EP0000486B1 - Verfahren zur Herstellung von stabilisierten trägergebundenen Proteinen - Google Patents

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EP0000486B1
EP0000486B1 EP78100312A EP78100312A EP0000486B1 EP 0000486 B1 EP0000486 B1 EP 0000486B1 EP 78100312 A EP78100312 A EP 78100312A EP 78100312 A EP78100312 A EP 78100312A EP 0000486 B1 EP0000486 B1 EP 0000486B1
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EP
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bound
carrier
mercapto
protein
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Dieter Dr. Krämer
Klaus Dr. Sauber
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Roehm GmbH Darmstadt
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Publication date
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    • Y10S530/816—Attached to the carrier via a bridging agent

Definitions

  • the invention relates to a method for producing stabilized carrier-bound proteins.
  • the proteins are advantageously used in the form of a material bound to a solid support.
  • the protein can thereby be separated from the treated substrate solution by simple filtration.
  • Carrier-bound proteins are important in affinity chromatography and especially in carrying out enzymatic processes, the protein bound by the carrier being an enzyme.
  • carrier-bound proteins are generally characterized by increased stability against inactivation due to pH shift, high temperatures or autoxidation. Nevertheless, the bio-specific effectiveness drops, e.g. in the case of enzymes, the enzymatic activity, with repeated reuse of the carrier-bound protein at each stage of use somewhat.
  • loss of activity of proteins can be stopped or reversed by treating them with mercaptans (see dissertation Jan Carlsson, Uppsala 1974, p. 8, abstract).
  • the effect of the mercaptans is attributed to the fact that they break down disulfide bridges within the protein molecule which have arisen from thiol groups by autoxidation. This auto-oxidation is considered to be the cause of the reversible loss of activity.
  • the object of the present invention was to produce carrier-bound proteins with increased stability against gradual loss of activity in aqueous solution by reacting the protein with a water-insoluble carrier material.
  • the object is achieved according to the invention in that a carrier material free of mercapto groups is used which contains oxirane groups as binding-active groups, and in that hydrogen sulfide or a compound having a molecular weight below 5000 with at least one mercapto group and at least one further mercapto group is added to the protein bound to the carrier. , Hydroxyl or primary or secondary amino group.
  • the sterically readily accessible oxirane groups which are active against binding to the protein are completely available for binding the protein in the process according to the invention, while the sterically hindered oxirane groups which are inaccessible to the large protein molecules are still present after the enzyme has been bound and for reaction with the relatively small molecules of the Sulfur compound are capable.
  • Penicillin acylase compared the loss of activity with multiple reuse with and without mercapto groups on the wearer.
  • the mercapto groups were introduced by binding dithioerythritol to an enzyme carrier containing epoxide groups.
  • the carrier material was a crosslinked acrylamide polymer with epoxy groups, which had first been reacted with penicillin acylase and then optionally with 50 or 500 mg of dithioerythritol per gram of the moist carrier material.
  • the activity of the preparation against 6-amino-penicillinic acid was determined in a repeated reaction of 1 to 2 g of the preparation, each with 5% substrate in 200 ml of substrate solution (0.01 M phosphate buffer, pH 7.5) at 37 ° C. by automatic titration Determined 1.0 N NaOH. The initial activity when used for the first time was designated as 100%.
  • the stabilization achieved in accordance with the invention is based on the binding of hydrogen sulfide or a compound containing at least one mercapto group and at least one further mercapto, hydroxyl or primary or secondary amino group to the binding-active oxirane groups of the carrier material.
  • the mercapto, hydroxyl or amino groups of the compounds mentioned react with the oxirane groups of the support material. Since the compounds have a molecular weight below 5000, they are still able to react with the oxirane groups of the carrier material due to their small molecular size, which are not accessible to protein molecules for reasons of steric hindrance.
  • the oxirane groups react more easily with hydrogen sulfide or with mercapto, hydroxyl and amino groups than with water, so that it is possible to react both the oxirane groups with the protein and the subsequent reaction with the mercapto and optionally hydroxyl or amino groups Make connection in the aqueous phase. Since the oxirane groups are nevertheless gradually decomposed by water, there should not be an unnecessarily long period of time between the first and the second reaction stages of the process according to the invention.
  • the desired stabilizing effect occurs when at least one mercapto group per bound molecule is retained in free form and the further mercapto, hydroxyl or amino group reacts with the oxirane group of the carrier. Since the carrier consists of an insoluble solid matrix and has a correspondingly low molecular mobility, the compound containing mercapto groups is largely bound to the carrier only with one of its functional groups. If this group is a hydroxyl or amino group, a mercapto group is definitely preserved. When using a compound with only one mercapto group and one or more amino or hydroxy groups, the mercapto group can react with the oxirane group of the support, so that only amino or hydroxyl groups remain. In this case the bound molecule does not contribute to the stabilization. However, since some of the molecules do not react with the mercapto but with an amino or hydroxyl group, the statistical average remains sufficiently stabilizing mercapto groups.
  • the amount of the mercapto group-containing compound is generally such that at least 0.3% by weight, based on the wet weight of the carrier enzyme product, is bound to free SH groups.
  • Hydrogen sulfide and compounds with 2 or more mercapto groups contain two (or more) hydrogen atoms bound to sulfur, so that after their binding to the Carrier definitely has at least one free Merkapto group left.
  • Compounds with two or more SH groups are particularly preferred.
  • dithioethylene glycol dithiopropylene glycol or dithiobutylene glycol
  • 1,12-dimerkaptododecane di-mercapto-acetic ester of ethylene glycol
  • dodecanediol dodecanediol
  • neopentyl glycol or 2,2'-bis (4-hydroxy-cyclohexyl) propane pentethylolaptopropionate
  • trimethylolaprophrione tri mercaptoacetate
  • -tetra-mercaptopropionate -tetra-mercaptocaproic acid ester or -tetra-mercaptoundecanoic acid ester
  • compounds with further functional groups such as dithioerythritol.
  • Merkaptoethylamine and cysteine may be mentioned as compounds with one amino and one mercapto group.
  • Compounds with only one mercapto and one or more hydroxyl groups are the least preferred because the mercapto groups generally react more easily than the hydroxyl groups with the oxirane groups of the support. Examples of this type of compound are monothioethylene glycol and monothiopropylene glycol.
  • a large number of water-insoluble carrier materials with oxirane groups which are active against proteins are known. An overview of such carriers can be found in 0. Zaborsky, "Immobilized Enzymes", Cleveland 1973.
  • the most important carrier materials are synthetic crosslinked polymers based on acrylamide, maleic anhydride, methacrylic acid, styrene or polypeptides. Carbohydrates such as agarose, cellulose, cross-linked dextran or starch are mentioned as natural carriers. Glass and other inorganic substances can also be used as carriers.
  • the number of oxirane groups should be large enough to bind at least 10 mg, preferably 100 mg or more protein per gram of carrier material.
  • Oxirane groups can already be incorporated in the preparation of a crosslinked acrylamide polymer, preferably a bead polymer produced by reverse suspension polymerization, by using comonomers containing glycidyl groups, such as glycidyl acrylate or methacrylate.
  • glycidyl groups can e.g. by reaction with epichlorohydrin or 1,4-bis (2,3-epoxypropyl) butane.
  • Pearl-shaped carriers with pearl diameters of 5 to 5000 ⁇ m are particularly advantageous because of their easy handling and their flow permeability.
  • a protein is bound to the support, which can interact in a biospecific manner with a component of a substrate mixture to be separated. This component is temporarily held on the carrier-bound protein.
  • Enzymes are preferably attached to the support, e.g. Penicillin acylase, ribonuclease, amylase or catalase. Penicillin acylase bound and stabilized in the sense of the invention is of particular technical importance because this is the only way to economically reuse this valuable enzyme on an industrial scale.
  • Some enzymes are sensitive to hydrogen sulfide or mercaptans; they are then generally not suitable for the process of the invention. Enzymes which are already stabilized or reactivated by hydrogen sulfide or free mercaptans can be converted into enzyme products of increased stability by the process of the invention.
  • penicillin acylase E. coli, specific activity 12.1 U / mg
  • 40 ml 0.1 M phosphate buffer pH 8, 0.02% NaN,
  • 10 g of the product (1a) given The mixture is left at 23 ° C. for 72 hours stand and then wash three times with 1000 ml of 1 M aqueous NaCl solution and twice with 0.05 M phosphate buffer (pH 7.5; 0.02% NAN 3 ). Yield: 37 g of moist product (after suction on glass frit).
  • Enzymatic activity 237 U / g wet product.
  • penicillin-G (potassium salt) are dissolved in 90 ml phosphate buffer (pH 7.5; 0.05 M) and the volume is brought to 100 ml with this buffer.
  • the activity is determined graphically from the linear starting area of the sales curve; 1 enzyme unit (U) corresponds to 1 ⁇ mol of cleaved substrate per minute.
  • Example 1 The product is tested as in Example 1 (a). Loss of activity after 20 repeated uses: 42%.
  • 1,4-dithioerythritol 50 mg are dissolved in 1 ml of H 2 O and the pH is adjusted to 7.5 by adding NaOH.
  • the solution is added to 2 g of carrier-bound penicillin acylase according to Example 1 (b) and the mixture is left to stand at 23 ° C. for 48 hours. Then it is washed with water (five times) and buffer (twice).

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von stabilisierten trägergebundenen Proteinen. Bei Verfahren, die auf der biospezifischen Wechselwirkung zwischen einem Protein und einem korrespondierenden Substrat beruhen, werden die Proteine mit Vorteil in Form eines an einen festen Träger gebundenen Materials eingesetzt. Das Protein läßt sich dadurch durch einfaches Filtrieren von der behandelten Substratlösung abtrennen. Trägergebundene Proteine haben Bedeutung bei der Affinitätschromatographie und besonders bei der Durchführung enzymatischer Prozesse, wobei das von dem Träger gebundene Protein ein Enzym ist.
  • Gegenüber den freien Proteinen in wäßriger Lösung zeichnen sich trägergebundene Proteine in der Regel durch eine erhöhte Stabilität gegen Inaktivierung durch pH-Wert-Verschiebung, hohe Temperaturen oder Autoxydation aus. Trotzdem sinkt die biospezifische Wirksamkeit, z.B. im Falle von Enzymen die enzymatische Aktivität, bei mehrfacher Wiederverwendung des trägergebundenen Proteins bei jeder Verwendungsstufe etwas ab. Es ist bekannt, daß man den Aktivitätsverlust von Proteinen aufhalten oder rückgängig machen kann, wen man sie mit Merkaptanen behandelt (vgl. Dissertation Jan Carlsson, Uppsala 1974, S. 8, Abstract). Die Wirkung der Merkaptane wird darauf zurückgeführt, daß sie Disulfidbrücken innerhalb des Proteinmoleküls aufspalten, die durch Autoxydation aus Thiolgruppen entstanden sind. Diese Autoxydation wird als die Ursache des reversiblen Aktivitätsverlustes angesehen.
  • Es ist in den meisten Fällen jedoch nicht erwünscht, zur Aufrechterhaltung der Aktivität des gebundenen Proteins der Substratlösung ein Merkaptan zuzusetzen, weil die Substratlösung dadurch verunreinigt wird und eine zusätzliche aufwendige Reinigungsstufe erforderlich wird. Auch die getrennte Reaktivierung des trägergebundenen Proteins zwischen zwei Anwendungen ist wegen des zusätzlichen Arbeitsaufwandes keine befriedigende Lösung. Außerdem sind die meisten Mercaptane toxisch und übelriechend.
  • Aus der DE - OS 22 15 509 ist es bekannt, ein Enzym an einen Träger, der Anhydridgruppen als gegenüber Enzymen bindungsaktive Gruppen enthält, in einer wäßrigen Lösung in Gegenwart bekannter SH-Reagentien als Stabilisatoren zu binden. Ob damit eine dauerhaft erhöhte Stabilität des gebundenen Enzyms erreicht wird, ist nicht erwiesen. Die Bindungskapazität gegenüber Proteinen wird jedoch herabgesetzt, da die bindungsaktiven Gruppen bevorzugt mit den niedermolekularen SH-Verbindungen reagieren, wodurch vor allem die sterisch gut zugänglichen, gegenüber den großen Proteinmolekülen bindungsaktiven Gruppen schnell verbraucht werden.
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, trägergebundene Proteine mit erhöhter Stabilität gegen allmählichen Aktivitätsverlust in wäßriger Lösung durch Umsetzung des Proteins mit einem wasserunlöslichen Trägermaterial herzustellen. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man ein merkaptogruppenfreies Trägermaterial einsetzt, das als bindungsaktive Gruppen Oxirangruppen enthält, und daß man auf das an den Träger gebundene Protein Schwefelwasserstoff oder eine Verbindung mit einem Molekulargewicht unter 5000 mit wenigstens einer Merkaptogruppe und wenigstens einer weiteren Merkapto-, Hydroxy- oder primären oder sekundären Aminogruppe einwirken läßt.
  • Die gegenüber dem Protein bindungsaktiven, sterisch gut zugänglichen Oxirangruppen stehen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vollständig zur Bindung des Proteins zur Verfügung, während die sterisch behinderten, für die großen Proteinmoleküle unzugänglichen Oxirangruppen nach der Bindung des Enzyms noch vorhanden und zur Umsetzung mit den verhältnismäßig kleinen Molekülen der Schwefelverbindung befähigt sind.
  • Da in der Fachwelt die Meinung vertreten wurde, daß die stabilisierende Wirkung von Merkaptanen auf ihrer Reaktion mit Disulfidbrücken beruht, war nicht zu erwarten, daß sie auch dann wirksam sein würden, wenn sie an das Trägermaterial gebunden und daher nicht in der Lage sind, in räumliche Nähe der Disulfidbrücken zu gelangen. Überraschenderweise wird durch die gebundenen Merkaptogruppen dennoch eine erhebliche Stabilisierung erreicht. In der nachfolgenden Tabelle wird am Beispiel einer trägergebundenen.
  • Penicillin-Acylase der Aktivitätsverlust bei mehrfacher Wiederverwendung mit und ohne Merkaptogruppen am Träger gegenübergestellt. Die Merkaptogruppen wurden in diesem Falle durch Bindung von Dithioerythrit an einen Epoxydgruppen enthaltenden Enzymträger eingeführt. Das Trägermaterial war ein vernetztes Acrylamidpolymerisat mit Epoxydgruppen, das zunächst mit Penicillin-Acylase und danach gegebenenfalls mit 50 bzw. 500 mg Dithioerythrit je Gramm des feuchten Trägermaterials umgesetzt worden war. Die Aktivität des Präparats gegenüber 6-Amino-penicillinsäure wurden in wiederholter Umsetzung von 1 bis 2 g des Präparats mit jeweils 5% Substrat in 200 ml Substratlösung (0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,5) bei 37°C durch automatische Titration mit 1,0 N NaOH ermittelt. Die Ausgangsaktivität bei der ersten Verwendung wurde jeweils als 100% bezeichnet.
    Figure imgb0001
  • Die erfindungsgemäß erreichte Stabilisierung beruht auf der Bindung von Schwefelwasserstoff oder einer wenigstens eine Merkaptogruppe und wenigstens eine weitere Merkapto-, Hydroxy- oder primäre oder sekundäre Aminogruppe enthaltenden Verbindung an die bindungsaktiven Oxirangruppen des Trägermaterials. Die Merkapto-, Hydroxy- oder Aminogruppen der genannten Verbindungen reagieren ebenso wie die entsprechenden Gruppen der zu bindenden Proteine mit den Oxirangruppen des Trägermaterials. Da die Verbindungen ein Molekulargewicht unter 5000 haben, vermögen sie aufgrund ihrer geringen Molekülgröße noch mit den Oxirangruppen des Trägermaterials zu reagieren, die für Proteinmoleküle aus Gründen sterischer Hinderung nicht zugänglich sind. Die Oxirangruppen reagieren mit Schwefelwasserstoff bzw. mit Merkapto-, Hydroxy- und Aminogruppen leichter als mit Wasser, so daß es möglich ist, sowohl die Umsetzung der Oxirangruppen mit dem Protein als auch die nachfolgende Umsetzung mit der Merkapto- und gegebenenfalls Hydroxy- oder Aminogruppen enthaltenden Verbindung in wäßriger Phase vorzunehmen. Da die Oxirangruppen dennoch allmählich durch Wasser zersetzt werden, sollte zwischen der ersten und der zweiten Umsetzungsstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens kein unnötig langer Zeitraum liegen.
  • Die erwünschte Stabilisierungswirkung kommt dann zustande, wenn wenigstens eine Merkaptogruppe je gebundenes Molekül in freier Form erhalten bleibt und die weitere Merkapto-, Hydroxy- oder Aminogruppe mit der Oxirangruppe des Trägers reagiert. Da der Träger aus einer unlöslichen festen Matrix besteht und eine entsprechend niedrige Molekülbeweglichkeit hat, wird die Merkaptogruppenhaltige Verbindung zum weit überwiegenden teil nur mit einer ihrer funktionellen Gruppen an den Träger gebunden. Wenn diese Gruppe eine Hydroxyl- oder Aminogruppe ist, bleibt auf jeden Fall eine Merkaptogruppe erhalten. Bei Verwendung einer Verbindung mit nur einer Merkaptogruppe und einer oder mehreren Amino- oder Hydroxygruppen kann gerade die Merkaptogruppe mit der Oxirangruppe des Trägers reagieren, so daß nur noch Amino- oder Hydroxygruppen übrigbleiben. In diesem Fall trägt das gebundene Molekül nicht zur Stabiliserung bei. Da jedoch ein Teil der Moleküle nicht mit der Merkaptosondern mit einer Amino- oder Hydroxygruppe reagiert, bleiben im statistischen Mittel genügend stabilisierend wirkende Merkaptogruppen übrig.
  • Die Menge der Merkaptogruppen-haltigen Verbindung wird im allgemeinen so bemessen, daß wenigstens 0,3 Gew.-%, bezogen auf das Feuchtgewicht des Träger-Enzym-Produkts, an freien SH-Gruppen gebunden ist. Schwefelwasserstoff und Verbindungen mit 2 oder mehr Merkaptogruppen enthalten zwei (oder mehr) an Schwefel gebundene Wasserstoffatome, so daß nach ihrer Bindung an den Träger auf jeden Fall wenigstens eine freie Merkaptogruppe übrig bleibt. Verbindungen mit zwei oder mehr SH-Gruppen sind besonders bevorzugt. Dazu gehören Dithioäthylenglykol, Dithiopropylenglykol oder Dithiobutylenglykol, 1,12-Dimerkaptododecan, Di-merkaptoessigester des Äthylenglykols, Dodecandiols, Neopentylglykols oder des 2,2'-Bis-(4-hydroxy-cyclohexyl)-propans, Trimethylolpropantri-merkaptopropionat, Pentaerythrit-tetra-merkaptoacetat, -tetra-merkaptopropionat, -tetra-merkaptocapronsäureester oder -tetra-merkaptoundecansäureester sowie Verbindungen mit weiteren funktionellen Gruppen, wie Dithioerythrit. Als Verbindungen mit je einer Amino- und einer Merkaptogruppe seien Merkaptoäthylamin und Cystein genannt. Verbindungen mit nur einer Merkapto- und einer oder mehr Hydroxylgruppen sind am wenigsten bevorzugt, da die Merkaptogruppen in der Regel leichter als die Hydroxylgruppen mit den Oxirangruppen des Trägers reagieren. Beispiele dieses Verbindungstyps sind Monothioäthylenglykol und Monothiopropylenglykol.
  • Es ist eine Vielzahl von wasserunlöslichen Trägermaterialien mit gegenüber Proteinen bindungsaktiven Oxirangruppen bekannt. Eine Übersicht über derartige Träger findet sich in 0. Zaborsky, "Immobilized Enzymes", Cleveland 1973. Als wichtigste Trägermaterialien werden dort synthetische vernetzte Polymere auf Basis von Acrylamid, Maleinsäureanhydrid, Methacrylsäure, Styrol oder Polypeptiden genannt. Als natürliche Trägerstoffe werden Kohlenhydrate, wie Agarose, Cellulose, vernetztes Dextran oder Stärke erwähnt. Auch Glas und andere anorganische Stoffe kommen als Träger in Betracht. Die Zahl der Oxirangruppen soll groß genug sein, um wenigstens 10 mg, vorzugsweise 100 mg oder mehr Protein je Gramm Trägermaterial zu binden.
  • Oxirangruppen können schon bei der Herstellung eines vernetzten Acrylamidopolymerisats, vorzugsweise eines durch umgekehrte Suspensionspolymerisation erzeugten Perlpolymerisats, durch Mitverwendung glycidylgruppenhaltiger Comonomerer, wie Glycidyl-acrylat oder -methacrylat, eingebaut werden. In Trägerkörper mit Kohlenhydratstruktur, wie Cellulose, Agarose oder Dextran, können Glycidylgruppen z.B. durch Umsetzung mit Epichlorhydrin oder 1,4-Bis-(2,3-epoxypropyl)-butan eingeführt werden. Perlförmige Trägerstoffe mit Perldurchmessern von 5 bis 5000 ,um sind wegen ihrer leichten Handhabbarkeit und ihrer Strömungsdurchlässigkeit besonders vorteilhaft.
  • Die Natur des zu bindenden Proteins richtet sich nach dem vorgesehenen Verwendungszweck des Verfahrensproduktes. Für Zwecke der Affinitätschromatographie wird ein Protein an den Träger gebunden, das in biospezifische Wechselwirkung zu einer Komponente eines aufzutrennenden Substratgemisches treten kann. Diese Komponente wird an dem trägergebundenen Protein vorübergehend festgehalten. Vorzugsweise werden Enzyme an den Träger gebunden, wie z.B. Penicillinacylase, Ribonuclease, Amylase oder Katalase. Im Sinne der Erfindung gebundene und stabilisierte Penicillinacylase hat besondere technische Bedeutung, weil erst dadurch eine wirtschaftliche Wiederverwendunq dieses wertvollen Enzyms im technischen Maßstab möglich wird.
  • Einige Enzyme sind gegenüber Schwefelwasserstoff oder Merkaptanen empfindlich; sie eignen sich dann im allgemeinen nicht für das Verfahren der Erfindung Enzyme, die schon durch Schwefelwasserstoff oder freie Merkaptane stabilisiert oder reaktiviert werden, lassen sich durch das Verfahren der Erfindung in Enzymprodukte von erhöhter Stabilität überführen.
    • Beispiel 1 a) Herstellung von Oxiranacrylharzperlen
  • In einem Rundkolben (6000 ml), versehen mit Thermometer, lmpeller-Rührer, Rückflußkühler und N,-Einleitungsrohr werden
    Figure imgb0002
    95% n-Butylmethacrylat
    5% 2-Trimethylammoniumäthylmethacrylat-chlorid
    vorgelegt. Unter Einleitung von Stickstoff wird bei ca. 55°C eine Mischung aus
    Figure imgb0003
    zugegeben und durch Rühren in der organischen Phase verteilt. Die Polymerisation wird durch Zugabe von 6 g Dimethylanilin beschleunigt. Nach 10-stündiger Polymerisation wird auf Raumtemperatur abgekühlt, die Perlen absetzen gelassen und die überstehende flüssige Phase abdekantiert. Die Perlen werden durch Zugabe von ca. 2000 ml Aceton entquollen, abgesaugt und zweimal mit Aceton nachgewaschen. Anschließend werden sie über Nacht bei Raumtemperatur im Vakuum getrocknet. Ausbeute: ca. 90% feine, leicht gelbl. Perlen.
    • b) Immobilisierung der Penicillinacylase
  • 1,2 g Penicillinacylase (E.coli, spez. Aktivität 12,1 U/mg) werden in 40 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8, 0,02% NaN,) gelöst und zu 10 g des Produkts (1a) gegeben. Man läßt bei 23°C 72 Stunden lang stehen und wäscht anschließend dreimal mit jeweils 1000 ml 1 M wäßriger NaCI-Lösung und zweimal mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,5; 0,02% NAN3). Ausbeute: 37 g Feuchtprodukt (nach Absaugen auf Glasfritte). Enzymatische Aktivität: 237 U/g Feuchtprodukt.
    • c) Aktivitätsbestimmung
  • 2 g Penicillin-G (Kaliumsalz) werden in 90 ml Phosphatpuffer (pH 7,5; 0,05 M) gelöst und das Volumen mit diesem Puffer auf 100 ml gebracht.
  • 20 ml dieser Substratlösung und 250 mg (Feuchtegewicht!) des Produktes (1b) werden in einem Titrierstand (TTA 3, Fa. Radiometer, Kopenhagen) bei 37°C thermostatisiert gerührt. Die durch Hydrolyse freiwerdende Phenylessigsäure wird bei pH 7,8 mit 1 N NaOH aus einer Autobürette (ABU 12, Fa. Radiometer, Kopenhagen) automatisch titriert, über pH-Meter und Titrator-(Typ 11, Fa. Radiometer, Kopenhagen) gesteuert. Simultan wird der NaOH-Verbrauch mit Hilfe eines Schreibers (Tritrigraph SBR 2c, Fa. Radiometer, Kopenhagen) registriert.
  • Die Aktivität wird aus dem linearen Anfangsbereich der Umsatzkurve graphisch ermittelt; 1 Enzymeinheit (U) entspricht 1 uMol gespaltenem Substrat pro Minute.
    • d) Aktivitätsverlust bei wiederholter Verwendung bei 95% Umsatz von Substratlösungen einer Konzentration von 5%
  • 2,0 g des Produktes (1b) und 20 ml einer 5%igen Substratlösung (5% Penicillin-G-K in 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,5 enthaltend 0,02% NaN3) werden bei pH 7,5 und 37°C bis zu einem Substratumsatz von 95-98% gerührt. Apparatur und Registrierung der Umsatkurve wie unter (1 c) beschrieben.
  • Dann werden die Enzymperlen auf einer Glasfritte abgesaugt und erneut gegen 20 ml Substratlösung eingesetzt. Diese Prozedur wird 20 mal hintereinander wiederholt.
  • Aktivitätsverlust nach 20 Verwendungen: 57%.
    • Beispiel 2
  • Zu 2 g der trägergebundenen Penicillinacylase nach Beispiel 1 (b) werden 10 ml einer wäßrigen Lösung von Dithioglykol (2% mit NaOH auf pH 7,5 eingestellt) gegeben. Man läßt das Gemisch bei 37°C 18 h lang stehen und wäscht mit Wasser (zehnmal jeweils 100 ml) und zweimal mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,5).
  • Ausbeute: 1,95 g Feuchtprodukt.
  • Das Produkt wird wie in Beispiel 1 (a) geprüft. Aktivitätsverlust nach 20 wiederholten Verwendungen: 42%.
    • Beispiel 3
  • 50 mg 1,4-Dithioerythrit werden in 1 ml H20 gelöst und der pH-Wert durch Zugabe von NaOH auf 7,5 eingestellt. Die Lösung wird zu 2 g trägergebundenen Penicillinacylase nach Beispiel 1 (b) gegeben und das Gemisch wird 48 h lang bei 23°C stehen gelassen. Dann wird es mit Wasser (fünfmal) und Puffer (zweimal) gewaschen.
  • Ausbeute: 1,98 g.
  • Aktivitätsver!ust nach 20 wiederholten Verwendungen, durchgeführt wie im Beispiel 1 (d): 35%.
    • Beispiel 4
  • 500 mg Dithioerythrit werden in 5 ml Wasser gelöst und durch NaOH-Zugabe wird ein pH von 7,8 eingestellt. Diese Lösung wird zu 2 g der trägergebundenen Penicillinacylase nach Beispiel 1 (b) gegeben und das Gemisch bei 23°C 48 h lang stehen gelassen. Dann wird es mit Wasser (fünfmal) und Puffer (zweimal) gewaschen.
  • Aktivitätsverlust nach 20 wiederholten Verwendungen, durchgeführt wie im Beispiel 1 (d): 11 %.

Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung von stabilisierten trägergebundenen Proteinen durch Umsetzung eines Proteins in wäßriger Lösung und eines SH-Gruppen enthaltenden Stabilisators mit einem wasserunlöslichen Trägermaterial, das gegenüber Proteinen bindungsaktive Gruppen enthält, dadurch gekennzeichnet, daß ein merkaptogruppen-freies Trägermaterial eingesetzt wird, das als bindungsaktive Gruppen Oxirangruppen enthält, und daß man auf das an den Träger gebundene Protein Schwefelwasserstoff oder eine Verbindung mit einem Molekulargewicht unter 5000 mit wenigstens einer Merkaptogruppe und wenigstens einer weiteren Merkapto-, Hydroxy- oder primären oder sekundären Aminogruppe einwirken läßt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Trägermaterial auf Basis eines Polyacrylamids oder von Kohlehydratderivaten verwendet wird.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekenzeichnet, daß ein perlförmiges Trägermaterial mit einem Perldurchmesser zwischen 5 und 1000 µm auf Basis eines vernetzten Polyacrylamids mit Oxirangruppen eingesetzt wird.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung mit wenigstens einer Merkaptogruppe eine aliphatische Verbindung mit 2 bis 8 C-Atomen einsetzt.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das gebundene Protein ein Enzym ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das gebundene Enzym Penicillin- acylase, Ribonuklease, Amylase oder Katalase ist.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das gebundene Enzym Penicillin- acylase ist.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 0,3 Gew.-% (bezogen auf das Feuchtgewicht des Endprodukts) an freien Merkaptogruppen an das Trägermaterial angelagert werden.
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3067764D1 (en) * 1979-09-21 1984-06-14 Ici Plc Fast crystallising block copolyester composition
US4442212A (en) * 1980-11-10 1984-04-10 E. I. Du Pont De Nemours & Company Monothioglycerol as thiol-protector in lyophilized materials
DE3136940A1 (de) * 1981-09-17 1983-03-31 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt "verfahren zur herstellung von 5'-ribonucleotiden"
DE3334848A1 (de) * 1983-09-27 1985-04-04 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur herstellung der optischen antipoden von tert.-leucin
DE3435156A1 (de) * 1984-09-25 1986-04-03 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur herstellung der stereoisomeren von 1-amino-alkylphosphonsaeuren oder 1-aminoalkylphosphinsaeuren
DE3726454A1 (de) * 1987-08-08 1989-02-16 Behringwerke Ag Thiolgruppenhaltige polymere, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US5168048A (en) * 1990-04-18 1992-12-01 Gist-Brocades Nv Penicillin G acylase, a gene encoding the same and a method for the production of this enzyme
DE4123014A1 (de) * 1991-07-11 1993-01-14 Kaltenbach & Voigt Bearbeitungsgeraet zum bearbeiten von feinwerktechnischen, insbesondere dentaltechnischen werkstuecken in einem von einem gehaeuse umgebenen bearbeitungsraum
DE19620036C2 (de) * 1996-05-17 1998-03-12 Roehm Gmbh Gewinnung von wasserfreiem 2-Trimethylammoniumethylmethacrylatchlorid aus wäßriger Lösung
DE19804518C2 (de) * 1998-02-05 2000-10-05 Roehm Gmbh Verfahren zur Herstellung von perlförmigen Mischpolymerisaten auf Acrylatbasis, danach hergestellte Trägerpolymermaterialien und deren Verwendung
JP7159617B2 (ja) 2018-05-25 2022-10-25 富士電機株式会社 冷却装置、半導体モジュール、車両および製造方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE337223B (de) * 1967-05-23 1971-08-02 Pharmacia Ab
US3853708A (en) * 1970-01-23 1974-12-10 Exploaterings Ab Tbf Coupling biologically active substances to oxirane-containing polymers
DE2215509C3 (de) * 1972-03-30 1980-06-26 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Vernetzte Copolymerisate
SE420733B (sv) * 1974-05-30 1981-10-26 Exploaterings Ab Tbf Gelprodukt, innehallande tiosulfatgrupper samt sett for framstellning derav
US4008126A (en) * 1976-03-15 1977-02-15 Owens-Illinois, Inc. Immobilization of proteins by in-situ polymerization

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