JPS6255083A - 酵素の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は酵素を固定化する方法に関し、さらに詳しくは
細胞と結合した酵素を細胞塊酵素粒子へ転化する方法に
関する。

〔従来の技術〕

固定化酵素生成物、特にカラムに使用される目的の固定
化酵素生成物は、現在非常に成長しつつある分野である
。研究努力は、常により低価格、より良い物理強度、よ
り高い単位活性およびカラム操作の間に最小限の圧力低
下を起こす粒径および形状ならびに摩耗に対し高い粒子
強度を有する固定化酵素生成物を製造する方向を目指し
てきていた。現在までのところ、当業者は相当な数の合
理的で満足すべき酵素固定化方法を利用できるようにし
た。

本発明は特に、細胞と結合した微生物酵素を微生物の細
胞塊から作られた粒子形固定化酵素へ転化することを目
指す。後述される酵素固定化の検　。

討はこの種の固定化酵素生成物と関係する。

概して、技術が進歩したので、固定化方法において長い
間重要でない欠点と考えられていた生成物および方法の
欠陥、たとえば不適当な粒径分布、粒子形状調節の欠除
および比較的低い生成物収率のコスト要因が、取り除か
れねばならない重要な欠陥となっている。たとえば、グ
ルグルアルデヒドは、アモソツ（Ａｍｏｔｚ）の米国特
許第３，９８０，５２１号に示されているように、細胞
と結合した酵素を架橋結合するために工業的規模の実施
に用いられてきている。しかしながら、グルタルアルデ
ヒドは、少なくとも細胞と結合する酵素に対する理想的
架橋剤ではなく、−Ｎ　Ｈ，および−３Ｈ基とのみ反応
する。多くの微生物種の細胞はグルタルアルデヒドとあ
まり反応しない。

ポリアゼチジンプレポリマーが架橋の目的で有利に使用
され、このことはウッドら（Ｗｏｏｄ　ａｔ　ａｌ、）
の米国特許第４．４３６．８１３号および“アノベルメ
ソッドオブインモビリゼーションアンドイッツユースイ
ンアスパルティックアシドプロダクション（Ａ　Ｎｏｖ
ｅｌ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ＩｎｕｗｏｂｉＪｉｚａｔ
ｉｏｎａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｌｌｓｅ　ｉｎ　Ａｓｐａｒｔ
ｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）″、ウッドら
、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　１９８４年１２月
、ｐｐ。

１０８１−１０８４により提案されている。この特許お
よび論文は本明細書中参考として組み入れられている。

ポリアゼチジンプレポリマーの架橋機構はグルタアルデ
ヒドよりも細胞結合酵素の固定化に広く利用されうる。

というのは架橋反応がポリアゼチジンプレポリマーと−
ＣＯＯＨおよび一〇Ｈ基ならびに−ＮＨ工および一５Ｈ
基の間に起こるからである。

本発明の実施が意図する事例は、所望の酵素形状が微生
物細胞および細胞性物質と、架橋剤および場合により補
助架橋剤だ、とえばタンパク質および／または凝集剤た
とえば高分子電解質、および／または微細に分割された
充てん剤から作られる粒子を構成する場合である。この
ような酵素生成物形状は、細胞塊粒子および／または細
胞塊粒子形状のように様々に定義される。ちなみに、上
記ウッドらの特許および論文は原則的に担体粒子に酵素
活性微生物細胞と細胞性物質を固定化することを目指す
ということを記しておく。本発明者によるポリアゼチジ
ンプレポリマーを架橋に用いて細胞塊粒子形状の酵素生
成物を生じさせる試みはこの方法に対する重大な欠陥の
存在を証明する。

反応混合物は、ポリアゼチジンプレポリマーの水性分散
液と個々の微生物細胞と、存在するいかなる細胞性物質
とで構成され、全体を一緒にして硬化反応を実施する。

反応生成物を粉砕し篩別することにより、所望の粒径の
分画が回収されるが、しかしながら所望する粒径分画の
全体的収率は通常低く、また個々の粒子形状は調節され
ない。したがって、細胞塊組成物を架橋すると、粒子形
状と大きさが調節されない固定化酵素生成物を生するこ
とになる。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、高収率で粒子形状細胞塊固定化酵素生
成物を製造する方法をもたらすことであり、粒子は高い
物理強度を有し、その際粒子の形状および大きさを調節
することもできるものである。

〔発明の構成および効果〕

簡単に言えば、本発明方法は、水性懸濁液中の酵素活性
微生物細胞をグルタルアルデヒドで部分的に架橋結合し
、続いて脱水し、得られたペースト状の粘稠な細胞塊を
ポリアゼチジンプレポリマーと混合することからなる。

混合物は粒子の形成に適するコンシスチンシー（稠度）
を示す。次いで、所望の形状および大きさの粒子が反応
混合物から乾燥することにより生成する。ポリアゼチジ
ンプレポリマーの硬化はこの乾燥工程の間に生ずる。

充てん床に使用される本発明にしたがって調製された固
定化酵素生成物は、非常にわずかの圧力低下（たとえば
匹敵する先行技術生成物のわずか約５０％である圧力低
下）を示し、および高い物理的強度と耐摩耗性を示し、
さらに固定化酵素生成物は高い粒子収率のために作るの
に比較的安価　。

である。また、本発明により調製される好ましい実施態
様の固定化酵素生成物は、高い容積活性を有することが
見出された。

細胞性物質とポリ了ゼチジンプレボリマー間の架橋反応
で酵素を再使用可能な組成物へ架橋することは上記で引
用したウッドらの特許第４，４３６，８１３号および論
文で示されており、したがって、ここで詳細に検討する
必要はない。

代表的なポリアゼチジンプレポリマー水溶液は、たとえ
ば次に記すようなもので、 式中Ｒは一般的に−ｆｃＨｚ　　ｈであるたとえばポリ
カップ（Ｐｏｌｙｃｕｐ）＠　１７２　［パーキュレス
社］は、加熱、Ｈ２０除去またはｐｕ値をアルカリ性に
調整することにより架橋する。硬化反応の幾つかは、酵
素活性微生物細胞におけるまたはこれら細胞からの細胞
性物質の利用可能なＮＨ２、ＯＨ，Ｓ　Ｈ，Ｃ００ＩＩ
基とプレポリマーとの反応である。

反応塊を個々の粒子に再分割した後硬化する場合を除き
、架橋した細胞塊生成物は一つの物質の塊り、すなわち
その後に所望の粒子形状の酵素生成物へ再分割せねばな
らない凝集塊になるであろう。すでに指摘したように、
このような転化は所望の粒径範囲の粒子を比較的低収率
で得る結果となり、さらに、個々の粒子の形状はまった
く調節されない。

細胞塊をばらばらの粒子としてからポリアゼチジンプレ
ポリマーで架橋することは勿論好ましいであろう。不都
合なことに、ポリアゼチジンプレポリマーと細胞塊たと
えば細胞スラッジの混合物は凝集性粒子を形成するのに
非常に適しているとは「えない。

本発明の改善は、微生物細胞塊を、水性ポリアゼチジン
プレポリマーと十分に混合しその後ばらばらの粒子に再
分割するのに適するペーストへ転化することを目指すも
のである。続いて粒子乾燥としてポリアゼチジン架橋反
応が生じる。

微生物細胞を比較的凝集したペースト軟塊へ転化するこ
とは、微生物細胞をグルグルアルデヒド水性分散液で部
分的に架橋結合することにより達成される。

本発明の実施のための出発物質は、培養液を濾過または
遠心分離することにより発酵物から回収される酵素活性
細胞スラッジである。細胞スラッジはこのようなものと
してまたは最初にホモジナイズして使用してもよい。発
酵物は固定化させるのにあまり容易でないかもしれない
ので、場合によってはホモジナイズした細胞スラッジを
凍結状態で保存してもよい。実際、細胞スラッジの凍結
とそれに次ぐ融解は、一連の方法全体において失活の害
を与えるというよりむしろ有利である。

微生物細胞および細胞性物質とグルタルアルデヒドとの
反応による部分的架橋を含む反応の詳細な化学は本発明
者には公知ではない。実際、本発明者が気が付く限りに
おいて、グルタルアルデヒドとの架橋の化学は十分明ら
かにされていない。

参考文献としては、ダグラス　ジエイ・フォード（Ｄｏ
ｕｇｌａｓ　Ｊ、　Ｆｏｒｄ）　、２　、　Ｒｅａｃｔ
ｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｌｕｔａｒ−ａｌｄｅｈｙｄｅ　ｗｉ
ｔｈ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏ
ｆＣ４ｎｃｉｎｎａＬｉ　；およびバーディ（ｌｌａｒ
ｄｙ）　、Ｔｈｅ　Ｎａｔｕｒｅｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｒｏ
ｓｓ−１ｉｎｋｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｙ　
Ｇｌｕｔａｒ−ａｌｄｅｈｙｄｅ、　Ｐａｒｔ　ｌ　、
　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌＳ
ｏｃｉｅｔｙ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏ
ｎｓ、　Ｖｏｌ　Ｌ　ｐ、９５８＋１９７６が挙げられ
る。しかしながら、技術はグルタルアルデヒドと微生物
細胞との反応から得られる実際的結果に精通する。

グルタルアルデヒドは酵素技術に対し架橋結合して細胞
塊粒子形状酵素を生じさせるものとして提案されてきた
。その例としては−Ｆ述の米国特許第３，９８０，５２
１号に示されている。グルタルアルデヒドはまた微生物
細胞において細胞と結合した酵素を安定化するために提
案されており、その例としては米国特許第３，７７９．
８６９号に示されている。

本発明の実施におけるグルタルアルデヒドの使用は上記
で引用した両方の特許の教えに関連するが、しかしこれ
らとは全（異なっている。架橋反応の発現が望ましいと
はいえ、グルタルアルデヒドとの反応が個々の微生物細
胞のｔ置火を予防しく特許第３，７７９．８６９号参照
）、または細胞および細胞フラグメントを凝集性の共有
的に結合した物質へ転化する（特許第３，９８０，５２
１号参照）はどの１ｉ１ｉ密な程度は、本発明の実施に
はほとんど重要でない。

本発明の実施においてグルタルアルデヒドでの処理の目
的は、脱水により水性ポリアゼチジンプレポリマーと混
合しうるペースト軟塊とし、次いで粒子を形成しうる凝
集性粘稠混合物となりうる反応生成混合物を生ずること
である。粒子形成能の発現が探し求めていた目的物であ
る。

グルタルアルデヒドでの細胞スラッジの処理に付随して
、−ＮＨユ、基を含む補助架橋剤、たとえばポリエチレ
ンイミン、チトサン、アルブミン、ゼラチンを反応混合
物へ加えてもよい。また、凝集剤を加えてもよい。さら
に、細胞スラッジを金属イオン錯体たとえばＥＤＴＡで
処理することが有利な場合もある。本発明の好ましい実
施Ｂ様について後述される模範的詳細は、他の細胞結合
酵素に対しすべての点で適用できるというわけでもない
。

好ましいグルタルアルデヒドの範囲内での手探り試験に
より、補助架橋剤を含むことおよび／または重合性凝集
剤を含むことが、脱水された部分的架橋細胞塊において
加工可能な稠度および適切な水分含量を達成するのに適
切かどうか、または多分必要かどうかが示唆される。

また微細に分割さ机た充てん剤および／または酵素安定
剤（たとえば、金属イオン）は、これらの存在が最終的
細胞塊固定化酵素生成物中で望まれる場合には、グルタ
ルアルデヒドとの部分的架橋に伴なう細胞塊へ混入する
のが最も良いであろう。

細胞スラッジにおける水の最並びにグルタルアルデヒド
とともに加えられるおよび部分的架橋反応混合物におけ
る任意の薬剤、たとえば凝集剤、補助架橋剤、酵素安定
剤イオン等とともに加えられろ水の量は決定的な要因で
ないことがわかった。

過剰の水分すべては部分的架橋細胞塊から゛濾去される
かまたは遠心分離により除去される。しかしながら、細
胞スラッジ乾燥物質およびグルタルアルデヒドの相対割
合は重要である。

本発明方法による好ましい実施態様において、グルタル
アルデヒドの量は細胞スラッジ乾燥物質に対し５％〜４
０％ｗ　／　ｗ、好ましくは１０％〜２０％ｗ　／　ｗ
である。グルタルアルデヒドの量が５％ｗ　／　ｗ以下
の場合には、部分的架橋した細胞塊の濾過性が低くなり
、グルタルアルデヒドの鼠が４０％ｗ　／　ｗ以上の場
合には固定化酵素生成物における酵素の回収率が不満足
になるであろう。

本発明方法の好ましい実施態様において、脱水された部
分的架橋細胞塊は水分含量７０〜９０％ｗ　／　ｗ、好
ましくは８０〜８５％ｗ　／　ｗである。

水分含量が７０％ｗ　／　ｗ以下の場合には粒子状固定
化酵素生成物の圧力低下特性は満足できないであろうし
、水分含量が９０％ｗ　／　ｗ以上の場合には造粒段階
の性能が不満足である。したがって、脱水された細胞塊
における比較的狭い７０％〜９０％水分含量が本発明の
実施において比較的重要である。

本発明の実施者は最も加工可能な稠度範囲をすぐに認別
することができるだろう。粒子形成能力は７０〜９０％
水分含量範囲の両端でいくらか低下する。最も加工可能
な稠度に対する水分含有量は酵素によって変化するであ
ろう。

脱水された部分的架橋細胞塊について上記で示された水
分含量範囲は、添加されるポリアゼチジンプレポリマー
が固形分１０−１５％の水溶液としてであることを考慮
する。８０〜８５％水分の好ましい範囲は大体約１２％
ポリアゼチジンプレポリマー溶液を想定しており、細胞
の乾燥重層に基づいてさらに好ましいポリアゼチジンプ
レポリマー含量が用いられる。

本発明方法の好ましい実施態様において、ポリアゼチジ
ンプレポリマーは、乾燥物質による細胞スラッジに基づ
いて５％〜３０％ｗ／ｗ（乾燥物質に基づく）の量、よ
り好ましくは１０〜２０％ｗ　／　ｗで添加される。５
％ｗ　／　ｗ以下の量の場合には粒子状生成物において
得られる圧力低下減少の改善が不満足な程低く、３０％
ｗ　／　ｗ以上の量の場合には、固定化された酵素粒状
生成物における酵素収率が不満足な程低い。したがって
粒状細胞結合酵素は収率または生成物安定のために１０
％より少ないかまたは２０％を越えるポリアゼチジンプ
レポリマーを必要とする場合には上記で示された最も好
ましい８０〜８５％水分含有範囲の任意の採用は勧めら
れない。

すでに指摘したように、＠柊的な反応混合物は粒子形成
に適する凝集性と稠度を示す。好ましい粒子形成技術は
、反応混合物を押出し、次いで部分的に乾燥しく乾燥に
よりポリアゼチジンプレポリマーを硬化する）、その後
球状化し、続いて追加の乾燥を行なうことからなる。た
だし最後の工程は任意である。英国特許第１，３６２，
２６５号のマルメライズを続けてもよい。

水分含量に関係なく、先行技術で意図された細胞スラッ
ジとポリアゼチジンプレポリマー（およびその他の有効
成分）は水中固相（ｓｏｌｉｄ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）を
形成し、再分割たとえば押出しにより一緒に融合して単
一の塊りを形成する。グルタルアルデヒドでの部分架橋
により凝集させられた酵素活性微生物細胞と細胞性物質
の水性マトリックスは明らかにある程度固体中水相（ｗ
ａｔｅｒ−ｉｎ−ｓｏｌｉｄ）と水分になり始める。後
者は濾過により除去される。水分含量と゛ポリアゼチジ
ンプレポリマーの割合が最終混合物において上記の限定
の範囲内に保たれているときには、本発明の実施により
作られた（ペースト軟塊の）マトリックスは固相の特徴
を示しこのマトリックスをたとえば押出しのような再分
割し、押出しリボンはポリアゼチジンプレポリマーの硬
化が作用する前には一緒に融合しない。

本発明方法による好ましい実施態様において、粒子形状
の固定化酵素を乾燥して水分含量約２５％ｗ　／　ｗ以
下にする。最終水分含量が約２５％以上であると生成物
の微生物安定性が不満足である。

さらに、すでに指摘したように、水分含量約２５％以上
であるとポリアゼチジンプレポリマーでの架橋は起こら
なかったかまたは完全ではないがもしれない。粒子は貯
蔵期間中凝集する傾向がある。

約１５％以下の水分含量まで乾燥すると酵素活性を失な
う原因となる。

すでに記載したように、本発明の実施は、技術が細胞結
合酵素を細胞塊粒子形へ転化することを望む場合を目脂
している。本発明の実施のための上述したパラメーター
は、いがなる微生物源細胞結合酵素にも本発明の実施を
応用できるようにするため十分に可変性である。たとえ
ば、非常に良く知られた細胞結合酵素であるグルコース
イソメラーゼは、バチルス　コアギユランス（ｌｌａｃ
　ｉ　Ｉ　Ｉ　ｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）の培養または
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に
属するグルコースイソメラーゼ産生株たとえばストレプ
トマイセス　ムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍ
ｕｒｉｎｕｓ）菌株群の培養により産生される。バチル
ス　コアギユランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕ　１
ａｎｓ）源の細胞結合酵素はグルタルアルデヒドとの反
応によりただちに固定化されうる（上述の米国特許第３
．９８０，５２１号参照）。しかしながら、ストレプト
マイセス　ムリナス（Ｓ　ｔｒｅｐ　Ｌｏｍｙｃｅｓｍ
ｕｒｉｎｕｓ）菌株群を含むストレプトマイセス（Ｓ　
ｔｒｅｐ　ｔｏｍｙｃｅｓ）属の株により産生される細
胞結合酵素は、グルタルアルデヒドとの不十分な架橋能
力で満足すべき細胞塊粒子形状固定化酵素を産生ずると
いう特性を示す。しかしながら、これら細胞結合酵素の
いずれも本発明の実施により細胞塊粒子形状に固定化さ
れうる。勿論、本発明の実施がストレプトマイセス　ム
リナス（Ｓ　ｔｒｅｐ　ｔｏｍｙｃｅｓ、ｍｕｒｉｎｕ
ｓ）酵素に特に適することになる。グルコースイソメラ
ーゼは市販されている重要な酵素であり、すなわち、ス
トレプトマイセス　ムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ　ｍｕｒｉｎｕｓ）グルコースイソメラーゼの固定化
は本発明の好ましい一実施態様である。

本発明の広汎な適用性はまた、全く異なる市販の重要な
細胞結合酵素、すなわち大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株か
ら誘導されるトリプトファンシンテターゼによって後で
例示される。この酵素の調製はまた本発明の好ましい実
施態様である。本発明者が調べた先行技術の固定化方法
のいずれも満足すべき物理強度の固定化トリプトファン
シンテターゼ生成物を得られなかった。トリプトファン
シンテターゼは捕捉因子を必要とするということに注意
すべきである。このようなものは細胞質に存在する。

細胞の分裂は捕捉因子の損失を起こすので、細胞全体の
固定化がトリプトファンシンテターゼ酵素の場合に使用
される。

本発明の実施により、特に本発明の好ましい実施態様に
より作られる酵素粒子は、優れた物理特性を示す。充て
ん床において、これらは液体流過のための圧力低下を示
し、これは比較する先行技術生成物の約５０％だけであ
る（この研究試験において、比較する先行技術生成物は
、米国特許第３．９８０．５２１号で示されたように作
られたグルグルアルデヒド架橋バチルス　コアギユラン
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ）グルコー
スイソメラーゼであり、広く商業的に使用されているも
のである）。

さらに、高い物理強度と耐磨耗性が見出された。

本発明の実施をさらに理解するために、次に実施例を示
す。

〔実施例〕

例１ グルコースイソメラーゼを含有するストレプトマイセス
　ムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｕｒｉｎｕ
ｓ）、ＤＳＭ　３２５２の細胞を、グルコース、複合窒
素源、無機物およびこん跡量の元素からなる通常の培地
で培養する。

ｐＨを７．０〜７．５に調整後、遠心分離により細胞を
発酵液から回収し、０．５％ｗ　／　ｖのＭｇ５Ｏａ　
・７１１２０を加えた後マントン−ゴーリン（ＭａｎＬ
ｏｎ−Ｇｏｕｌｉｎ）ホモジナイザーでホモジナイズす
る。ホモジナイズした細胞スラッジを一１８℃に保ち、
固定化実験に使用する前に急速に溶かす。

６．７％乾燥物質含有量のホモジナイズした細胞スラッ
ジ３００ｇを１．５％Ｍｇ５Ｏ＜　’　７１ｈＯで７５
０ｍ１まで溶かし、ｐＨを７．５までに調整する。コル
キャ７　）　（Ｃｏｒｃａｔ）　Ｐ　−１８ポリエチレ
ンイミン凝集剤（コルドパ　ケミカル社　Ｃｏｒｄｏｖ
ａ　Ｃｈｅｓａ、　Ｃｏ、）３０ｇを加える；次いで５
０％グルタルアルデヒド９．２４ｇを加えｐＨを１時間
７．４〜７．６に保つ、濾過によりフロックを集める。

はぼ１５．８％ＤＭを含むフィルターケーキを乾燥物質
含量の観点から三等分する。２つの部分をフィルターケ
ーキ乾燥物質に基づいてポリカップ（Ｐ’ｏｌｙｃｕｐ
）　Ｑ　１８８４ポリアゼチジンプレポリマー溶液、ｐ
Ｈ７，５（バーキュレス社製、プラウエア）のそれぞれ
０および１５％ｗ／ｗ（乾燥物質に基づく）と混合する
。両方の部分を０．８　ａｍオリフィスを通して押出す
。押出した物質を室温で乾燥物質８３〜８５％ｗ　／　
ｗまで乾燥させる。部分別により３００〜７００μ分画
を得る。

２つの固定化酵素調製物中に回収されたグルコースイソ
メラーゼ活性（ノボ　ドキュメント　Ｆ８５０３９９に
より測定）はほとんど同じであった。ノボ、ＡＦ１６６
により測定された圧力低下（ｇ　／　ｃｕｔ　）を次の
第１表に示す。

第１表 圧力低下とポリアゼチジンの％（フィルターケーキ乾燥
物質として計算） 例２ トリプトファンシンテターゼ産生大腸菌ＡＴＣＣ１５４
９１株を３７℃で寒天傾斜面に増殖し、ここから３７℃
で振とうフラスコ中の予備培養物へ移す。

予備培養物を下記のように調製された培地に接種する。

培地の組成は次のようである： （ＮＨ４）２５０４　　　　　　　　　　　　　８　ｇ
　／　１にＨ２ＰＯ，１，６ｇ／Ｉ ＮａｚＨＰＯ，，２１１ｚ０　　　　　　　　　　５．
６　ｇ　／　１クエン酸三ナトリウム、２１１□０　　
　０．５ｇ／ｌＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　
　　　３ｇ／ｌＭｇＳＯ４，７１１ｚＯｏ、　５　ｇ　
／　ｌＣａＣ１ｚ、２）１ｚ０　　　　　　　　　　０
０．２　ｇ　／　ＩＦｅＣＩＪｌｌｚｏ　　　　　　　
　　　　　　９０　ｍｇ／　ｌＺｎＳＯ４，ＩＨｚｏ　
　　　　　　　　　　　２０　ｔｒｙ／　ｌＭｇＳＯ４
，４１１ｚ０　　　　　　　　　　　２４　ｎｖ／　ｌ
ＭｎＳＯ４，４Ｈｚ０　　　　　　　　　　　２２　ｍ
ｇ／　１ＣｕＳＯｎ、５１１ｚＯ’−４ｍｇ／　ＩＫｌ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　４暉／ｌＮａＭｏＯ４，２１１ｚＯ４ｎｗ／　１１１
Ｊ（ｈ、６１１□０　　　　　　　　　　　　　　　　
１．２　ｒ■／１ＣＯＣ１２，６１１２０６ｍｇ／　ｌ ＮｉＣ１ｚ、６１１□０　　　　　　　　　　　　　　
　　　６１■／１＊ビオチン　　　　　　　　　　　　
　　４μｇ／ｌ＊パントテン酸カルシウム　　　　８０
０ｇｇ／ｌ＊葉　酸　　　　　　　　　　　　４μｇ／
ｌ＊イノシトール　　　　　　　　４０００ｇｇ／ｌ＊
ナイアシン　　　　　　　　　　８００ｇｇ／ｌ＊ｐ−
アミノ安息香酸　　　　　　　４００ｇｇ／ｌ＊ピリド
キシンｌＩｃ１　　　　　　　　　８００ｇｇ／ｌ＊リ
ボフラビン　　　　　　　　　４００ｇｇ７１＊チアミ
ンＩＣ１８００ｇｇ／ｌ 培地を１２１　’Ｃで２５分間滅菌するがただしビタミ
ン（＊）を除く。−緒に冷却後滅菌濾過によりデキスト
ロース（１０ｇＺＩｌ）と４８％エタノール中のインド
ール（１２５■／１）を加える。無菌状態下で３７℃に
てｌ容量／容量７分のエアレーションで浸水発酵を行な
い、５００ｒｐｍＴ：撹拌し、酸／塩基添加によりｐｏ
を調整して４０時間ｐＨ７，０にする。接種後２４時間
してからさらにデキストロース（４０ｇ／ｌ）と４８％
エタノール中のインドール（８７５■／１）を添加する
。４０時間後に遠心分離により細胞を採取し、後述の例
３で記載する固定化実験にただちに使用する。

例３ 例２で記載したように回収された乾燥物質含量１７％ｗ
　／　ｗの湿式細胞６０ｇを０．２ＭＥＤＴ八（ｐ１１
７．５に調整）　１２００ｍ！！に再懸濁し、室温で３
０分間放置し、次いで遠心分離する。ＥＤＴＡ水溶液で
洗浄する操作を゛もう一回くり返す。

湿式細胞を８５ｒｎＭ　ＫＩｌ、ＰＯ４，ｐＨ７，５，
３００ｍｊ２　；コダック製ポリスチレン（２００〜４
００メツシユ、２％ｗ　／　ｗジビニル安息香酸で架橋
）８．４ｇ；ピリドキサールホスフェート９６呵および
１２．５Ｗ／Ｖグルタルアルデヒド溶液９．６ｇと混合
する。固定化方法により塩基を添加してｐＨ値を７．５
に保持する。次いでコルドパ　ケミカル　カンパニー（
ミシガン）製のコルキャットＰ−１５０ポリエチレンイ
ミン溶液（ｌＯＮＮａＯＨでｐＨ７，５に調整）６０ｇ
を加え、次いで前述のようにグルタルアルデヒドの同量
を加える。グルタルアルデヒドの最初の添加から１時間
後、５０ｍＭのにＨ２ＰＯ４（１）Ｈ７，５）９００ｍ
ｌで希釈する。次いでアメリカン　サイアナミド（＾ｍ
ｅｒｉｃａｎ　Ｃｙａｎａｍｉｄｅ）社製２５０　ｍ　
ｌの１％Ｗ／Ｖスーパフロック（Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ）
　Ａ　１３０を添加して凝集を行なう。部分的に架橋し
凝集した細胞を濾過により集める。はぼ１９％ｗ　／　
ｗの乾燥物質を含むフィルターケーキを三等分する。一
方を、発酵から遠心分離により回収した湿式細胞中の乾
燥物質と比較して１６．５％ｗ　／　ｗの乾燥ポリアゼ
チジンプレポリマーに相当する７、２ｇのポリカップ０
１７２（バーキュレス社製、プラウエア）と混合する。

両方の部分を０．８　ｎ＋の穴を通して押出す。

押出された物質（両方とも）を、乾燥物質含量９０％ｗ
　／　ｗになるまで室温で乾燥させる。篩分別により３
００〜７００ｇ分画を得る。

２つの固定化酵素生成物中に回収されたトリプトファン
シンテターゼ活性はほぼ同じである。ノボ、ＡＦ１６６
により測定されたポリアゼチジンを用いた生成物の圧力
低下（ｇ／ｃＪ）は１４（２５ｈ）／１５　（５０ｈ）
であり、ポリアゼチジンを用いない生成物の場合は２３
　（２５ｈ）／２４（５０ｈ）である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、酵素活性微生物細胞および細胞性物質の水性分散液
   を水性ポリアゼチジンプレポリマーと混合し、続いて硬
   化することからなる酵素活性微生物細胞および細胞性物
   質の固定化方法において、酵素活性微生物細胞スラッジ
   をグルタルアルデヒドで処理して部分的架橋を起こさせ
   ；その後、部分的に架橋した細胞スラッジを水分含量７
   ０〜９０％ｗ／ｗの範囲まで脱水し、これによりペース
   ト状細胞塊を作り；前記ペースト状細胞塊を水性ポリア
   ゼチジンプレポリマーと混合し；次いで、混合したペー
   スト状細胞塊と水性ポリアゼチジンプレポリマーを再分
   割し、次いで前記硬化を行ない粒子形状の固定化酵素生
   成物を得ることからなる酵素の固定化方法。 ２、粒状混合物の水分含量を硬化の間に約２５重量％以
   下まで減少させる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、グルタルアルデヒドが細胞スラッジ乾燥物質の５％
   〜４０％である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、ポリアゼチジンが細胞スラッジ乾燥物質の５〜３０
   ％である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、酵素活性微生物細胞が、グルコースイソメラーゼ産
   生ストレプトマイセス　ムリナス （Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ｍｕｒｉｎｕｓ）菌株群源
   の細胞である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、酵素活性微生物細胞がトリプトファンシンテターゼ
   産生微生物株源の細胞である特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ７、細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株源のものである特
   許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、部分的架橋細胞スラッジを水分含量８０〜８５％ｗ
   ／ｗの範囲まで脱水する特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ９、グルタルアルデヒドが細胞スラッジ乾燥物質の１０
   〜２０％である特許請求の範囲第１項記載の方法。