JPH01503677A - 固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 固定化方法 本発明は、ポリアゼチジンを用いた架橋方法により生物学的材料を固定化する方 法に関する。

発明の背景 固定化すれり生物学的に活性な材料の分野は、約２０年前に夙わされており、そ れ以来多数の刊行物が、固定化技術及び固定化生成物の使用に関し見い出されて いる。このような研究は、酵素、細胞、抗体及び補酵素の固定化にわたっている 。

固定化生成物のいくつかの使用は、大型の工業的プラントにおけるグルコースイ ソメラーゼの使用から精製の目的に対し固定化された抗体の使用に至るまで、上 記期間にわたって商品化されてきている。

当業者において知られている多くの固定化方法のうちで、１つのグループに属す る方法は、架橋方法として知られ、これは例えばに、モスバッハにより、（Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）（４４（１９７６））において記載 されている。架橋は、材料をビーもしくはポリ官能性架橋材と反応させることに より生起する。

グルタルアルデヒドが酵素に対しく例えば、ＤＫ１４３５６９）及び微生物細胞 に対しく例えば、米国特許３，７７９，８６９参照）架橋材として用いられて来 ている。今までのところでは、グルタルアルデヒドは理想的な架橋材ではない。

何故なら、このグルタルアルデヒドは−ＮＨ，及び−ＳＨ基とのみしか反応しな いからである。多くの酵素及び細胞は、これらの基の含量が少ないためグルタル アルデヒドとの反応性は乏しい。

ポリアゼチジンポリマーは、ヨーロッパ特許出願ＥＰ０２０６６８７に記載され ているように架橋の目的に対し好都合に用いられる。ポリアゼチジンポリマー架 橋系はグルタルアルデヒドよりも固体化に対し適用範囲がより広い。何故ならば 酸系は−ＣＯＯＨ、−ＯＨ及び−Ｎ）Ｉ基、並びニーＮＨ，及び−ＳＨ基と反応 するからである。

しかしヨーロッパ特許出願０２０６６８７に記載された固定化方法は以下の点で 理想的ではないニ ーポリアゼチジンポリマーとの混合時において、細胞集団のペースト状のコンシ スチンシーのため、混合プロセスが困難である。

一架橋材の量は、相当に大きく、一般にポリアゼチジンの５〜３０％及びグルタ ルアルデヒドの５〜４０％であり、さらに好ましくは各々の１０〜２０％（細胞 スラッジの乾燥分のパーセント）である０本発明者は、混合時のペースト状コン シスチンシーによるポリアゼチジンとの混合が劣っているため多量必要となると 考える。

−得られた粒子は、拡散が高度に制限されており極めて密である。おそら（これ は多量の架橋材のためだと考えられる。

ポリアゼチジンを用いた固定化はまた、Ｇ、Ｊ、カルトン等により、Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ、　４巻３１７〜３２０ページ（１９８６）において、米国特 許４，４３６，８１３において、ウッド等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　 １９８４年１２月　１０８１〜１９８４ページ、及びヨーロッパ特許公報ＥＰ　 Ｏ０８９１６５において開示されている。しかし、これらは純粋な架橋方法では なく、そのかわり担体に活性細胞を付着することを含む。担体結合固定化は、多 くの場合に好ましくない。何故なら担体の使用は、活性を希釈し、これは低活性 の生成物をもたらし、さらに高価な担体物質がしばしば要求されるからである。

発明の目的 本発明の目的は、ポリアゼチジンを用いて架橋させることにより、高活性及び高 い物理的強度を有する固定化された生物学的材料を調製するため用いることの出 来る方法を提供することにより、上記の困難性を克復するためあるいは少くとも 緩和することにある。

発明の説明 本発明は、ポリアゼチジンを用いた架橋により生物学的材料を固定化する方法を 提供するものであり、この方法は、生物学的材料をポリアゼチジンと水溶性的に 混合する工程、得られた混合物を凝集する工程、凝集した生成物を脱水する工程 、脱水した生成物を細分する工程ついで粒子系の固定化生成物をうるため細分し た材料を硬化する連続工程を含んでなる。この方法において、架橋反応は主に最 終硬化中で生起する。

本発明方法によって得られた粒子系の固定化生成物は、それが低い圧力下降を示 す、充填カラムにおいて使用する場合充分に適合する。また本発明による固定化 生成物は、粉砕中摩損に対し極めて抵抗性を有し、従って撹拌されたタンク反応 器内で使用するのに良好に適合する。

ヨーロッパ特許０２０６６８７の上記従来プロセスと比較して、ポリアゼチジン ポリマーは、脱水する前に溶液または懸濁液に添加され、これによりペースト状 態における困難な混合を避けることが出来る。架橋材の量は、混合がより有効で あるためヨーロッパ特許０２０６６８７に比較して減少出来る。ポリアゼチジン は、脱水する前に添加されるけれども、それが凝集された材料とほとんど定量的 に結合しているのでポリアゼチジンの損失はほとんど無い。

発明の詳細な説明 本発明方法によって固定化されうる生物学的材料には酵素、細胞集団（無傷のま たは破壊した細胞、生存もしくは非生存）、抗体及び補酵素が含まれる。これら の材料は、必要により通常の技術を用い精製することの出来る水溶液または分散 液として使用される。精製の程度は、本発明の実施には重要でないが、固定化さ れた製品の特性には影響する。

反応混合物中に存在する水の量は、重要でないことが見い出された。過剰の水は 、活性材料の重大な損失を伴うことなく脱水中に除去されうる。従って水は、好 都合のコンシスチンシーをうるために添加される。好都合には、生物学的材料は 水溶性の分散液または溶液の形態で添加される。

本発明の実施に対し使用されるポリアゼチジンポリマーは、例えばドイツ特許公 報ＤＴ−ＭＳ−１，１７７，８２４に従いポリアミドとイビクロロヒドリンとを 反応させることによって得られるような、実質的な含量の反応性アゼチジン環を 有する水溶性ポリマーであってよい。商業的に入手可能な生成物の例は、ポリカ ップ（Ｐｏｌｙｃｕｐ）２００２　、キメン（Ｋｙｍｅｎｅ）　５５７Ｈ及びレ チン（Ｒｅ　ｔｅｎ）　３０４である　（これらは全てパーキュレス社、米国の 商標である）。

ポリアゼチジンの量は、固定化生成物の特性を制御するため用いられる。従って 、高い量は、一般に物理的に強い粒子を生成し、一方低い量は、低拡散制限従っ て高い活性を有する粒子を与える。適当な量は、通常約０．１〜約１０％（以下 、パーセントは生物学的材料における乾燥分の重量パーセントである）の範囲内 にあり、典型的には約０．５〜約５％、例えば約０．５〜約３％の範囲内にある 。

プロセス全体にわたってのｐＨは一般に中性付近であり、大抵は約５〜約９の間 である。酵素の安定性に応じて、より高いかまたはより低いｐＨが好ましい。反 応中ｐＨを安定化させるため緩衝剤を含ましめることも出来る。

所望により、グルタルアルデヒドがポリアゼチジンに加えて架橋剤として使用出 来る。グルタルアルデヒドの量は、約４０％（上述のように乾燥分の）まで、典 型的には約１５％未満である。もしグルタルアルデヒドを用いる場合、ポリアゼ チジンの添加前あるいは添加後のいずれかにおいて、生物学的材料及びグルタル アルデヒドの混合物を、例えば約５分〜約１時間保持して架橋反応を生起せしめ るのが好ましい。

所望により、ポリアゼチジンと反応する基、例えば−ＮＨ２基（例えば、ポリエ チレンイミン、チトサン、卵白またはゼラチン）、または−ＣＯＯＨ基（例えば 、カルボキシメチルセルロース）を含有する補助的架橋材が反応混合物に添加さ れる。

もしもグルタルアルデヒドを用いると、−ＮＨ２含有試剤は、グルタルアルデヒ ドより先に添加されるべきである。これらは、例えば物理的強度を増加するため 、取り扱いを容易にするためフィルターケークのコンシスチンシーを調節するた め用いることが出来る。また、ある場合には、例えばペニシリンアシラーゼの場 合には固定化材料の活性を希釈するためこれらを含有することが望ましい。補助 剤の量は、乾燥分の１００％までである。好ましい量は、ポリエチレンイミンに 対しては２０％まで、卵白またはゼラチンに対しては５０％まで、さらにカルボ キシメチルセルロースに対しては１０％までである。

混合（さらにもし用いた場合保持）中の温度は、一般に０゜〜６０’Ｃの範囲内 である。室温近くの温度はしばしば好都合であるが、より低い温度が酵素の不安 定性のため必要とされる。

満足な凝集をうるため脱水する前に通常の凝集剤を添加することが必要である。

これに対する要求物並びに凝集剤の適当な型及び量は、当業者により容易に決定 される。

チオン性凝集剤として作用しうる。従って、負に帯電した材料に対し、もし充分 なポリアゼチジンを添加する場合別の凝集剤は省略出来る。

本発明の脱水工程は、凝集後の過剰の水を除去することを意図しており、これに よりペースト状の固まりが得られる。

好都合には濾過または濃縮によりこれはなされる。

本発明にかかる細分は、硬化される前になされる。何故なら、この工程でのペー スト状の固まりのコンシスチンシーは、制御された大きさの個々の粒子に容易に 形成しうるからである。好ましい技術は押出し法である。所望により、押し出さ れた粒子は硬化前または硬化後、例えば英国特許明細書ＧＢ１、．３６２，２６ ５に記載された「マルメライザー」技術により、丸みをつけられる（球面化され る）。

本発明の硬化工程は、水を除去するためさらに架橋反応を進行させるため存効で あり、その結果物理的に強い製品が得られる。好ましい技術は、一般に１５〜８ ０“Ｃでの空気乾燥または流動床乾燥である。非常に怒受性のある生物的材料の 場合には、低温度の乾燥または凍結乾燥が必要とされる。

好ましくは、固定化生成物は水分含量約２５％１へ未満の水分含量に乾燥される 。約２５％を超える最大水分含量では、生成品の微生物安定性は不満足である。

さらに、約２５％を超える水分含量では、ポリアゼチジンプレポリマーによる架 橋は、おこらないかまたは完全ではない；粒子は保存中に凝集する傾向にある。

約１０％未満の水分含量に乾燥することは、生物学的材料を不活性化する。

本発明のプロセスは、高い物理的強度、従って充填床に用いた場合比較的低い圧 力低下により固定化製品に至る。実際的効果は、以下の事実によって説明される 。すなわち２〜４の圧力硬化数値（例１で測定されるごとく）を伴う本発明にか かる固定化生成物（フサリアム期限のペニシリンアシラーゼ）は、高さ１ｍ及び 直径１ｍの固定床カラム反応器内で、１分の保持時間で使用出来る。床の全体に わたる圧力硬化は、６力月以上でもほとんど一定である。１０を超える圧力硬化 数値を有する同様の従来技術の製造物は、これらの条件に耐えることは出来ない 。

本発明にかかる固定化製品の高い物理的強度はまた、以下の実施例から明らかな ように低い摩砕損失をもたらす。低い摩砕損失を有する製品は、連続的撹拌タン ク反応器において著しくより安定である。本発明にかかる固定化ペニシリンアシ ラーゼを用いると、４ｍ反応器系において４力月以上の実際的耐用年数が、５０ ％以下の活性損失をもって期待出来る。

利用性 本発明方法は、生物学的材料、例えば酵素、細胞集団、補酵素及び抗体（モノク ローナルまたはポリクローナル）の固定化に広く適用出来る。

酵素は、部分的にまたは完全にホモジナイジされた細胞ペーストの酵素的に活性 な細胞の形態で、または広く細胞を含有しない酵素溶液として固定化出来る。本 発明方法が特に好都合であるいくつかの例を以下に掲げるニー例えば次の種由来 のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ。

由来のグルコースイソメラーゼ：Ｓ、ムリナス（ヨーロッパ特許０１９４７６０ ）　、Ｓ、　フラボリレンス、Ｓ、アクロモゲナス、Ｓ、エシナタス、Ｓ、ウェ ドモレンシス、Ｓ、アルプル（米国特許３，６１６，２２１）　、Ｓ、オリボク ロモゲネス、Ｓ、ベネズエレ（米国特許３，６２２，４６３）　、Ｓ、グリセオ フラバス（米国特許４，３５１，９０３）　、Ｓ、グラウセシネス（米国特許４ 、１３７．１２６）、Ｓ、オリバセウス（米国特許３，６２５，８２８）　、Ｓ 。

ガルブス、Ｓ、グラシリス、Ｓ、マテンシス、Ｓ、ニベウス、Ｓ、プラテンシス （ハンガリー特許１２，４１５）、Ｓ、ヴィオラセニガー（ドイツ特許２，４１ ７，６４２）　、Ｓ、アシドトランス（米国特許４，３９９，２２２）　、Ｓ、 フエロクロモゲネス、Ｓ、フラディアエ、Ｓ、ロゼオクロモゲネス、Ｓ、オリバ セウス、Ｓ、カリホニカス、Ｓ、バナセウス、Ｓ、ビルギニエ（日本特許公報６ ９−２８．４７３） 一バシラスコアグユランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ）由来のグ ルコースイソメラーゼ（米国特許３，９７９．２６１参照）。

−アクチノプラネス（八ｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）ｓｐ、　、特にＡ、ミソウリ エンシス（ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）由来のグルコースイソメラーゼ。

−アスペルグルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ｓｐ、、特にブラックアスペルギ リ及びそれに特異的にはＡ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）　（米国特許３．６７７．９ ０２参照）由来、またはリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）ｓｐ、　、特にＲｈ、デ ルマー（ｄｅｌｅｍａｒ）またはＲｈ、ニベウス（ｎｉｖｅｕｓ）由来のグルコ アミラーゼ。

一フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）ｓｐ、　、特にＦ、アングイオイデス（ａｎ ｇｕｉｏｉｄｅｓ）、Ｆ、アルギラセウム（ａｒｇｉｉｌａｃｅｕｍ）　、Ｆ、 アベナセウム（ａｖｅｎａｃｅｕｍ）　、Ｆ　、プルビゲナム（ｂｕｌｂｉｇｅ ｎｕｍ）、Ｆ、コエルレウム（ｃｏｅｒｕｌｅｕｍ）　、Ｆ、　クルモラム（ｃ ｕ　Ｉｍｏｒｕｍ）、Ｆ、エキセチ（ｅｑｕｉｓｅｔｉ）、Ｆ、ラテリティウム （ｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ）、Ｆ、ミニマム（ｍｉｎｉｍｕｍ）　、Ｆ、　モノリ ホルメ（ｍｏｎｏｌｉｆｏｒｍｅ）、Ｆ、オキシスポラム（ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ）　、Ｆ、サムブシナム（ｓａｍｂｕ−ｃｉｎｕｍ）、Ｆ、セミセフタム（ｓｅ ｍｉｓｅｃｔｉｍ）、Ｆ、ソラニ（ｓｏｌａｎｉ）、及びＦ、スルツレラム（ｓ ｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）（ＧＢ　８９１，１７３参照）由来のペニシリン−■アシ ラーゼ。

一エシリシアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ　ｃｏｌｉ）　、プロテウスレテゲリ （Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、クルベラシトフィラ（Ｋｌｕｙｖｅｒ ａ　ｃｉｔｒｏ−ｐｈｉｌａ）、バシラススフエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ ｐｈａｅｒｉｃｕｓ）　、ボビスタブラムへア（Ｂｏν１ｓｔａ　ｐｌｕｍｂｅ ａ）またはバシラスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ） 由来のペニシリンアシラーゼ。

−クルベロマイシス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ、、特にに、フラギリ ス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）もしくはに、ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）由来のラクト ース。

−デンマーク出願ＤＫ　８７／１２８３によるシアニブヒドラターゼ。

−特に、ロドコックス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）　ｓｐ、、フセウドモナス（ Ｐｓｅｕｄｏｎ＋ｏｎａｓ）　ｓｐ、、またはブレビバクテリア（Ｂｒｅｖｉｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ、　（米国特許４，００１，０８１、ヨーロッパ特許０ ０９３７ε２及びヨーロッパ特許０１８８３１６参照）由来のニトリラーゼ、ニ トリルヒドラクーゼまたはアミダーゼ。

本発明による固定化されるべき細胞集団は、生存もしくは非生存の無傷細胞並び にホモゲナイズドした細胞ペーストの形態である。細胞は、好ましくは微生物ま たは食物起源である。好ましい例は次のとおりであるニ ー生物変還において使用される生存細胞、例えばエタノール発酵に対する酵母。

一酵素活性を有する細胞、例えばシアニドヒドラターゼを含有する真菌菌糸体、 ヨーロッパ特許００６１２４９及びヨーロッパ特許０１１６４２３参照。

−例えば重金属の吸着除去において使用される細胞集団、ヨーロッパ特許０　］ 、８１４９７、米国特許４，３２０，０９３、米国特許４．２９８，３３４、米 国特許４，２９３，３３３及び日本特許公開公報４９−１０４、４５４参照。

例　１ グルコースイソメラーゼ含有細胞を、ヨーロッパ特許公開公報ＥＰ　Ｏ１９４， ７６０による、ストレプトマイセスムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｕ ｒｉｎｕｓ）、菌株ＤＳＭ　３２５３の発酵により調製した。

細胞を培養ブロスの遠心分離により集めた。細胞スラッジは、７．０％の乾物含 量を有していた。

全体の固定化手順は次のとおりである：３００ｇの細胞スラッジに１．５％のＭ ｇ５Ｏｎ、７Ｈ２ｏを含有する３００ｇの脱イオン水を添加した。ｐ＋＋を７． ５に調節した。指示された量のポリエチレンイミン（セディブル、ＢＡＳＦ　（ 西ドイツ）の製品）を添加し、ついで完全に混合したのち、混合物を細胞スラッ ジ乾燥物質及びポリエチレンイミン乾燥物質に対し１５％の活性グルタルアルデ ヒドを添加して架橋せしめた。１時間後、ポリアゼチジン（ポリカップＯ２００ ２）を添加しついで架橋細胞懸濁液とともに完全に混合した。

ついで混合物を、カチオン性凝集剤、スーパーフロックＣ５２１（サイナミド社 ）を添加して凝集せしめた。架橋した酵素を、濾過して集め、０．８　ｍｍのス クリーンを押し出しにより通過せしめ粒子を得、ついで室温で乾燥した。

ノボ分析法Ｆ−８５５３１０（要求によりノボ社Ａ／Ｓ、デンマークから入手可 能）並びにカラム全体にわたる圧力降下として測定した物理的強度により測定し た。

圧力降下は、直径２４ｍｍ及び酵素床の高さ４ｃｍ（５ｇの酵素）を有するカラ ム全体について測定した。溶液、１ｇのＭｇ５Ｏａ／　ｌを有する脱イオン水中 の４５％グルコースを、６０゛Ｃで毎分４０ｇの割合でカラムにポンプ挿入した 。圧力降下（液体の胴で表示）は、酵素粒子の物理的安定性を説明し、すなわち 低い圧力降下は良好な物理的安定性に対応する。

結果を次の表に掲げる。

液体約２０ｍｍを超える圧力降下を有する調製品は、工業的グルコースイソメラ ーゼカラムに対し不適当であると考えられ、従ってポリアゼチジンは、この例に おいて工業的に有用な酵素を製造するため必須である。活性は、ポリアゼチジン 濃度の増加とともにわずかに減少する。

この例は明らかに、ポリアゼチジンとともに得られた固定化調製品の物理的安定 性を改善する。

例２ 例１で記載したと同様の実験を、ＤＳＭ　３２５３の高収率子孫を用いて行った 。

細胞スラッジの乾物含量は、５．３％であり、細胞をホモゲニゼーシコンにより 部分的に破壊した。一方、固定化を例１に記載したと同様に行った。

結果を次の表に示す。

これらの実験から明らかなように、ポリアゼチジンは、非常に物理的に安定な製 剤の物理強度を改善することが結論づグルコースイソメラーゼを含量するバシラ スコアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ）を、ポリアゼチジ ンにより、あるいはこれによらないで固定化した。

米国特許３，９７９．２６１に従って調製した。Ｂ、コアギユランス（ｃｏａｇ ｕ　１ａｎｓ）のホモゲナイズド細胞ペーストを、０．１％硫酸マグネシウム中 最終乾燥物質濃度３％に懸濁せしめた。グルタルアルデヒドを、０．５％の最終 濃度に添加した。６０分後室温で混合しながらポリアゼチジン（ポリカップ＠　 ２００２）を添加しついでスーパーフロックＣ５２１を用いて凝集せしめた。

架橋酵素を濾過して回収し、押し出して粒子に形成し、ついで室温で乾燥した。

活性及び圧力降下を例１に記載したと同様に測定した。摩砕に対する抵抗性を、 プロペラ−を用い２０戚の５０ｍＦホスフェ　）（ｐＨ７）中０．５ｇの酵素を １時間激しく撹拌したのち６６０ｎｍで濁り（光学密度）として測定した。分析 する前、酵素を膨潤せしめついで５０ｍＭのホスフェ−）（ｐＨ７，０）中６％ ＮａＣ１に洗浄した。

ポリアゼチジンの量（乾燥物質％）　０　１　３活性（μｍｏｌｅ／ｍｉｎ／　 ｇ）　５４０　５０６　４９３圧力降下（値液体）　５　３　２ 摩砕　０．１１１０．０６８０．０６２摩砕に対する抵抗性及び物理的安定性の 両方を、ポリアゼチジンを添加して改良し、一方わずかな小程度の活性損失が認 められた。

例４ 細胞集団ではなく酵素の固定化の例として、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒ ｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来のアミログロコシラーゼを選んだ。この酵素は 細胞外酵素である。

商品ＡＭＧ　４００　Ｌ　ＨＰ（ノボインダストリーＡ／Ｓ、デンマーク・）を ５０ｍＭのホスフェート（ｐＨ７，０）に対し透析した。商品を乾物濃度２％に 希釈し、ついで同量の卵白を添加した。

グルタルアルデヒドを、０．６％−／Ｖの濃度に添加した。１時間撹拌後、ポリ アゼチジン（ポリカップ０２００２）を、示された最終濃度０．０８％−／Ｖに 添加し、ついで混合物をフィルトラフロック（セルボＢ、Ｖ、オランダ）を用い て凝集せしめた。酵素を先の実施例に記載したように回収した。

活性度を、ノボ分析法ＡＦ１５９／　２に記載したごとく測定した。圧力降下を 、例１で記載したように測定したがただし３５°Ｃでかつ５０ｍＭのホスフェ） （ｐＨ７，５）中１１％Ｗ／Ｖのグルコースを用いた。

ポリアゼチジン、％ｗ／ｖ　０　０．０８活性度（μｍｏｌ／ｍｉｎ／　ｇ）　 ”　１９６　１６０圧力降下（柵液体）９６ 本粒子のフラクション：　４２５−７１０Ｉ！ｍ例５ ０．９％のＮａＣＩ！、ですでに完全に洗浄していた、ペニシリンアシラーゼ活 性を有するフサリアム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）ｓｐ、の細胞ペースト　（英国特許 ＧＢ　８９１，１７３明細書に従って調製）を、５０ｍＭのホスフェート（ｐＨ ７，０）中に懸濁させ最終乾物濃度３％を得た。ポリエチレンイミン（セディプ ル）を、添加し最終乾物濃度０．１％を得た。グルタルアルデヒドを添加し最終 濃度０．２％ｗ　／　ｖとした。１時間完全に混合したのち、ポリアゼチジンを 添加し、ついで最終的に混合物をカチオン性凝集剤、フィルトラフロックを用い て凝集せしめた。架橋酵素を濾過法により回収し、０．６　ｍｍのスクリーンに 押し出して粒子に形成しついで室温で乾燥した。

酵素活性をノボ分析ＡＦ１８６により測定し、物理的安定性を圧力降下（例３） 及び摩砕に対する抵抗性（例３）により測ポリアゼチジン（％）０１３　１ 活性度”（ＰＶｔｌ／ｇ）　７２　５７　４２　３５圧力降下（＋ｎｍ１ｉｑｕ ｉｄ）　６　４　３　２摩砕　０．５６３０．３０５　０．１４０　０．１０３ ＊　４５０−７１０μモ 上記表から明らかなように、ポリアゼチジンは、物理的安定性を増加し、すなわ ち摩砕に対する抵抗性を増加させさらに高度に改良された圧力安定性を与える。

しかし、これは一部拡散制限に起因する活性の損失の犠牲により得られる。これ は再びポリアゼチジンが存在している時さらに緻密な調製品に起因するものと考 えられる。

例６ フサリアム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）ｓｐ、を、例５で記載したように固定化したが 異なるｐＨ値及び１％キメネ＠　５５７Ｈを全ての調製品において用いた。

結果を次の表に示す。

ｐｌ（６７８ 活性度（ＰＶｔｌ／　ｇ　）　３３．３　３６．１　４１．５圧力降下（ＩｎＴ Ｉ＋液体）　２　３　３摩砕　０．１？１　０．１５４　０．１８８物理的安定 性は良好でありかつ試験した範囲内のｐＨ（６〜８）において独立であった。

例７ ポリアゼチジンの添加時間の重要性に関し、フサリアム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）ｓ ｐ、の細胞ペーストを用いて測定した。固定化を例５に記載したと同様に行った が、ただしＰＥＩは用いずさらにグルタルアルデヒドの添加前及び添加後景終濃 度０．３％にポリアゼチジン（ポリカップ６２００２）を添加した。

活性度（ＰＶ［Ｉ／ｇ）　５８　３２　３を圧力降下（胴液体’）　２７　６　 ４ 物理的安定性は、ポリアゼチジンとグルタルアルデヒドより前あるいは後に添加 した場合増加する。

例８ ポリアゼチジンと組み合わせたグルグルアルデヒドの効果を試験した。フサリア ム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）ｓｐ、を、いくつかの成分は用いずに、例５に記載した と同様に固定化した。結果を次の表に示す； １　３　０　４５．３　５　０．１１８３　３　０　＋　３９．６　８　０．０ ９５１０　３　０　＋　３９．９　８　０．０９１３　０　０　、＋　３７．２ 　７　０．０８８１　３　７　＋　３５．６　２　０．１５３結果は、グルタル アルデヒドが物理的安定性、特に圧力に対する抵抗性を増加せしめていることを 示している。しかし許容出来る調製品は、グルタルアルデヒド、ＰＥＩまたは凝 集剤なしでも製造することが出来る。

例　９ ニトリルを加水分解する能力を有するロドコッコスエリトロポリス（Ｒｈｏｄｏ ｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）の細胞スラッジ（ヨーロッパ特許１ ８８，３１６に従って調製）を、水を用い２％の乾物に希釈した。１０％のポリ エチレンイミン（セデイプル）（細胞スラッジに対する乾物基準）を添加し、つ いでｐＨを７．０に調節した。混合物を、５％の活性グルクルアルデヒド（細胞 スラッジ乾物及びポリエチレンイミン乾物に対する基準）を添加して架橋せしめ た。１時間後、２％のポリアゼチジン（キメネ）（全乾物に対する割合）を添加 した。

ついで混合物を、アニオン性凝集剤、スーパーフロックＡ１３０を添加して凝集 せしめた。架橋酵素を、濾過して回収し、０．８鵬のスクリーンに押し出し粒子 を形成しついで室温で乾燥した。

比較のため、同じ細胞スラッジをポリアゼチジンを用いず、上記と同様の方法で 架橋せしめた。

比較のため、同じ細胞スラッジを従来法、すなわち米国特許４，２４８．９６８ に従ってポリアクリルアミドゲル中で捕捉により固定化した。さらに詳しくは、 細胞スラッジを１２．５％の乾物に希釈しついで例１２に記載したごとく固定化 した。最後に、細胞を１価メツシュの篩で篩分けしついで上澄み液が澄明になる まで塩水で洗浄した。

圧力降下を、次の条件で測定した： １１％グルコースシロンブ、流速：４０ｇ／分、温度：３５°Ｃ圧力降下を２５ 時間後測定した。

５ｇ（乾物）の固定化酵素を、圧力降下の測定に対し適用した。

結果（圧力降下　ｇ／ｃＴＡ）　： 本発明： ポリアゼチジンによる架橋　１３ 比較 ポリアゼチジンを用いない架橋　２００ゲル補促　２００ 国際調査報告 ＋−ｕ−−、ｕ−ｍ　Ａｅ−＋１−１７．−−　ｙ−、ＰＣ丁／ＤＫ８８１００ １０Ｂ

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．ポリアゼチジンを用いて架橋により生物学的材料を固定化する方法であって 、生物学的材料をポリアゼチジンと水溶性で混合する工程、得られた混合物を凝 集する工程、凝集した生成物を脱水する工程、脱水した生成物を細分する工程つ いで粒子系の固定化生成物をうるため細分した材料を硬化する連続工程を含んで なる、前記方法。
2. ２．ポリアゼチジンの量が、生物学的材料中約０．１重量％〜約１０重量％の乾 燥分、好ましくは約０．５％〜約５％の範囲内にある、請求項第１項記載の方法 。
3. ３．脱水する前に、グルタルアルデヒドをポリアゼチジン／生物学的材料混合物 中に導入する、請求項第１項または第２項記載の方法。
4. ４．グルタルアルデヒドの量が、生物学的材料中約４０％未満の乾燥分、好まし くは約１５％未満の乾燥分である、請求項第３項記載の方法。
5. ５．グルタルアルデヒドを、生物学的材料とともに水溶性で混合し、グルタルア ルデヒド／生物学的材料混合物をそれとポリアゼチジンとを混合する前に保持す る、請求項第３項または第４項記載の方法。
6. ６．グルタルアルデヒド及びポリアゼチジンを、生物学的材料とともに水溶性で 混合し、グルタルアルデヒド／ポリアゼチジン／生物学的材料混合物を、それを 脱水する前に保持する、請求項第３項または第４項記載の方法。
7. ７．脱水する前に、さらに、好ましくは約１００％未満の乾燥分のポリエチレン イミン（最も好ましくは約１０％未満）、卵白（最も好ましくは約５０％未満） 、ゼラチン（最も好ましくは約５０％未満）またはカルボキシメチルセルロース （最も好ましくは約１０％未満）（全てのパーセントは生物学的材料中乾燥分に 対する重量基準である）を混合することを含んでなる、請求項第１項〜第６項の いずれかに記載の方法。
8. ８．有効量の凝集剤を、脱水する前に添加する、請求項第１項〜第７項のいずれ かに記載の方法。
9. ９．生物学的材料を、水性分散液または溶液の形態で添加する、請求項第１項〜 第８項のいずれかに記載の方法。
10. １０．生物学的材料が、好ましくは植物または微生物起源の完全にもしくは部分 的に崩壊した細胞由来の全細胞または細胞集団を含んでなる、請求項第１項〜第 ９項のいずれかに記載に方法。
11. １１．固定化される材料が、好ましくは重金属を吸着除去するために使用出来る 、請求項第１０項記載の方法。
12. １２．生物学的材料が酵素を含んでなる、請求項第１項〜第１０項のいずれかに 記載の方法。
13. １３．酵素がグルコースイソメラーゼである、請求項第１２項記載の方法。
14. １４．酵素が、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．、最も 好ましくはＳ．ムリナス（ｍｕｒｉｎｕｓ）、バシルスコーギュランス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ）またはアクチノプラネスミソウリエンシス（ Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ　ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）から由来する、請求 項第１３項記載の方法。
15. １５．酵素がペニシリンアシラーゼである、請求項第１２項記載の方法。
16. １６．酵素が、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）ｓｐ．、好ましくはＦ．アンギ ュリオイデス（ａｎｇｕｉｏｉｄｅｓ）、Ｆ．アルギラセウム（ａｒｇｉｉｌａ ｃｅｕｍ）、Ｆ．アベナセウム（ａｖｅｎａｃｅｕｍ）、Ｆ．ベルビゲナム（ｂ ｕｌｂｉｇｅｎｕｍ）、Ｆ．コエルエルム（ｃｏｅｒｕｌｅｕｍ）、Ｆ．クルモ ラム（ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、Ｆ．エクセッチ（ｅｑｕｉｓｅｔｉ）、Ｆ．ラテル チウム（ｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ）、Ｆ．ミニマム（ｍｉｎｉｍｕｍ）、Ｆ．モノ リフォルメ（ｍｏｎｏｌｉｆｏｒｍｅ）、Ｆ．オキシスポラム（ｏｘｙｓｐｏ− ｒｕｍ）、Ｆ．サムブシナム（ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、Ｆ．セミセクタム（ｓ ｅｍｉｓｅｃｔｕｍ）、Ｆ．ソラニ（ｓｏｌａｎｉ）またはＦ．スルフレウム（ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）から誘導される、請求項第１５項記載の方法。
17. １７．酵素が、好ましくはロドコックス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．（好 ましくはＲｈ．エリトロポリス（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ））、フセウデモナ ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．またはブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．から由来するニトリラーゼである、請求項第１２項記 載の方法。
18. １８．酵素がシアニドヒドラターゼである、請求項第１２項記載の方法。
19. １９．生物学的材料は補酵素である、請求項第１項〜第８項のいずれかに記載の 方法。
20. ２０．生物学的材料が抗体である、請求項第１項〜第８項のいずれかに記載の生 成物。
21. ２１．酵素触媒プロセスにおいて請求項第１２項〜第１８項のいずれかに記載の プロセスにより調製される固定化酵素の使用。