JPH05501499A - 固定化酵素調製品、その製法および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 固定化酵素調製品、その製法および使用技術分野 本発明は、特に固定化酵素調製品、酵素触媒プロセスにおいて該固定化酵素調製 品の使用および酵素活性の生物学的材料の固定化方法に関する。

背景技術 以下の内容は公知である。すなわち、担体を用いずに、ポリエチレンイミン（Ｐ ＥＩ）および架橋剤、例えばグルタルアルデヒドまたはポリアゼチジン（例えば 米国特許第４．２８８゜５５２、米国特許第４．３５５，１０５　、ヨーロッパ 特許第２９７，９１２　）を用いた架橋により酵素を固定化し得る。このような 方法は、固定化酵素、特に固定床カラムで連続的に使用するのに適した良好な活 性および物理強度を有する形態のものを製造するために使用できる。しかし、Ｐ ＥＩは高価な材料であり、従って、これに代わる代替物を見出すことが望まれる 。また、ＰＥＩによる幾つかの酵素の固定化は、時として、不都合な凝集をおこ し、これは脱水を困難にする。

本発明の目的は、固定床カラムの使用に対し、満足できる特性；活性、安定性（ 半減期）および物理強度（圧力降下）を有する固定化酵素調製品を製造するため の、改良された凝集および脱水並びにＰＥＩの必要性を排除した方法に関する。

発明の要約 驚くべきことに、以下の内容が見出された。すなわち、本発明の目的はポリエチ レンイミンを、固定化に対してこれまで知られていなかった成る種のポリマーと 反応させることによって達成できる。

従って、本発明は以下の連続的工程： ａ）酵素活性の生物学的材料を含む水性媒体を得、ｂ）１−アミノエチレン部分 および所望によりＮ−ビニルホルムアミドを含むポリマーへ添加し、Ｃ）アミノ 基に対する架橋剤を添加し、ｄ）架橋および凝集を行うために混合物を保持し、 ｅ）脱水し、 ｒ）細分割し、次いで ｇ）乾燥する を含むプロセスによって得ることのできる粒状固定化酵素を提供する。

本発明は又、酵素触媒プロセスにおける固定化酵素調製品の使用を提供する。最 後に、本発明は、前記の連続工程を含むことを特徴とする、酵素活性の生物学的 材料を固定化する方法を提供する。

発明の詳細な説明 本発明に係る固定化される生物学的材料は、酵素的に活性である。これは、無傷 の細胞又は部分的にもしくは完全に破壊した細胞から成る細胞ペーストを含有す る培養ブロスの形態で酵素活性微生物細胞を含み得る。生物学的材料は、無細胞 酵素溶液もしくは精製酵素から成るか又はそれらを含んでなる。

生物学的材料は、不活性な蛋白質を、好ましくは０〜５０重量％含むことができ る。従って、もし高精製の酵素が固定化できる場合、これは好ましくはアルブミ ン又はゼラチンの如き不活性蛋白質に添加できる。

反応混合物中に存在する水の量は、重要ではない。過剰の水は、活性物質の重大 な損失なしで脱水中に除去できる。従って、水は、好都合なコンシスチンシーを 得るために添加できる。好都合には、生物学的材料は、水性懸濁液もしくは溶液 の形態で、典型的には乾燥物質の１〜２５％（Ｗ／Ｗ）、特に培養ブロスの場合 には、１〜１０％、又は精製酵素の場合には１０〜２５％で添加される。

本発明で用いられるポリマーは、１−アミノエチレンのホモポリマー又はこのモ ノマーとＮ−ビニルホルムアミドとのコポリマーである。このポリマーは、好都 合には、−ＣＨ，−ＣＨ（ＮＨｚ）一単位の１０〜１００モル％（最も好ましく は２５〜５０％）および−ＧＨｚ　ＣＨ（ＮＨＣＨＯ）一単位の０〜９０モル％ （最も好ましくは５０〜７５％）を含有する。このポリマーは、好ましくは、５ ０，０００〜５Ｇｏ、ｏｏｏの範囲の分子量を有する。該ポリマーは、例えば米 国特許第４，４２１，６０２又はヨーロッパ特許第７１，０５０に従い、Ｎビニ ルホルムアミド　ホモポリマーを加水分解することにより製造できる。ポリマー の分子量は、米国特許第４．４２１．５０２に記載される如く、非加水分解Ｎ− ビニルホルムアミド　ホモポリマーのフィケンゼル（Ｆｉｋｅｎｔｓｃｈｅｒ） 　Ｋ値により出願中に記載される。このに値は、１０〜２００の間で変わり得る 。

ポリマーの量は、好ましくは生物学的材料の乾物の２〜３０重量％、最も好まし くは２〜１５％である。キトサンを上記ポリマーに加えて用いることができる。

好ましくは、１〜１５％のキトサンおよび１〜１５％のポリマーが用いられる（ 生物学的材料中の乾物の重量％）。キトサンは、工程Ｃ）における架橋剤の添加 前に導入すべきであり；これはポリマーと共に添加できる。

本発明で用いられる架橋剤は、アミノ基と反応する試剤である。この例は、グル タルアルデヒド、ジイソシアネート（例えばトルイレン又はヘキサメチレンジイ ソシアネート）およびポリアゼチジン（ヨーロッパ特許第２９７，９１２に記載 の如く）である。

所望により、架橋剤もまた、工程ａ）の水性媒体中に添加でき更に混合物は、ポ リマーを導入する前に部分架橋を行なわしめるのに十分長く（例えば５〜２０分 ）保持できる。この場合、工程Ｃ）で添加される架橋剤に対する工程ａ）で添加 される架橋剤の割合は、好ましくは１：２〜１：４である。

架橋剤の全量は、好ましくは生物学的材料中の乾物の５〜４０重量％の範囲内に ある。比較的高量、例えば２０〜４０％が物理的に強固な特性を有するために好 まれる；しかじ別に低量（例えば１０〜２０％）も少ない拡散制限および高活性 を有する粒子を得るために用いることができる。工程ｄ）における保持時間は０ ．５〜２時間である。

プロセス中の温度は、一般に６〜６０°Ｃである。室温付近の温度はしばしば部 分的であるが、より低温も酵素の不安定性さのため必要とされる。

プロセス中のｐＨは一般に中性付近であるが、大部分は約５〜約９である。

酵素の安定性に応じてより高いかもしくはより低いｐＨも好ましい。反応中にｐ Ｈを安定化させるため、緩衝剤を含ましめることができる。

本発明の脱水工程は、凝集後過剰の水を除去することを企図しており、これによ りペースト状素材を得る。これは、好都合には、濾過又は遠心により行われる。

本発明による細分割は、脱水素材を制御した大きさの個々の粒子に形成するため に行なわれる。好ましい技術は、押出である。所望により、押出された粒子は、 硬化前又は硬化後に、例えば英国特許第１，３６２．２６５明細書に記載される 「マルメサイザー（Ｍａｒｕ■ｅｒｉｚｅｒ）　Ｊ技術を用いて丸味をつける（ 球状化）ことができる。

細分割した材料を、例えば１０〜２５％ｗ　／　ｗ未満の含水率に乾燥する。２ ５％を超える最大含水量では、製品の微生物安定性は不必要であろうし、粒子は 保存中の期間にわたって凝集する傾向にあるかもしれない。約１０％未満の含水 率に乾燥することは、微生物的材料を失活させる可能性がある。

は、低温度の乾燥又は凍結乾燥も必要であろう。

本発明は、広範囲の酵素の固定化に通用できる。幾つかの例を次に示すニ ーグルコース　イソメラーゼ、例えばストレプトマイセス（特、Ｓ、ムリナス） 、バシラス（特にＢ、コアギユランス）又はアクチノプラネス（特にＡ、ミソウ リエンシス由来）、−アミノペプチダーゼ、例えばプソイドモナス由来、−ペニ シリン　アシラーゼ、例えばフサリアム由来、−ニトリラーゼ、例えばホトコツ カス（特にＲｈ、エリトロポリス）由来、プソイドモナス由来又はブレビバクテ リウム由来、 ′　−フルクトロシル　トランスフェラーゼ、例えばアスペルギルス由来、 一インベルターゼ、例えばサツカロマイセス由来、−ラクトース、例えばタルベ ロマイセス由来−シナンダーゼ、例えばアルカリゲネス由来。

実施例 例１ 対照試料を次のように調製した： ストレプトマイセス　ムリナス由来のグルコース　イソメーゼ含有発酵液（米国 特許第４．６８７．７４２に従って調製、乾燥物質含量４％）ｉｌを、ｌＯｇの Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ，Ｏと混合し、ｐＨを７．５に調節した。５０％のグル タルアルデヒド５ｄを添加し、細胞スラッジを、ｐＨ７，５のｐＨ調節下で１０ 分間撹拌した。次いで、５．０％（乾物基準）のポリエチレンイミン（セジプル 、ＢＡＳＦ社の製品、西ドイツ国）を添加し、完全に混合した後、混合物の架橋 用として１０Ｍ１のグルタル質に対して１８％の全グルタルアルデヒド）を添加 した。ｐＨを７．５の一定に調整した。１時間後は、カチオン性凝集剤（スーパ ーセルＣ５２１（サイナミド社））を添加して架橋混合物を凝集させた。架橋し た酵素を濾過して除き、０．８＋ｗｎの篩を通して押出し粒子に形成し、室温で 乾燥した。

本発明に係る一連の調製品を上記と同様にして製造した。

但し、ポリエチレンイミンの代りにＮ−ビニルホルムアミド（ＢＡＳＦ　（西ド イツ）の実験的調製品）と共に又はそれなしで１−アミノエチレンのポリマーを 用いた。ポリマーの組成を表１に示す。

グルコース　イソメラーゼ活性を、ノボ分析法Ｆ−８５５３１０（ノボ社（デン マーク国）より要求により入手可）に従って測定した。固定化酵素の初期活性並 びにある場合、実験的規模のカラム（６０℃、ｐＨ７，５＞中で数週間連続異性 化中の活性の双方を測定した。活性度の低下は半減期で表わされ、この時間は活 性が初期活性の半分に等しいときである。

長径２４ｓｎおよび酵素床の高さ４Ｃ■（５ｇの酵素）のカラムについて圧力降 下を測定した。１　ｇ　Ｍ　ｇ　Ｓ　０４　／　ｊ！を有する税イオン水に溶解 した４５％のグルコース溶液を６０°Ｃで毎分４０ｇの割合でカラムにポンプ導 入した。圧力降下（液体のｗ＋ｍで表わす）は酵素粒子の物理的安定性、すなわ ち良好な安定性に相当する低圧力降下を示す。

実験結果（初期活性、半減期および圧力降下）を表２に示す。

Ａ　６７　４−５ｘｌＯ５１０６ Ｂ　１００　４−５Ｘ１０’　１０６ Ｃ３２２−３Ｘ１０’　８６ Ｄ　６１　２−３Ｘ１０Ｓ８６ Ｅ　９５　２−３Ｘ１０’　８６ Ｆ　４３　３−４Ｘ１０’　３２ Ｇ　６１　３−４Ｘ１０’　３２ Ｈ９８３−４Ｘ１０’　３２ ｕ 対照　３５０　２０００　１５ Ａ　４５０　１０００　５０ Ｂ　３００　２０００　３１ Ｃ３００２２００１１ Ｄ　３５０　２０００　＞１００ Ｅ　３８０　９００　４９ Ｆ　３３０　２０００　２６ Ｇ　３４０　１８００　２３ Ｈ３１０９００ −−一一一−−−−−−−−−−−−−−一一一一−−−−−工し例２ 例１における如（一連の調製品を製造した。但し、２倍量のグルタルアルデヒド を用いた。すなわち、ポリマー（すなわちポリエチレンイミン）の添加前１ｏＩ ｄの５０％グルタルアルデヒドおよび添加後２０−の同グルタルアルデヒドを用 いた。従ってグルタルアルデヒドの全量は、３６％に達する。

結果を表３に示す。

ｌ−主 セジプル　２２０４ ８　２００　、　４ 例３ 例１におけると同様に一連の調製品を製造した。但し、ポリエチレンイミン又は ｌ−アミノエチレンとＮ−ビニルホルムアミド（乾物に対し２．５％）のポリマ ー又はＮ−ビニルホルムアミドなしの該１−アミノエチレン　ポリマーの半量を 用いた。結果を表４に示す。

５ｅｄｉｐｕｒ　５００　１１００　１４８Ｂ　４８０　１８４ Ｃ５５０１１００３５６ Ｄ　５４０　１２００　５５１ Ｇ　５０５　−　１２７ 例４ ストレプトマイセス　ムリナス由来のグルコース　イソメーゼ含有発酵液（乾燥 物質含量４％）ｌｆｆｉを、１０ｇのＭｇ５Ｏ，・７Ｈ，Ｏと混合し、ｐｉ（を ７．５に調節した。５０％のグルタルアルデヒド１５ｄを添加し、細胞スラッジ を、ｐＨ７，５のｐＨｍ節下で１０分間撹拌した。次いで、２．５％（乾物基準 ）のポリマーＣおよび４６０ｄの０．５％酢酸に溶解した２、５％（乾物基準） のキトサン（カヤミック４００、日本化薬社（製））を添加し、完全に混合した 。ｐＨを７．５の一定に調整した。１時間後は、カチオン性凝集剤（スーパーセ ルＣ５２１（サイナミド社））を添加して架橋混合物を凝集させた。架橋した酵 素を濾過して除き、０．８ｍｎの篩を通して押出し粒子に成形し、室温で乾燥し た。

例５ 例１におけると同様にして一連の調製品を製造した。但し、全てのグルタルアル デヒドを、ポリマー添加前に発酵液に添加し更にグルタルアルデヒドの濃度を変 えた。

結果を表５に示す。

ｌ セジブル　１８　２７５　２０００　４セジブル　２７　２４０　１８００　４ セジブル　３６　２００　１５００　７Ｃ１８３００１７００１３ Ｃ２７２７０１５００２０ Ｃ３６２０５１６００１６ 各実験例の結果は以下の内容を示している。すなわち、本発明によれば、固定床 カラムで用いるのに適した良好な活性、安定性および物理強度を有する試料が、 種々の組成のポリマーおよび種々の量のグルタルアルデヒドを用いて得ることが できる。特に良好な安定性と物理強度を有する調製品か、２５〜５０％の１−ア ミンエチレンを含有するポリマーを用いて得られる。特に良好な物理強度を有す る調製品が３０〜４０％のグルタルアルデヒドを用いて得られる。

国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の連続的工程： ａ）酵素活性の生物学的材料を含む水性媒体を得、ｂ）１−アミノエチレン部分 および所望によりＮ−ビニルホルムアミドを含むポリマーを添加し、ｃ）アミノ 基に対する架橋剤を添加し、ｄ）架橋および凝集を行うために混合物を保持し、 ｅ）脱水し、 ｆ）細分割し、次いで ｇ）乾燥する を含むプロセスによって得ることのできる粒状固定化酵素調製品。
2. ２．前記ポリマーの量が、生物学的材料中で乾物の２〜３０重量％、好ましくは ２〜１５％である、請求の範囲第１項記載の固定化調製品。
3. ３．前記ポリマーが、１０〜１００モル％（好ましくは２５〜５０％）の−ＣＨ ２−ＣＨ（ＮＨ２）−単位および０〜９０モル％（好ましくは５０〜７５％）の −ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ−ＣＨＯ）−単位を含有し、更に好ましくは５０，０００ 〜５００，５００の分子量を有する、請求の範囲第１又は２項記載の固定化調製 品。
4. ４．工程ｃ）における架橋剤の導入前に、キトサンを好ましくは生物学的材料中 の乾物の１〜１５重量％の量で添加する、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記 載の固定化調製品。
5. ５．前記架橋剤が、グルタルアルデヒド、ポリアゼチジン又はジイソシアネート である、請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の固定化調製品。
6. ６．工程ａ）の水性媒体に更に架橋剤を添加し、次いで工程ｂ）においてポリマ ーを導入する前に部分的架橋を行うために保持し、ここにおいて工程ａ）および 工程ｃ）において添加する架橋剤の割合が好ましくは１：２〜１：４の範囲であ る、請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の固定化調製品。
7. ７．用いる架橋剤の全量が生物学的材料中の乾物の５〜４０重量％である、請求 の範囲第１〜６項のいずれかに記載の固定化調製品。
8. ８．前記生物学的材料が、溶解した酵素、好ましくは植物もしくは動物起源の無 傷の細胞の、又は十分にもしくは部分的に粉砕した細胞塊状物を含んでなる、請 求の範囲第１〜７項のいずれかに記載の固定化調製品。
9. ９．前記生物学的材料が、更に酵素的に不活性の蛋白質を含んでなる、請求の範 囲第１〜８項のいずれかに記載の固定化調製品。
10. １０．前記生物学的材料が、 グルコースイソメラーゼ、（好ましくは、ストレプトマイセス、バシラス又はア クチノプラネス由来）、アミノペプチダーゼ（好ましくは、プソイドモナス由来 ）、ペニシリンアシラーゼ、（好ましくは、フサリアム由来）、ニトリラーゼ、 （好ましくはホドコッカス由来、プソイドモナス由来又はブレビバクテリウム由 来）、フルクトロシルトランスフェラーゼ、（好ましくは、アスペルギルス由来 ）、インベルターゼ（好ましくはサッカロマイセス由来）、ラクトース（好まし くはクルベロマイセス由来）、シナンダーゼ、（好ましくはアルカリゲネス由来 ）を含んでなる、請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載の固定化調製品。
11. １１．酵素触媒プロセスにおいて、請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載の 固定化酵素調製品の使用。
12. １２．固定床中で固定化酵素を用いた連続的プロセスにおける、請求の範囲第１ 〜１１項のいずれかに記載の固定化酵素調製品の使用。 １３酵素活性の生物学的材料を固定化する方法であって次の工程： ａ）酵素活性の生物学的材料を含む水性媒体を得、ｂ）１−アミノエチレン部分 および所望によりＮ−ビニルホルムアミドを含むポリマーを添加し、ｃ）アミノ 基に対する架橋剤を添加し、ｄ）架橋および凝集を行うために混合物を保持し、 ｅ）脱水し、 ｆ）細分割し、次いで ｇ）乾燥する を含んでなる、前記方法。