DD157107A1 - Verfahren zur enzymatischen kofaktorgewinnung - Google Patents

Abstract

Glucosedehydrogenase (Gluc-DM, EC 1.1.1.47) wird an aminogruppenhaltigen Polymeren vom Methacrylattyp, die durch polymeranaloge Umsetzungen von polymeren Sulfoestern mit /-Diaminoalkanen gewonnen werden, immobilisiert. Diese polymeren Biokatalysatoren wandeln in Gegenwart des Kosubstrates Glucose NAD und NADP mit annaehernd gleicher Reaktionsgeschwindigkeit in die reduzierten Kofaktoren NADH und NADPH um. Das Verfahren kann in der Biotechnologie und stoffwandelnden Industrie genutzt werden.

Description

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Dr. Kühn Dr. Kirstein Dr, Scheller Schubert Prof. Dr. Mohr

"Verfahren zur enzymatisehen Kofaktorgewinnung"

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung der reduzierten Formen von Kofaktoren. Anwendungsgebiete sind die Biotechnologie und die stoffwandelnde Industrie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen In der Biotechnologie, Analytik und stoffwandelnden Industrie erlangen Reaktionen mit löslichen und immobilisierten Enzymen zunehmende Bedeutung. Einer weiteren Ausdehnung von enzymatischen Reaktionen auf den genannten Gebieten sind aber Grenzen gesetzt, weil es gegenwärtig nicht möglich ist, UADH- (1,4-Dihydronicotinamiddinucleotid) und HADPH- (1,4-Bihydronicotinamiddinucleotidphosphat) abhängige Enzymreaktionen in ökonomisch vertretbaren Dimensionen wegen der hohen Kosten der nur einmalig einsetzbaren Kofaktoren zu betreiben. Es hat deshalb in den letzten Jahren nicht an Versuchen gefehlt, einfache und billige Methoden zur Kofaktorgewinnung und Kofaktorregenerierung auf der Basis chemischer, elektrochemischer oder enzymatischer Verfahren zu entwickeln. Große Nachteile der bisher bekannten Verfahren sind aber, daß Fremdstoffe oder Reaktionspartner durch komplizierte Trennoperationen von den reduzierten Kofaktoren abgetrennt werden müssen, daß neben den eigentlichen aktiven 1,4-Dihydroderivaten der Pyridinnucleotide auch ein hoher Prozentsatz inaktiver 1,6-Dihydroderivate oder dimerer Produkte gebildet v/erden und daß verschiedene Verfahren nur diskontinuierlich betrieben werden können.

Ein beschriebener Ausv/eg zur Lösung des zuletzt genannten Problems besteht in der Immobilisierung der die oxidierten Kofaktoren reduzierenden Systeme. Die Immobilisierung von Enzymen zur Reduktion oxidierter Kofaktoren bietet dabei den Vorteil, daß in spezifischen Reaktionen ausschließlich aktive reduzierte Pyridinnucleotide gebildet werden. Die Immobilisierung von UAD- und RADP-reduzierenden Enzymen ist bekannt, wobei vor allem kommerzeill zugängliche Enzyme wie Alkoholdehydrogenase, Laktatdehydrogenase, Malatdehydrogenase oder Isooitratdehydrogenase eingesetzt wurden«, Die Verwendung dieser Enzyme hat aber den Kachteil, daß sie sehr substrat spezifisch nur KAD oder UADP reduzieren bzw» eine sehr viel größere Spezifität gegenüber nur einem der beiden oxidierten Kofaktoren besitzen, so daß sie nicht allgemein zur Synthese von KADH und KADPH einsetzbar sind.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein allgemein anwendbares enzymatisches Verfahren zur Synthese von HADH und KADPH" zu entwickeln, das die beschriebenen Nachteile bisher bekannter Verfahren nicht besitzt, und bei dem sowohl KAD als auch KADP mit annähernd gleicher Geschwindigkeit zu den reduzierten Kofaktoren umgesetzt werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Erfindungsgemäß wird Glucosedehydrogenase (Gluc~DH, EG \e1iio47) a& unlöslichen Trägern immobilisiert und in dieser Form mit Glucose und KAD oder KADP als Kosubstrate in Pufferlösungen vom pH-Wert 7 bis.9, vorzugsweise aber 8, und bei Temperaturen von 0 - 5O⁰C, vorzugsweise bei Umgebungstemperatur, in Säulen- oder Tankreaktoren umgesetzt. Kach der einfach durchführbaren Trennung von Trägermaterial und Reaktionslösung v/erden die gebildeten reduzierten Pyridinnucleotide nach bekannten Verfahren quantitativ bestimmt und isoliert. Kach den Untersuchungen eignet sich Glukosedehydrogenase für ein allgemein einsetzbares Verfahren zur Reduktion von Kofaktoren besonders gut, weil sowohl NAD als auch KADP

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mit fast annähernd gleicher Geschwindigkeit reduziert werden. Pur einen wirtschaftlichen Einsatz in Säulen- und Tankreaktoren und zur Erhöhung der Langzeit- und Arbeitsstabilität wird die Glucosedehydrogenase an makroporösen, modifizierten Poly (2-hydroxyäthylmethacrylaten) koyalent gebunden, d₀ h. in eine unlösliche Form gebracht."Dabei zeigte sich, daß für eine optimale katalytische Aktivität der immobilisierten Glucosedehydrogenase Polymere mit einer Porenausschlußgrenze von 1' 000 000 Dalton eingesetzt werden müssen. Eine weitere Voraussetzung für den effektiven Einsatz immobilisierter Glucosedehydrogenase in Reaktoren ist deren Immobilisierung nach einer optimalen Methode, um Träger mit hoher Arbeitsund Langzeitst©,bilität sowie hoher katalytischer Aktivität zu erhalten. Es wurde gefunden, daß nach einem speziellen Verfahren synthetisierte modifizierte Poly (2-hydroxyäthylmethaerylate) mit einem hohen Gehalt an primären Aminogruppen bessere· Ausgangspolymere zur Immobilisierung der Glucosedehydrogenase darstellen, als nach bisher bekannten Verfahren hergestellte aminogruppenhaltige Polymere. Die Aktivierung dieser aminogruppenhaltigen Polymeren zur kovalenten Bindung der Glucosedehydrogenase ist nach bekannten Methoden möglich, wobei es zur Erzielung hoher katalytischer Aktivitäten wichtig ist, daß die Glucosedehydrogenase nicht in Gegenwart der Aktivierungsreagenzien immobilisiert wird» Am vorteilhaftesten geht man dabei so vor, daß die aminogruppenhaltigen Polymeren mit einem bifunktionellen Aktivierungsreagenz wie 1j4-Benzochinon, Glutaraldehyd, Cyanursäurechlorid oder anderen umgesetzt werden, die unlöslichen Polymeren von der lösung mit dem überschüssigen Aktivierungsreagenz abgetrennt werden und danach die Glucosedehydrogenase bei 0-30 C, vorzugsweise 0 - 5⁰C,in Pufferlösungen vom pH-Wert 6-8, vorzugsweise 6,5 - 7, immobilisiert wird.. Die auf diese Weise immobilisierte Glucosedehydrogenase zeichnet sich durch eine hohe katalytische Aktivität und mit im Vergleich zu nach anderen Methoden und an anderen Trägermaterialien immobilisierter Glucosedehydrogenase höherer

Langzeit- and Arbeitsstabilität aus. Auf Grand der stabilen sphärischen Form der zar Immobilisierung verwendeten Polymeren kann neben dem Einsatz in gerührten Reaktoren mit Vorteil aach in Säulenreaktoren bei hoher Durchf laufgeschwindigkeit über einen langen Zeitraum gearbeitet werden« Die Immobilisierung der Glucosedehydrogenase an neuen, zur Glucosedehydrogenase-Immobilisierung optimierten, aminogruppenhaltigen Poly (2-hydroxyäthylmethacrylaten) stellt damit ein verbessertes und allgemein anwendbares Verfahren zur Synthese sowohl von HADH als auch von. IADPH dar. Und schließlich kann als weiterer Vorteil des Verfahrens angesehen werden, daß die Glucosedehydrogenase als Cosubstrat nur die billige und leicht zugängliche Glucose benötigt. Bei Verwendung anderer Enzyme sind dagegen weitaus teurere Gbsubstrate notwendig. Sachfolgend soll die Erfindung anhand von Beispielen erläutert v/erden, die jedoch den allgemeinen Charakter der Erfindung nicht einschränken sollen»

Ausführungsbeispiel Beispiel ,1.

50 g eines nach WP ' hergestellten Polymeren mit aromatischen Sulfoestergruppen und einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 1 000 000 Dalton werden in 100 ml Äthanol 12 Standen gequollen. In die Suspension werden 5 g 1j,6~Di~ aminohexan eingetragen, die bei 70⁰C 30 Minuten gerührt wird. Nach dem Abfiltrieren des aminogruppenhaltigen Polymeren wird es mit Äthanol, Wasser, Salzsäure (0,01 Mol/l), Natronlauge (0,01 Mol/l) und Wasser gewaschen. 'Das aminogruppenhaltlge Polymere wird zu einer aoetonischen "Lösung von 1,4-Benzochinon addiert, und die Suspension wird 5 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Das Polymere wird abfiltriert und mit Aceton und Wasser gewaschen,· bis das Eluat farblos ist. Zuo2 Immobilisierung der Glucosedehydrogenase werden 500 mg des Enzyms in 50 ml Phosphatpuffer (0,1 Mol/l, pH-Wert 6,5) gelöst, und in diese Lösung.wird das mit 1j4-Benzochinon aktivierte aminogruppenhaltige Polymere eingetragen. Die Immobi-

lisierung wird bei 4°C 8 Stunden durchgeführt, und danach wird das Polymere abgetrennt und mit dem Kupplungspuffer gewaschen, bis im Eluat kein Protein mehr nachweisbar ist. 50 g dieses Glucosedehydrogenase-Kupplungsproduktes werden in einer Säulenanordnung mit einer Lösung von 5 g IiADP und 67,7 g Glucose pro Liter Phosphatpuffer (0,05 Mol/l, pH-Wert 8) bei Umgebungstemperatur durchströmt. Im Säulenauslauf wird die HADPH-Konzentration spektralphotometrisch bestimmt. Die Umsatzgeschwindigkeit dieser Säule beträgt 45,2 mg UADP/min.

Beispiel 2

50 g eines nach Beispiel 1 hergestellten Polymeren mit kovalent gebundener ßlucosedehydrogenase werden in einem Säulenreaktor mit einer Lösung von 4,2 g UAD und„67,7 g Glucose pro Liter Phosphatpuffer (0,05 Mol/l, pH-Wert 8) bei Umgebungstemperatur durchströmt. Im Säulenauslauf wird die NADH-Konzentration spektralphotometrisch bestimmt. Bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 27 ml/min oder kleiner beträgt der Umsatz 100 %,

1 g eines aminogruppenhaltigen Polymeren vom Typ des Wofatit AK 40 wird 12 Stunden in 5 ml Tris-Puffer (0,1 Mol/l; pH 7,6) gequollen und dann mit 10 ml Glutaraldehyd'(25 %ig) versetzt. Nach einer Aktivierungszeit von 3 Stunden wird das Polymere mit 5 1 destilliertem Wasser gewaschen. Dieser aktivierte Träger wird in 5 ml einer wäßrigen Lösung eingetragen, in der zuvor 1 Enzymeinheit an Glucosedehydrogenase aufgelöst wurde* Die Suspension wird 6 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Έach der Immobilisierung der Glukosedehydrogenase wird der Träger abgetrennt, mit 2 Liter destilliertem Wasser gewaschen und im Ford-Reaktor wird seine Aktivität bestimmt. Die Produktmenge beträgt in diesem Falle 8 χ 10 ^ mg NADH pro Minute und pro Gramm Träger. ' -

Claims (2)

1. - 6- . <&> ί / 1 4 1

   Erfindunffsanspruch

   1. Verfahren zur Herstellung der reduzierten Kofaktoren IADH
   und NADPH, dadurch gekennzeichnet, daß immobilisierte
   Glucosedehydrogenase mit einem Monosaccharid, vorzugsweise Glucose, und HAD oder NADP als Kosubstrate in Pufferlösungen vom pH-Wert 7 "bis 9? vorzugsweise aber 8, und bei Temperaturen von 0 - 50 C, vorzugsweise bei Umgebungstemperatur, in Säulen- oder Tankreaktoren umgesetzt wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur
   Immobilisierung der Glueosedehydrogenase mit bifunktionellen Reagenzein aktivierte aminogruppenhaltige Träger, vorzugSY/eise Kopolymere von Hydroxyalkylmethaerylaten (Alkyl
   Cp-Og) mit ausgewählten Vernetzungsmitteln aus den Gruppen von Divinyl- oder Polyviny!monomeren des Methao'yylattyps
   eingesetzt werden*