DE3336257C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur
Immobilisierung von Enzymen. Die Ansprüche 2 bis 6 betreffen Ausgestaltungen
dieses Verfahrens.
Enzyme, die mit Hilfe von Vernetzungsmittels immobilisiert
sind, gehören zu den verbreitetsten Formen von
immobilisierten Enzymen. Um derartige immobilisierte
Enzyme herzustellen, sind zahlreiche Verfahren entwickelt
worden. Bei einem derartigen Verfahren wird
ein Träger zunächst mit dem Vernetzungsmittel aktiviert
und dann mit dem Enzym behandelt, welches auf
diese Weise fest mit dem Träger verbunden wird. Eine
derartige Aktivierung kann eine Imprägnierung des Trägers
mit einem Polyamin und eine anschließende Behandlung
mit einem Überschuß an Glutaraldehyd umfassen wie
in der US-PS 42 92 199 oder in Biotechnology and Bioengineering,
22, S. 271-287 (1980) beschrieben. Eine andere
derartige Aktivierung kann ein Beschichten des Trägers
mit einem die Adsorption erleichternden unlöslichen
Polymer und die anschließende Adsorption des Enzyms auf
dem Polymer und eine weitere Immobilisierung durch Vernetzung
in situ umfassen wie in der US-PS 37 05 084 beschrieben.
Eine weitere derartige Aktivierung ist in der
US-PS 40 69 106 angegeben. Ein Keratin-haltiger Träger
wird aktiviert durch Reduktion des Keratins und Vernetzung
des Enzyms bzw. Bindung des Enzyms daran über S-S-
Gruppen. Eine andere derartige Aktivierung beschreibt
die US-PS 38 02 909. Glas wird in Gegenwart eines Proteins
zerbrochen, wodurch frische aktivierte Stellen entstehen,
die das Protein binden können. Eine weitere derartige
Aktivierung ist in der US-PS 35 19 538 angegeben.
Danach wird Glas nacheinander mit verschiedenen Chemikalien
behandelt, um die gewünschten aktiven Stellen zu erzeugen.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung eines
immobilisierten Enzyms ist beschrieben in Biochemical
and Biophysical Research Communications, Bd. 36, S. 235-242,
1969: Das Enzym wird auf kolloidaler Kieselsäure
ohne vorherige Aktivierung adsorbiert und dann durch
Vernetzung mit Glutaraldehyd weiter fixiert.
Alle diese oben erwähnten Verfahren sind gekennzeichnet
durch eine dünne Schicht der Enzymmoleküle, die direkt
an die aktiven Stellen eines Trägers gebunden sind und
dadurch wird die Menge an immobilisiertem Enzym bestimmt
durch die Anzahl der aktiven Stellen.
Ein grundsätzlich anderes Vorgehen besteht darin, eine
dickere Schicht (Enzym) an die Oberfläche des Trägers
zu binden, wodurch nur ein kleiner Anteil der Enzymmoleküle
in direktem Kontakt mit dem Träger steht. Bei
dieser Arbeitsweise ist es nicht der Oberflächenbereich
des Trägers, der die Menge an immobilisiertem Enzym bestimmt
und dadurch wird es möglich die Menge an gebundenem
Enzym zu optimieren in Abhängigkeit von den Verfahrensparametern
während der Anwendung. Dieses Ziel
ist jedoch schwieriger zu erreichen, da es durch die
verhältnismäßig große Menge an Enzym schwierig wird, es
während der Immobilisierung festzuhalten. Daher ist
bezüglich dieser Arbeitsweise verhältnismäßig wenig
veröffentlicht worden, ungeachtet der offensichtlichen
Vorteile, die dadurch erreicht werden könnten. In den
CA-PS 10 11 671 und 10 11 672 ist die Verwendung einer
wäßrigen Lösung eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels
als Vernetzungsmedium beschrieben, wobei
die Konzentration an organischem Lösungsmittel hoch genug
gehalten wird, daß das Enzym unlöslich bleibt, jedoch
niedrig genug, um bei der Vernetzungs- bzw. Bindungsreaktion
nicht zu stören.
Der Hauptnachteil im Zusammenhang mit diesem Verfahren
besteht darin, daß es erforderlich ist, große Mengen
organischer Lösungsmittel anzuwenden, wobei die damit
verbundene Explosionsgefahr Sicherheitsvorkehrungen erforderlich
macht. Auch ist das auf diese Weise erhaltene
Produkt nicht ganz befriedigend im Hinblick auf die
physikalische Stabilität und Aktivitätsausbeute vermutlich aufgrund
der verhältnismäßig hohen Konzentration an organischem
Lösungsmittel, die erforderlich ist, um das Enzym
während der Immobilisierung ungelöst zu halten.
Ein anderes Verfahren, das sich auf dieses Problem bezieht,
ist in der US-PS 41 16 771 angegeben. In einem begrenzten
Volumen Wasser wird das Enzym mit Glutaraldehyd und
einem inerten Protein behandelt, bevor es schnell zu dem
Träger zugesetzt wird, dann ein Gel bilden kann und
dann granuliert und endlich getrocknet wird. Der Hauptnachteil
dieses Verfahrens ist die hohe Konzentration
an Vernetzungmittel, die eine Folge der begrenzten
Wassermenge ist. Viele Enzyme sind sehr empfindlich gegenüber
hohen Konzentrationen an Vernetzungsmitteln entweder
weil sie inaktiviert werden oder weil sie dadurch
während der Endanwendung nicht mehr zugänglich sind
(d. h. ihre freien Bindungsstellen blockiert sind) aufgrund
der übermäßigen Vernetzung oder beides. Das zeigt
die Hauptschwierigkeit bei der Anwendung größerer Mengen
Enzym auf einem Träger: Um eine ausreichend niedrige Konzentration
an Vernetzungsmittel zu erreichen, sind verhältnismäßig
große Mengen an Medium erforderlich, die es
unmöglich machen, das Enzym an der Lösung in dem Medium
zu hindern bevor die Vernetzung wirksam wird, während
eine hohe Konzentration an Vernetzungsmittel, die das
Enzym vor dem Auflösen bewahren kann, aus den oben erwähnten
Gründen ungünstig ist.
Aus der FR-PS 23 46 366 ist ein Verfahren zur Immobilisierung
von Glucoseisomerase bekannt, bei dem man zunächst eine Lösung
des Enzyms herstellt, aus der das Enzym an kolloidale Kieselsäure
adsorbiert wird. Danach wird eine Lösung von Glutaraldehyd
und später (im allgemeinen nach 60 min) eine Lösung von
MgCl₂ · 6H₂O zugegeben.
Ein nochmals vollständig unterschiedliches Vorgehen besteht
darin, das wäßrige Medium überhaupt zu vermeiden
und statt dessen eine gasförmige Phase anzuwenden. Diese
Arbeitsweise ist beschrieben in The Journal of Society
of Chemical Industry, Bd. 18, S. 16-20 (1989) zur Herstellung
von unlöslichen Gelatinefasern und in JP-PS
J 5 70 02 683 zur Immobilisierung von Enzymen. Dieses Verfahren
erfordert jedoch ein gut wirksames Ventilationssystem
und darüber hinaus spezielle Mittel, um die Bildung
von unlöslichen Abscheidungen innerhalb dieses Ventilationssystems
zu vermeiden.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur
Herstellung einer immobilisierten Enzymzubereitung mit
Hilfe eines Vernetzungsmittels zu entwickeln, das einfach
durchführbar sein soll, z. B. ohne die Notwendigkeit
spezieller Sicherheitsvorkehrungen und mit Hilfe
dessen das immobilisierte Enzym mit einer hohen Enzymaktivität
und mit guter physikalischer Stabilität erhalten
werden kann.
Diese Aufgabe wird gelöst durch das im Hauptanspruch angegebene
Verfahren. Vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Verfahrens sind
in den Unteransprüchen angegeben.
Wenn das fertige immobilisierte Enzym einen Überschuß an Vernetzungsmittel
enthält, kann dieses durch Waschen entfernt werden.
Die im Anspruch 4 angegebene Gruppe von Salzen (wobei eine spezielle
Gruppe von Salzen für jede Kombination eines speziellen Enzyms
und eines speziellen Vernetzungsmittels in Frage kommen kann)
umfaßt üblicherweise billige Salze. Selbstverständlich können
bei der erfindungsgemäßen Verfahren ein oder mehrere Enzymzubereitungen,
ein oder mehrere Vernetzungsmittel und ein oder
mehrere Salze angewandt werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Enzym zusammen mit
einem Träger angewandt. Dadurch wird es möglich, Teilchen mit
besseren Fließeigenschaften herzustellen, die geeignet sind für
Festbettverfahren. Unabhängig davon, ob das Enzym fest oder gelöst
vorliegt, ist es eng mit dem Träger verbunden. Im festen
Zustand kann das Enzym eine Schicht auf dem Träger bilden, und
in gelöster Form kann die Enzymlösung in den (porösen) Träger
eindringen.
Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die Enzymzubereitung
ein Träger, der mit einer Schicht des festen Enzyms
überzogen ist. Hierdurch wird es möglich, eine Enzymzubereitung
herzustellen mit irgendeinem erwünschten Enzymgehalt innerhalb
weiter Grenzen durch Variation der Dicke der Enzymschicht.
Sehr günstig ist es auch, wenn die Enzymzubereitung aus
einem porösen Träger besteht, der mit einer Enzymlösung
imprägniert ist. Hierdurch erhält man ein sehr einfaches
Verfahren zur Herstellung einer immobilisierten Enzymzubereitung
nach der Erfindung.
Das Vernetzungsmittel ist vorzugsweise Glutaraldehyd.
Glutaraldehyd ist verhältnismäßig billig und von den Gesundheitsbehörden
zugelassen. Glutaraldehyd ist auch für
viele Enzyme ein sehr wirksames und doch mildes Vernetzungsmittel.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß die Konzentration
an Glutaraldehyd in dem wäßrigen Medium zwischen 0,001
und 5% (Gew./Vol.), vorzugsweise 0,005 bis 1% (Gew./Vol.)
beträgt. Aus den später in der Beschreibung angegebenen
Beispielen geht hervor, daß die zurückgewonnene
Enzymaktivität abhängt von der Konzentration an
Glutaraldehyd und üblicherweise liegt die Glutaraldehydkonzentration,
die einer maximalen Ausbeute an Enzymaktivität
entspricht, innerhalb der oben angegebenen
Bereiche. Der Prozentsatz an Glutaraldehyd (Gew./Vol.)
wird berechnet entsprechend der folgenden Gleichung.
Das Salz wird vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe,
umfassend Sulfat, Phosphat, Citrat, Bicarbonat, Carbonat,
Fluorid, Acetat, Tartrat, Polysulfat, Polyphosphat, Ferrocyanid,
Phenolsulfonat, Sorbat, Ethylsulfat, Chlorid,
Nitrat und Succinat von sekundärem, tertiärem oder quaternären Ammonium
oder einem der Alkalimetalle insbesondere Natriumsulfat,
Natriumphosphat, Kaliumphosphat und Kaliumcitrat.
Diese Salze sind allgemein billig und können zurückgewonnen
werden und eröffnen die Möglichkeit, eine immobilisierte
Enzymzubereitung mit einer hohen Ausbeute an
Enzymaktivität herzustellen.
Die Salzkonzentration liegt vorzugsweise zwischen 0,1 m
und einer gesättigten Lösung, insbesondere bei etwa 0,5
bis etwa 3 m. Wie aus den später angegebenen Beispielen
hervorgeht, ist es möglich eine Glutaraldehydkonzentration
und eine Salzmolarität innerhalb der oben angegebenen
Grenzen zu wählen, die zu einer sehr hohen Ausbeute an
Enzymaktivität führt.
Das Enzym wird vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe,
bestehend aus Glukoseisomerase, Amylasen, insbesondere
Amyloglukosidase, Pullulanase, Lactase, Pectinasen, Naringinase,
Penicillinacylasen, Inulinasen, Lipasen und
Proteasen.
So bewahrt die Verwendung der oben erwähnten Salze,
selbst in niedrigeren Konzentrationen, als sie zur Ausfällung
der Enzyme erforderlich sind, die Enzyme für alle praktischen
Zwecke davor, in dem Vernetzungsmedium (Salzlösung)
gelöst zu werden, während sie für das Vernetzungsmittel
vollständig zugänglich bleiben, wenn das Enzym in
fester Form vorliegt oder sie verhindern, daß das Enzym
sich mit der Salzlösung vermischt, wenn es in gelöster
Form vorliegt. Auf diese Weise kann eine optimale Konzentration
an Vernetzungsmittel angewandt werden, die
nur zu einer minimalen Schädigung des Enzyms führt und
ihm noch eine ausreichend gute physikalische Stabilität
verleiht. So hat es sich gezeigt, daß um die Konzentration
an Vernetzungsmittel zu verringern die Salzkonzentration
erhöht werden muß, um die Enzymaktivität auf einem
optimalen Niveau zu halten. Erfindungsgemäß sollten Salze,
die entweder mit dem Enzym oder dem Vernetzungsmittel
reagieren, wie Silber- oder Quecksilbersalze, die das Enzym
inaktivieren können, oder Ammoniumsalze oder primäre
Aminsalze oder Sulfitsalze, die leicht mit verschiedenen
Vernetzungsmitteln reagieren, vermieden werden. Die Salze,
die für die erfindungsgemäßen Zwecke angewandt werden
können, variieren in weiten Grenzen in Bezug auf ihre
Wirksamkeit und diese Wirksamkeit kann von Enzym zu Enzym
variieren. Einige allgemeine Richtlinien bezüglich
der Auswahl des Salzes können jedoch folgendermaßen festgelegt
werden: Es ist günstig, das löslichere Salz zu
verwenden, wenn zwei sonst gleiche Eigenschaften besitzen.
So ist Na₂SO₄ im allgemeinen K₂SO₄ vorzuziehen,
aufgrund der wesentlich höheren Löslichkeit. Es hat sich
auch gezeigt, daß allgemein Salze von mehrwertigen Anionen
wie Sulfate, Phosphate, Carbonate, Citrate und
ähnliches wirksamer sind als einwertige Anionen wie
Chloride und Nitrate. Das Gegenteilige gilt jedoch im
allgemeinen für die Kationen: Die einwertigen Kationen
wie Na⁺, K⁺ oder Tetramethylammonium sind wirksamer als
die mehrwertigen wie Mg++ oder Ca++. Die bevorzugten Salze
sind daher die Alkalisalze von Sulfaten, Phosphaten
und Citraten und insbesondere Natriumsulfat, Natriumphosphat
Kaliumphosphat, Kaliumcitrat und Tetramethylammoniumsulfat.
Die Salzkonzentration wird üblicherweise auf einem Minimum
gehalten. Dieses Minimum hängt einerseits ab von dem
fraglichen Enzym, da unterschiedliche Enzyme häufig unterschiedliche
Konzentrationen erfordern, und andererseits
von der Konzentration an Vernetzungsmittel: Je höher
diese ist, umso weniger Salz ist erforderlich und umgekehrt.
Die Konzentration an Vernetzungsmittel wird ebenfalls
auf einem Minimum gehalten, da die meisten Enzyme
gegenüber Vernetzungsmitteln empfindlich sind. Die Konzentration
sollte jedoch hoch genug sein, um eine wirksame
Immobilisierung sicherzustellen. Es sollte jedoch
Sorgfalt angewandt werden, wenn die optimalen Bedingungen
für die Vernetzungsreaktion bei sehr hohen Salzkonzentrationen
festgelegt werden, besonders mit wirksamen
Salzen. So hat es sich gezeigt, daß bei hohen Konzentrationen
an Na₂SO₄ oder Kaliumphosphat z. B. die Aktivierungsausbeuten
wesentlich verringert werden im Vergleich
mit solchen, die bei mäßigen Konzentrationen erreicht
werden. Das beruht vermutlich auf der sehr festen Vernetzung,
die die Enzymmoleküle teilweise unzugänglich
macht.
Ein anderer Vorteil, der bei der Verwendung von Salzen in dem
Vernetzungsmedium auftritt, besteht darin, daß die Enzymzubereitung,
wenn sie in Form von Teilchen vorliegt, während der
Immobilisierungsreaktion keine Aggregate bildet. Eine derartige
Aggregation bzw. Agglomeration ist unerwünscht, da sie zu einer
geringeren Wirksamkeit und schlechteren Fließeigenschaften bei
der Anwendung führt. Auch in dieser Beziehung unterscheiden
sich die Salze stark.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in mehreren Stufen durchgeführt
werden, deren Reihenfolge nicht kritisch ist. So wird bei
der erfindungsgemäßen Arbeitsweise ein Träger zunächst
mit einer Enyzmlösung behandelt, getrocknet und dann in
einer Lösung, die ein Vernetzungsmittel und Salz enthält, behandelt,
gewaschen und gegebenenfalls getrocknet. Bei einer Abwandlung
des gleichen Verfahrens kann ein Teil der Gesamtsalzmenge
in der Enzymlösung enthalten sein. Für bestimmte Zwecke,
z. B. wenn es erwünscht ist, daß das immobilisierte Enzym leicht
und faserig ist, kann die Menge an Träger sehr klein sein, und
die Enzymzubereitung wird in einem Koagulationsbad mit dem Vernetzungsmittel
und dem Salz behandelt.
Der pH-Wert, die Temperatur und die Dauer der Vernetzungsreaktion
können einen erheblichen Einfluß auf die Aktivitätsausbeute
haben in Abhängigkeit von dem Enyzm und
den inerten Zusätzen, soweit vorhanden sind. Im
allgemeinen hat es sich gezeigt, daß ein pH-Bereich von
etwa 4 bis etwa 9 geeignet ist. Der in den meisten Fällen
geeignete Temperaturbereich liegt zwischen etwa 15
und etwa 30°C, obwohl höhere Temperaturen in einigen
Fällen mit Vorteil angewandt werden können, z. B., wenn
es erwünscht ist, die Dauer der Vernetzungsreaktion zu
verkürzen, und niedrigere Temperaturen vorteilhaft angewandt
werden können im Falle von sehr temperaturempfindlichen
Enyzmen. Die Dauer der Vernetzungsreaktion kann
in weiten Grenzen variieren, von wenigen Minuten bis zu
einigen Tagen, abhängig von der Art und Konzentration des
Vernetzungsmittels, der Art und Konzentration des Salzes,
dem Enzym, dem pH-Wert und der Temperatur. Sie sollte
daher in jedem einzelnen Falle neu festgelegt werden.
Für Glutaraldehyd und die meisten Enzyme scheint jedoch
ein Bereich von etwa 10 min bis zu einigen Stunden
bei Raumtemperatur geeignet zu sein.
Im folgenden wird auf verschiedene Novo Veröffentlichungen
Bezug genommen. Kopien aller dieser Veröffentlichungen
können von Novo Industri A/S Novo Alle, 2880 Bagsvaerd,
Dänemark erhalten werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die folgenden
Beispiele näher erläutert.
Im folgenden Teil der Beschreibung und den Beispielen
sind Werte für den Druckabfall (physikalische Festigkeit)
während des Arbeitens in einer Säule angegeben. Dieser
Wert wurde bestimmt nach AF 166/2 einer Beschreibung
eines Novo Laborverfahrens. Einige theoretische Überlegungen
im Zusammenhang mit dieser Druckabfallbestimmung sind
beschrieben in Starch/Stärke 31 (1979) Nr. 1, S. 13-16.
Zum Vergleich mit handelsüblichen Produkten ist zu erwähnen,
daß die besten Werte für den Druckabfall für die bekannte
Zubereitung aus immobilisierter Glukoseisomerase Sweetzyme
etwa 9,81 mbar (10 g/cm²) betragen. Aus den Beispielen
geht hervor, daß der Druckabfall bei den erfindungsgemäß
hergestellten immobilisierten Enzymzubereitungen
so gering sein kann wie 1,96 mbar (2 g/cm²) und
daß alle Werte deutlich unter 9,81 mbar (10 g/cm²) liegen,
woraus der technische Fortschritt des erfindungsgemäßen
Verfahrens deutlich hervorgeht.
Anteile von 20 g trockener Trägerteilchen, die mit teilweise
gereinigter Glukoseisomerase in einer Menge von
28 Gew.-% überzogen waren und hergestellt worden waren
nach dem in Beispiel 8 der DE-PS 33 36 235
wurden unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur in 500 ml
einer Lösung, enthaltend 0,06 m Natriumphosphat, 1,4 m
Na₂SO₄ und unterschiedliche Menge Glutaraldehyd, pH 7,0,
suspendiert. Nach 1 h wurden die Teilchen entfernt und
1 h in 0,06 m Natriumphosphatlösung, pH 7,0, suspendiert.
Dieser Waschvorgang wurde 3mal wiederholt und die Teilchen
dann über Nacht in der Phosphatlösung stehengelassen
und anschließend ihre Aktivität nach Novo Analyseforskrift
AF 189/1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in
Fig. 1 angegeben, die eine Kurve zeigt, in der der Prozentsatz
an Glutaraldehyd gegen die zurückgewonnene Enzymaktivität
in Einheiten/g aufgetragen ist und die die
Empfindlichkeit des Enzyms gegenüber Glutaraldehyd zeigt.
Es wurden Teilchen entsprechend Beispiel 1 hergestellt,
wobei jedoch kein Salz zugesetzt wurde, abgesehen von
der minimalen Menge Phosphat, das als Puffer dient
(0,06 m Natriumphosphat pH 6,5). Der Prozentsatz an Glutaraldehyd
wurde gegen die zurückgewonnene Enzymaktivität
in Einheiten/g aufgetragen, s. Fig. 2, die zeigt, daß
das Vernetzungsmittel zwei gegensätzliche Wirkungen aufweist:
Einerseits erhöht es die Ausbeute, indem es das
Enyzm vor dem Lösen bewahrt, andererseits verringert es
die Ausbeute durch Inaktivierung des Enzyms. Das Optimum
wird in diesem Falle bei ungefähr 1% Glutaraldehyd erreicht.
Ein Vergleich der Fig. 1 und 2 zeigt, daß das
Optimum der Glutaraldehydkonzentration ungefähr 40mal
so hoch liegt wie bei Zusatz von 1,4 m Natriumsulfat und
daß die Ausbeute (der Aktivität) in diesem Falle nur
ungefähr 60% derjenigen bei Zusatz des Salzes beträgt.
Es wurden Teilchen wie in Beispiel 1 hergestellt, wobei
in diesem Falle jedoch Kaliumphosphat als Salz angewandt
wurde und die Salzkonzentration variiert wurde, während
die Glutaraldehydkonzentration auf 3 unterschiedlichen
Werten konstant gehalten wurde und der pH-Wert 6,5 betrug.
Der Prozentsatz an Kaliumphosphat wurde gegen die
Ausbeute an Enzymaktivität in Einheit/g aufgetragen. Diese
Werte sind in Fig. 3 angegeben, aus der die günstige
Wirkung einer Erhöhung der Salzkonzentration deutlich
hervorgeht, besonders bei der niedrigen Glutaraldehydkonzentration.
Der Versuch des Beispiels 2 wurde wiederholt, wobei jedoch
Natriumsulfat anstelle von Kaliumphosphat verwendet
wurde. Die Molarität von Na₂SO₄ wurde gegen die gewonnene
Enzymaktivität in Einheit/g aufgetragen. Die Ergebnisse
sind in Fig. 4 angegeben, aus der die günstige Wirkung
des Salzes deutlich hervorgeht. Wie ebenfalls aus
Fig. 4 hervorgeht, existiert ein Optimum für die Salzkonzentration
jenseits dessen die Aktivität abnimmt, wobei dieses
Optimum von der Glutaraldehydkonzentration
abhängt.
Der in Beispiel 2 angegebene Versuch wurde wiederholt,
wobei lediglich die Salzkonzentration erhöht wurde. Die
Molarität an Kaliumphosphat wurde gegen die gewonnene
Enzymaktivität in Einheiten/g aufgetragen. Die Ergebnisse
sind in Fig. 5 angegeben. Ein Vergleich zwischen
Fig. 4 und 5 zeigt, daß Na₂SO₄ und Kaliumphosphat sich
ähnlich verhalten.
Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt,
wobei jedoch Kaliumcitrat pH 7,0 anstelle von Phosphat
und Sulfat in dem Vernetzungsmedium angewandt wurden. In
Fig. 6 ist die Glutaraldehydkonzentration gegen die Aktivität
in Enzymeinheiten/g aufgetragen und die Ergebnisse
ähneln deutlich denen in Beispiel 1.
20 g getrocknete Trägerteilchen, die wie in Beispiel 4
der DE-PS 33 36 235
hergestellt worden
waren, wurden in einem Wirbelbett vom Lab Typ fluidisiert.
45,8 g einer 11%igen (Gew./Gew.) homogenisierten
Zellaufschlämmung (gezüchtet wie in Beispiel 1 der
Dänischen Patentanmeldung 5 190/79 angegeben und Aufschlämmung
hergestellt wie in Beispiel 4 dieser Patentanmeldung)
enthaltend 80,1 E/g thermophile Lactase von
Bacillus Sp NRRL B 11.229 wurden bei 30 bis 40°C auf die
Trägerteilchen aufgesprüht und die überzogenen Teilchen
konnten trocknen. Die Einheit der Lactasenaktivität
ist definiert als die Menge Lactase, die 1 µm. 1 Lactose/min
unter den folgenden Reaktionsbedingungen spaltet:
Substratkonzentration = 10% Lactose, Temperatur = 60°C,
pH = 6,5, Reaktionszeit = 30 min. Die gewonnene
Enzymaktivität betrug 79,8%. 10 g überzogene Kügelchen
wurden dann in 250 ml einer Lösung behandelt, enthaltend
0,06 m Na₂HPO₄, 1,4 m Na₂SO₄ und 0,1% (Gew./Vol.) Glutaraldehyd,
pH 7,5. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurden
die Teilchen entfernt und gründlich mit 0,06 m K₂HPO₄
bei pH 7,5 gewaschen. Die Aktivitätsausbeute in Bezug
auf die Vernetzungsstufe betrug 17,2%.
24 g getrocknete Trägerteilchen, die entsprechend Beispiel 4
der DE-PS 33 36 235
hergestellt worden
waren wurden in 20,2 g einer Lösung aus 39,6 Gew.-%
teilweise gereinigter Amyloglukosidase von A. niger gegeben,
die erhalten worden war durch Ultrafiltration des
Handelsproduktes AMG 200L (beschrieben in der Novo-Schrift
NOVO Enzymes AMG, B 020 g-GB), um niedermolekulare
Bestandteile zu entfernen bis zu einem Feststoffgehalt
von 39,6 Gew.-% (Aktivität 2610 IAG/g, wobei die Aktivitätseinheit
definiert ist in Novo Analyseforskrift
AF 159/2). Es wurde 1 h Vakuum angelegt. Das so erhaltene
Produkt enthielt 25 Gew.-% teilweise gereinigte Amyloglukosidase-
Feststoffe mit einer Ausbeute an Enzymaktivität
von 77,9%.
20 g Teilchen mit 71,8% Feststoffgehalt wurden dann in
1600 ml einer Lösung behandelt, bestehend aus 0,06 m
NaH₂PO₄, 1,4 m Na₂SO₄ und 0,2% Glutaraldehyd, pH 4,5.
Nach 1 h wurden die Teilchen abfiltriert und mit 0,06 m
NaH₂PO₄ bei pH 4,5 gewaschen.
Die gewonnene Enzymaktivität, bezogen auf die Vernetzungsstufe,
betrug 55,1%.
40 g Trägerteilchen, die entsprechend Beispiel 4 der
DE-PS 33 36 235 erhalten worden waren und
einen Feststoffgehalt von 98,8% besaßen, und 24 g im
Vakuum eingedampftes teilweise gereinigtes Glukoseisomerase-
Konzentrat
von Bacillus coagulans wurden mit 5%
Glukose und 8% Natriumsulfat (Feststoffgehalt 41,8%)
vermischt und die Flüssigkeit konnte die Luft in den
Poren der Teilchen durch Vakuumbehandlung verdrängen.
Das Gewicht nach dem Vermischen betrug 63,22 g. Der Feststoffgehalt
war 79,2%.
Anteile von 18 g dieser Zubereitung (ungefähr 14 g Feststoffe)
wurden 1 h bei Raumtemperatur mit 375 ml einer
Lösung, enthaltend in allen Fällen 1,5 m Natriumsulfat,
5% Glukose und 0,06 m Natriumphosphat, pH 7,5, behandelt
und außerdem mit entweder 0,1 oder 0,2 oder 0,3% Glutaraldehyd.
Nach dieser Behandlung wurden die Anteile 5mal mit etwa
150 ml 1%iger Natriumphosphatlösung pH 7,5 gewaschen.
Die Enzymaktivität wurde bestimmt nach AF 189/1 nach
Ablaufen der Flüssigkeit von den Teilchen. Auch der Feststoffgehalt
wurde an den Teilchen, von denen das Wasser
abgelaufen war, bestimmt.
Man erhielt die folgenden Ergebnisse:
Der Druckabfall wurde an Proben entsprechend 5 g Feststoffen
untersucht.
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Herstellung
eines immobilisierten Enzymproduktes auf der Grundlage
von Aktivkohle als Träger.
Es wurden 20 g Aktivkohle Typ in
33 g einer Lösung aus 39,2 Gew.-% teilweise gereinigte
Glukoseisomerase von Bacillus coagulans (Aktivität 3950 E/g
Feststoffe, wobei die Aktivitätseinheit definiert ist
in Novo Analyseforskrift AF 189/1) gegeben.
Es wurde 20 h bei 4°C Vakuum angelegt, das während dieser
Zeit 4 mal aufgehoben wurde. Das so erhaltene Produkt
enthielt 35 Gew.-% teilweise gereinigte Glukoseisomerase-
Feststoffe mit einer 97%igen Gewinnung der Enzymaktivität.
98% des oben erwähnten agglomerierten Produkts wurden
dann in 890 ml einer Lösung von 0,06 m KH₂PO₄, 1,4 m
Na₂SO₄ und 0,18% Glutaraldehyd, deren pH-Wert mit 4 n
NaOH auf 7,5 eingestellt war, immobilisiert. Nach 2 h
bei Raumtemperatur unter leichtem Bewegen wurden die
Teilchen abfiltriert und gründlich mit 0,06 m KH₂PO₄,
pH 8,0, gewaschen.
Die Aktivität wurde in der Vernetzungsstufe zu 31% zurückgewonnen.
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Herstellung
einer immobilisierten Enzymzubereitung mit einem Träger,
bestehend aus Kieselsäure-Kügelchen mit einem Durchmesser
von etwa 2 mm.
- A) 20 g der Kieselsäure-Kügelchen wurden in einem Wirbelbett
vom Lab Typ fluidisiert und 40 g einer Lösung von
15 Gew.-% teilweise gereinigter Glukoseisomerase von
Bacillus coagulans (Aktivität 3306 E/g Feststoffe,
die Aktivität ist definiert in Novo Analyseforskrift
AF 189/1) wurden bei 25 bis 30°C auf die Kügelchen
aufgesprüht und die überzogenen Kügelchen konnten
trocknen. Das so erhaltene Produkt enthielt 23 Gew.-%
teilweise gereinigte Glukoseisomerase mit einer Aktivitätsausbeute
von 78%.
95% der überzogenen Kügelchen wurden dann in 500 ml einer Lösung, enthaltend 0,06 m K₂HPO₄, 1,4 m Na₂SO₄ und 0,1% (Gew./Vol.) Glutaraldehyd, mit 4 n NaOH auf pH 7,5 eingestellt, behandelt. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurden die Teilchen entfernt und gründlich mit 0,06 m KH₂PO₄, pH 8,0, gewaschen. Dann wurde die Aktivität bestimmt. Die Aktivität wurde in der Vernetzungsstufe zu 55% zurückgewonnen. - B) 20 g der Kieselsäure-Kügelchen wurden in 15 g einer Lösung von 40 Gew.-% teilweise gereinigter Glukoseisomerase von Bacillus coagulans (Aktivität 3270 E/g Feststoffe) unter Zusatz von 0,56 m Na₂SO₄ behandelt. Es wurde 20 min Vakuum angelegt und dieses während dieser Zeit 4 mal aufgehoben. Das so erhaltene Produkt enthielt 20 Gew.-% teilweise gereinigte Glukoseisomerase mit einer 90%igen Rückgewinnung der Enzymaktivität. 95% der überzogenen Kügelchen wurden dann wie in Teil A) dieses Beispiels beschrieben behandelt. Die Aktivität wurde in dieser Vernetzungsstufe zu 45% zurückgewonnen.
In einigen Fällen, wenn das Enzym besonders schwierig zu
vernetzen ist, können Salze nicht nur vorteilhaft sondern
auch unbedingt erforderlich sein, wenn das Enzym in
reiner Form immobilisiert werden soll. Ein gutes Beispiel
ist die Amyloglukosidase von Novo (Handelsname AMG
200 L, s. die Broschüre Novo enzymes AMG, B B 020 g-GB
2500 Juli 1982), die in reinem Zustand praktisch nicht mit
Glutaraldehyd immobilisiert werden kann. Es hat sich als
unmöglich erwiesen, diese Amyloglukosidase zu immobilisieren,
selbst bei so hohen Konzentrationen wie 50 Gew.-%
Glutaraldehyd. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens,
bei dem Salze zugesetzt werden, ist es jedoch (wenn
auch bei verhältnismäßig hohen Konzentrationen) möglich,
das Enzym sogar bei einer so geringen Glutaraldehydkonzentration
wie 0,05% (Gew./Vol.) zu immobilisieren wie
aus den folgenden Beispielen 11 bis 13 hervorgeht. Die
so erhaltenen Enzymzubereitungen, die ausgezeichnet filtrierbar
sind und noch leicht aufgeschlämmt werden können,
können vorteilhafter Weise zur Herstellung von beispielsweise
Bier mit niedrigem Kaloriengehalt angewandt
werden.
Handelsübliche Novo AMG 200 L, die auf einen Feststoffgehalt
von 30% (Gew./Vol.) verdünnt worden war, wurde mit
Diatomeenerde vermischt und getrocknet,
wodurch man eine Zubereitung erhielt, enthaltend 21 Gew.-%
Feststoffe aus der AMG-Zubereitung. 1 g Anteile dieses Mittels
wurden dann zu einer Lösung, enthaltend 2,4 m Na₂SO₄,
0,06 m Kaliumphosphat, pH 6,5, und Glutaraldehyd in unterschiedlichen
Konzentrationen bei 32°C zugegeben und das
Gemisch 20 h bei dieser Temperatur stehen gelassen. Die
Teilchen wurden dann abfiltriert und 3mal mit entionisiertem
Wasser gespült und die Aktivitätsausbeute gemessen.
Die Ergebnisse zeigten das bekannte Muster der beiden
entgegengesetzten Effekte von Glutaraldehyd mit einem
Optimum bei 0,05% wie aus Fig. 7 hervorgeht.
Es wurde wie in Beispiel 11 gearbeitet, wobei jedoch unterschiedliche
Konzentrationen an Na₂SO₄ angewandt wurden.
Die Aktivitätsausbeute ist bei diesem Enzym außerordentlich
empfindlich auf die vorhandene Salzmenge wie
aus Fig. 8 hervorgeht.
Es wurde wie in Beispiel 12 gearbeitet mit der Ausnahme,
daß eine AMG-Zubereitung, enthaltend nur halb so viel Enzym,
angewandt wurde. Als Ergebnis dieser Arbeitsweise
wurde deutlich eine Verschiebung des Glutaraldehyd-Optimums
zu einer niedrigeren Konzentration hin beobachtet
wie aus Fig. 9 hervorgeht.
Dieses Beispiel zeigt die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen
Verfahrens auf andere Vernetzungsmittel als Glutaraldehyd,
nämlich mehrwertige Kationen. In diesem Falle
wurde Sn++++ als Vernetzungsmittel angewandt. So wurden
0,5 g der Celite-AMG-Zubereitung, entsprechend Beispiel 11,
vor dem Vernetzen langsam unter Rühren zu 100 ml einer
Lösung, enthaltend 2 m Na₂SO₄, 0,4 m Kaliumacetat (pH 4,35)
und 0,0086 m SnCl₄ · 5H₂O gegeben und das Gemisch 5 min
unter gelegentlichem Schütteln bei Raumtemperatur stehen
gelassen. Die so entstandenen Teilchen wurden abfiltriert
und in 100 ml 0,2 m Kaliumacetatlösung, pH 4,35,
dispergiert und die Suspension dann 5 min gerührt. Diese
Arbeitsweise wurde 3mal wiederholt. Das Endprodukt besaß
43% der ursprünglichen Aktivität.
In diesem Beispiel wurde das Produkt nach dem Verfahren
des Beispiels 14 hergestellt, mit der Ausnahme, daß die
Konzentrationen an Acetat und Zinnsalz auf 0,8 m bzw.
0,017 m verdoppelt wurden. Man erhielt ein ähnliches Produkt
mit einer Aktivitätsausbeute von 65%.
In diesem Beispiel wurde das Verfahren des Beispiels 14
wiederholt, jedoch die Acetatkonzentration auf die Hälfte,
d. h. 0,2 m verringert. Man erhielt wieder ein ähnliches
Produkt mit einer Aktivitätsausbeute von 48%.
In diesem Beispiel wird die Verwendung noch eines weiteren
Vernetzungsmittels, nämlich von Benzochinon beschrieben.
Es wurden 0,5 g einer getrockneten Celite-AMG-
Zubereitung, entsprechend Beispiel 11, zu 75 ml eines Gemisches
gegeben, enthaltend 2,1 m Na₂SO₄ und 0,05 m
Natriumacetat und anschließend wurden 5 ml einer Lösung
von 20% (Gew./Vol.) Benzochinon in reinem Ethanol zugegeben
und das Gemisch 80 min unter gelegentlichem Rühren
bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die so erhaltenen
Teilchen wurden abfiltriert, in 75 ml 0,1 m Kaliumacetatpuffer,
pH 4,4, dispergiert, 5 min gerührt und erneut
filtriert. Diese Arbeitsweise wurde 3 mal wiederholt
und anschließend die Aktivität bestimmt. Die Aktivitätsausbeute
betrug 14%.
Claims (6)
1. Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen mit Hilfe eines
Vernetzungsmittels durch Zusammenbringen einer einen Träger
aufweisenden Enzymzubereitung in fester oder gelöster Form mit
einem Vernetzungsmittel in einem wäßrigen Medium und Isolierung
des immobilisierten Enzyms,
dadurch gekennzeichnet, daß man der Enzymzubereitung,
aus einem Träger, der mit einer Schicht des festen Enzyms
überzogen ist oder einem porösen Träger, in dem die Enzymlösung eingedrungen
ist, in einer Lösung ein Vernetzungsmittel und ein wasserlösliches Salz, das mit dem Vernetzungsmittel
nicht reagiert und das Enzym nicht inaktiviert, in einer solchen
Konzentration zugibt, daß ein Lösen des Enzyms oder ein
Vermischen mit der Salzlösung während der Vernetzungsreaktion
verhindert wird.
2. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man als Vernetzungsmittel
Glutaraldehyd verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß die Glutaraldehydkonzentration
in dem wäßrigen Medium zwischen 0,001 und 5%
(Gew./Vol.), vorzugsweise 0,005 bis 1% (Gew./Vol.), beträgt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß das Salz ausgewählt
ist aus der Gruppe der Sulfate, Phosphate, Citrate, Bicarbonate,
Polyphosphate, Ferrocyanide, Phenolsulfonate, Sorbate,
Ethylsulfate, Chloride, Nitrate und Succhinate der Alkalimetalle,
insbesondere aus Natriumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumphosphat
und Kaliumcitrat.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, daß die Salzkonzentration
zwischen 0,2 m und der Sättigung, insbesondere zwischen
0,5 m und etwa 3 m liegt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Glucoseisomerase, Amylasen,
insbesondere Amyloglucosidase, Pullulanase, Lactase, Pectinasen,
Naringinase, Penicillinacylasen, Inulinasen, Lipasen und
Proteasen.
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