätswerte sind in Tabelle 5 zusammengestellt, aus der die Schaltung von a^Amylase., mit Methyl-3-Thiol-propioimidat an Thiolagarose thioliert^ die mit 2,2'-Pyridindisulfid aktivierte war, hervorgeht. Die Aktivität wurde gegenüber 1%-iger Stärkelösung gemessen.

Tabelle V	Enzymgehalt im Konjugat, mg/g	Aktivität, mg Maltose/mg a-Amylase/3 Min.	Relative Aktivität %
Katalysator	-	480	„
a-Amylase	85	92	19,2
a-Amylaseagarose	24	2 3 5	4 9
;"	18,5	7 0 5	43
	15	2 2 5	47
!

Eine dieser Präparationen wurde auf einer Kolonne für kontinuierlichen Abbau von Stärke bei Raumtemperatur während 20 Tagen angewendet, bevor ein Absinken der Aktivität zu merken war.

Bei Erhöhung der Reaktorsäuletemperatur auf 45°C sank die Aktivität rasch ab, sodass nach etwa 2 Tagen noch 50% der Aktivität, nach 5 Tagen jedoch praktisch keine Aktivität mehr vorhanden war. Die Reaktorkolonne kann jedoch in situ dUi>ch Einpumpen von 20 mM Dithiothreitollösung in 0,1 M Natriumwasserstoffcarbonat_s Waschen mit 0₃·1 Μ Natriumwasserstoffcarbonat lösung, Durchpumpen von 1,5 mM 2 ,2'-Dipyridindisulfidlösung in 0,1 M Natriumwasserstoffcarbonat, Waschen mit 0,1 M Natriumwasserstoffcarbonatlösung, 1 M in Bezug auf Kochsalz und schliesslich durchpumpen einer Lösung aus thio-

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lierter α-Amylase, regeneriert werden. Die Regenerierbarkeit ist aus dem Diagramm in Fig. 2 ersichtlich;, die den Prozenten der Initialaktivität als Funktion der Zeitdauer in Tagen mit wiederholten Regenerierungen der Kolonne zeigt.

Beisp5.el XI. Kovalente Chromatograf i.

a) Reinigung_der_yrease ·

Urease ist ein Thiolgruppen enthaltendes Enzym. Eine Lösung aus 150 mg Urease, Sigma Type IV, in 50 ml O/l M Tris-HCl-Puffer mit pH 7,2 wurde gemäss Xa) durch eine Kolonne mit 2-Pyridiiidisulfidagarose geleitet. Die Höhe des Gelbettes betrug 22 mm_s der Diameter 10 mm und die Strömungsgeschwindigkeit 5 ml/h. Die Kolonne war mit Tris-HCl-Puffer vorgewaschen worden und nach Umsetzung mit der Ureaselösung wurde erneut mit dem gleichen Puffer nachgewaschen. Danach wurde die immobilisierte Urease mit einer 50 mM Dithiothreitol-Lösung verschoben. Nach Gelfiltrieren des eluierten Enzyms wurde die spezifische Aktivitet bestimmt und mit der spezifischen Aktivitet der ursprünglichen Enzympräparation verglichen. Dabei erreichte man eine 8,4-malige Reinigung.

ι- E-SH 7> ■

(Thiolhaltiges Protein)

-E τ S =

_{o o}

übe'rschuss R-SH

+ E-SH + R-S-S-R

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b) Reinigung_von_Mercagtoalbumin.

Bovines Serumalbumin ist ein Gemisch aus einer Thiolgruppe/ Mol enthaltendem Mercaptoalbumin und Non-Mercaptoalbumin, in dem die Thiolgruppe mit Cystein oder Glutathion maskiert ist. Handelsübliche Fraktionen des Albumins enthalten 60-70% in Bezug auf Mercaptoalbumin.

Bovines Serumalbumin von der Firma Sigma Chem. Comp., USA, wurde mit aktiver Kohle entfettet. Monomeres Serumalbumin präparierte man durch GeIfiltrierung auf Sephadex G 200. 380 mg des monomeren Albumins mit einem Thiolgehalt von 0,6 Thiolgruppen/Mol in 80 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer mit pH 7,5 und 0,3 M in Bezug auf HCl samt 1 mM in Bezug auf EDTA wurden auf eine 3,2 χ 18 cm 2-Pyridindisulfidkolonne mit einer Geschwindigkeit von 11 ml/h eingeführt. Die Eluierung wurde bis A₂₇₈ < 0,03 fortgesetzt. Kovalent gebundene Stoffe wurden mit 25 mM im Eluierpuffer gelösten Cystein verschoben. Das erhaltene Eluat wurde auf Sephadex G 2 5 in 0,1 M Natriumazetatpuffer mit pH 5,4 sowie 0,3 M in Bezug auf HCl und 1 mM in Bezug auf EDTA filtriert. Das ausgebeutete Protein enthielt 1,00 - 1,0 2 Thiolgruppen/Mol.

Beispie] XII. Herstellung von Thiolsulfatgelen, Thiolgelen und deren Derivaten, basiert auf epichlorhydrinquergebundenes Dextran.

•p

5 g epichlorhydrinquergebundenes Dextran (Sephadex G-150 der Firma Pharmacia Fine Chem., Uppsala, Schweden) wurden in 200 ml 0,5 Natriumhydroxydlösung suspendiert. Man versetzte die Suspension mit 250 mg NaBH₁^ und 15 ml Epichlorhydrin. Danach wurde umgerührt und die Temperatur im Laufe von 30 Minuten von Raumtemperatur bis 60⁰C angehoben. Man liess die Reaktion dann bei 60° 2 Stunden lang fortschreiten. Das Gelprodukt wurde mit Wasser und 0,5 M Natriumphosphatpuffer, pH 7 auf Büchner-Trichter gewaschen. Danach suspendierte man

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das Gelprodukt in 100 ml 2 M Na₂S₂O₃ und liess es 20 Stunden lang bei Raumtemperatur -inter langsamen Schwenken reagieren» Der ausgebeutete "Bunte Salz'^!-6el wurde mit Wasser gewaschen und mit einer 0,2 M NaKCO„-Lösung, 1 mM in Bezug auf EDTA. Dann reduzierte man den Gel mit 300 mg Dithiothreitol, das in 20 ml einer 0,2 M NaHCO_g/1 mM EDTA-Lösung gelöst worden war«

Die Thiolgruppenanalyse ergab einen Thiolgehalt von 230 μΜοΙ/g Trockenprodukt.,

Die Thiolgruppen konnten mit 2,2'-Pyridindisulfid bis zu 10% aktiviert werden.

Schaltung des Mercaptoalbumins bei pH 8,0 ergab Albumin-Sephadex-Konjugate mit 2,6 yMol Albumin/g Trockenprodukt.

Der '"Bunte Salz"-Gel konnte unmittelbar mit 2 , 2 ' -Pyridindisulf id oder Tetramethylthiuramdisulfid aktiviert werden. Diese Produkte konnten beim Konjugieren des Mercaptoalbumins angewendet werden und man erhielt Kon jugate mit M-, 1 bzw. 2,4 μΜοΙ Albumin/g Trockenprodukt·

Beispiel XIII. Herstellung von Thiosulfatgelen und Thiolgelen, basiert auf epichlorhydrinquergebundenem Polyvinylalkohol.

3 0 ml epichlorquergebundener Polyvinylalkoholgel in Perlenform wurden in 24 ml 1 M NaOH-Lösung suspendiert, wonach man 4_S5 ml Epichlorhydrin zusetzte. Die Reaktionsbedingungen waren im übrigen die gleichen wie bei der Herstellung des entsprechenden Dextranderivates.

Man behandelte den Gel 20 Stunden lang mit 30 ml 2 M Na₂S₂O₃-Lösung. Danach wurde die Reduktion des Reaktionsproduktes

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mit 500 mg Dithiothreitol, das in 10 ml 1 M NaHCOg/1 mM EDTA-Lösung gelöst war₂ durchgeführt. Die Thiolgruppenanalyse ergab 300 μΜοΙ/g Trockenprodukt. Der Gel reagierte mit Anisaldehyd bei pH < 1,0 unter Mercaptalbildung. Das Anisaldehyd konnte mit einer wässrigen Lösung des HgC^ abgeschoben werden.

Beispiel XIV. Herstellung von auf Cellulose basierten Thio-Polymeren.

^a) li§£§£§ilüQS_Y°n_/^!B\in1:^

5 g Cellulosepulver wurden 24- Stunden bei 0° in Stickstoffatmosphäre in 5 M Natriumhydroxydlösung merzerisiert. Man wusch das Produkt auf Filter mit 0,5 M Natriumhydroxydlösung und suspendierte in 25 ml 0,5 M Natriumhydroxydlösung. Dann versetzte man die Suspension mit 250 mg NaBK₁, und 5 ml Epichlorhydrin, rührte und erhitzte 30 Minuten bis 60 · Man liess die Reaktion danach weitere 6 0 Minuten bei dieser Temperatur fortschreiten. Das Produkt wurde auf Filter mit Wasser und 0,5 M Natriumphosphatpuffer mit pH 7 gewaschen. Dann behandelte man das Produkt mit 25 ml 2 M Na₂S2O₃-Lösung 20 Stunden bei Raumtemperatur und unter Rühren. Man wusch das Produkt mit Wasser und 0,2 M MaHCO„-Lösung, 1 mM in Bezug auf EDTA. Die Reduktion wurde mit 300 mg Dithioerythritol, gelöst in 10 ml 1 M NaHCO₃/1 mM EDTA-Lösung vorgenommen. Die Thiogruppenanalyse ergab 460 yMol/g Trockenprodukt. Thiolcellulosederivate adsorbierten Kupfer oder Quecksilberionen aus stark verdünnter Kupfersulfat" und Quecksilbernitratlösung. Die Metallionan waren mit Dinatrium-EDTA desorbierbar.

b) Herstellung_vgn_Cellulose_mit_-vizinalen_3H-Grug2e2■

5 g Cellulosepulver vmrde wie oben merzerisiert- Die Suspension der Cellulose in 1Π ml 5 M Natriumhydroxydlösung wurde mit 2 50 mg NaBH₄ versetzt= Danach wurde der Suspension 1 g

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Allylbromid zugesetzt und das Gemisch unter Umrühren 6 Stunden lang in einem Peaktionsgefäss mit Rückflusskühler auf 70 erhitzt. Danach wurde mit Alkohol/wässrigen Lösungsgemischen und schliesslich mit 9 6%-igem Alkohol gewaschen. Man suspendierte das Celluloseprodukt in 10 ml Kohlenstofftetrachlorid und versetzte die Suspension unter Umrühren mit Brom bis zur beständigen Farbe. Das Produkt wurde mit Alkohol und Wasser gewaschen.

^a2^u . 9HO der Firma Merck, Darmstadt₃ wurde eine 1 M-Lösung von "Natriumsulfid" in Wasser hergestellt. Obiger bromierter Celluloseäther wurde mit 5 ml der "Natriumsulf id'"-Lösung 6 Stunden bei Raumtemperatur behandelt= Man wusch das Produkt mit Wasser, 1C M Salzsäure und Wasser, Der SH-Gruppengehalt des Produktes war 410 μΜοΙ/g. Das Cellulosederivat adsorbierte Kupfer- oder Quecksilberionen aus stark verdünnten Kupfersulfat und salpetersauren Quecksilberoxydlösungen. Etwa 40% des iletallionengehaltes war mit Dinatrium-EDTA desorbierbar. Der Rückstand muss als über viz. SH-Gruppenstrukturen gebunden angesehen werden.

Beispiel XV. Herstellung von 2-Pyridindisulfidagarose.

20 g gewaschener und abgesaugter Agarosegel (2%-ig) wurden in 1635 ml 1 M Natriumhydroxydlösung suspendiert. Danach wurde mit Wasser bis auf 50 ml Totalvolumen aufgefüllt. Man versetzte die Suspension mit 3,1 ml Epichlorhydrin, das man 20 Minuten lang bei Raumtemperatur und danach 2 Stunden lang bei 60 C reagieren liess, Der Gel wurde auf Filter mit Wasser und einem 0,5 M Phosphatpuffer mit pH 6₃3 gewaschen und danach mit 20 ml 2 1' Natriumthiosulfatlösung versetzt. Die Reaktionszeit betrug 6 Stunden bei Raumtemperatur. Demnach wusch man das Produkt auf Filter mit 1 M Kochsalzlösung und Wasser. Nach der auf Schwefel bezogenen Analyse des Produktes ergaben sich 17tö yliol 3/g Trockenprodukt.

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Das Produkt wurde in 50 ml einer 50% Methanol/50% 0,1 M Natriumbicarbonatlösung, 1 mM in Bezug auf EDTA, suspendiert, und 1,2 g Pyridindisulfid zugesetzt, wonach man die Reaktion 48 Stunden lang bei 60°C verlaufen liess. Dann V7urde das Produkt auf Filter mit Methanol und Wasser gewaschen und auf Stickstoff analysiert, was 526 μΜοΙ N/g Trockenprodukt ergab.

Beispiel XVI. Glutathionschaltung .

Ueber eine Kolonne von 3,M- ml 2-Pyridindisulfidagarose (aus vorstehendem Beispiel) wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml/h eine Glutathionlösung in 0₃1 M Natriumazetat/0 ,1 mM EDTA mit pil 4,0, eingepumpt. Insgesamt verbrauchte man 43 ml Glutathionlösung. Das Produkt wurde mit 0,1 M NaAc-Puffer (pH 4,1), 0,1 M bezogen auf Kochsalz, Wasser und mit 0,1 M Bicarbonatlösung, 1 M bezogen auf Kochsalz sowie mit Wasser gewaschen. Das Produkt wurde auf Glutathion analysiert und ergab ein Gehalt an 415 yMol Glutathion pro trockenes Produkt. Nach Reduktion mit 50 mM Dithiothreitol-Lösung bewies eine Analyse auf Glutathion vollständige Abspaltung desselben.

Beispiel XVII. Schaltung des Koenzym A.

G,9 g 2'Pyridinsulfidagarose, wurde mit 0,1 M Natriumazetatpuffer ₃ pH 4,0 gewaschen und nach Absaugen in 5 ml des genannter. Puffers, in diesem Fall sogar 0,1 mM bezogen auf EDTA₅ suspendiert. 27 mg CoA wurden zugesetzt und die Reaktionszeit betrug 4 Stunden bei 2 3 C. Danach wurde 5 Stunden lang mit 0₃1 M Natriumazetatpuffer, 1 M in Bezug auf Kochsalz, 2 Stunden mit Wasser-, 24 Stunden mit 0₃1 M Natriumbicarbonatlösung, 1 M in Bezug auf Kochsalz, sowie 2 Stunden mit Wasser gewaschen.

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HO

Die CoA-Aufnähme war 22 0 μΜοΙ/g Trockenprodukt- Das geschaltete Koenzym kann mit Dithiothreitol vollständig desorbiart werden=

Beispiel XVIII. Schaltung der Urease.

Man adsorbierte Urease, Sigma, Type IV bis zur Sättigung an 2--Pyridindisulfidagarose mittels 0,1 M Tris-HCl-Puffer von pH 7j2. Nach gründlichem Waschen des Produktes fand man, dass es 360 mg Protein/g Trockenkonjugat enthielt. Das Enzymprotein konnte mit 50 mM Dithiothreitol-Lösung desorbiert werden. Nach dem Gelfiltrieren erhielt man eine Ureasepräparationj deren spezifische Aktivität 6,2 mal höher als die der Ausgangspräparation war,

Beispiel XIX. Herstellung von Disulfidagarosegel durch Behandlung mit Alkylthiosulfatestergel mit Tetramethylthiuramidisulfid.

Dieser Versuch wird analog der Präparation des obigen 2-Pyridinsulfidgels durchgeführt, Die Stickstoffanalyse ergab 360 μΜοΙ N/g Trockenprodukt. '

Beispiel XX. Schaltung von Glutathion an Gel gemäss Beispiel V.

Hier wird analog der Schaltung an 2-Pyridindisulfidgel gehandelt. Die Analyse in Bezug auf gebundene Glutathion ergab 230 μΜοΙ/g Glutathion/g Trockenprodukt. Nach der Reduktion mit 50 mM Dithiothreitol-Lösung zeigte die Analyse in Bezug auf Glutathion eine vollständige Abspaltung«

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Beispiel XXI. Aktivieren der Thiolagarose mittels Diäthylazodxcarboxylat.

Bei nachstehenden Versuchen wurde ein aus Perlen 6%-iger Agarose erhaltener Thiolagarosegel gemäss der früher beschriebenen Verfahrensweise verwendet. Das Charakteristische für das Produkt waren 730 μΜοΙ SH-Gruppen pro Gramm Trockenprodukt,

a) Aktivierstufe.

5 g abgesaugter Thiolgel wurden in 5 ml 96%-igem Äthanol suspendiert und die Suspension mit 0,5 ml Diäthylazodicarboxylat versetzt. Danach rührte man anderhalb Stunden bei 22 C und wusch mit 50%-igexn Äthanol, 1 M Kochsalzlösung und Wasser. Der Stickstoffgehalt nach Trocknen im Vakuum bei 100 C, 15 Stunden lang, betrug 1,6%.

1 g aktivierter Gel aus der obigen Stufe a) wurde in 1 ml 1 M Azetatpuffer mit pH t,5 suspendiert. Danach wurden 20 mg Glutathion zugesetzt und man liess die Reaktion 4 Stunden bei 22 C verlaufen. Danach wurde das Produkt mit 0_D1 M Azetatpuffer, 1 M in Bezug auf Kochsalz, mit 0,1 M Bicarbonatlösung_: 1 M in Bezug auf Kochsalz, mit Wasser und schliesslich mit Azeton gewaschen. Die Aminosäureanalyse zeigte einen Glutathiongehalt von 610 μΜοΙ/g Trockenprodukt.

Analog dem obigen Versuch jedoch mit pH 7,0 als SchaltungspH erhielt man 65 μΜοΙ Glutathion/g Trockenprodukt. Nach einer monatlichen Lagerung des aktivierten Gels als wässrige Suspension bei 4°C war die Schaltungsfähigkeit bei pH 7 um 6% gesunken.

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Beispiel XXII. Sorption und Desorption der Urease im Gel gemäss Beispiel VII.

Man führte den Versuch, analog dem Beispiel 4 durch, jedoch wurde die Sorption bei pH 6₃9 vollzogen. Nach der Desorption mit Dithiothreitol und Gelfiltrieren wurde die spezifische Aktivität des Ureaseproteins bestimmt. Man hatte eine Reinigung von 5,2 mal erreicht.

Beispiel XXIII,. Aktivieren der Thiolagarose mittels Diisopropjyl-Azodicarboxylat oder Methyl-phenylazof ormat sowie nachfolgende Glutathionschaltung.

Man vollzog die Aktivierung analog dem Beispiel XXI a) . Der Stickstoffgehalt des Produktes war 1> 3% „

Die Glutathionschaltung wurde analog dem Beispiel XXIb) bei pH 4,5 vollzogen und der Glutathiongehalt betrug 385 μΜοΙ/g Trockenprodukt.

b 5 MethjjlEhen^lazof ormat *

Man aktivierte wie oben» Der Stickstoffgehalt des Produktes war Q,5 %«

Die Glutathionschaltung vollzog sich wie oben und der Glutathiongehalt betrug 11 yMol/g Trockenprodukt.

Beispiel XXIV. Chemisches Modifizieren von disulfidimmobilisiertem Protein (I) durch Schaltung an Protein (II) sowie reduktive Abspaltung von Protein(I)-Protein(II)-Komplexen.

Obiges ist bereits mit Protein (I) = Papain und Protein (II) = Chymotrypsin vollzogen worden.

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20 mg Papain (0,5 SH/Mol) in 5 ml 0,1 Tris-HCi-Puffer, pH 8,2 wurden mit 5 g in genanntem Puffer gewaschenem un abgesaugten , pyridyldisulfidaktivi ertem Mercaptohydroxypropyläther-Sepharose-Gel untermischt. Man liess die Reaktion unter vorsichtigem Rühren 5 Stunden bei Raumtemperatur (+23 C) verlaufen und wusch das entstandene Papain-Sepharose-Konjugat auf Glasfilter mit folgenden Lösungen:

1) 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,2 1 M in Bezug auf NaCl, 1 mM bezogen auf EDTa 200 ml,

2) 0,1 M Na-Azetatpuffer₃ pH 4,5 1 M in Bezug auf NaCl, 1 mM bezogen auf EDTA 200 ml,

3) 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 6,5.

Daraufhin wurde der Gel auf Glasfilter abgesaugt und in 15 ml 0₅1 M Na-Phosphatpuffer, pH 6,5, suspendiert. 15 mg a-Chymotrypsin, 100 ul Cyclohexylisonitril und 100 μΐ Azetaldehyd wurden zugesetzt und das Reaktionsgemisch durch Rotieren 2 Stunden lang bei +23 C gerührt. Danach wurde das GeI-enzymkonjugat auf eine Säule eingelassen und mit nachstehenden Lösungen gewaschen:

1) 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 6,5, 2 Stunden, Strömungsgeschwindigkeit 10 ml/h,

2) 0,1 M NaAc-Puffer., 1 M NaCl, pH 4, 6 Stunden. Strömungsgeschwindigkeit 10 ml/h,

3) H^O, 3 Stunden, Strömungsgeschwindigkeit 10 ml/h,

4) 0,1 M NaHCO₃-I M NaCl, 3 Stunden, Strömungsgeschwindigkeit 10 ml/h,

5) 0,1 M NaHCO₃ 1 M NaCl, 3 Stunden, Strömungsgeschwindigkeit 10 ml/h, und

6) 0,1 M NaHCO₃ 1 mM EDTA, 1 Stunde, Strömungsgeschwindigkeit 10 ml/h.

Man befreite daraufhin das Papain-Chymotrypsinkonjugat vom Gel durch Reduktion mit 2 0 mM Cystein in 0,1 M NaHCO₃-I mM EDTA das durch die Säule eingepumpt wurde i Fraktionen mit einer Absorption bei 280 nm werden gepoolt und auf Sephadex

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G-7-Kolonne gelfiltriert (dies um überschüssige Reduktionsmittels entbundenes 2-Thiopyridon usw. zu entfernen). Die dem Papain--Chymotrypsinkonjugat entsprechende Fraktion - nach Molekülgewicht zu urteilen - besitzt sov-70hl Chymotrypsinaktivität (Hydrolyse-N--Azetyl-L-Teposin-Ä-chylester) als auch Papainaktivität (Hydrolyse N-Benzoyl-Argininäthylester).

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Claims

Patentansprüche

e Produkt zu Separationszwecken, Ionenaustauschzwecke als Basenmaterial zur Herstellung verschiedener Derivate u.a. zu Separationszwecken, für Adsorption oder Immobilisieren verschiedener spez. biochemisch interessanter Stoffe sowie Enzymen, Inhibitoren oder Partikel, zur Durchführung von Redox-Reaktionen oder dergleichen wie auch aus deren Derivaten bestehender Produkte, dadurch gekennzeichnet j dass sie aus einem in Wasser nicht löslichen, hydroxyl- oder aminogruppenhaltigen Polymer bestehen, das mit organischen Seitenketten von je einer oder mehreren Thiosulfatgruppen (-S₀O- -Gruppen) enthaltenen Seitengruppen oder den Derivaten derartiger Gruppen, substituiert ist.

2. Produkt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das Polymer ein Gel ist.

3. Produkt nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet , dass das Polymer eine Agare oder ein Agarederivat ist.

4. Produkt nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet , dass das Polymer ein Polyvinylalkohol ist.

5. Produkt nach Anspruch 1 -2, dadurch gekennzeichnet 3 dass das Polymer eine Cellulose ist.

6. Produkt nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet , dass das Polymer ein quergebundenes PoIysaccharid, beispielsweise Dextran, ist.

7. Produkt nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet , dass das Polymer ein aminogruppen-substi-

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tuiertes Polyacrylamid ist,

8. Polymer nach Anspruch 1-7, dadurch gekenn zeichnet ₃ dass die substituierten organischen Seitenketten folgende allgemeine Formel haben.

Z Z

R-C-C-R'
ι t
X Y

wobei R CH₉, CH₉-CH₉-SO-, oder CH₉-CH (OH) -CH₉-O-R₉-O-CH₉ ist₃ R₉ feine gerade oder verzweigte Alkylengruppe ist, Z für H und/oder eine Alkylgr-uppe steht, R' H₅ Alkyl, Alkenyl oder Aryl ist, und X OH₃ H oder S O₃" ist, wenn Y S₉0_q ist oder X S₃O₃" bedeutet, wenn Y OH, H oder S₂O₃" ist.

9 ο Polymer nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet j dass es folgende Formel hat:

P-O-CH₂-CH(OH)-CH₂-S₂O₃".

10. Polymer nach Anspruch 1-8, dadurch gekenn zeichnet , dass es folgende Formel hat;

P-O-CH₂-CHCOH)-CH₂-O-(CH₂)^-CH₂-CHCOH)-CH₂-S₂O₃".

11 . Polymer nach Anspruch 1-8, dadurch gekenn zeichnet , dass es folgende Formel hat:

P-O-CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂-S₂O₃".

12. Produkt nach Anspruch 1-8, dadurch ge kenn zeichnet , dass es fol ende Formel hat:

P-O-CH₂-CH(S₂O,

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13. Polymer nach Anspruch 1-11, dadurch gekenn zeichnet , dass die darin angegebenen S₂O₃ -Gruppen ganz oder teilweise auf -SH-Gruppen überführt oder durch diese ersetzt wurden.

14. Polymer nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , dass die -SH-Gruppen ganz oder teilweise auf "S-S-(Disulfid-)--Gruppen überführt wurden.

15. Polymer nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Thiosulfatgruppen ganz oder teilweise auf -SH-Gruppen überführt oder mit diesen ersetzt wurden.

16. Produkt, das aus einem Produkt nach Anspruch 1-13 hergeleitet wurde mit der· allgemeinen Formel

P-C-V
O JL j

wobei P-S- dem Rest von einem Polymerthiosulfat nach Anspruch 1-12 oder einem Polymerthiol nach Anspruch 13 entspricht, und wobei Y eine Gruppe bedeutet, die dem Produkt eine markante Reaktivität gegenüber einer organischen Thiolverbindung oder einen Thiolgruppen enthaltenden Partikel der Formel H-S-P¹ aufweist, dadurch gekennzeichnet , dass das Produkt P-S-Y beim Kontakt mit einem thiolhaltigen Produkt vorgenannter Art eine Reaktion des Typus

P-S-Y + H-S-P' > P-S-S-P' + Y¹

"gibt, wobei Y^f einer in gegensätzlicher Richtung verlaufenden Reaktion entzogen wird., entweder indem das Gleichgewicht Y' 4-^-> Yⁿ weit zu Y^w verschoben ist oder indem Y' selbst ausserstande ist, mit dem aktivierten Gel zu reagieren.

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17. Produkt nach Anspruch 16, dadurch gekenn zeichnet, dass Y die Struktur

— O

hat, wobei R durch Verschiebung des Gleichgewichtes in der Reaktion zwischen der Thiolthionform -SR^-S=R zur Thionform hin, gekennzeichnet ist.

18. Produkt nach Anspruch 17, dadurch gekenn zeichnet , dass Y die Formel

-S-C-N(A)₀
H ²

hat, wobei A eine Alkyl-Gruppe bezeichnet, d.h. in das Molekül Tetra-Alkyl-Thiuramdisulfid

(A)₂-N-C(S)-S-S-C(S)-N-(A)₂
eingeht.

19. Produkt nach Anspruch 16, dadurch gekenn zeichnet , dass Y die Struktur

-M(E)-N(H)-E
hat, wobei E eine elektronenattrahxerende Gruppe bezeichnet,

20. Produkt nach Anspruch 16 und 19, dadurch gekennzeichnet , dass Y die Struktur

-N(COOA)-N(H)-COOA'
wobei A und A^T unter sich gleiche oder verschiedene Alkyl-

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gruppen sind.

21. Polymer, hergeleitet von einem Produkt nach Anspruch 16, durch die Formel

P-S-S-P'

gekennzeichnet, wobei H+S+P' eine organische thiolhaltige Substanz;» beispielsweise ein thiolhaltiges Protein, Peptid^ Aminosäure, Amin, Nucleotid usw. oder ein derartige Gruppen enthaltendes Partikel ist.

22. Verfahren zur Herstellung von Produkten nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer zunächst mit einem Reagenz mit zumindest zwei bifunktionellen Gruppen so aktiviert wird, dass zumindest eine der reaktiven funktioneilen Gruppen in jedem Molekül mit dem Polymer verbunden wird und eine bedeutende Anzahl der übrigen in nicht reagierter jedoch aktiver Form verbleiben, wonach das dermassen aktivierte Polymer nach Abwaschen des überschüssigen Reagenzen mit einer Lösung eines Thiosulfats reagiert wird.

23. Verfahren zur Herstellung von einem Produkt nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Aktiviermittel ein Epihalohydrin in alkalischer Lösung oder eine Substanz> die in alkalischer Lösung auf diese Substanz als Dxbrompropanol übergeht, angewendet wird.

24. Verfahren zur Herstellung eines Produktes nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Aktiviermittel ein Bisepoxid in alkalischer Lösung oder eine Substanz, die unter¹ den vorhandenen Bedingungen in diese Verbindung übergeht, angewendet wird.

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25. Verfahren zur Herstellung eines Produkts nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Aktiviermittel Divinylsulfon oder dessen Derivate in alkalischer Lösung angewendet werden.

26. Verfahren zur Herstellung eines Produktes nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer zunächst mit Allyibromid reagiert wird, wonach Brom an das erhaltene Allyl-Polymer addiert wird und man das dermassen erhaltene Produkt mit einer Thiosulfatlösung umsetzt.

27. Verfahren zum Ueberfuhren von Produkten nach Anspruch 13 und 15 auf Thiolpolymere, dadurch gekennzeichnet 3 dass das Thiosulfatpolymer mit einer Lösung aus einem Stoff> der fähig ist -S₀CU -Gruppen in -SH-Gruppen zu überführen, behandelt.

28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet ₅ dass die Ueberführung von Thiosulfat an Thiol mit einer Lösung aus I₃ ¹+ Dimercaptobutan oder dessen Derivaten vorsichgeht.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet j dass für die Reduktion eine Lösung aus Threo- oder Erytro-1,4-dimercapto-2,3-butandiol₅ s.go Dithiothreitol bzw. Dithioerytroitol₃ angex«?endet wird =

30. Verfahren zur Herstellung von Thiolverbindungen nach Anspruch 13 und 15, dadurch g:e kennzeichnet, dass der nach Anspruch 23-26 aktivierte Gel unmittelbar mit einer Lösung aus Natriumsulfhydrat behandelt wird,

31 ο Verfahren zur Herstellung von Produkten nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass

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Thiolpclymere einem geeigneten Oxydationsmittel ausgesetzt werden.

32. Verfahren zur Herstellung von Produkten nach Anspruch 16 und 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Thiosulfatpolymer in Suspension oder Kolonne unmittelbar mit einer Lösung aus 2-2'-Pyridindisulfid reagiert wird, wonach das Produkt bis zur Freiheit von überschüssigem Reagenz und löslichen Reaktionsprodukten gewaschen wird.

33. Verfahren zur Herstellung von Produkten nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Thiosulfat- oder Thiolpolymer in Suspension oder Kolonne mit einer Lösung aus einem Tetraalkyl-Thiuramdisulfid, insbesondere Tetramethyl·-Thiuramdisulfid reagiert wird, wonach das Produkt frei von überschüssigem Reagenz und löslichen Reaktionsprodukten gewaschen wird.

34. Verfahren zur Herstellung von Produkten nach Anspruch 19 und 2O₃ dadurch gekennzeichnet, dass das Thiosulfatpolymer zunächst nach Anspruch 27-29 auf Thiolpolymer überführt, wonach dieses mit einer angemessenen Azodicarboxylat-Lösung, beispielsweise einer Lösung aus Azodiäthylcarboxylat reagiert und das Polymer danach abgetrennt und gewaschen wird.

35. Verfahren zur Herstellung eines Polymers mit der Struktur nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass ein Polymer nach Anspruch 16-20 mit einer Lösung des kovalent zu bindenden Stoffes (HS-P'), der anzunehmend erweise -SH--Gruppen enthält, reagiert, oder wenn es eine Disulfidgruppe derselben enthält, zunächst durch Kontakt mit einem höhersubstituierten -SH-Polymer nach Anspruch 13 oder 15 in Thiolgruppen überführt wird, wonach man das

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Polymer separiert und wäscht.

36. Verfahren zur Rückgewinnung des Thio!polymers aus einem Polymer des Typus P-S-S-P* nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet ₃ dass man das Polymer einer reduzierenden Lösung nach Anspruch 27-29 aussetzt, wobei die S-S-Bindung aufgebrochen und ein Thiolpolymer erhalten wird, das nach Aktivieren erneut zum Fixieren der Gruppe B angewendet werden kann.

37. Verfahren zur Herstellung von Substitutionsprodukten aus Thiolverbindungen nach Anspruch 13 oder 15_S x-jobei H in der -SH-Gruppe durch derartige Radikale ersetzt worden ist, die auf an sich bekannte Weise auf gelöste Thiole eingeführt werden können, dadurch gekennzeichnet, dass die Thiolpolymere Reaktionen unterworfen werden, analog den in Lösung angewendeten, wobei die Reaktionen mit den SH-Gruppen des Polymers ohne nennenswerte Abänderung der physikalischen Struktur des Polymers verlaufen.

38. Verfahren zur Chemiesorptionsseparation von thiol- oder disulfidhaltigen Produkten, dadurch gekennzeichnet, dass man Thiol-Disulfidaustauschreaktionen mit Disulfid- bzw. Thiclpolymeren in der chromatografischen Technologie anwendet.

39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass derartige Substituenten im Polymer gewählt werden, die die Anwendung des Polymers bei ehromatografisehen Separationsprozessen ermöglichen.

40. Verfahren zum Reinigen von Wasser besonders aus kleineren Gehalten an schweren. Metallionen oder metallorganischen Verbindungen unter Zuhilfenahme von Polymeren nach Anspruch 13 oder 15₀ dad u r ch gekennzeich-

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net, dass das Wasser mit dem Thiolpolymer in Verbindung gebracht wird, wobei der Metallion praktisch quantitativ gebunden wird, wonach das Polymer nach Erhalt des erforderten Sättigungsgrades die Regenerierung des Polymers durch Behandlung mit einer Lösung eines für Metallionen starken Komplexbilders durchgeführt werden kann.

41. Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet , dass entweder die eine oder beide Stufen kontinuierlich auf einer Kolonne vollzogen werden.

42. Verfahren nach Anspruch 40 und 41, dadurch gekennzeichnet , dass das Wasser kommunales Leitungs- oder geeignet vorgereinigtes Abwasser ist.

43. Verfahren nach Anspruch 40-42, dadurch gekennzeichnet , dass die abgetrennten Metallionen der Art sind, die in saurem, neutralen oder schwach alkalischem Wasser schwerlösliche Sulfide ergeben.

44. Verfahren zum Schützen von biologischen Lösungen gegen mikrobiologischem Zuwachs mit Thio!polymeren nach Anspruch 13 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung in Kontakt mit dem Thiolpolymer gebracht wird, wobei der mikrobiologische Zuwachs durch die reduzierenden und/oder metallkomplexbildenden Eigenschaften des Polymers verhindert wird5 ohne dass das biologische System durch einen gelösten, mehr oder weniger schwer zu trennenden Zuwachsinhibitor verschmutzt wird.

45. Verfahren zur Anwendung von Thiopolymeren nach Anspruch 1-13 und 15 für Separationszwecke, dadurch gekennzeichnet , dass man deren Ionenaustauscheigenschaften ausnutzt.

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252379a'

46 . Verfahren zur Anwendung von Thiosulfatpolymeren nach Anspruch 1-15 zu Separationszwecken_s dadurch gekennzeichnet , dass man sie in einem Redox-System anwendet.

1+7= Verfahren zu?n Immobilisieren thiolhaltiger Proteine oder thioproteinhaltigor Partikel in Polymeren nach Anspruch 13 und 15 j dadurch gekennzeichnet, dass man eine Thiol-Disulfidaustauschreaktion ausnutzt.

48. Verfahren beim Immobilisieren nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung oder Suspension zunächst der reduzierenden Wirkung auf eventuelle -S-S-Bindungen mit einem stark substituierten Thiolgel aussetzt, wonach man das thiolhaltige Produkt mit einem Disulfidpolymer reagieren lässt.

49. Verfahren zur Anwendung von Polymerprodukten nach Anspruch 16-20 als Stützphase für eine derartige kcvalente Modifizierung einer organischen Verbindung wie z.B. Peptid, Protein-., Saccharid oder Polynucleotide, im Falle sie in Lösung vollzogen würde;, zu intermolekularen Querbindungsreaktionen führen würde.j dadurch gekennzeichnet, dass die organische Substanz entweder unmittelbar, falls sie SH-Gruppen enthält, oder nach Reduktion, falls sie -S-S-Gruppen enthält, oder durch Thiolieren, falls sie keine oder keine ausreichende Menge dieser Gruppen enthält, in einer Sulfid/Disulfid-Austauschreaktion auf ein Polymer nach Anspruch 16-20 immobilisiert wird, wonach die chemische Reaktion auf der immobilisierten organischen Verbindung vollzogen wird, welche dann nach Abwaschen der Reagenz vom Polymer durch Reduktion der S~S~Bindung, z.B. mit Dithiothreitol, befreit wird.

50. Verfahren zur Herstellung von Adsorptionskomplexen

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zwischen einem Protein·, einem Saccharid oder einem Polynucleotid samt einer biospezifischen, komplementären Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass entweder das Protein, das Saccharid oder Polynucleotid oder ebenfalls die komplementäre Substanz über Disulfidbindung an Thiolpolymere konjugiert wird, wonach im ersten Falle die Komplement ar sub st an ζ auf das polymergebundene Protein, usw. adsorbiert, oder im zweiten Falle das Protein usw. auf die polymergebundene Komplementarsubstanz adsorbiert wird, wonach die gebildeten Komplexe durch Zusatz eines geeigneten Reduktionsmittels nach Anspruch 2 8 oder 29 vom Polymer abgespalten werden können.

51. Verfahren zur Ueberführung von Disulfidbindungen auf Polymere nach Anspruch 14 oder 21 oder andere organische Verbindungen ₃ vorzugsweise des Typus Protein, Peptid, Aminosäure, Amin, Nucleotid oder Partikel, enthaltend derartige Verbindungen an Thiolgruppen, dadurch gekennzeichnet , dass 1,4-Dimercaptobutan oder deren Derivat, Dithiothreitol oder Dithioerythreitol als Reagenz angewendet wird.

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