DD200592A1 - Verfahren zur herstellung von traegermaterialien mit katalytischer aktivitaet - Google Patents

Abstract

Zur Erhoehung der Viskositaet von Proteinloesungen beim Prozesz der Herstellung flaechiger oder sphaerischer Traegermaterialien werden zunaechst Traegerproteine in waeszrigen Loesungen aufgeloest, gegebenenfalls mit Formaldehyd versetzt und durch Eintragen in mit Wasser nicht mischbaren Loesungsmitteln wieder ausgefaellt. Die erneut in Wasser oder Pufferloesungen geloesten Traegerproteine werden mit katalytisch aktiven Verbindungen, die im Falle der Verwendung von Enzymen zuvor mit den gleichen Traegerproteinen in vernetzter oder nicht vernetzter Form behandelt werden und Indikatorsystemen zur Bestimmung der katalytischen Aktivitaet vermischt. Diese Proteinloesungen mit erhoehter Viskositaet werden zu flaechigen oder sphaerischen Traegermaterialien mit katalytischer Aktivitaet verarbeitet. Den Proteinloesungen zur Herstellung der flaechigen oder sphaerischen Traeger werden zur Erhoehung der Lagerstabilitaet Antibiotika zugesetzt.

Description

Dr. M. Kühn K. Buttgereit S. Eokardt

"Verfahren zur Herateilung von Trägermaterialien mit katalytischer Aktivität"

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Viskosität von Proteinlösungen zur Herstellung unlöslicher flächiger oder sphärischer Trägermaterial!en aus ihnen, welche auf stoffwandelndem Gebiet, in analytischen Systemen, in der Medizin oder fotochemischen Industrie verwendet werden können.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Proteine wie Kollagen, Gelatine, Albumin und andere werden auf Grund ihrer leichten Zugänglichkeit und der ausgeprägten Biokompatibilitat häufig als Trägerproteine zur Immobilisierung von Enzymen, aber auch anderer katalytisch aktiver oder fotochemisch aktiver Verbindungen verwendet. Weitere Vorteile bei der Verwendung dieser Proteine bestehen darin, daß die daraus hergestellten unlöslichen Träger oder Trägerschichten eine gute Quellbarkeit in Wasser besitzen und sich durch ihre hervorragenden hydrophilen Eigenschaften auszeichnen. Technologisch wird bei den Immobilisierungsreaktionen so vorgegangen, daß die aufgelösten oder suspendierten Trägerproteine mit katalytisch aktiven Verbindungen oder Fotochemikalien vermischt werden und durch Geleinschluß, gegebenenfalls auch durch Quervernetzung mit bifunktionellen Reagentien immobilisiert werden. Herstellung und Anwendung dieser Trägermaterialien ist aber oft schwierig oder überhaupt nicht möglich, weil die in wäßrigen Lösungen aufgelösten oder suspendierten Trägerproteine allein oder auch in Verbindung eines

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Gemisches mit den katalytisch oder fotochemisch aktiven Verbindungen häufig nicht in eine unlösliche Form gebracht werden können. Dafür muß die während des Immobilisierungsprozesses sich ständig verringernde Viskosität verantwortlich gemacht werden. Dieses Problem konnte auch nicht durch die Erhöhung der Konzentration der Trägerproteine oder durch die Verwendung von bifunktionellen Vernetzungsmitteln gelöst werden.

Von einem optimalen, unlöslichen Trägermaterial zur Immobilisierung von katalytisch aktiven Verbindungen wird aber auch verlangt, daß es nach seiner Herstellung eine ausreichende Langzeitstabilität sowohl unter Lagerungs- als auch Arbeitsbedingungen besitzt und nicht, wie es häufig beobachtet wird, unter dem Einfluß von Feuchtigkeit durch Verlust der Aktivität unbrauchbar wird. Aus den genannten Gründen und wegen der praktischen Bedeutung solcher Lösungen der Trägerproteine und den daraus hergestellten unlöslichen Trägermaterialien besteht ein großes Interesse an solchen Proteinlösungen, die eine zur Herstellung von unlöslichen Trägermaterialien aus-? reichende Stabilität und optimale, sich möglichst nur wenig verändernde Viskosität besitzen. /

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, die Viskosität von Proteinlösungen aus einem inerten Trägerprotein oder einem Gemisch von Trägerprotein mit katalytisch aktiven Verbindungen und Indikatorsystemen zur Bestimmung der katalytischen Aktivität oder einem Trägerprotein mit fotochemisch aktiven Verbindungen oder den genannten Gemischen untereinander in Wasser so zu erhöhen, daß aus ihnen stabile sphärische oder flächige Trägermaterialien hergestellt werden können. Diese Proteinlösungen und die daraus hergestellten unlöslichen Träger sollen sich dadurch auszeichnen, daß sie eine größere Stabilität als bisher bekannte ähnliche Proteinlösungen oder Trägermaterialien besitzen.

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Darlegung des Wesens der Erfindung

Erfindungsgemäß werden Trägermaterialien mit katalytischer Aktivität, ausgehend von Lösungen eines inerten Trägerproteins mit katalytisch aktiven Verbindungen, deren Viskositäten sich innerhalb von 2 Stunden bei einer eingestellten Temperatur im Bereich von 20 - 50⁰C sich nicht um mehr als 10 30 % verringert, hergestellt. Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß Trägerproteine wie Kollagen, Gelatine oder Albumin in Wasser oder Pufferlösungen, gegebenenfalls mit 1 5 % Formaldehyd aufgelöst werden und danach durch Eintragen in mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische, die mit 1 - 10 % eines Emulgators versetzt wurden, wieder ausgefällt werden. Als mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel oder Gemische werden vor allem aliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe, halogenierte Kohlenwasserstoffe oder Äther sowie deren Gemische eingesetzt und als Emulgatoren Polyglykolmonoalkyl- oder arylather höherer Alkohole und Alkylphenole mit Alkyl größer als C₁-. Die auf diese Weise erhaltenen sphärischen Partikel der Trägerproteine werden mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel behandelt und in eiskaltem Wasser aufgequollen und in dieser Form oder nach Quervernetzung mit bifunktionellem Vernetzungsmittel mit Lösungen von Enzymen bei 0 - 30⁰C, vorzugsweise bei 0 - 5⁰C, in Kontakt gebracht. Dies ist sowohl im Batch- als auch im Säulenverfahren möglich, wobei nicht vernetzte Trägerproteine mit Vorteil im Batchverfahren eingesetzt werden und vernetzte im Säulenverfahren. Aus den Elutionslösungen können die Enzyme nach bekannten Verfahren z. B. durch Ausfällen mit organischen Lösungsmitteln bzw. durch Lyophilisation isoliert werden, oder sie werden in den Lösungen bei 0 - 4⁰C aufbewahrt. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin, daß auf die beschriebene Art vorbehandelte Enzyme oder Enzymgemische, aber auch andere katalytisch aktive Verbindungen wie lösliche und unlösliche Komplexkatalysatoren oder fotochemische Systeme zusammen mit den nicht vernetzten Trägerproteinen aufgelöst

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werden oder zu Suspensionen verarbeitet werden und daraus flächige oder sphärische Trägermaterialien mit katalytischer Aktivität hergestellt werden, indem diese Lösungen oder Suspensionen auf ebenen Flächen aufgetragen und verteilt bzw. versprüht werden oder unter Rühren in organische Lösungsmittel eingetragen werden. Als organische Lösungsmittel kommen je nach Art der eingesetzten katalytisch aktiven Verbindungen mit Wasser mischbare Lösungsmittel, wie sie auch zur Herstellung der nicht vernetzten sphärischen Trägerproteine verwendet werden, in Betracht. Zur Bildung und/oder Stabilisierung dieser Trägermaterialien können bifunktionelle Vernetzungsmittel Bestandteil der Lösungen und Suspensionen oder der organischen Lösungsmittel sein sowie Antibiotika zum Schutz der die Trägermaterialien bildenden Trägerproteine vor bakteriellem Befall. Der gleiche Schutz vor bakteriellem Befall kann auch erreicht werden, wenn die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten sphärischen oder flächigen Trägermaterialien zwischen für niedermolekulare Substanzen durchlässige Membranen, die die katalytischen Umsetzungen nicht stören, gebracht werden. Darüber hinaus können die nach der Erfindungsbeschreibung herstellbaren sphärischen und flächigen Träger zur Anwendung in analytischen Systemen farbbildende Indikatorsysteme enthalten, so daß die katalytische Aktivität auch auf visuellem Wege in einfachster Weise bestimmt werden kann.

Das Verfahren zur Erhöhung der Viskosität von Proteinlösungen zur Herstellung von sphärischen und flächigen Trägermaterialien zeichnet sich dadurch aus, daß damit unlösliche Trägermaterialien aus löslichen Proteinen hergestellt werden können, die eine höhere Stabilität als bisher bekannte ähnliche Träger unter Lagerungs- und Arbeitsbedingungen besitzen· Damit wird es möglich, gelöste Trägerproteine auch ohne Quervernetzung mit bifunktionellen Reagentien in stabile Trägermaterialien umzuwandeln. Das ist von besonderem Vorteil beim Geleinschluß von katalytisch aktiven Verbindungen, besonders

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von Enzymen, weil dadurch eine Inaktivierung durch die bifunktionellen Reagentien vermieden werden kann. Auf Grund dieser Eigenschaften können Träger mit hoher katalytischer Aktivität hergestellt werden, die sowohl in der StoffWandlung und Chromatographie als auch in analytischen Systemen eingesetzt werden können.

Im Folgenden wird der Gegenstand der Erfindung anhand von Beispielen beschrieben, die jedoch nicht als Einschränkung gelten.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

5 g Gelatine werden bei 4O⁰C in 50 ml destilliertem Wasser gelöst und mit 5 ml 30 %igem Pormaldehyd versetzt. Die Lösung wird unter Rühren bei 5 C in 1 1 Chlorbenzol eingetragen, dem 10g eines Monoäthers aus p-n-Nonylphenol und Polyäthylenglykol zugesetzt wurden. Die Mischung wird 15 Minuten bei Umgebungstemperatur gerührt, die gebildeten Gelatinepartikel werden abfiltriert, mit je 1 Liter Aceton und Äthanol gewaschen und in eiskaltem destilliertem Wasser 2 Stunden aufgequollen. 3 g der feuchten Gelatineparttfcfel werden in eine Peroxidaselösung eingetragen, die aus 100 mg Peroxidase und 25 ml Phosphatpuffer (0,01 mol · 1~¹) vom pH-Wert 7,0 hergestellt wurde, und die resultierende Suspension wird 3 Stunden bei 4⁰C geschüttelt. Die Suspension wird durch Filtration getrennt, und die Gelatinepartikel werden mit dem gleichen Phosphatpuffer gewaschen. Aus der Pufferlösung wird die Peroxidase durch Lyophilisieren in fester Form gewonnen. Zur Viskositätsbestimmung werden 2 g der Gelatinepartikel bei 38⁰C in 13 ml destilliertem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung werden 2 ml einer Peroxidaselösung addiert, die durch Auflösen von 20 mg mit Gelatinepartikeln behandelter Peroxidase in 2 ml destilliertem Wasser^hergestellt wurde. Von dieser Mischung aus Peroxidase und Gelatine wird die Änderung der Viskosität bei 38⁰C im Verlaufe von 2 Stunden verfolgt. Sie wird

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in dieser Zeit um 23 % herabgesetzt, während sich die Viskosität der Gemische von roher Peroxidase und Gelatine um 45 % verringert. Zur Bildung sphärischer Partikel wird die Peroxidase-Gelatine-Lösung unter Rühren in kaltes Aceton eingetragen. Die sphärischen Gelatinepartikel werden abgetrennt und sorgfältig mit kaltem destilliertem Wasser gewaschen. Katalytisch aktive Membranen können aus der Peroxidase-Gelatine-Lösung hergestellt werden, indem diese auf einer transparenten Fläche gleichmäßig verteilt wird und die Membran einem Trocknungsprozeß bei möglichst niedrigen Temperaturen unterworfen wird. Zur Stabilisierung der sphärischen oder flächigen Partikel können den Peroxidase-Gelatine-Lösungen bifunktionelle Reagentien, z. B. Glutaraldehyd oder Cyanursäurechlorid bzw. Antibiotika z. B. Chloramphenikol in einer Konzentration von 0,01 % - 1 % zugesetzt werden.

Beispiel 2

Nach Beispiel 1 hergestellte vernetzte Gelatinepartikel werden in eine Säule (2,5 x 30 cm) gefüllt und mit einem Liter eines Phosphatpuffers (0,01 mol · 1 ) vom pH-Wert 7 umgepuffert. Auf diese Säule werden 300 mg in 6 ml des gleichen Phosphatpuffers aufgelöste Glukoseoxidase aufgetragen und mit demselben Phosphatpuffer eluiert. Die Glukoseoxidase-Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Wie im Beispiel 1 beschrieben wird die Viskosität einer Glukoseoxidase-Gelatine-Lösung bestimmt. In diesem Falle verringert sich die Viskosität eine Lösung der gereinigten Komponenten um 9 %> während sich die der nicht gereinigten Komponenten um 36 % verringert. Sphärische und flächige katalytisch aktive Membranen können aus den Lösungen der gereinigten Komponenten ebenfalls nach Beispiel 1 hergestellt werden.

Beispiel 3

10 mg nach Beispiel 1 gereinigte Peroxidase und 20 mg nach Beispiel 2 gereinigte Glukoseoxidase werden in eine Gelatinelösung eingetragen, die durch Auflösen bzw. Suspendieren von

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3 g gereinigter aber nicht vernetzter Gelatine in 30 ml Phosphatpuffer (1 mol · 1~¹) vom pH-Wert 7 bei 38⁰C hergestellt wurde. Die Viskosität dieser Proteinlösung verringert sich im Verlaufe von 2 Stunden um 15 %, während sich die Viskosität einer Lösung der gleichen, aber nicht gereinigten Proteine um 52 % im gleichen Zeitraum verringert. Zu dieser Lösung werden 200 mg o-Dianisidinhydrochlorid und 2 mg Chloramphenicol zugesetzt und durch Rühren gleichmäßig in der Proteinlösung verteilt. Diese wird auf eine ebene Glasfläche oder einem anderen transparenten Material aufgetragen. Wach dem Trocknen wird die entstandene Membran mit einem Tropfen einer 0,1%igen Glukoselösung benetzt. Eine sich entwickelnde Rotfärbung an der Auftropfstelle zeigt die enzymatische Aktivität der Peroxidase und Glukoseoxidase an.

Claims (4)

233 542 5 Erfindungsanspruch

1. Verfahren zur Herstellung sphärischer oder flächiger Trägermaterialien mit katalytischer Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß zu ihrer Bildung Lösungen eines inerten Trägerproteins mit katalytisch aktiven Verbindungen verwendet werden, deren Viskositäten sich innerhalb von 2 Stunden bei einer eingestellten Temperatur im Bereich von 20 - 50⁰C nicht mehr als um 10 - 30 % verringern.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösungen inerter Trägerproteine und katalytisch aktiver Verbindungen durch Ausfällen von Proteinen aus wäßrigen Lösungen, die gegebenenfalls 1 - 5 % Formaldehyd enthalten, durch mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel in Gegenwart von Emulgatoren, erneutes Lösen dieser Proteine in Wasser oder Pufferlösungen und Mischen mit Lösungen katalytisch aktiver Verbindungen,.wobei die katalytisch akti-

. ven Verbindungen zusätzlich mit bifunktionellen Vernetzungsmitteln und gegebenenfalls bifunktionellen aminogruppenhaltigen Verbindungen vernetzten Trägerproteinen behandelt Bein können.

3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägerproteine Kollagen, Gelatine, Albumin, als katalytisch aktive Verbindungen Enzyme, lösliche bzw. unlösliche Komplexkatalysatoren oder fotochemisch aktive Substanzen und als Emulgatoren Polyglykolmonoalkyl- und arylether, höherer Alkohole und Alkylphenole mit Alkyl größer als CV verwendet werden.

4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bildung und/oder Stabilisierung der sphärischen oder flächigen Trägermaterialien die Lösungen aus inerten und katalytisch aktiven Verbindungen unter Rühren in organische Lösungsmittel, die gegebenenfalls mit bifunktionelle» Vernetzungsmittel versetzt sein können, eingetragen werden oder, gegebenenfalls nach Zugabe bifunktioneller Vernetzungsmittel, auf ebenen Flächen verteilt oder versprüht werden.

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Verfahren nach Punkt 1 bia 4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der katalytischen Aktivität die Trägermaterialien Indikatorsysteme enthalten.

Verfahren nach Punkt 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß beim Prozeß der Herstellung der sphärischen und flächigen Trägermaterialxen zu ihrer Stabilisierung Antibiotika zugesetzt werden oder daß die Trägermaterialxen in semipermeable Membranen eingeschlossen werden.