DK160843B

DK160843B - Fremgangsmaade til fremstilling af et partikelformet, immobiliseret produkt og anvendelse af immobiliseret enzym fremstillet herved

Info

Publication number: DK160843B
Application number: DK097189A
Authority: DK
Inventors: Henrik Moellgaard
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1987-07-01
Filing date: 1989-03-01
Publication date: 1991-04-22
Also published as: DK97189D0; DK160843C; DE3886280T2; KR890701737A; EP0297912A3; ES2061656T3; DE3886280D1; DK97189A; EP0297912B1; WO1989000195A1; DK336987D0; JP2641934B2; JPH01503677A; KR970000186B1; EP0297912A2; ATE98689T1

Description

DK 160843 B

Denne opfindelse vedrører en fremgangsmåde til fremstilling af et partikelformet, immobiliseret produkt, indeholdende et enzym, en cellemasse, et co-enzym eller et anti-5 stof, fremstillet ved krydsbinding med polyazetidin. Opfindelsen vedrører desuden anvendelse af immobiliseret enzym fremstillet ved en sådan fremgangsmåde i en enzym-katalyseret proces.

Immobiliserede biologisk aktive materialer fremkom for 10 omkring 20 år siden, og siden da er der udkommet et stort antal publikationer vedrørende immobiliseringsteknikker og anvendelser af immobiliserede produkter. Sådanne undersøgelser dækker immobilisering af enzymer, celler, antistoffer og co-enzymer.

Flere anvendelser af immobiliserede produkter er blevet 15 kommercielle i denne periode, lige fra anvendelse af glucose isomerase i store industrianlæg til anvendelse af immobiliserede antistoffer til oprensningsformål.

Blandt de mange kendte immobiliseringsmetoder er en gruppe metoder kendt som krydsbinding som beskrevet i K.

20 Mosbach, Methods of Enzymology, 44./ (1976) . Krydsbinding foregår ved at lade materialet reagere med bi- og polyfunktio-nelle krydsbindingsmidler.

Glutaraldehyd har været anvendt som krydsbindingsmiddel både til enzymer (se f.eks. DK patentansøgning nr. 1435/69) og 25 til mikrobielle cel-ler (se f.eks. US patent nr. 3,779,869). Glutaraldehyd er dog ikke et ideelt krydsbindingsmiddel, da det kun reagerer med -NH2 og -SH grupper. Mange enzymer og celler reagerer dårligt med glutaraldehyd på grund af et lavt indhold af disse grupper.

30 En polyazetidin polymer kan med fordel anvendes til krydsbindingsformål som beskrevet i EP-A1 0 206 687. Krydsbinding med polyazetidin polymer er mere bredt anvendelig til immobilisering end glutaraldehyd, da den reagerer med COOH, -OH og -NH-grupper såvel som med -NH2 og -SH grupper.

r 2

DK 160843 B

Immobiliseringsmetoden beskrevet i EP-A1 0 206 687 er imidlertid ikke ideel i følgende henseender:

Den pastaagtige konsistens af cellemassen på tidspunktet 5 for blanding med polyazetidin polymer gør blandings- processen vanskelig.

Mængden af krydsbindingsmidler er ret stor, sædvanligvis 5-30% polyazetidin og 5-40% glutaraldehyd, og fortrinsvis 10-10 20% af hver (% af celleslam tørstof). Vi mener, at store mængder bliver nødvendige på grund af dårlig blanding med polyazetidin på grund af den pastaagtige konsistens på blandingstidspunktet.

15 - De resulterende partikler er meget tætte med høj diffusionsmodstand, sandsynligvis på grund af den store mængde krydsbindingsmidler.

Immobilisering med polyazetidin er også beskrevet i 20 G.J. Calton et al, Biotechnology, bind 4, siderne 317-320 (1986), i US patent nr. 4,436,813, i Wood et al, Bio/-Technology, December 984, siderne 1081-1084, og i EP-A1 0 089 165. Disse er imidlertid ikke rene krydsbindingsmetoder, menindebærer i stedet binding af aktive celler til et bærermateri-25 ale. Immobilisering på et bærermateriale er i mange tilfælde uønsket, da anvendelsen af et bærermateriale fortynder aktiviteten og fører til lav-aktive produkter, og et dyrt bærermateriale er ofte nødvendigt.

Det er formålet med opfindelsen at undgå eller i hvert 30 fald mindske de ovennævnte ulemper ved at tilvejebringe en proces, som kan anvendes til at fremstille immobiliserede, biologiske materialer med høj aktivitet og høj fysisk styrke ved krydsbinding med polyazetidin.

Opfindelsen tilvejebringer en fremgangsmåde til frem-35 stilling af et partikelformet, immobiliseret produkt, indeholdende et enzym, en cellemasse, et co-enzym eller et antistof, fremstillet ved krydsbinding med polyazetidin, hvilken 3

DK 160843 B

fremgangsmåde er ejendommelig ved, at den angår følgende trin i den angivne rækkefølge: Blanding af det pågældende biologiske materiale med polyazetidin i vandfase, flokkulering af den fremkomne blanding, afvanding af det flokkulerede produkt, 5 opdeling af det afvandede produkt og til sidst tørring af det opdelte materiale til frembringelse af et partikelformet immobiliseret produkt. I denne proces foregår krydsbindingsreaktionen hovedsagelig i det afsluttende tørringstrin.

Opfindelsen tilvejebringer tillige en anvendelse af det 10 immobiliserede enzym fremstillet ved ovennævnte fremgangsmåde i en enzym-katalyseret proces.

Det partikel formede immobil iserede produkt fremstillet ifølge opfindelsen er velegnet til anvendelse i søjler med fast leje, hvor det udviser et lavt trykfald. Det er også meget 15 modstandsdygtigt mod slid ved formaling og er derfor velegnet til anvendelse i tankreaktorer med omrøring. I modsætning til den ovennævnte kendte proces i EP-A1 0 206 687 tilsættes polyazetidin polymeren til opløsningen eller dispersionen før afvanding, hvorved den vanskelige blanding i pastaagtig 20 tilstand undgås. Mængden af krydsbindingsmiddel til fremstilling af partikler med høj fysisk styrke kan formindskes i forhold til EP-A1 206 687, fordi blandingen er mere effektiv.

Selv om polyazetidin tilsættes før afvanding, går der meget lidt polyazetidin tabt under afvanding, da den bindes næsten 25 kvantitativt til det flokkulerede materiale.

Biologiske materialer, som immobiliseres ved metoden ifølge opfindelsen, er enzymer, cellemasse (hele eller nedbrudte celler, levedygtige eller ikke-levedygtige) , antistoffer og co-enzymer. Materialet anvendes som en vandig opløsning 30 eller dispersion, som kan være oprenset som ønsket ved kendte teknikker. Oprensningsgraden er ikke afgørende for udøvelsen af opfindelsen, men påvirker egenskaberne ved det immobiliserede produkt.

Det har vist sig, at den mængde vand, der er til stede 35 i reaktionsblandingen, ikke er afgørende. Overskydende vand bliver fjernet under afvandingen uden noget væsentligt tab af aktivt materiale. Vand kan således tilsættes for at opnå en 4

DK 160843 B

hensigtsmæssig konsistens. Det biologiske materiale tilsættes hensigtsmæssigt i form af en vandig dispersion eller opløsning.

Polyazetidin polymeren, der anvendes ved udøvelse af denne opfindelse, kan være en vilkårlig vandopløselig polymer 5 med et væsentligt indhold af reaktive azetidin-ringe, f.eks. fremstillet ved at lade et polyamid reagere med epichlorhydrin ifølge tysk patentskrift DE-fremlæggelsesskrift nr. 1,177,824. Eksempler på kommercielt tilgængelige produkter er Polycup 2002, Kymene 557H og Reten 304 (disse er alle varemærker fra 10 Hercules, Inc., U.S.A.).

Mængden af polyazetidin kan anvendes til at justere egenskaberne ved det immobiliserede produkt. En høj mængde giver således almindeligvis fysisk stærke partikler, hvorimod en lav mængde giver partikler med lav diffusionsmodstand og 15 derfor høj aktivitet. En passende mængde vil sædvanligvis være i området fra ca. 0,1 til ca. 10% (herefter angives procenter i forhold til vægt af tørstof i det biologiske materiale), typisk ca. 0,5 - ca. 5%, f.eks. ca. 0,5 - ca. 0,3%.

pH er i hele processen sædvanligvis omkring neutral, 20 for det meste mellem ca. 5 og ca. 9. Højere eller lavere pH kan være foretrukket afhængig af enzymstabilitet. En buffer kan tilsættes for at fastholde pH under reaktionen.

Om ønsket kan glutaraldehyd anvendes som krydsbindings-middel udover polyazetidin. Mængden af glutaraldehyd kan være 25 op til omkring 40% (i forhold til tørstof som ovenfor), typisk under ca. 15%. Hvis glutaraldehyd anvendes, foretrækkes det at lade blandingen af biologisk materiale og glutaraldehyd henstå for at lade krydsbinding foregå f.eks. i ca. 5 minutter - ca.

1 time enten før eller efter tilsætning af polyazetidin. Om 30 ønsket kan krydsbindingshjælpemidler indeholdende grupper, der reagerer med polyazetidin, såsom -HN2-grupper (f.eks. polyethy-lenimin, chitosan, albumen eller gelatine) eller -COOH-grupper (f.eks. carboxy-methyl cellulose) tilsættes til reaktionsblandingen. Hvis der anvendes glutaraldehyd, bør et eventuelt 35 middel indeholdende -NH2 fortrinsvis tilsættes før glutar-aldehydet. Disse kan tilsættes f.eks. for at øge den fysiske styrke eller for at justere konsistensen af filterkagen, så den 5

DK 160843 B

bliver nem at håndtere. I nogen tilfælde kan det også være ønskeligt at tilsætte disse for at fortynde aktiviteten af det immobiliserede materiale, f.eks. i tilfælde af penicillin acylase. Mængden af hjælpemiddel kan være op til 100% af 5 tørstoffet. Foretrukne mængder er for polyethylenimin op til 20%, for albumen eller gelatine op til 50%, og for carboxy-methyl cellulose op til 10%.

Temperaturen under blanding (og henstand, hvis det anvendes) er sædvanligvis i området 0-60*C. En temperatur nær 10 omgivelsernes er ofte bekvem, men lavere temperatur kan være nødvendig af hensyn til enzym-ustabilitet.

Det kan være nødvendigt at tilsætte et sædvanligt flokkuleringsmiddel før afvanding for at få tilfredsstillende flokkulering. Behovet herfor såvel som egnet type og mængde af 15 flokkuleringsmiddel bestemmes nemt af en fagmand.

Polyazetidin kan optræde som et kationisk flokkuleringsmiddel, foruden at optræde som et krydsbindingsmiddel.

For negativt ladede materialer kan et separat flokkuleringsmiddel således udelades, hvis tilstrækkelig polyazetidin 20 tilsættes.

Afvandingstrinnet i opfindelsen har til hensigt at fjerne overskydende vand efter flokkulering og derved danne en pastaagtig måsse. Det gøres bekvemt ved filtrering eller centrifugering.

25 Opdelingen ifølge opfindelsen gøres før tørring, da konsistensen af den pastaagtige masse på dette trin vil gøre det let at danne enkelte partikler af kontrolleret størrelse.

En foretrukken teknik er ekstrusion. Om ønsket kan de ekstruderede partikler afrundes (spheroniseres) før eller efter 30 tørring, f.eks. ved teknikken med "Marumerizer” som beskrives i britisk patentskrift nr. 1,362,265.

Tørringstrinnet i opfindelsen tjener til at fjerne vand og til at fremme krydsbindingsreaktionen, således at der opnås et fysisk stærkt produkt. Foretrukne teknikker er tørring i 35 luft eller et fluidiseret leje, sædvanligvis ved 15-806C. I tilfælde af meget følsomme, biologiske materialer kan tørring ved lav temperatur eller frysetørring være nødvendig.

6

DK 160843 B

Det immobiliserede produkt tørres fortrinsvis til et vandindhold på under 25% (vægt/vægt). Med et vandindhold i det færdige produkt på over 25% kan produktets mikrobielle stabilitet være utilfredsstillende. Med vandindhold på over 25% er det 5 desuden muligt, at krydsbindingen med polyazetidin prepolymeren ikke er foregået eller ikke er fuldstændig. Partiklerne kan være tilbøjelige til at klumpe sammen med tiden under lagring. Tørring til et vandindhold på under ca. 10% kan inaktivere det biologiske materiale.

10 Processen ifølge opfindelsen fører til et immobiliseret produkt af høj fysisk styrke og følgeligt lavt trykfald, når det anvendes i et fast leje. Den praktiske virkning illustreres af, at et immobiliseret produkt fremstillet ifølge opfindelsen (penicillin acylase afledt fra Fusarium) med et trykfald på 2-15 4 (målt som i eksempel 1) kan anvendes i en søjlereaktor med fast leje med en højde på 1 meter og en diameter på 1 meter med en opholdstid på 1 minut. Trykfaldet over lejet forbliver næsten konstant i over 6 måneder. Et tilsvarende produkt ifølge kendt teknik med et trykfald på over 10 er ikke i stand til at 20 klare disse betingelser.

Den høje fysiske styrke af et produkt, der er immobiliseret ifølge opfindelsen resulterer også i et lavt formalingstab, som det ses i de efterfølgende eksempler. Produkter med lavt formalingstab er væsentligt mere stabile i en kontinuert 25 tank reaktor med omrøring. Med penicillin acylase immobiliseret ifølge opfindelsen kan praktiske levetider på mere end 4 måneder i 4 m3 reaktorsystemer forventes med aktivitetstab, som ikke overstiger 50%.

Processen ifølge opfindelsen er bredt anvendelig til 30 immobilisering af enzymer, cellemasse, co-enzymer og antistoffer (monoklonale eller polyklonale).

Enzymer kan immobiliseres i form af enzymatisk aktive celler, af helt eller delvis homogeniseret cellepasta eller som en stort set cellefri enzymopløsning. Nogle eksempler, hvor 35 metoden ifølge opfindelsen er særligt fordelagtig, er som følger: 7

DK 160843 B

glucose isomerase fra Streptomvces sp. . f.eks. fra følgende arter: S. murinus 5 (EP-A1 0 194 760) S. flavovirens S. achromogenus S. echinatus 10 S. wedmorensis S. albus (US patent nr. 3,616,221) S. olivochromogenes 15 S. venezuelae (US patent nr. 3,622,463) S. griseoflavus (US patent nr. 4,351,903) 20 S. glaucescens (US patent nr. 4,137,126) S. olivaceus 25 (US patent nr. 3,625,828) S. galbus S. gracilis S. matensis 30 S. niveus S. platensis (ungarsk patent nr. 12,415) S. violaceoniger 35 (tysk patent nr. 2,417,642) S. acidodurans (US patent nr. 4,399,222) 40 S. phaechromogenes S. fradiae S. roseochromogenes S. olivaceus S. californicus 45 S. vanaceus S. virginiae (japansk patentskrift nr. 69-28,473) glucose isomerase fra Bacillus coaqulans. (se US patent nr.

50 3,979,261)

DK 160843B

8 glucose isomerase fra Actinoplanes sp., især A. missou-riensis glucose amylase fra Aspergillus sp.. især fra sorte Aspergiller og specielt fra A. nicer (se US patent nr.

5 3,677,902) eller fra Rhizoous sp.. især Rh. delemar eller

Rh. niveus penicillin-V acylase fra Fusarium sp. . især F. anquioides.

F. araiilaceum. F. avenaceum. F. bulbigenum. F. coeruleum.

F. culmorum f F. equiseti. F. later it ium. F. minimum. F.

10 monoliforme. F. oxysporum, F. sambueinum. F. semisectum. F. solani og F. sulphureum (se GB patent nr. 891,173). penicillin acylase fra Eschericia coli. Proteus retteeri. Kluwera citrophila. Bacillus sphaericus. Bovista plumbea eller Bacillus megaterium.

15 - lactase fra Kluweromvces sp.. især fra K. fragilis eller K. lactis.

cyanid hydratase ifølge dansk patentansøgning nr. 87/1983. nitrilase, nitril hydratase eller amidase, især fra Rhodococcus sp.. Pseudomonas sp. eller Brevibacterium sp.

20 Se US patent nr. 4,001,081, EP-A1 0 093 782 og EP-A1 0 188 316.

Cellemasse, der skal immobiliseres ved processen ifølge opfindelsen, kan være i form af levedygtige eller ikkelevedyg-25 tige hele celler såvel som homogeniseret cellepasta. Cellerne er fortrinsvis af mikrobiel eller planteoprindelse. Nogle foretrukne eksempler er som følger:

Levedygtige celler til brug i biologisk omdannelse, f.eks.

30 gær til ethanol gæring.

Celler med enzymaktivitet, f.eks. svampemycelium indeholdende cyanid hydratase, se EP-A1 0 061 249 og EP-A1 0 116 423.

Cellemasse til brug ved fjernelse af f.eks. tungmetaller 35 ved adsorption, se EP-A1 0 181 497, US patent nr.

4,320,093, US patent nr. 4,298,334, US patent nr. 4,293,333 og JP-A 49-104,454.

9

DK 160843 B

Opfindelsen illustreres nærmere i de følgende eksempler.

5 EKSEMPEL 1

Celler indeholdende glucose isomerase blev fremstillet ved gæring af Streptomyces murinus. stamme DSM 3253, 10 ifølge EP-A1 0 194 760.

Cellerne blev høstet ved centrifugering af kulturvæske. Cellestammen havde et tørstofindhold på 7,7%.

Den generelle immobiliseringsmetode var som følger:

Til 300 g celleslam blev tilsat 300 g afioniseret vand 15 indeholdende 1,5% MgS04,7H20. pH blev indstillet til 7,5. Den angivne mængde polyethylenimin (Sedipur produkt fra BASF, Vesttyskland) blev tilført, og efter at være blevet grundigt blandet blev blandingen krydsbundet ved tilsætning af 15% aktiv glutaraldehyd i forhold til tørstof af celleslam plus polyet-20 hylenimin. Efter 1 time blev polyazetidin (Polycup 2002) tilsat og grundigt blandet med den krydsbundne celleopslemning.

Blandingen blev dernæst flokkuleret ved tilsætning af et kationisk flokkuleringsmiddel, Superfloc C521 (Cyanamid Int.). Det krydsbundne enzym blev udvundet ved filtrering og 25 lavet til partikler ved ekstrudering gennem en 0,8 mm sold og tørret ved stuetemperatur.

Glucose isomerase aktiviteten blev målt ved Novo Analyse Metode F-855310 (kan fås ved henvendelse til Novo Industri A/S, Danmark) og den fysiske stabilitet blev bestemt som 30 trykfald over en søjle.

Trykfaldet blev målt over en søjle med en diameter på 24 mm og en højde på enzymlejet på 4 cm (5 g enzym). Opløsningen, 45% glucose i demineraliseret vand med 1 g MgS04/l, blev pumpet gennem søjlen med en hastighed på 40 g/min ved 60°C.

35 Trykfaldet (i mm væskesøjle) beskriver den fysiske stabilitet af enzympartiklerne, d.v.s. et lavt trykfald svarer til en god fysisk stabilitet.

10

DK 160843 B

Resultaterne er vist i nedenstående tabel.

5 Glucose isomerase Trykfald aktivitet (μΐϋοΐ/min/g) (mm) 0% poly- 10 azetidin 614 400 5% poly- ethylen- 2,5% poly- imin azetidin 667 99 15 5% polyazetidin 586 57 0% poly- azetidin 692 105 20 10% poly- ethylen- 2,5% poly- imine azetidin 578 11 5% poly- 25 azetidin 506 10

Præparater med trykfald, som overstiger ca. 20 mm væskesøjle, anses for uegnede til industrielle glucose isome-30 rase søjler, og polyazetidin er således afgørende for at fremstille et industrielt anvendeligt enzym i dette eksempel. Aktiviteten aftager svagt med stigende koncentration af polyazetidin.

Dette eksempel viser klart den forbedring af fysisk 35 stabilitet af de immobiliserede præparater, som opnås med polyazetidin.

EKSEMPEL 2 40

Et forsøg svarende til det, der er beskrevet i eksempel 1, blev udført med en højere ydende stamme afledt fra DSM 3253.

Tørstofindholdet af celleslammen var 5,3%, og cellerne var delvis nedbrudt ved homogenisering. I øvrigt blev immo-45 biliseringen udført som beskrevet i eksempel 1.

11

DK 160843 B

Resultaterne er angivet i nedenstående tabel:

Glucose isomerase Trykfald 5 aktivitet (μίηοΐ/min/g) (mm) 0% poly- azetidin 556 16 10 5% poly- ethylen- 1% poly- imin azetidin 855 13 2,5% poly- 15 azetidin 830 13 5% poly- azetidin 707 8 20 0% poly- azetidin 651 12 10% poly- ethylen- 1% poly- imin azetidin 975 10 25 2,5% poly- azetidin 911 5 5% poly- 30 azetidin 853 3

Fra disse forsøg kan det konkluderes, at polyazetidin forbedrer den fysiske stabilitet også af præparater, som i 35 forvejen fysisk er meget stabile.

EKSEMPEL 3 40 Bacillus coaaulans indeholdende glucose isomerase blev immobiliseret med og uden polyazetidin.

Homogeniseret cellepasta fra B. coaaulans fremstillet ifølge US patent nr. 3,979,261 blev suspenderet i 0,1% MgS04 til en tørstofkoncentration på 3% i den færdige suspension.

45 Glutaraldehyd blev tilsat til en koncentration på 0,5% i den færdige blanding. Efter 60 minutters blanding ved stuetempera 12

DK 160843 B

tur blev polyazetidin (Polycup® 2002) tilsat, efterfulgt af flokkulering med Superfloc C521. Det krydsbundne enzym blev udvundet ved filtrering, formet til partikler ved ekstrudering og tørret ved stuetemperatur.

5 Aktivitet og trykfald blev målt som beskrevet i eksempel 1. Modstandsdygtighed mod formaling blev målt som turbiditet (OD-værdi) ved 600 nm efter 1 times kraftig omrøring af 0,5 g enzym i 20 ml 50 mM fosfat ved pH 7 med en omrører. Før målingen var enzymet blevet opblødt og vasket i 6% 10 NaCl i 50 mM fosfat, pH 7,0.

Mængde af polyazetidin (% tørstof) 0 13

Aktivitet (Amol/min/g) 540 506 493

Trykfald (mm væskesøjle) 5 32 15 Formaling 0,111 0,068 0,062'

Modstandsdygtighed mod formaling og fysisk stabilitet blev forbedret ved tilsætning af polyazetidin, mens der kun observeredes et lille aktivitetstab.

20 EKSEMPEL 4

Amyloglucosidase fra Aspergillus nicer er valgt som et eksempel på immobilisering af et enzym og ikke en cellemasse.

25 Dette enzym er ekstracellulært.

Et kommercielt præparat AMG 400 L HP (Novo Industri A/S, Danmark) blev dialyseret mod 50 mM fosfat ved pH 7,0. Præparatet blev fortyndet til en tørstofkoncentration på 2%, og en tilsvarende mængde albumen fra æg blev tilsat. Glutar- 30 aldehyd blev tilsat til en koncentration på 0,6% w/v. Efter 1 . . · times omrøring blev polyazetidin (Polycup ) tilsat til den angivne slutkoncentration på 0,08% w/v, og blandingen blev flokkuleret med Filtrafloc (Servo B.v., Holland). Enzymet blev udvundet som beskrevet i de foregående eksempler.

35 Aktiviteten blev målt som beskrevet i Novo Analyse

Metode AF159/2. Trykfaldet blev målt som beskrevet i eksempel 13

DK 160843 B

1, men ved 35eC og med 11 vægtprocent glucose i 50 mM fosfat ved pH 7,5.

Polyazetidin (% w/v) 0 0,08

Aktivitet (/imol/min/g) 1 196 160 5 Trykfald (mm væskesøjle) 9 6 * Partikel fraktion: 425-710 μτα 10 EKSEMPEL 5

Cellepasta af Fusarium sp. indeholdende penicillin acylase aktivitet (fremstillet ifølge britisk patentskrift GB nr. 891,175), som var blevet grundigt vasket med 0,9% NaCl, 15 blev suspenderet i 50 mM fosfat ved pH 7,0 til en slutkon-centration af tørstof på 3%. Polyethylenimin (Sedipur) blev tilsat til et slutindhold af tørstof på 0,1%. Glutaraldehyd blev tilsat til en slutkoncentration på 0,2% w/v. Efter 1 times grundig blanding blev polyazetidin tilsat, og til slut blev 20 blandingen flokkuleret med et kationisk flokkuleringsmiddel, Filtrafloc. Det krydsbundne enzym blev udvundet ved filtrering, formet til partikler ved ekstrudering gennem en 0,6 mm sold og tørret ved stuetemperatur.

Enzymaktiviteten blev bestemt ved Novo Analyse AF186, 25 og den fysiske stabilitet bestemt som trykfald (eksempel 3) og modstandsdygtighed mod formaling (eksempel 3).

Polyazetidin Intet Polycup® 2002 Kymene®

30 type 557H

Polyazetidin (%) 0 1 3 1

Aktivitet1 (PUV/g) 72 57 42 35

Trykfald 35 (mm væskesøjle) 643 2

Formaling 0,563 0,305 0,140 0,103 450-710 μιη fraktion

DK 160843B

14

Som det kan ses af tabellen, forøger polyazetidin den fysiske stabilitet, d.v.s. den giver forøget modstandsdygtighed mod formaling og giver kraftigt forbedret trykstabilitet. Dette opnås imidlertid på bekostning af et aktivitetstab, som delvis 5 skyldes diffusionshæmning, hvilket igen menes at skyldes et mere tæt præparat, når polyazetidin er til stede.

EKSEMPEL 6 10

Fusarium so. blev immobiliseret som beskrevet i . . ® eksempel 5, men ved forskellige pH-værdier og med 1% Kymene 557H i alle præparater.

Resultaterne ses i nedenstående tabel: 15 pH 6 7 8

Aktivitet (PVU/g) 33,3 36,1 41,5

Trykfald (mm væskesøjle) 233 Formaling 0,171 0,154 0,188 20

Den fysiske stabilitet er god og uafhængig af pH i det afprøvede område (6-8).

25 EKSEMPEL 7

Betydningen af tidspunktet for polyazetidin tilsætning blev undersøgt med cellepasta af Fusarium so. Immobiliseringen blev udført som forklaret i eksempel 5, men uden PEI og med φ.

30 tilsætning af polyazetidin (Polycup 2002) til en slutkon-centration på 0,3% enten før eller efter tilsætning af glu-taraldehyd.

15

DK 160843 B

Tidspunkt for Ikke Før Efter polyazetidin- tilsat glutar- glutar- 5 tilsætning aldehyde aldehyde

Aktivitet (PVU/g) 58 32 31

Trykfald (mm væskesøjle) 27 6 4 10

Den fysiske stabilitet forøges, både når polyazetidin tilsættes før og efter glutaraldehyd.

15 EKSEMPEL 8

Effekten af glutaraldehyd i kombination med polyazetidin er blevet afprøvet. Fusarium sp. blev immobiliseret som beskrevet i eksempel 5, men med udeladelse af nogle komponen-20 ter. Resultaterne vises i tabellen:

Kymene® PEI Glutar- Tilsætn. Akti- Trykfald Modstands-aldehyde af Fil- vitet dygtighed 25 trafloc (mm væske- mod for- (%) (%) (%) (PVU/g) søjle) maling 130 + 40,9 10 0,181 130 - 45,3 5 0,118 30 3 3 0 + 39,6 8 0,095 10 3 0 + 39,9 8 0,091 300 + 37,2 7 0,088 137 + 35,6 2 0,153 35

Resultaterne viser, at glutaraldehyd forøger den fysiske stabilitet, især modstandsdygtigheden mod tryk. Acceptable præparater kan imidlertid laves uden glutaraldehyd, PEI eller flokkuleringsmiddel, 40 16

DK 160843 B

EKSEMPEL 9

Celleslam af Rhodococcus ervthropolls med evne til at hydrolysere nitril (fremstillet ifølge EP-A1 188,316) blev 5 fortyndet til 2% tørstof med vand. 10% polyethylenimin (Sedi-pur) (baseret på tørstof af celleslam) blev tilsat, og pH blev indstillet til 7,0. Blandingen blev krydsbundet ved tilsætning af 5% aktiv glutaraldehyd (baseret på tørstof i celleslam plus polyethylenimin). Efter 1 time blev 2% polyazetidin (Kymene) 10 (baseret på totalt tørstof) tilsat.

Blandingen blev så tilsat et anionisk flokkulerings-middel, Super floe A 130. Det krydsbundne enzym blev så udvundet ved filtrering, formet til partikler ved ekstrudering gennem en 0,8 mm sold og tørret ved stuetemperatur.

15 Til sammenligning blev den samme celleslam krydsbundet uden polyazetidin, men i øvrigt på samme måde som ovenfor.

Til yderligere sammenligning blev den samme celleslam immobiliseret ved en kendt metode, nemlig indeslutning i polyacrylamid gel ifølge US patent nr. 4,248,968. Nærmere 20 angivet blev celleslammet fortyndet til 12,5% tørstof og immobiliseret som beskrevet i eksempel 12 i det angivne patentskrift. Endelig blev gelet siet med en si med 1 mm masker og vasket med saltvand, indtil supernatanten blev klar.

Trykfaldet blev målt ved følgende betingelser: 25 11% glucose sirup

Gennemstrømningshastighed: 40 g/min Temperatur: 3 5e C

Trykfaldet blev målt efter 25 timer.

5 g immobiliseret enzym (tørstof) blev tilsat til 30 måling af trykfaldet.

Resultater (trykfald i g/cm2):

Opfindelsen:

Krydsbinding med polyazetidin 13

Reference: 35 Krydsbinding uden polyazetidin 200

Gel indeslutning 200

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et partikelformet, immobiliseret produkt, indeholdende et enzym, en cellemasse, et co-enzym eller et antistof, fremstillet ved krydsbinding med polyazetidin, kendetegnet ved, at den angår følgende trin i den angivne rækkefølge: Blanding af det pågældende biologiske 10 materiale med polyazetidin i vandfase, flokkulering af den fremkomne blanding, afvanding af det flokkulerede produkt, opdeling af det afvandede produkt og til sidst tørring af det opdelte materiale til frembringelse af et partikelformet immobiliseret produkt. 15

2. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendetegnet ved, at mængden af polyazetidin er fra ca. 0,1 til ca. 10 vægtprocent af tørstof i det biologiske materiale, fortrinsvis fra ca. 0,5 til ca. 5 vægtprocent. 20

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at vandfasen indeholdende polyazetidin og biologisk materiale yderligere indeholder glutaraldehyd, før afvandingen foretages, og kendetegnet ved, at mængden af glutaraldehyd fortrinsvis er 25 under ca. 40% af tørstof i det biologiske materiale, mest fortrinsvis under ca. 15%.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at glutaraldehydet blandes med det biologiske materiale i vand- 30 fase, og blandingen af glutaraldehyd/biologisk materiale henstår før tilsætningen af polyazetidin.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at glutaraldehyd og polyazetidin blandes i vandfase med det biolo- 35 giske materiale, hvorefter blandingen af glutaraldehyd, polyazetidin og biologisk materiale henstår før afvandingen heraf. DK 160843 B

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1 - 5, kendetegnet ved yderligere tilsætning (fortrinsvis under ca. 100% af tørstof) af polyethylenimin (mest fortrinsvis under ca. 10%), albumen (mest fortrinsvis under ca. 50%), gelatine (mest fortrinsvis 5 under ca. 50%) eller carboxymethyl cellulose (mest fortrinsvis under ca. 10%) før afvanding (idet alle procenter er efter vægt i forhold til tørstof i det biologiske materiale).

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1-6, kendetegnet ved, at 10 det biologiske materiale tilsættes i form af en vandig dispersion eller opløsning.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1-7, kendetegnet ved, at det biologiske materiale omfatter hele celler eller cellemasse 15 fra helt eller delvis nedbrudte celler, fortrinsvis af plante- eller mikrobiel oprindelse.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1-8, kendetegnet ved, at det biologiske materiale omfatter et enzym, fortrinsvis glucose 20 isomerase, penicillin acylase eller nitrilase.

10. Anvendelse af det immobiliserede enzym fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 9 i en enzym-katalyseret proces. 25