SU1495378A1 - Способ получени препарата дл определени моноаминов на основе иммобилизованной моноаминооксидазы - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии, а именно к получению иммобилизованных органоидов клетки и ферментов, и может найти применение при получении биокатализаторов, а также в химическом, клиническом и токсилогическом анализе. Цель изобретени  - улучшение характеристик препарата дл  определени  моноаминов за счет повышени  активности моноаминооксидазы, механической прочности и антимикробных свойств пленки. Способ заключаетс  во введении ферментного препарата с моноаминооксидазной активностью (гомогенат митохондрий печени) в водный раствор желатина с последующим добавлением террилитина в количестве 1-10 протеолитических единиц на 1 мл суспензии, немедленном нанесении суспензии на нерастворимую подложку, высушивании суспензии на воздухе и обработке полученной пленки в течение 3-5 мин глутаровым альдегидом. Полученный препарат обладает повышенными механической прочностью и антимикробными свойствами, а также в 1,5 раза более высокой активностью моноаминооксидазы. 1 з.п. ф-лы. 2 табл.

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , а именно к области получени  иммобилизованных органоидов клетки и ферментов , и может найти применение при получении биокатализаторов, а также в химическом, клиническом и токсикологическом анализе

Целью изобретени   вл етс  улучшение характеристик препарата дл  определени  моноаминов за счет повышени  активности моноаминооксидазы (МАО), механической прочности и антимикробных свойств пленки.

Способ заключаетс  во введении ферментного препарата (гомогената. митохондрий печени) в водный раствор желатина с последующим добавлением террилитина в количестве 1-10 проте- олитических единиц на 1 нп объема суспензии, немедленном нанесении полученной суспензии на нерастворимую подложку, высушивании суспензии на воздухе и обработке полученной пленки глутаровым альдегидом (предпочтительно в течение 3-5 мин). Введение террилитина приводит к частичному

4; со сд оэ

Ь

разрушению митохондриальных мембран, что увеличивает активность моноамино- оксидазы. Кратковременность воздействи  террилитина на моноаминооксидазу (до высушивани  пленки) позвол ет избежать ее инактивации за счет протео- лиза. Способ позвол в получить целевой продукт с улучшенными характеристиками: активность иммобилизованной ю ет 1 цмоль субстрата за 1 мин при моноаминооксидазы возрастает в 1,5 ра- +25 С и рН 7,0,

цикла работы препарат высушиваетс  на воздухе и взвешиваетс .

Характеристики препаратов приве ны в табл. 1.

ъ

За единицу протелитической акти ности террилитина прин то такое ко личество фермента, которое расщепл

ет 1 цмоль субстрата за 1 мин при +25 С и рН 7,0,

цикла работы препарат высушиваетс  на воздухе и взвешиваетс .

Характеристики препаратов приведены в табл. 1.

ъ

За единицу протелитической активности террилитина прин то такое количество фермента, которое расщепл 

за, увеличиваетс  также прочность

пленки и ее бактериостатическое дей- с твие.

Пример 1о 0,2 г желатина помещают в стаканчик с 4 мл дистиллированной воды дл  набухани . Затем туда же добавл ют 5 мл 0,05 М фосфатного буфера с рН 7,4 и нагревают при

желатина. Далее раствор охлаждают до +25 С и внос т в него 2 г гомогёната

перемешивании до полного растворени  20 могената митохондрий печени свиньи

в 0,07 М фосфатном буфере, рН 7,4. К полученной суспензии добавл ют 1 мл митохондрий печени свиньи в 0,05 Мраствора террилитина в воде с активфосфатном буфере, рН 7,4 и перемети- ностью 100 ПЕ, т„е. 10 ПЕ/1 мл. Не- вают. К полученной суспензии добавл -25 медленно из полученной смеси 5 мл вы- ют 1 мл раствора террилитина в воделивают на алюминиевую фольгу, 5 мл с суммарной активностью 10 протеоли- тических единиц (ПЕ), т.е. 1 ПЕ/1 мл состава. Смесь немедленно порци ми по 5 мл выпивают на ровную поверхность 30 случа х обрабатывают 5 мл 8%-ного полиэтиленовой пластины и высушивают раствора ГА в течение 5 мин. После в потоке воздуха в течение 1,5 ч. Су- этого избыт.ок раствора ГА сливают, а . хую пленку желатина обрабатываютгшенки многократно промьшают водой

10 мл 2%-ного раствора глутаровогои 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,5.

альдегида (ГА) в течение 3 мин. После 35 Капроновую сетку с желатиновой плен- этого избыток раствора ГА сливают, акой осторожно снимают с поверхности

пленку многократно прогфшают водой икафел . Обе пленки высушивают в по0 ,05 М фосфатным буфером, рН 7,4, итоке воздуха при +25 с в течение 1 ч.

на кафель, на котором нат нута капронова  сетка, и сушат в потоке воздуха в течение 2 ч. Сухую пленку в обоих

снова высушивают в потоке воздуха в течение 1 ч. Сухие препараты хран т в холодильнике при 4-10 С. МАО активность диагностического препарата:

6,83-10 Е/мг белка (по тирамину);

5,60-10 Е/мг белка (по серотони -4

Е/мг белка (по бензилну );

4,65-10

амину).

Активность препарата сохран етс  в течение года.

Кактериостатическа  активность. Задержка роста культуры кишечной палочки в пробах с пленкой полученного диагностического препарата по сравнению с контролем 86J4%.

Механическа  сохранность в услови х многократного использовани : препарат стабилен в 50 циклах работы Один цикл работы п ть дней по п ть определений в день. После каждого

Пример 2. О,7 г желатина обливают 4 мл дистиллированной воды дп  набухани . Затем туда же добавл - ют 5 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,4 и нагревают при перемешивании до полного растворени  желатина. Далее раствор охлаждают до +20 С и внос т в него при перемешивании 1 г гослуча х обрабатывают 5 мл 8%-ного раствора ГА в течение 5 мин. После этого избыт.ок раствора ГА сливают, а гшенки многократно промьшают водой

на кафель, на котором нат нута капронова  сетка, и сушат в потоке воздуха в течение 2 ч. Сухую пленку в обоих

-4

10 Е/мг белка (по тирамину);

,-Ч

Е/мг белка (по серото5

МА.О активность диагностического 0 препарата:

6,85

5,50 10

Нину); 4

4,52 10 Е/мг белка (по бензипамину ).

Бактериостатическа  активность. Задержка роста культуры кишечной папочки в пробах с пленкой диагностического препарата по сравнению с контролем без пленки 86,0%. Препарат стабилен в 50 циклах работы.

Пример 3. 0,5г желатина обливают 4 мл дистиллированной воды дп  набухани . Затем туда же добавл ют 5 мл 0,05 М фосфатного буфера.

0

5

рН 7,4 и нагревают при перемешивании до полного растворени  желатина. Далее раствор охлаждают до +20 С и внос т в него при перемешивании 2 г гомогената митохондрий печени крысы (АО мг белка) в 0,07 М фосфатном буфере , рН 7,4. К полученному раствору добавл ют 1 мл раствора террилитина в воде с сзт марной активностью 50 ПЕ, т.е. 5 ПЕ/1 мл. Смесь перемешивают и по 5 мл выливают на полимерную мембрану и капроновую сетку, нат нутую на кафель, и высушивают в потоке воздуха при 20 С в течение 1 ч. Сухую пленку обрабатывают 5 мл 8%-ного раствора ГА в течение 4 мин. После этого избыток ГА сливают, а пленку многократно промьгоают водой и 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,5. Капроновую сетку с желатиновой пленкой снимают с поверхности кафел . Пленки высушивают в потоке воздуха при +25 С в течение 1ч.

МАО активность полученного диагностического препарата:

6,7610 Е/мг белка (по тирамину);

5, Е/мг белка (по серотонину );

,

4,71-10 Е/мг белка (по бензил- амину)

Бактериостатическа  активность. Задержка роста культуры кишечной палочки в пробах с пленкой диагностического препарата по сравнению с контролем без пленки 85,9%.

Препарат стабилен в 50 циклах работы .

Пример 4. 0,8 г желатина обливают 9 мл воды дл  набухани . Затем добавл ют 10 мл фосфатного бу- .фера с рН 7,4 и нагревают при перемешивании до растворени . Далее раствор охлаждают до +20 С и внос т в него при перемешивании 2 г суспензии митохондрий в фосфатном буфере, рН 7,4. К полученному раствору добавл ют 1 мл раствора террилитина в воде с суммарной концентрацией 10 ПЕ т.е. 0,5 ПЕ/1 мл. Смесь перемешивают, и выливают на полимерной мембране, Высушивают в потоке воздуха в течени 1 ч. Сухую пленку обрабатывают раствором ГА в течение 2 мин и промьшают аналогично примеру 3..

МАО активность диагностического препарата.

4,55-1 О Е/мг белка (по тирамиру) 3,7 10 Е/мг белка (по серото- нину) ; .

3, 1 10 Е/мг белка (по бензил- амину) .

0

0

5

0

5

0

5

0

5

Бактериостати {еска  активность. Задержка роста культуры в пробах с пленкой по сравнению с контролем 74,2%.

. Препарат пригоден дп  20 циклов работы.

Пример 5. 1,6г желатина обливают 15,6 мл воды дл  набухани . Затем добавл ют 20 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,4 и нагревают при перемешивании до растворени . Далее раствор охлаждают до +20 С и внос т в него при перемешивании 4 г суспензии митохондрий в фосфатном буфере, рН 7,4. К полученному раствору добавл ют 4,4 мл раствора террилитина в воде с суммарной протеолитической активностью , равной 440 единиц, т.е. 11 ПЕ/1 мл. Смесь перемешивают и выливают на нерастворимую подложку. Высушива от в потоке воздуха в течение 1 ч. Сухую пленку обрабатывают 8%-ным раствором ГА в течение 6 мин и промывают.

МАО активность диагностического препарата:

4,50-10 Е/мг белка (по тирамину);

3,7210 Е/мг белка (по серотонину );

3,2 10 Е/мг белка (по бензил- амину) .

Бактериостатическа  активность. Задержка роста культуры в пробах с пленкой по сравнению с контролем 67,8%.

Пленка имеет жесткую структуру, что про вл етс  как повьптенна  хрупкость . Препарат расслаиваетс  после 18-20 циклов работы.

Пример 6. 0,2г желатина помещают в пробирку с 2 мл дистиллированной воды дл  набухани . Затем туда же добавл ют I мл стандартного фосфатного буфера, рН 6,86, нагревают , перемешива  до кипени , при котором происходит полное растворение желатина. Далее раствор охлаждают до +35 С и внос т в него при перемешивании 0,4 мл гомогената митохондрий печени крыс (таких же, как в примере 3). Добавл ют 1,6 мл раствора террилитина с активностью 50 ПЕ, Затем в пробирку со смесью опускают чувствительную головку электрода, слегка подсушивают (I мин) его в струе воздуха при +20 С и снова опускают в раствор. Оперлцип повтор ют 5 раз, после чего высуглшают пленку

на поверхности электрода в струе воздуха в течение 15 мин при +20°С. Далее электрод с сухой пленкой опускают на 4 мин в 5%-ный раствор глутаро вого альдегида. Затем вынимают электрод и тщательно промывают его водой и фосфатным буфером, Поверхность электрода с планкой высушивают в струе воздуха при +20°С в течен-ие 15 мин и хран т в холодипьнике при 4-10°С. Дп  градуировки и в период работы электрод вымачивают в фосфатном буфере при рН 7,4 и хран т в нем в холодильнике,

МАО активность электрода: 6,7 10 Е/мг белка (по триамину) 5,45-10 Е/мг белка (по серото- нину);

4,0 1- 10 Е/мг белка (по бензил- амину).

МАО активность электрода сохран етс  в течение года. Желатинова  пленка на электроде механически стабильна в услови х использовани  и может примен тьс  дл  определени  моноаминов в течение года. Предел обнаружени  4,55 10 моль/л.

Бактериостатическа  характеристика пленки на электроде аналогична примерам 1, 2, 3.

МАО активность диагностического препарата в Е/мг, т,е. ju моль/мг белка по всем субстратам определ ют электрохимическим методом с помощью электрода с газовым затвором по количеству образовавшегос  йродукта ферментативной реакции - аммиака, )

Бактериостатическую активность определ ют и рассчитывают по задержке роста культуры кишечной палочки в присутствии желатиновых пленок без добавок, с- добавкой МАО и с добавкой МАО и террилитина. Дл  этих проб по сравнению с контролем задержка составл ет соответственно 57, 75 и 86%.

- Предел обнаружени  моноаминов с помощью ползгченных препаратов МАО

составл ет 4,410 - 4,5510 М.

Значительно возрастает активность целевого продукта по всем субстратам за счет добавлени  террилитина при иммобилизации (табл, 1), Улучшаютс  также механические свойства пленок,

Q что позвол ет длительно использовать их дл  проведени  анализа.

Таким образом, использование предлагаемого способа позвол ет получить препараты пленок дл  определени  мо5 ноаминов с улучшенными характеристиками за .счет повьш1ени  активности МАО в 1,5 раза, увеличени  механической прочности пленок и их антимикробного действи  (от 75 до 86%).

Claims (2)

1.Способ получени  препарата дл  определени  моноаминов на основе иммобилизованной моноаминооксидазы, включающий введение гомогената мито5 хондрйй, обладающих активностью моно- аминооксидазы, в водный раствор желатина , получение желатиновой пленки путем высушивани  нанесенного на нерастворимую подложку раствора желати0 на и обработку полученной пленки глу- таровым альдегидом, отличающийс  тем, что, с целью улучшени  характеристик препарата за счет повьшени  активности моноамино- оксидазы, механической прочности и антимикробных свойств пленки, после введени  гомогената митохондрий в водный раствор желатина к полученной суспензии добавл ют террилитин в количестве 1-10 протеолитических единиц на 1 мл объема и полученную смесь немедленно нанос т на нерастворимую подложку.

2.Спо ро б по п. 1, о т л и ч а 5

0

ю щ и и с  

тем, что обработку

пленки глутаровым альдегидом ведут в течение 3-5 мин.

Препарат с МАО активностью (без террилитина) Предлагаемый диагностический препарат с МАО активностью (содержащий террилитин)

4,55 «10 3,7 . Ю 3,1 10

6,8 10 5,6 ft) 4,6 . 10

- 4

Препарат с МАО активностью (без террилитина )

Предлагаемый диагностический препарат с МАО активностью:

7,3 7,3 7,1 5,6 Пленка расслаиваетс 

Таблица

1600

- 4

2400

Таблица 2