NL8303415A

NL8303415A - Werkwijze ter bereiding van een geimmobiliseerd enzympreparaat door middel van een verknopingsmiddel.

Info

Publication number: NL8303415A
Application number: NL8303415A
Authority: NL
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1982-10-06
Filing date: 1983-10-05
Publication date: 1984-05-01
Also published as: FI85284C; ES8504247A1; FI833615A0; NL192796B; IT1163947B; ES526247A0; KR900007631B1; DE3336257A1; FR2534272A1; IT8323150A0; BE897926A; JPH047192B2; DE3336257C2; FI833615A; FI85284B; JPS59130184A; IE56079B1; IE832344L; AR245215A1; FR2534272B1

Description

N.0. 32041 1—

Werkwijze ter bereiding van een geïmmobiliseerd enzympreparaat door middel van een verknopingsmlddel.

Enzymen, die door middel van een verknopingsmlddel geïmmobiliseerd zijn, zijn ongeveer de meest wijd verspreide vormen van geïmmobiliseerde enzymen. Om dergelijke enzymen te bereiden zijn een aantal werkwijzen ontwikkeld. Bij één van dergelijke werkwijzen wordt een drager 5 eerst door het verknopingsmlddel geactiveerd en vervolgens met het enzym behandeld, dat dus stevig aan de drager verbonden wordt. Een dergelijke activering kan een impregnering van de drager met een polyamine en een daarop volgende behandeling met een overmaat glutaaraldehyd, zoals in het Amerikaanse octrooischrift 4.292.199 of in Biotechnology and 10 Bio-engineering, 22_ (1980), 271-287 beschreven, omvatten. Een andere activering van dit type kan een bekleding van een drager met een de adsorptie bevorderend onoplosbaar polymeer, de daarop volgende adsorptie van het enzym op het polymeer en een verdere immobilisering door verknoping in situ, zoals beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 13 3.703.084, omvatten. Een andere activering van dit type is in het Ame rikaanse octrooischrift 4.069.106 beschreven: Een keratine bevattende drager wordt geactiveerd door de reductie van het keratine en verknoping van het enzym daaraan via S-S groepen. Een andere activering van dit type is in het Amerikaanse octrooischrift 3.802.909 beschreven: 20 Glas wordt bij aanwezigheid van een proteïne gebroken, waardoor vers voortgebrachte actieve plaatsen worden verschaft om het proteïne te binden. Een andere activering van dit type is in het Amerikaanse octrooischrift 3.519.538 beschreven: Glas wordt met een reeks chemicaliën behandeld om de gewenste actieve plaatsen voort te brengen. Een andere 25 werkwijze ter bereiding van een geïmmobiliseerd enzym is beschreven in Biochemical and Biophysical Research Communications 36_ (1969), 235-242:

Het enzym wordt op colloldaal siliciumdioxide zonder voorafgaande activering geadsorbeerd en vervolgens door verknoping met glutaaraldehyd gefixeerd.

30 Alle bovenvermelde werkwijzen worden gekenmerkt door een dunne laag van enzymmoleculen, die direct aan de actieve plaatsen op een drager worden verbonden en derhalve wordt de hoeveelheid geïmmobiliseerd enzym bepaald door het aantal actieve plaatsen.

Een in alle opzichten verschillende benadering is aan het opper-35 vlak van de drager een veel dikkere laag te hebben verbonden, waarbij slechts een kleine fractie van de enzymmoleculen in direct contact met de drager is. Op deze wijze is het niet het oppervlaktegebied van de ---Λ n t Λ drager, dat de hoeveelheid geïmmobiliseerd enzym bepaalt en deze benadering maakt het mogelijk de hoeveelheid gebonden enzym te optimaliseren, afhankelijk van de procesparameters tijdens het uiteindelijke gebruik. Deze benadering is echter moeilijker tot stand te brengen, aan-5 gezien de relatief grote hoeveelheid enzym het moeilijk maakt, dit tijdens de immobilisering op zijn plaats te handhaven. Derhalve is vergelijkenderwijs over deze benadering, niettegenstaande de voor de hand liggende voordelen ervan, weinig gepubliceerd. Eén voorstel, beschreven in de Canadese octrooischriften 1.011.671 en 1.011.672, is het gebruik 10 van een water bevattende oplossing van een in water oplosbaar organisch oplosmiddel als het verknopingsmilieu, waarbij de concentratie van het organische oplosmiddel voldoende hoog wordt gehouden om het enzym onoplosbaar te houden, echter laag genoeg om de verknopingsreactie niet te veel te belemmeren. Het voornaamste nadeel in verband met deze werkwlj-15 ze is de eis van relatief grote hoeveelheden organische oplosmiddelen, vergezeld van explosierisico1s, die uitgebreide veiligheidsvoorzieningen noodzakelijk maken. Ook is het op deze wijze verkregen produkt niet geheel bevredigend in fysische stabiliteit en activiteitsherstel, waarschijnlijk tengevolge van de relatief hoge concentratie van het organi-20 sche oplosmiddel, die noodzakelijk is om het enzym tijdens de immobili-satie buiten oplossing te houden. Een andere werkwijze, die betrekking heeft op dit probleem, is in het Amerikaanse octrooischrift 4.116.771 voorgesteld: In een beperkt volume water wordt het enzym met glutaaral-dehyd en een inert proteïne behandeld, voordat snel aan de drager wordt 25 toegevoegd, vervolgens wordt gegeleerd, daarna gegranuleerd en tenslotte gedroogd. Het voornaamste nadeel van deze werkwijze is de hoge concentratie van het verknopingsmiddel, die een gevolg is van de beperkte hoeveelheid water. Vele enzymen zijn voor hoge concentraties van ver-knopingsmiddelen zeer gevoelig, hetzij omdat zij geïnactiveerd worden, 30 hetzij omdat zij tijdens later gebruik tengevolge van de uitgebreide verknoping ontoegankelijk worden, hetzij beide. Dit illustreert de voornaamste moeilijkheid bij toepassing van een grote hoeveelheid enzym op een drager: Teneinde een voldoende lage concentratie van het verknopingsmiddel te verkrijgen heeft men relatief grote hoeveelheden milieu 35 nodig, wat het onmogelijk maakt te voorkomen dat het enzym in het milieu oplost voordat de verknoping effectief wordt, terwijl een hoge concentratie verknopingsmiddel, die het enzym uit oplossing kan houden, zoals boven toegelicht, ongewenst is.

Een volledig verschillende benadering van het probleem is het to-40 taal vermijden van het water bevattende milieu en het gebruik van een ' y ï m 3 gasvormige fase in plaa£s daarvan; dit is beschreven in The Journal of Society of Chemical Industry, JIJ (1899), 16-20 voor de bereiding van onoplosbare gelatinevezels en in het Japanse octrooischrift J 57.002.683 voor het immobiliseren van enzymen. Echter zal deze werk-5 wijze een zeer ingewikkeld ventilatiesysteem vereisen en zal voorts speciale middelen vereisen ter voorkoming van de vorming van onoplosbare afzettingen binnen het ventilatiesysteem.

Derhalve is een doel van de uitvinding het verschaffen van een werkwijze ter bereiding van een geïmmobiliseerd enzympreparaat door 10 middel van een verknopingsmiddel, welke werkwijze eenvoudig zal kunnen worden uitgevoerd, bijv. zonder noodzaak van ingewikkelde veiligheidsvoorzieningen en door middel waarvan het geïmmobiliseerde enzym met een groot enzymactiviteitsherstel en met een goede fysische houdbaarheid bereid kan worden.

15 Volgens de uitvinding werd nu gevonden, dat het mogelijk is het bovenvermelde doel te bereiken door toepassing van bepaalde zouten in een gespecificeerde minimum concentratie. Zelfs hoewel de hiervoor geciteerde stand der techniek alleen betrekking heeft op geïmmobiliseerde enzympreparaten op dragers, is de uitvinding niet beperkt tot dergelij-20 ke geïmmobiliseerde enzympreparaten, maar omvat eveneens geïmmobiliseerde enzympreparaten zonder een drager.

*

Derhalve omvat de uitvinding een werkwijze ter bereiding van een geïmmobiliseerd enzympreparaat door middel van een verknopingsmiddel, waarbij de volgende bestanddelen in een water bevattend milieu bij el-25 kaar worden gebracht: a) een enzympreparaat in een vaste of opgeloste toestand, b) een verknopingsmiddel en c) een in water oplosbaar zout, dat niet met het verknopingsmiddel reageert of het enzym activeert, in een voldoende concentratie om 30 te voorkomen dat enig wezenlijk deel van het enzym oplost in of mengt met de zoutoplossing, terwijl de verknopingsreactie plaatsheeft, waarna het geïmmobiliseerde enzym wordt hersteld.

Wanneer het afgewerkte geïmmobiliseerde enzym een overmaat verkno-35 pingsmiddel bevat, kan dit laatste door wassen verwijderd worden.

Het zal duidelijk zijn, dat het enzympreparaat in een vaste of opgeloste toestand kan zijn; voorts kan het enzympreparaat zeer zuiver zijn of het kan inerte toevoegsels bevatten (bijv. vulstoffen, versterkingsmiddelen, bindmiddelen of granuleringsmiddelen). Ook zal het dui-40 delijk zijn dat de volgorde, waarin de bestanddelen bij elkaar worden · > i * « 4 gebracht, willekeurig is, behalve dat in het geval dat het enzymprepa-raat en het verknopingsmiddel bij elkaar worden gebracht vöör de toevoeging van de zout, de enzymopbrengst zal afnemen, wanneer de toevoeging van zout ongegrond wordt uitgesteld.

5 Be boven aangegeven categorie zouten (waarbij een specifieke cate gorie van zouten kan worden toegewezen aan elke combinatie van een gespecificeerd enzym en een gespecificeerd verknopingsmiddel) omvat gewoonlijk goedkope zouten. Het spreekt vanzelf, dat een of meer enzym-preparaten, een of meer verknopingsmiddelen en een of meer zouten bij 10 de werkwijze volgens de uitvinding gebruikt kunnen worden.

Bij een voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding bevat het enzympreparaat een drager. Hoewel de werkwijze volgens de uitvinding zonder een drager kan worden uitgevoerd (zie bijvoorbeeld voorbeeld 15), verdient het gewoonlijk de voorkeur een drager 15 te gebruiken, in hoofdzaak vanwege de mogelijkheid, die door de drager geboden wordt, voor de bereiding van een deeltje met voortreffelijke stromingseigenschappen, geschikt voor bewerkingen met een gepakt bed. Het maakt niet uit of het enzym in een vaste toestand of opgelost is, het is in dit geval nauw verbonden met de drager: In een vaste toestand 20 kan het enzym een bekledingslaag op de drager zijn en in een opgeloste toestand kan de enzymoplossing de (poreuze) drager impregneren.

Bij een voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding is het enzympreparaat een drager, die bekleed is met een laag vast enzym. Hierdoor wordt het mogelijk gemaakt een enzympreparaat 25 voort te brengen met elke gewenste enzymbelasting binnen ruime grenzen door variatie van de dikte van de enzymlaag.

Bij een voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding is het enzympreparaat een poreuze drager, die met een enzymoplossing geïmpregneerd is. Hierbij wordt een zeer eenvoudige werkwijze 30 voor de bereiding van het geïmmobiliseerde enzympreparaat volgens de uitvinding verschaft.

Bij een voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding is het verknopingsmiddel glutaaraldehyd. Glutaaraldehyd is relatief goedkoop en door de gezondsheidsautoriteiten wordt geen bezwaar 35 gemaakt. Ook is in verhouding met vele enzymen glutaaraldehyd een zeer werkzaam en toch mild verknopingsmiddel.

Bij een voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding ligt de glutaaraldehydconcentratie in het water bevattende milieu tussen 0,001 en 5 gew./vol.%; bij voorkeur van 0,005 tot 1 40 gew./vol.%. Zoals uit de voorbeelden later in de beschrijving blijkt, ' # 5 hangt het enzymactiviteitsherstel af van de glutaaraldehydconcentratie en gewoonlijk ligt de glutaaraldehydconcentratie, die overeenkomt met een maximum enzymactiviteitsherstel, binnen de boven aangegeven intervallen. Het percentate glutaaraldehyd (gew./vol.) wordt berekend vol-5 gens de formule gewicht van glutaaraldehyd, g χ volume van (zoutoplossing en glutaaraldehyd), ml 10 Bij een voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uit vinding wordt het zout gekozen uit de groep bestaande uit een sulfaat, fosfaat, citraat, waterstofcarbonaat, carbonaat, fluoride, acetaat, tartraat, polysulfaat, polyfosfaat, ferrocyanide, fenolsulfonaat, sor-baat, ethylsulfaat, chloride, nitraat en succinaat van secondair, ter-15 tiair of kwateraair ammonium of een van de alkalimetalen, in het bijzonder natriumsulfaat, natriumfosfaat, kaliumfosfaat en kaliumcitraat. '

In het algemeen zijn deze zouten goedkoop en terug te winnen en openen de mogelijkheid voor de bereiding van een geïmmobiliseerd enzymprepa-raat met een hoog enzymactiviteitsherstel.

20 Bij een voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uit vinding ligt de zoutconcentratie tussen 0,1 molair en verzadiging, in het bijzonder van ongeveer 0,5 molair tot ongeveer 3 molair. Zoals uit de voorbeelden later in de onderhavige beschrijving blijkt, is het mogelijk een glutaaraldehydconcentratie en een zoutmolariteit te kiezen 25 binnen de boven aangegeven intervallen, hetgeen resulteert in een zeer hoog enzymactiviteitsherstel.

Bij een voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding wordt het enzym gekozen uit de groep bestaande uit glucose iso-merase, amylasen, in het bijzonder amyloglucosidase, pullulanase, lac-30 tase, pectinasen, naringinase, penicilline acylasen, inulinasen, lipa-sen en proteasen.

Derhalve voorkomt het gebruik van de boven aangegeven zouten, zelfs in lagere concentraties dan vereist voor de precipitatie van de enzymen, dat het enzym voor alle praktische doeleinden wordt opgelost 35 in het verknopingsmilieu (zoutoplossing), terwijl het volledig toegankelijk gehouden wordt voor het verknopingsmiddel, wanneer het enzym in een vaste toestand is, of voorkomt dat het enzym met de zoutoplossing gemengd wordt, wanneer het enzym opgelost is. Op deze wijze kan een optimum concentratie van het verknopingsmiddel gebruikt worden, die 40 slechts een minimale schade aan het enzym zal veroorzaken en toch een 6 voldoende goede fysische stabiliteit verleent. Derhalve werd gevonden, dat men om de concentratie van het verknopingsmiddel te verminderen, de zoutconcentratie dient te verhogen om het enzymactiviteitsherstel op het optimale niveau te handhaven. Volgens de uitvinding dient het ge-5 bruik van zouten, die met hetzij het enzym hetzij het verknopingsmiddel reageren, zoals zilver- of kwikzouten, die het enzym kunnen inactiveren, of ammoniumzouten of primaire aminezouten of sulf iet zouten, die de neiging hebben met verschillende verknopingsmiddelen te reageren, vermeden te worden. De zouten, die voor het doel van de onderhavige uit-10 vinding gebruikt kunnen worden, variëren aanzienlijk met betrekking tot hun doelmatigheid en voorts zal deze doelmatigheid van het ene enzym tot het andere kunnen variëren. Enkele ruime richtlijnen met betrekking tot de keuze van het zout kunnen echter als volgt gesteld worden: Het is raadzaam het meer oplosbare zout te kiezen, wanneer twee zouten 15 overigens identiek zijn met betrekking tot de eigenschappen. Derhalve verdient Na2S04 gewoonlijk de voorkeur boven K2SO4 vanwege de veel grotere oplosbaarheid. Ook werd gevonden dat in het algemeen zouten van veelwaardige anionen, zoals sulfaten, fosfaten, carbonaten, ci-traten en dergelijke doelmatiger zijn dan de eenwaardige anionen, zoals 20 chloriden en nitraten. Het omgekeerde is echter gewoonlijk het geval voor de kationen: De eenwaardige kationen, zoals Na+, K+ of tetra-methylammonium, zijn doelmatiger dan de veelwaardige, zoals Mg"*"*· of Ca"1"*"· De zouten, die de voorkeur verdienen, zijn derhalve de alka-limetaalzouten van sulfaten, fosfaten en citraten, en in het bijzonder 25 natriumsulfaat, natriumfosfaat, kaliumfosfaat, kaliumcitraat en tetra-methylammoniumsulfaat.

De zoutconcentratie wordt gewoonlijk op een minimum gehouden. Dit minimum is enerzijds afhankelijk van het betreffende enzym, aangezien verschillende enzymen vaak verschillende concentraties vereisen en an-30 derzijds van de concentratie van het verknopingsmiddel: Hoe hoger de laatstgenoemde, hoe minder zout vereist is en vice versa. De concentratie van het verknopingsmiddel wordt eveneens op een minimum gehouden, aangezien de meeste enzymen voor verknopingsmiddelen gevoelig zijn.

De concentratie dient evenwel hoog genoeg te zijn om een doelmatige im-35 mobilisatie te waarborgen. Voorzichtigheid dient echter in acht genomen te worden bij het vaststellen van de optimale omstandigheden voor de verknopingsreactie bij een zeer hoge zoutconcentratie, in het bijzonder met werkzame zouten. Derhalve werd gevonden, dat bij hoge concentraties van Na2SC>4 of kaliumfosfaat bijvoorbeeld, de activiteitsrendementen 40 aanzienlijk worden verminderd in vergelijking met die bij middelmatige

. - . . I

'J

-V

*' 7 concentraties. Dit is waarschijnlijk toe te schrijven aan de zeer dichte verknoping, die de enzymmoleculen ten dele ontoegankelijk maakt.

Nog een ander voordeel van het gebruik van deze zouten in het ver-knopingsmilieu is het voorkomen van aggregatie van de enzym bevattende 5 deeltjes tijdens de immobilisatiereactie, wanneer het enzym in een vaste toestand aanwezig is. Een dergelijke aggregatie is ongewenst, aangezien deze resulteert in lagere doelmatigheden en slechte stromingsei-genschappen tijdens het gebruik. Ook in dit opzicht verschillen zouten aanzienlijk.

10 De werkwijze volgens de uitvinding kan in een aantal trappen wor den uitgevoerd, waarvan de volgorde niet kritisch is. Derhalve wordt bijv. bij een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding een drager eerst met een enzymoplossing behandeld, gedroogd en vervolgens behandeld in een oplossing, die een verknopingsmiddel en zout bevat, gewas-15 sen en eventueel gedroogd. Volgens een variatie van dezelfde werkwijze kan een deel van de totale hoeveelheid zout in de enzymoplossing aanwezig zijn. Volgens nog een andere variatie wordt het enzym eerst met het verknopingsmiddel en onmiddellijk daarna met het zout behandeld. Voor bepaalde doeleinden, bijvoorbeeld wanneer het gewenst is, dat het gelm-20 mobiliseerde enzym licht en vezelachtig is, kan de hoeveelheid drager zeer gering zijn of de drager kan totaal vermeden worden, en het enzym kan in een coagulatiebad met het verknopingsmiddel en het zout behandeld worden. Derhalve kan het enzym worden opgelost in een oplossing, die in een zoutbad gecoaguleerd wordt, waarbij het verknopingsmiddel 25 aan de enzymoplossing of aan het bad, hetzij voor hetzij na de coagula-tie, wordt toegevoegd. Ook kan het zout als een droog poeder in plaats van een oplossing worden toegevoegd, wanneer het gewenst is de hoeveelheid water te beperken. Derhalve is de volgorde, waarin de verschillende bestanddelen bij elkaar worden gebracht of de toestand ervan, dat 30 wil zeggen, hetzij in oplossing hetzij droog, niet kritisch voor de werkwijze volgens de uitvinding.

De pH, de temperatuur en de duur van de verknopingsreactie kan een diepgaand effect op het activiteitsherstel hebben, afhankelijk van het enzym en indien aanwezig inerte toevoegsels. In het algemeen werd ge-35 vonden, dat een pH-traject van ongeveer 4 tot ongeveer 9 geschikt is.

Het in de meeste gevallen geschikte temperatuurtraject is van ongeveer 15°C tot ongeveer 30°C, hoewel hogere temperaturen met voordeel in bepaalde gevallen gebruikt kunnen worden, bijv. wanneer het gewenst is de duur van de verknopingsreactie te verkorten en lagere temperaturen kun-40 nen met voordeel gebruikt worden in het geval van zeer temperatuurge- 9 *»· δ voelige enzymen. De duur van de verknopingsreactie kan aanzienlijk variëren, van enkele minuten tot enkele dagen, afhankelijk van het type en de concentratie van het verknopingsmiddel, het type en de concentratie van het zout, het enzym, de pH en de temperatuur en dient derhalve 5 in elk afzonderlijk geval vastgesteld te worden. Voor glutaaraldehyd en de meeste enzymen blijkt echter het traject van ongeveer 10 minuten tot enkele uren bij kamertemperatuur geschikt te zijn.

In het volgende wordt naar verschillende NOVO literatuurreferen-ties verwezen. Copieën van al deze referenties kunnen verkregen worden 10 bij NOVO Industri A/S, Novo Alle, 2880 Bagsvaerd, Denemarken.

De werkwijze volgens de uitvinding zal door de volgende voorbeelden worden toegelicht.

In het volgende deel van de beschrijving, dat de voorbeelden bevat, worden waarden van de drukval (fysische sterkte) tijdens het be-15 drijf van de kolom aangegeven. Deze waarde wordt bepaald volgens AF

166/2, dat een beschrijving is van een NOVO laboratoriummethode. Enkele theoretische overwegingen, die verband houden met deze drukvalbepaling zijn beschreven in Starch/Stërke _31 (1979) nr. 1, 13-16. Ter vergelijking met bekende handelsprodukten kan worden vermeld, dat de beste 20 waarden van de drukval voor de geïmmobiliseerde glucose isomeraseprepa-raten SWEETZYME ongeveer 10 g/cm^ is. Uit de voorbeelden blijkt, dat drukvallen met de geïmmobiliseerde enzympreparaten, bereid door middel van de werkwijze volgens de uitvinding, 2 g/cm^ kan zijn en dat alle waarden aanzienlijk lager zijn dan 10 g/cm^, waardoor het technische 25 voordeel van de uitvinding duidelijk wordt aangetoond.

Voorbeeld I

Hoeveelheden van 20 g deeltjes van droge drager bekleed met ten dele gezuiverd glucose-isomerase preparaat tot een hoeveelheid van 28 gew.% en bereid volgens de werkwijze, zoals beschreven in voorbeeld 8 30 van de samenhangende Deense octrooiaanvrage 4430/82 werden bij kamertemperatuur in 500 ml van een oplossing, die 0,06 mol natriumfosfaat, 1,4 mol Na2S04 en verschillende hoeveelheden glutaaraldehyd, ingesteld op een pH van 7,0, bevatte, gesuspendeerd en voorzichtig geroerd. Na 1 uur werden de deeltjes verwijderd en gedurende 1 uur gesuspendeerd 35 in een op een pH van 7,0 ingestelde oplossing van 0,06 mol natriumfosfaat. Deze wasbehandeling werd driemaal herhaald en vervolgens werden de deeltjes ëën nacht in de fosfaatoplossing bewaard, waarna de activiteit ervan werd bepaald volgens NOVO analyseforskrift AF 189/1. De resultaten zijn in fig. 1 voorgesteld, die een grafiek is, waarin het 40 percentage glutaaraldehyd is uitgezet tegen het enzymactiviteitsherstel 9 uitgedrukt in enzymeenheden/g, en die de gevoeligheid van het enzym voor glutaaraldehyd laat zien.

Voorbeeld II (vergelijking)

Deeltjes werden zoals in voorbeeld I bereid, alleen werd geen zout 5 toegevoegd, behalve een minimale hoeveelheid fosfaat om als buffer te dienen (0,06 mol natriumfosfaat, pH 6,5). Eet percentage glutaaraldehyd werd uitgezet tegen het enzymactiviteitsherstel in eenheden/g, zie fig. 2, die laat zien, dat het verknopingsmiddel twee tegengestelde effecten heeft: Enerzijds vergroot het de opbrengst door te voorkomen dat het 10 enzym oplost; anderzijds vermindert het de opbrengst door het enzym te inactiveren. Het optimum wordt in dit geval vastgesteld bij ongeveer 1% glutaaraldehyd. Uit een vergelijking tussen fig. 1 en fig. 2 blijkt, dat het optimum van de glutaaraldehydconcentratie ongeveer 40 maal zo hoog is als met 1,4 mol natriumsulfaat en dat de opbrengst in dit geval 15 slechts ongeveer 60% van de opbrengst met het zout is.

Voorbeeld III

Deeltjes werden zoals in voorbeeld I bereid, slechts werd in dit geval kaliumfosfaat als zout toegevoegd en werd de zoutconcentratie gevarieerd, terwijl de glutaaraldehydconcentratie op drie niveaus en de 20 p& bij 6,5 constant werden gehouden. Het percentage kaliumfosfaat werd uitgezet tegen het enzymactiviteitsherstel in eenheden/g, zie fig. 3, waaruit het gunstige effect van het verhogen van de zoutconcentratie duidelijk blijkt, in het bijzonder bij een lage glutaaraldehydconcentratie.

25 Voorbeeld IV

Het experiment in voorbeeld III werd herhaald, alleen werd hier natriumsulfaat in plaats van kaliumfosfaat gebruikt. De molariteit van Na2S04 werd uitgezet tegen het enzymactiviteitsherstel in eenheden/g, zie fig. 4, waaruit het gunstige effect van het zout duidelijk 30 blijkt. Zoals ook uit fig. 4 blijkt, bestaat een optimum voor het zout-effect, waarbuiten het activiteitsherstel afneemt en waarbij dit optimum van de glutaaraldehydconcentratie afhangt.

Voorbeeld V

Het in voorbeeld III beschreven experiment wordt herhaald, slechts 35 werd de zoutconcentratie verhoogd. De molariteit van kaliumfosfaat werd uitgezet tegen het enzymactiviteitsherstel in eenheden/g, zie fig. 5.

Een vergelijking tussen de fig. 4 en 5 laat zien dat Na2S04 en kaliumfosfaat zich soortgelijk gedragen.

Voorbeeld VI

40 Het in voorbeeld I beschreven experiment wordt herhaald, slechts 10 werd kaliumcitraat, pH 7,0, gebruikt in plaats van fosfaat en sulfaat in het verknopingsmilieu. In fig. 6 is de glutaaraldehydconcentratie tegen de activiteit in enzymeenheden/g uitgezet en de resultaten lijken duidelijk op die van voorbeeld I.

5 Voorbeeld VII

20 g gedroogde dragerdeeltjes, bereid zoals in voorbeeld 4 van de samenhangende Deense octrooiaanvrage 4430/82 werden in een gefluïdi-seerd bed van het laboratoriumtype gefluldiseerd. 45,8 g van een 11,0 gew.% gehomogeniseerde celsuspensie (gefermenteerd zoals aangegeven in 10 voorbeeld 1 van de Deense octrooiaanvrage 5190/79, welke suspensie bereid is zoals aangegeven in voorbeeld 4 van de Deense octrooiaanvrage 5190/79), die 80,1 eenh./g thermofiel lactase van Bacillus sp. NRRL B-ll.229 bevatte, werden bij 30-40°C op de dragerdeeltjes gesproeid en de beklede deeltjes werden gedroogd. De lactase-activiteitseenheid 15 wordt gedefinieerd als die hoeveelheid lactase, die 1 pmol laetase/mi-nuut onder de volgende reactieomstandigheden zal splitsen: Substraat-concentratie - 10% lactose, temperatuur » 60°C, pH = 6,5 en reactietijd = 30 minuten. Het enzymactiviteitsherstel was 79,8%. 10 g beklede bolletjes werden vervolgens bij een pH van 7,5 behandeld in 250 ml van een 20 oplossing, die 0,06 mol Na2HP04, 1,4 mol Na2S04 en 0,1 gew./vol.% glutaaraldehyd bevatte. Na 1 uur bij kamertemperatuur werden de deeltjes verwijderd en grondig met 0,06 molair K2HPO4 bij een pH van 7,5 gewassen. Het activiteitsherstel met betrekking tot de verkno-pingstrap was 17,2%.

25 Voorbeeld VIII

24 g gedroogde dragerdeeltjes, bereid zoals in voorbeeld 4 van de samenhangende Deense octrooiaanvrage 4430/82 werden in 20,2 g oplossing van een 39,6 gew.% ten dele gezuiverde amyloglucosidase van A. niger, bereid door ultrafiltratie van het handelsprodukt AMG 200 L (beschreven 30 in de NOVO brochure NOVO Enzymes AMG, B 020 g-GB) gedrenkt om de bestanddelen met laag molecuulgewicht te verwijderen tot een droge stof-gehalte van 39,6 gew.% (activiteit 2610 IAG/g, waarbij de activiteits-eenheid gedefinieerd is in NOVO Analyseforskrift AF 159/2). Vacuum werd gedurende 1 uur aangebracht. Het aldus verkregen produkt bevatte 25 35 gew.% droge stof van partieel gezuiverde amyloglucosidase met een enzymactiviteitsherstel van 77,9%.

20 g deeltjes met een gehalte droge stof van 71,8% werden vervolgens behandeld in 1600 ml van een oplossing van 0,06 mol NaH2P04, 1,4 mol Na2S04 en 0,2% glutaaraldehyd bij een pH van 4,5. Na 1 uur 40 werden de deeltjes door filtratie verwijderd en met 0,06 molair ·» ; / χ· 11

NaÜ2P04 bij een pH van 4,5 gewassen.

Het enzymactiviteitsherstel met betrekking tot de verknopingstrap was 55,1%.

Voorbeeld IX

5 40 g dragerdeeltjes, bereid zoals aangegeven in voorbeeld 4 van de samenhangende Deense octrooiaanvrage 4430/82 en met een gehalte droge stof van 98,8% en 24 g onder vacuum ingedampt concentraat van partieel gezuiverde Bacillus coagulans glucose isomerase met 5% glucose en 8% natriumsulfaat toegevoegd (gehalte droge stof 41,8%) werden gemengd en 10 de vloeistof kreeg de gelegenheid de lucht in de poriën van de deeltjes door behandeling met vacuum te vervangen. Het gewicht na het mengen was 63,22 g. Het gehalte droge stof was 79,2%.

Porties van 18 g van dit preparaat (ongeveer 14 g droge stof) werden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur behandeld met 375 ml van een 15 op een pH van 7,5 ingestelde oplossing, die in alle gevallen 1,5 mol natriumsulfaat, 5% glucose en 0,06 mol natriumfosfaat en voorts hetzij 0,1 hetzij 0,2 hetzij 0,3% glutaaraldehyd bevatte.

Na deze behandeling werden de porties vijfmaal met ongeveer 150 ml 1-procents natriumfosfaat, pH 7,5, gewassen.

20 De enzymactiviteit werd bepaald volgens AF 189/1 nadat de vloei stof uit de deeltjes was afgevoerd. Ook werd het gehalte droge stof bij deze deeltjes bepaald.

% droge eenh./g eenh./g op- opbrengst 25 stof nat droog brengst gelmmob.

_%_% enzymconcentraat 41,8 1415 3385 enzymconentraat + drager 79,2 463 585 86 30 gelmmob. met 0,1% GA 32,5 158 486 72 83 - 0,2% - 38,9 141 362 53 62 - 0,3% - - 117 333 49 57

Porties, equivalent aan 5 g droge stof, werden op drukval onder-35 zocht.

t 12 glutaaraldehyd drukval concentratie bij 25 uren 50 uren immobilisatie 5 0,1% 3 5 0,2% 1 3 0,3% 2 3

Voorbeeld X

10 In dit voorbeeld wordt een werkwijze beschreven ter bereiding van een geïmmobiliseerd enzymprodukt op basis van geactiveerde kool uit Norit als drager.

Derhalve werden 20 g Norit Rox 0,8 geactiveerde kool, type A-3397 gedrenkt in 33 g van een 39,2 gew.% oplossing van ten dele gezuiverde 15 glucose-isomerase van Bacillus coagulans (activiteit 3950 eenh./g droge stof, welke activiteitseenheid gedefinieerd Is in NOVO Analyseforskrift AF 189/1).

Vacuum werd gedurende 20 uren bij 4°C aangebracht, behalve dat het vacuum viermaal gedurende deze periode werd opgeheven. Het aldus ver-20 kregen produkt bevatte 35 gew.% droge stof van ten dele gezuiverde glucose-isomerase met een enzymactiviteitsherstel van 97%.

98% van het boven aangegeven aggregaatprodukt werd vervolgens geïmmobiliseerd in 890 ml van een oplossing van 0,06 mol KH2PO4, 1,4 mol Na2S04 en 0,18% glutaaraldehyd, die met 4 N NaOH op een pH van 25 7,5 was ingesteld. Na 2 uren bij kamertemperatuur onder voorzichtig roeren werden de deeltjes door filtratie verwijderd en grondig met 0,06 molair KH2PO4, pH 8,0, gewassen.

Het activiteitsherstel met betrekking tot de verknopingstrap was 31%.

30 Voorbeeld XI

In dit voorbeeld wordt een werkwijze beschreven ter bereiding van een geïmmobiliseerd enzympreparaat met een drager, bestaande uit sili-ciumdioxidebolletjes met een diameter van ongeveer 2 mm.

A. 20 g van de siliciumdioxidebolletjes werden In een gefluldiseerd 35 bed van het laboratoriumtype gefluldiseerd en 40 g oplossing van 15 gew.% ten dele gezuiverde glucose-isomerase van Bacillus coagulans (activiteit 3306 eenh./g droge stof, welke activiteit gedefinieerd is in NOVO analyseforskrift AF 189/1) werden bij 25-30°C op de bolletjes gesproeid en de beklede bolletjes werden gedroogd. Het aldus verkregen 40 produkt bevatte 23 gew.% ten dele gezuiverde glucose-isomerase met een 13 activiteitsherstel van 78%.

95% van de beklede bolletjes werden vervolgens behandeld In 500 ml van een met 4 N NaOH op een pH van 7,5 ingestelde oplossing, die 0,06 mol K2HPO4, 1,4 mol Na£S04 en 0,1 gew./vol.% glutaaraldehyd bevat-5 te; na 1 uur bij kamertemperatuur werden de deeltjes verwijderd en grondig met 0,06 molair KH2PO4 bij een pH van 8,0 gewassen. Vervolgens werd de activiteit bepaald. Het activiteitsherstel met betrekking tot de verknopingstrap was 55%.

B. 20 g van de siliciumdioxidebolletjes werden gedrenkt in 15 g op-10 lossing van 40 gew.% ten dele gezuiverde glucose-lsomerase van Bacillus coagulans (activiteit 3270 eenh./g droge stof) waaraan 0,56 mol Na2S04 was toegevoegd. Vacuum werd gedurende 20 minuten aangebracht, behalve dat het vacuum viermaal tijdens deze periode werd opgeheven. Het aldus verkregen produkt bevatte 20 gew.% ten dele gezuiverde 15 glucose-isomerase met een enzymactiviteitsherstel van 90%. 95% van de beklede bolletjes werden vervolgens zoals in deel A van dit voorbeeld beschreven, behandeld. Het activiteitsherstel met betrekking tot de verknopingstrap was 45%.

In sommige gevallen, waarbij het enzym bijzonder moeilijk te ver-20 knopen is, kunnen zouten niet alleen doelmatig worden, maar veeleer onmisbaar zijn, wanüeer het enzym in zuivere toestand geïmmobiliseerd dient te worden. Een goed voorbeeld is het amyloglucosidase, dat door NOVO geproduceerd wordt (en bijvoorbeeld verkocht onder het handelsmerk AMG 200 L, zie de brochure NOVO enzymes AMG, B 020 g-GB 2500, juli 25 1982), welk produkt nagenoeg onmogelijk met glutaaraldehyd, wanneer dit

in zuivere toestand is, te immobiliseren is: Het is onmogelijk gebleken dit amyloglucosidase onoplosbaar te maken, zelfs bij een zo hoge concentratie als 50 gew.% glutaaraldehyd. Echter is het door middel van de bij de werkwijze volgens de uitvinding gebruikte zouten (hoewel bij ta-30 melijk hoge concentraties) mogelijk doelmatig het enzym zelfs bij een zo lage concentratie als 0,05 gew./vol.% glutaaraldehyd onoplosbaar te maken, zoals aangetoond door de volgende voorbeelden XII-XVII. De aldus verkregen preparaten, die een uitstekende filtreerbaarheid hebben en toch gemakkelijk zwevend gemaakt kunnen worden, kunnen met voordeel ge-35 bruikt worden bij de bereiding van bijvoorbeeld laag calorisch bier. Voorbeeld XII

NOVO AMG 200 L uit de handel, verdund tot een droge stofgehalte van 30 gew./vol.% werd met Hyflo Celite gemengd en gedroogd, waarbij een preparaat werd verkregen, dat 21 gew.% droge stof afkomstig van het 40 AMG preparaat bevatte. Porties van 1 g van het preparaat werden vervol- 14 gens bij 32°C toegevoegd aan een oplossing, die 2,4 mol Na2S04, 0,06 mol kaliumfosfaat bij een pH van 6,5 en glutaaraldehyd bij verschillende concentraties bevatte en het gehele mengsel werd gedurende 20 uren bij die temperatuur bewaard. De deeltjes werden vervolgens af-5 gefiltreerd en driemaal met gedeloniseerd water uitgespoeld en het ac-tiviteitsrendement werd gemeten. De resultaten laten het vertrouwde patroon zien van de twee tegengestelde effecten van glutaaraldehyd met een optimum bij 0,05%, zie fig. 7.

Voorbeeld XIII

10 Dezelfde methode als in voorbeeld XII werd herhaald, alleen werden hier verschillende concentraties van Na2S04 gebruikt. Het activi-teitsherstel met dit enzym is uiterst gevoelig voor de aanwezige hoeveelheid zout, zie fig. 8.

Voorbeeld XIV

15 De methode van voorbeeld XII werd herhaald, behalve dat hier een AMG preparaat werd gebruikt, dat slechts half zoveel enzym bevatte. Als resultaat werd een verschuiving van het glutaaraldehydoptimum naar een lagere concentratie duidelijk waargenomen, zie fig. 9.

Voorbeeld XV

20 NOVO AMG 200 L werd door sproeien gedroogd en het verkregen poeder

werd als uitgangsprodukt gebruikt en de methode werd enigszins gevarieerd: 0,5 g van het AMG poeder werd bij 32°C toegevoegd aan 100 ml van een oplossing, die 2,5 mol Na2S04, 0,1 mol kaliumfosfaat, pH

6,5 en 1 gew./vol.% glutaaraldehyd bevatte en werd bij die temperatuur 25 gedurende 1 uur onder zo nu en dan schudden bewaard. De aldus gevormde onoplosbare deeltjes werden vervolgens afgefiltreerd en opnieuw in hetzelfde milieu, alleen zonder glutaaraldehyd en bij dezelfde temperatuur gedurende 20 uren gelncubeerd. Vervolgens werden de deeltjes afgefiltreerd en driemaal met gedeloniseerd water gespoeld. Deze gemakkelijk 30 te filtreren microbolletjes hadden een diameter van ongeveer 10-100 ym en behielden 19% van de oorspronkelijke activiteit.

Voorbeeld XVI

Een aan die van voorbeeld XV identieke methode werd hier gevolgd, behalve dat het glutaaraldehyd aan de zoutoplossing werd toegevoegd, 35 nadat het enzympoeder daaraan was toegevoegd. Een soortgelijk produkt met 34% van de oorspronkelijke activiteit werd aldus bereid.

Voorbeeld XVII

Opnieuw werd de methode van voorbeeld XV gevolgd, behalve dat slechts 0,4 gew./vol.% glutaaraldehyd werd gebruikt en de totale incu-40 batie tot 3 uren werd verkort. Een produkt met 37% van de oorspronke- 15 lijke activiteit werd aldus bereid.

Voorbeeld XVIII

Dit voorbeeld licht de toepasbaarheid van de werkwijze volgens de uitvinding toe met andere verknopingsmiddelen dan glutaaraldehyd, name-5 lijk veelwaardige kationen. In dit geval werd Sn1111 als het verknopingsmiddel gebruikt. Zo werd 0,5 g van het Celite-AMG preparaat van voorbeeld XII, in de toestand vddr verknoping, langzaam en onder roeren toegevoegd aan 100 ml van een oplossing, die 2 mol Na2S04, 0,4 mol kaliumacetaat (pH 4,35) en 0,0086 mol SnCl4.5H20 bevatte en 10 het mengsel werd gedurende 5 minuten onder zo nu en dan schudden bij kamertemperatuur bewaard* De aldus gevormde deeltjes werden afgefil-treerd en in 100 ml 0,2 molair kaliumacetaat, pH 4,35 gebracht en de suspensie werd gedurende 5 minuten geroerd. Deze methode werd driemaal herhaald. Het eindprodukt bezat een enzymactiviteitsherstel van 43%.

15 Voorbeeld XIX

In dit voorbeeld werd een produkt bereid volgens de in voorbeeld XVIII beschreven werkwijze, slechts werden de acetaat en de tin(IV)-zoutconcentraties tot respectievelijk 0,8 mol en 0,017 mol verdubbeld. Een soortgelijk produkt werd verkregen, waarbij het enzymactiviteits-20 herstel 65% was.

Voorbeeld XX

In dit voorbeeld werd eveneens de methode van voorbeeld XVIII herhaald, slechts werd de acetaatconcentratie tot de helft verminderd, d.w.z. 0,2 mol. Opnieuw werd een soortgelijk produkt verkregen met een 25 enzymactiviteitsherstel van 48%.

Voorbeeld XXI

In dit voorbeeld wordt het gebruik van nog een ander verknopingsmiddel, namelijk benzochinon, beschreven. Derhalve werd 0,5 g van een gedroogd Celite-AMG preparaat zoals in voorbeeld XII toegevoegd aan 75 30 ml van een mengsel, dat 2,1 mol Na2S04 en 0,05 mol natriumacetaat bevatte, vervolgens werden 5 ml van een oplossing van 20 gew./vol.% van benzochinon in zuivere ethanol toegevoegd en werd het gehele mengsel gedurende 80 minuten onder zo nu en dan roeren bij kamertemperatuur bewaard. De aldus gevormde deeltjes werden vervolgens afgefiltreerd, in 35 75 ml van een 0,1 molaire kaliumacetaatbuffer, pH 4,4, gedispergeerd, gedurende 5 minuten geroerd en opnieuw gefiltreerd. Deze methode werd driemaal herhaald en vervolgens werd de activiteit bepaald. Het enzymactiviteitsherstel was 14%.

• s *

Claims

1. Werkwijze ter bereiding van een geïmmobiliseerd enzympreparaat door middel van een verknopingsmiddel, met het kenmerk» dat de volgende bestanddelen in een water bevattend milieu bij elkaar worden gebracht: 5 a) een enzympreparaat in een vaste of opgeloste toestand, b) een verknopingsmiddel en c) een in water oplosbaar zout, dat niet met het verknopingsmiddel reageert of het enzym activeert, in een voldoende concentratie om te voorkomen dat enig wezenlijk deel van het enzym oplost in of 10 mengt met de zoutoplossing, terwijl de verknopingsreactie plaats heeft, waarna het geïmmobiliseerde enzym wordt gewonnen.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het enzympreparaat een drager bevat·

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het enzym-15 preparaat een drager is, die met een laag vast enzym bekleed is1

4. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het enzympreparaat een poreuze drager is, die met een enzymoplossing geïmpregneerd is.

5. Werkwijze volgens conclusies 1 tot 4, met het kenmerk, dat het 20 verknopingsmiddel glutaaraldehyd is.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de glutaar-aldehydconcentratie in het water bevattende milieu tussen 0,001 en 5 gew./vol.%, bij voorkeur van 0,005 tot 1 gew./vol.% ligt.

7. Werkwijze volgens conclusies 1 tot 6, met het kenmerk, dat het 25 zout gekozen is uit de groep bestaande uit een sulfaat, fosfaat, ci- traat, waterstofcarbonaat, carbonaat, fluoride, acetaat, tartraat, po-lysulfaat, polyfosfaat, ferrocyanide, fenolsulfonaat, sorbaat, ethyl-sulfaat, chloride, nitraat en succinaat van een van de alkalimetalen, in het bijzonder natriumsulfaat, natriumfosfaat, kaliumfosfaat en ka-30 liumcitraat.

8. Werkwijze volgens conclusies 1 tot 6, met het kenmerk, dat de zoutconcentratie tussen 0,2 molair en verzadiging, in het bijzonder van ongeveer 0,5 molair tot ongeveer 3 molair ligt.

9. Werkwijze volgens conclusies 1 tot 8, met het kenmerk, dat het 35 enzym gekozen wordt uit de groep bestaande uit glucose-isomerase, amy- lasen, in het bijzonder amyloglucosidase, pullulanase, lactase, pecti-nasen, naringinase, penicilline acylasen, inulinasen, lipasen en prote-asen. I I I I Η I ~ ‘ 3 n l ?