JPS61234781A - 細胞内酵素の安定化 - Google Patents
細胞内酵素の安定化Info
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- JPS61234781A JPS61234781A JP61046041A JP4604186A JPS61234781A JP S61234781 A JPS61234781 A JP S61234781A JP 61046041 A JP61046041 A JP 61046041A JP 4604186 A JP4604186 A JP 4604186A JP S61234781 A JPS61234781 A JP S61234781A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
微生物により触媒される方法（以後、微生物−触媒方法
と称す）は、精化学薬品（ファインケミカル）まｆＣ＆
’！、特殊化学薬品として知られる種々の化学物質の製
造に特に有用である。
と称す）は、精化学薬品（ファインケミカル）まｆＣ＆
’！、特殊化学薬品として知られる種々の化学物質の製
造に特に有用である。
微生物−触媒方法の最も重要な商業的応用は食品産業で
あるだろう。この種の方法の例は固定化グルコースイソ
メラーゼ（グルコース異性化酵素）によって触媒される
高フルクトース含量コーンシロップ（ＨＦＣ８）の製造
である。この方法はグルコースを転化して大体等モルの
フルクトースとグルコースの混合物を製造するものであ
り、この混合物は以後ＨＦＣ８と呼ぶことにする。
あるだろう。この種の方法の例は固定化グルコースイソ
メラーゼ（グルコース異性化酵素）によって触媒される
高フルクトース含量コーンシロップ（ＨＦＣ８）の製造
である。この方法はグルコースを転化して大体等モルの
フルクトースとグルコースの混合物を製造するものであ
り、この混合物は以後ＨＦＣ８と呼ぶことにする。
微生物−触媒方法によって製造されるその他の化学物質
の例は、食品添加物として、動物飼料において、および
医薬品において有用であるし一アミノ酸である。アミノ
酸を製造する場合、化学合成法は往々にして発酵法エリ
も簡単であるが、化学的方法はほとんどいつもアミノ酸
のラセミ混合物をもたらす。このラセミ混合物はその後
生物学的に活性なＬ−アミノ酸を得るために分割しなけ
ればならない。一方、微生物−触媒方法は主としてＬ−
アミノ酸を生産するであろう。
の例は、食品添加物として、動物飼料において、および
医薬品において有用であるし一アミノ酸である。アミノ
酸を製造する場合、化学合成法は往々にして発酵法エリ
も簡単であるが、化学的方法はほとんどいつもアミノ酸
のラセミ混合物をもたらす。このラセミ混合物はその後
生物学的に活性なＬ−アミノ酸を得るために分割しなけ
ればならない。一方、微生物−触媒方法は主としてＬ−
アミノ酸を生産するであろう。
多くの様々な微生物−触媒方法を触媒する酵素を固定化
すると、一般に目的生産物の収量が増加し且つ酵素の一
体性が保たれる。基本的に、固定化とは水溶性の可動状
態から水不溶性の固定状態へ酵素を転化することである
。酵素の固定化は、酵素がまだ生存微生物（細胞内）に
存在する間に、あるいは酵素が無細胞状態で存在する時
に行うことができる。固定化方法はこれらの２つの酵素
状態にエリ変わるであろう。従って、細胞内酵素に有効
な固定化条件が必ずしも細胞外酵素に適するとは限らず
、またその逆も同様であると理解すべきである。
すると、一般に目的生産物の収量が増加し且つ酵素の一
体性が保たれる。基本的に、固定化とは水溶性の可動状
態から水不溶性の固定状態へ酵素を転化することである
。酵素の固定化は、酵素がまだ生存微生物（細胞内）に
存在する間に、あるいは酵素が無細胞状態で存在する時
に行うことができる。固定化方法はこれらの２つの酵素
状態にエリ変わるであろう。従って、細胞内酵素に有効
な固定化条件が必ずしも細胞外酵素に適するとは限らず
、またその逆も同様であると理解すべきである。
本発明によれば、細胞と関連した活性酵素を有する微生
物細胞（完全な細胞または破壊した細胞）全部分的に修
飾し几陽イオン性高分子成解質と接触させることにより
細胞を凝結し、所望により包膜（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔ
ｉｏｎ ）する方法を用いて、前記微生物細胞を安定化
する。この方法の驚くべき効果を実現するためには、高
分子電解質（例えばポリアミン）を部分的に修飾するこ
とが重要である。
物細胞（完全な細胞または破壊した細胞）全部分的に修
飾し几陽イオン性高分子成解質と接触させることにより
細胞を凝結し、所望により包膜（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔ
ｉｏｎ ）する方法を用いて、前記微生物細胞を安定化
する。この方法の驚くべき効果を実現するためには、高
分子電解質（例えばポリアミン）を部分的に修飾するこ
とが重要である。
例えば、グルコースイソメラーゼ産生性微生物細胞（以
後に記す）を部分的に修飾したポリアミンと接触させた
場合、前記微生物細胞の半減期は約１４８４時間である
と概算されろ同じ微生物細胞を未修飾ポリアミンと接触
させた対照は約６６９時間の半減期を示した。完全にカ
ルボキシメチル化したポリエチレンイミン（ＰＥ工）に
ついても試験した。完全にカルボキシメチル化し７’（
ＰＥ工との接触は約３１０時間の半減期を示した。高分
子電解質の部分的修飾はカルボキシアルキル化またはホ
スホノアルキル化によって行うことができ、この場合の
アルキルは−（Ｃ’Ｈ２）４− （ｎ ＝ １〜３ 、
好ましくはｎ＝１）、または−（ＣＨＲ）−（ＣＨ２）
；！−（Ｒ＝メチル、エチル、プロピルまたはイングロ
ビル基、およびｎ ＝ ｌまたは２）である。
後に記す）を部分的に修飾したポリアミンと接触させた
場合、前記微生物細胞の半減期は約１４８４時間である
と概算されろ同じ微生物細胞を未修飾ポリアミンと接触
させた対照は約６６９時間の半減期を示した。完全にカ
ルボキシメチル化したポリエチレンイミン（ＰＥ工）に
ついても試験した。完全にカルボキシメチル化し７’（
ＰＥ工との接触は約３１０時間の半減期を示した。高分
子電解質の部分的修飾はカルボキシアルキル化またはホ
スホノアルキル化によって行うことができ、この場合の
アルキルは−（Ｃ’Ｈ２）４− （ｎ ＝ １〜３ 、
好ましくはｎ＝１）、または−（ＣＨＲ）−（ＣＨ２）
；！−（Ｒ＝メチル、エチル、プロピルまたはイングロ
ビル基、およびｎ ＝ ｌまたは２）である。
固定化細胞をポリマーの保護層で包膜することにより、
その固定化酵素をさらに安定化することができる。一般
に、包膜は酵素の半減期を２倍に増加させることが見出
された。付加的なこの酵素安定化は６〜８．５のｐＨ範
囲、有利にはｐＨ６〜７．５で実施される方法に対して
応用できる。異性化方法をより低いｐＨで行う利点は（
１）異性化の前後のｐＨ調整が最小限に抑えられる；（
２）副産物の形成が抑制され、その結果精製コストが低
下する；および（３）一層純粋なＨＦＣ８が得られる；
ということであり、これらの利点はＨＦＯ８の生産者に
よく知られている。
その固定化酵素をさらに安定化することができる。一般
に、包膜は酵素の半減期を２倍に増加させることが見出
された。付加的なこの酵素安定化は６〜８．５のｐＨ範
囲、有利にはｐＨ６〜７．５で実施される方法に対して
応用できる。異性化方法をより低いｐＨで行う利点は（
１）異性化の前後のｐＨ調整が最小限に抑えられる；（
２）副産物の形成が抑制され、その結果精製コストが低
下する；および（３）一層純粋なＨＦＣ８が得られる；
ということであり、これらの利点はＨＦＯ８の生産者に
よく知られている。
本明細書で用いる”凝結（ｆ’１ｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ
）”とは、高分子電解質を使用して水性媒体中の小さ
な粒状物を凝集させる方法を意味する。凝結剤は発酵培
地から微生物細胞を単離しやすくするために都合よく使
用された。発酵培地中に適音存在する細胞物質の固定化
において、凝結は次の理由：すなわち（１）細胞物質の
単離および脱水を容易にする；および（２）添加剤を加
えて細胞物質と共に同時凝結させ、それにより固定化酵
素調製物に望ましい性質を付与する；のために用いられ
る。Ｐ、Ｉ、、プツシ−ＩＬ （Ｂｕｓｃｈ ）および
Ｗ、スタム（ｓｔｕｍｎ）の環境Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
） ２ 、４９〜５３ （１９６８年１月）；ならびに
り、Ｌ、ガスチー（Ｇａｒｎｅｒ ）およびり、工、Ｃ
１Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ） １２ 、８７３〜
８８７（１９７０）を参照されたい。
）”とは、高分子電解質を使用して水性媒体中の小さ
な粒状物を凝集させる方法を意味する。凝結剤は発酵培
地から微生物細胞を単離しやすくするために都合よく使
用された。発酵培地中に適音存在する細胞物質の固定化
において、凝結は次の理由：すなわち（１）細胞物質の
単離および脱水を容易にする；および（２）添加剤を加
えて細胞物質と共に同時凝結させ、それにより固定化酵
素調製物に望ましい性質を付与する；のために用いられ
る。Ｐ、Ｉ、、プツシ−ＩＬ （Ｂｕｓｃｈ ）および
Ｗ、スタム（ｓｔｕｍｎ）の環境Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
） ２ 、４９〜５３ （１９６８年１月）；ならびに
り、Ｌ、ガスチー（Ｇａｒｎｅｒ ）およびり、工、Ｃ
１Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ） １２ 、８７３〜
８８７（１９７０）を参照されたい。
色層（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ）とは膜状の外被
で粒子を包囲することである。酵素学の分野において、
酵素または酵素産生性微生物のミクロ色層は、固定化お
よび酵素安定化の手段として用いられた。
で粒子を包囲することである。酵素学の分野において、
酵素または酵素産生性微生物のミクロ色層は、固定化お
よび酵素安定化の手段として用いられた。
一般に、酵素は半透膜で包囲される。半透膜は酵素が基
質溶液へ漏れ出るの全防ぎ且つ不純物が酵素に接近して
酵素失活を促進するのを妨げるためのバリヤーとして役
立つ。Ｔ、Ｍ、Ｓ、チャンク（Ｃ！ｈａｎｇ ）のサイ
エンス、１４６．５２４（１９６４）’（ｌ−参照され
たい。本発明によれば、固定化酵素（ｉｍｍｏｂｉｌｉ
ｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ、ＩＭＥ ）は例えば部分的にカ
ルボキシメチル化したＰＥＩの溶液中に１Ｍ８粒子を浸
漬（または被覆）して、架橋反応の際に不溶化される薄
い膜状外被全形成させることにより色層される。
質溶液へ漏れ出るの全防ぎ且つ不純物が酵素に接近して
酵素失活を促進するのを妨げるためのバリヤーとして役
立つ。Ｔ、Ｍ、Ｓ、チャンク（Ｃ！ｈａｎｇ ）のサイ
エンス、１４６．５２４（１９６４）’（ｌ−参照され
たい。本発明によれば、固定化酵素（ｉｍｍｏｂｉｌｉ
ｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ、ＩＭＥ ）は例えば部分的にカ
ルボキシメチル化したＰＥＩの溶液中に１Ｍ８粒子を浸
漬（または被覆）して、架橋反応の際に不溶化される薄
い膜状外被全形成させることにより色層される。
本発明の実施に際して使用できる架橋剤には二官能性お
よび／または多官能性試薬が含まれ、例えばグルタルア
ルデヒド、グリオキサール、ジアルデヒド澱粉およびポ
リグルタルアルデヒドのよウナアルデヒド類；トルエン
−２，４−ジインシアネート、ヘキサメチレン−ジイソ
シアネートおよびジフェニル−メタン−ジイソシアネー
トのようなイソシアネート類；ポリメタクリル酸無水物
およびポリ（エチレン−マレイン酸無水物）のような酸
無水物類；ｌ−シクロへキシル−３−（２−モルホリノ
エチル）カルボジイミドおよびメト−Ｏ−）ルエンスル
ホネートーＮ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド
のような水溶性カルボジイミド類；塩化シアヌルの工う
なりロルトリアジン顕；ヒスージアゾベンジジン−３，
３′−ジスルホネートおよびテトラアゾ化−〇−ジアニ
シジンの工うなジアゾ化合物類；１，３−ジフルオル−
４，６−シニトロベンゼンのようなジフルオルベンゼン
類；エピクロルヒドリンのようなエポキシ化合物類；ク
ロル蟻酸エチルのようなホスゲン誘導体；お工び臭化ブ
ロムアセチルの↓うなハロゲノアルキル誘導体が含まれ
る。
よび／または多官能性試薬が含まれ、例えばグルタルア
ルデヒド、グリオキサール、ジアルデヒド澱粉およびポ
リグルタルアルデヒドのよウナアルデヒド類；トルエン
−２，４−ジインシアネート、ヘキサメチレン−ジイソ
シアネートおよびジフェニル−メタン−ジイソシアネー
トのようなイソシアネート類；ポリメタクリル酸無水物
およびポリ（エチレン−マレイン酸無水物）のような酸
無水物類；ｌ−シクロへキシル−３−（２−モルホリノ
エチル）カルボジイミドおよびメト−Ｏ−）ルエンスル
ホネートーＮ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド
のような水溶性カルボジイミド類；塩化シアヌルの工う
なりロルトリアジン顕；ヒスージアゾベンジジン−３，
３′−ジスルホネートおよびテトラアゾ化−〇−ジアニ
シジンの工うなジアゾ化合物類；１，３−ジフルオル−
４，６−シニトロベンゼンのようなジフルオルベンゼン
類；エピクロルヒドリンのようなエポキシ化合物類；ク
ロル蟻酸エチルのようなホスゲン誘導体；お工び臭化ブ
ロムアセチルの↓うなハロゲノアルキル誘導体が含まれ
る。
本発明は細胞と関連した活性酵素を有する完全なまたは
破壊した微生物細胞を安定化および凝結させ、所望によ
り色層する方法に関する。この方法は微生物細胞が固定
系に存在する場合に特に有用である。固定化それ自体は
細胞内酵素の安定化方法と考えられるが、本発明方法は
特定酵素の半減期から測定してその安定性を増加させ、
且つまた完全なまたは破壊した微生物ａ胞を有利に凝結
させる。その最終結果は微生物−触媒方法における改良
された酵素使用方法を提供する。
破壊した微生物細胞を安定化および凝結させ、所望によ
り色層する方法に関する。この方法は微生物細胞が固定
系に存在する場合に特に有用である。固定化それ自体は
細胞内酵素の安定化方法と考えられるが、本発明方法は
特定酵素の半減期から測定してその安定性を増加させ、
且つまた完全なまたは破壊した微生物ａ胞を有利に凝結
させる。その最終結果は微生物−触媒方法における改良
された酵素使用方法を提供する。
本発明方法は、固定化グルコースイソメラーゼヲ用いて
グルコースをフルクトースに転化する方法について述べ
ることによりここに詳細に例示されるであろう。類似の
技術が他の酵素を産生する微生物細胞に対して使用でき
る。この種の他の微生物細胞の使用を受は入れる際に必
要とされる修飾は、微生物酵素の分野における当業者の
技術の範囲内である。
グルコースをフルクトースに転化する方法について述べ
ることによりここに詳細に例示されるであろう。類似の
技術が他の酵素を産生する微生物細胞に対して使用でき
る。この種の他の微生物細胞の使用を受は入れる際に必
要とされる修飾は、微生物酵素の分野における当業者の
技術の範囲内である。
グルコースイソメラーゼは米国特許第
４３０８３４９号第１欄、２６〜３２行に記載されるよ
うに多数の微生物に工って産生される。前５ｐｅｃｉｅ
θ）は特に優れたグルコースイソメラーゼ産生菌である
ことが見出された。一般に入手可能な当分野で知られた
その他のグルコースイソメラーゼ産生菌も、本発明方法
で使用するグルコースイソメラーゼを産生させるために
利用できる。
うに多数の微生物に工って産生される。前５ｐｅｃｉｅ
θ）は特に優れたグルコースイソメラーゼ産生菌である
ことが見出された。一般に入手可能な当分野で知られた
その他のグルコースイソメラーゼ産生菌も、本発明方法
で使用するグルコースイソメラーゼを産生させるために
利用できる。
細胞と関連した活性酵素を有する微生物細胞（完全なま
たは破壊した細胞）は、部分的に修飾した陽イオン性高
分子電解質と接触させる。有利には、この修飾は当分野
でよく知られた方法を使って高分子電解質をカルボキシ
アルキル化することにより行われる。例えば、米国特許
第３４２４７９０号を参照されたい。この特許はカルボ
キシメチル化ポリエチレンイミンの製造方法を開示して
いる。高分子電解質はその他にホスホノアルキル化によ
っても部分修飾され得る。ホスホノアルキル化は周知の
方法であり、例えばウェスターバック（Ｗｅｓｔｅｒｂ
ａｃｋ）ものジャーナル・（Ｊ、Ａｍ、Ｃ！ｈｅｍ、ｓ
ｏｃ、） ８７ 、２５６７の（１９６５）；メーデリ
ツツア−（Ｍｃｅｄｒｉｔｚｅｒ ）らのジャーナＣｈ
ｅｍ、 ） ３１ 、１６０３ （１９６６） ｋ参照
されたい。上記のカルボキシアルキル化およびホスホノ
アルキル化におけるアルキルは−（ｃＨｚ）Ｈ−（ここ
でｎ＝１〜３、好ましくはｎ＝１）、または−（ＣＨＲ
）−（ＯＨ２）ルー（ここでＲ＝メチル、エチル、プロ
ピルまたはイソプロピル、ｎ＝１または２）である。
たは破壊した細胞）は、部分的に修飾した陽イオン性高
分子電解質と接触させる。有利には、この修飾は当分野
でよく知られた方法を使って高分子電解質をカルボキシ
アルキル化することにより行われる。例えば、米国特許
第３４２４７９０号を参照されたい。この特許はカルボ
キシメチル化ポリエチレンイミンの製造方法を開示して
いる。高分子電解質はその他にホスホノアルキル化によ
っても部分修飾され得る。ホスホノアルキル化は周知の
方法であり、例えばウェスターバック（Ｗｅｓｔｅｒｂ
ａｃｋ）ものジャーナル・（Ｊ、Ａｍ、Ｃ！ｈｅｍ、ｓ
ｏｃ、） ８７ 、２５６７の（１９６５）；メーデリ
ツツア−（Ｍｃｅｄｒｉｔｚｅｒ ）らのジャーナＣｈ
ｅｍ、 ） ３１ 、１６０３ （１９６６） ｋ参照
されたい。上記のカルボキシアルキル化およびホスホノ
アルキル化におけるアルキルは−（ｃＨｚ）Ｈ−（ここ
でｎ＝１〜３、好ましくはｎ＝１）、または−（ＣＨＲ
）−（ＯＨ２）ルー（ここでＲ＝メチル、エチル、プロ
ピルまたはイソプロピル、ｎ＝１または２）である。
高分子電解質の修飾（例えばポリエチレンイミンのカル
ボキシメチル化）の量は高分子電解質の０．１〜１．０
当量、好ましくは０．２５〜０．５当量の範囲で変化し
うる。これは限定量のクロル酢酸（全窒素含量により測
定して高分子電解質の０．１〜１．０当量）を反応させ
ることにエリ達成される。
ボキシメチル化）の量は高分子電解質の０．１〜１．０
当量、好ましくは０．２５〜０．５当量の範囲で変化し
うる。これは限定量のクロル酢酸（全窒素含量により測
定して高分子電解質の０．１〜１．０当量）を反応させ
ることにエリ達成される。
従って、本明細書においてＣＭ −ＰＥ工の前に示され
る分数は、合成で更用されるクロル酢酸とＰＥＩ中の全
窒素含量との化学量論的比ｋＷわす。
る分数は、合成で更用されるクロル酢酸とＰＥＩ中の全
窒素含量との化学量論的比ｋＷわす。
本発明の範囲に含まれる高分子電解質（上記の工うな部
分修飾が可能なもの）は陽イオン性高分子電解質として
分類されるものであり、例えばポリアミン類（第一、第
二、第三および第四アミン類）；ポリリシンのようなポ
リアミノ酸類；ポリジメチルアミノプロピルメタクリル
アミドのような陽イオン注ポリアクリルアミド類；トリ
エチレンテトラミンでアミン化されたポリ（塩化ビニル
）のような陽イオン性ポリ（塩化ビニル）；スチレン−
ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド（５０：５０
）コポリマーのＬつな陽イオン性コポリマー；お工びプ
リフロックＣ−３１（Ｐｕｒｉｆｌｏｃ Ｏ−３１；ダ
ウ・ケミカル社の商標名）のような陽イオン性凝結剤で
ある。
分修飾が可能なもの）は陽イオン性高分子電解質として
分類されるものであり、例えばポリアミン類（第一、第
二、第三および第四アミン類）；ポリリシンのようなポ
リアミノ酸類；ポリジメチルアミノプロピルメタクリル
アミドのような陽イオン注ポリアクリルアミド類；トリ
エチレンテトラミンでアミン化されたポリ（塩化ビニル
）のような陽イオン性ポリ（塩化ビニル）；スチレン−
ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド（５０：５０
）コポリマーのＬつな陽イオン性コポリマー；お工びプ
リフロックＣ−３１（Ｐｕｒｉｆｌｏｃ Ｏ−３１；ダ
ウ・ケミカル社の商標名）のような陽イオン性凝結剤で
ある。
固定化細胞系で使用する場合、部分修飾した陽イオン性
高分子電解質はその固定系の中に組み込まれる。従って
、それは原料および生産物から物理的に分離される。こ
の特徴は、都合がよいことに、その部分修飾した陽イオ
ン性高分子電解質を最終生成物から取り除く必要性を排
除する。また、部分修飾した陽イオン性高分子電解質は
固定系の中に”組み入れられる”ので、原料の予備処理
金全く必要としない。このことは固定系を使用する場合
の生産コスＩｆ最小限に抑える。
高分子電解質はその固定系の中に組み込まれる。従って
、それは原料および生産物から物理的に分離される。こ
の特徴は、都合がよいことに、その部分修飾した陽イオ
ン性高分子電解質を最終生成物から取り除く必要性を排
除する。また、部分修飾した陽イオン性高分子電解質は
固定系の中に”組み入れられる”ので、原料の予備処理
金全く必要としない。このことは固定系を使用する場合
の生産コスＩｆ最小限に抑える。
本発明方法の他の有利な面は、固定化グルコースイソメ
ラーゼ系に応用した場合に見られる。この方法は表１に
示すように公知の商品よりも広い使用可能なｐＨ範囲（
ｐＨ６〜８．５）ｔ−有する。
ラーゼ系に応用した場合に見られる。この方法は表１に
示すように公知の商品よりも広い使用可能なｐＨ範囲（
ｐＨ６〜８．５）ｔ−有する。
表 ■
種々のｐＨお工び６０℃での固定化グルコースイソメラ
ーゼの半減期 ｔ３Ａ（時間） ０．２５ＣＭ−ＰＦＪ工で凝結したＡｍｐ ３５
２ １２４８ １４８４ノボ・スイーザイムＱ”
１４７ ４５２ １４９０Ｇ、Ｂ、 マツク
サザイム＊＊＊ １３０ ３２５ １１４３
（Ｍａｘａｚｙｍｅ） 基質は３ｍＭＭｇ および０．０２％アジ化ナトリウ
ム全含有する５０％（重量／容量）グルコースであった
。
ーゼの半減期 ｔ３Ａ（時間） ０．２５ＣＭ−ＰＦＪ工で凝結したＡｍｐ ３５
２ １２４８ １４８４ノボ・スイーザイムＱ”
１４７ ４５２ １４９０Ｇ、Ｂ、 マツク
サザイム＊＊＊ １３０ ３２５ １１４３
（Ｍａｘａｚｙｍｅ） 基質は３ｍＭＭｇ および０．０２％アジ化ナトリウ
ム全含有する５０％（重量／容量）グルコースであった
。
＊＊ デンマーク国、バグスバード、ノボ・インダス
トリーズＡ／Ｓの商標名 ＊＊大 オランダ国、ギストーブローカデスＮＶ（Ｇｉ
ｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ ）の商標名 部分修飾した陽イオン性高分子電解質（ＣＭ−ＰＥＩ）
により安定化された固定化酵素系はまた、原料中に存在
する不純物に対して感受性がより乏しい。
トリーズＡ／Ｓの商標名 ＊＊大 オランダ国、ギストーブローカデスＮＶ（Ｇｉ
ｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ ）の商標名 部分修飾した陽イオン性高分子電解質（ＣＭ−ＰＥＩ）
により安定化された固定化酵素系はまた、原料中に存在
する不純物に対して感受性がより乏しい。
固定化細胞の色層は酵素の安定性を非常に高める。色層
は凝結細胞（粒子）″または凝結−架橋細胞に対して行
われる。細胞を色層するのに使用できるポリマーは、微
生物細胞の凝結のために本明細書において記載したもの
と同じである。
は凝結細胞（粒子）″または凝結−架橋細胞に対して行
われる。細胞を色層するのに使用できるポリマーは、微
生物細胞の凝結のために本明細書において記載したもの
と同じである。
色層に使用される高分子電解質は微生物細胞の凝結に使
用されるものより高度に修飾することができる。この修
飾は高分子電解質の０，２〜１．０当量、好ましくは０
．４〜０３７５当量であり得る。
用されるものより高度に修飾することができる。この修
飾は高分子電解質の０，２〜１．０当量、好ましくは０
．４〜０３７５当量であり得る。
固定化酵素触媒は適当なサイズの粒子、例えば直径が５
００〜８４０ミクロン、長さが０．２５４〜０．５０８
０（０，１〜０．２インチ）の褐色ないし暗褐色をした
円筒状粒子として調製される。これらの粒子は暗反応器
内での２０００時間以上の連・ 続作業に対して十分な
構造安定性を有している。
００〜８４０ミクロン、長さが０．２５４〜０．５０８
０（０，１〜０．２インチ）の褐色ないし暗褐色をした
円筒状粒子として調製される。これらの粒子は暗反応器
内での２０００時間以上の連・ 続作業に対して十分な
構造安定性を有している。
本発明方法の有利な面を要約すると、部分的にカルボキ
シメチル化したＰＥＩにより例示されるように、（１）
微生物および酵素を非常によく凝結する；（２）グルコ
ース供給原料流に存在する不純物および／または金属イ
オンを除去するのに有効な基（例えばＨＮ −ＯＨ，−
０００Ｈ） ′に含有する；および（３）細胞物質と凝
結剤とを共有結合により架橋するための第一アミ／官能
基を含有する；ということになる。
シメチル化したＰＥＩにより例示されるように、（１）
微生物および酵素を非常によく凝結する；（２）グルコ
ース供給原料流に存在する不純物および／または金属イ
オンを除去するのに有効な基（例えばＨＮ −ＯＨ，−
０００Ｈ） ′に含有する；および（３）細胞物質と凝
結剤とを共有結合により架橋するための第一アミ／官能
基を含有する；ということになる。
次の実施例は本発明の方法および生産物について示す。
特に指定しない限り、全ての百分率は重量基準であり、
全ての溶媒混合物の割合は容量基準である。
全ての溶媒混合物の割合は容量基準である。
実施例１−凝結
の完全細胞の懸濁液５００＊／（３，３１％の固形分を
含有する）ｉ５Ｎ水酸化カリウムでｐＨ８，０に調整し
た。これに部分カルボキシメチル化ポリエチレンイミン
（（Ｃ！Ｍ−ＰＥ工〕； ＣＭ対ＰＥ工の比０．２５、
ｐＨ７，０において１００ｄあたり０．０１ｇ当量の窒
素を含む）１に１分間激しく攪拌しながら加え、次に５
分以上穏やかＫｆ！拌した。凝結した細胞は５２００
ｒｐｍでＩＥＣＥＣ化学遠心機バスケラ（１，Ｅ、 ＋
１３０３、直径１２．７ｃ！ｒＩＸ深さ６．３５ＩＭ（
５インチ×２３Ａインチ）、インターナショナルーイク
イブメント社（工ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｑｕｉｐ
ｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ ）、ニードハムＨｔ、、ｖ
サチューセッツ州〕の中に集め、ミリーＱウォーター
（： Ｍｉｌｌｉ −Ｑ ｗａｔｅｒ ；高度に精製さ
れた水に対するミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ
ｒｐ、 、ミル７オード、マサチューセッツ州）の商標
名）１５００ゴで洗った。その後、この細胞ペーストを
７０’Ｃで１時間加熱した。加熱処理した細胞（約３０
〜４０チの固形分を含有する）は４０００ ｐｓｉ（２
７，５７８８Ｎ／ｄ）でフレンチプレス（アメリカンー
インスツルメント社、シルバースプリング、メリーラン
ド州）上の押出管（内径０．７６２鵡）ヲ通してアセト
ン８００ｄ中に押出した。アセトン浴中で１時間脱水し
た後、この押出物全集め、真空オーブン内でさらに２〜
３時間乾燥して残留アセトンを除き、次いでワーリング
プレンダ−（３Ｘ５秒パルス）を用いて粒子状にし、そ
して篩分けした。５００〜８４０ミクロンの粒子を架橋
および安定性試験のために使用した。
含有する）ｉ５Ｎ水酸化カリウムでｐＨ８，０に調整し
た。これに部分カルボキシメチル化ポリエチレンイミン
（（Ｃ！Ｍ−ＰＥ工〕； ＣＭ対ＰＥ工の比０．２５、
ｐＨ７，０において１００ｄあたり０．０１ｇ当量の窒
素を含む）１に１分間激しく攪拌しながら加え、次に５
分以上穏やかＫｆ！拌した。凝結した細胞は５２００
ｒｐｍでＩＥＣＥＣ化学遠心機バスケラ（１，Ｅ、 ＋
１３０３、直径１２．７ｃ！ｒＩＸ深さ６．３５ＩＭ（
５インチ×２３Ａインチ）、インターナショナルーイク
イブメント社（工ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｑｕｉｐ
ｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ ）、ニードハムＨｔ、、ｖ
サチューセッツ州〕の中に集め、ミリーＱウォーター
（： Ｍｉｌｌｉ −Ｑ ｗａｔｅｒ ；高度に精製さ
れた水に対するミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ
ｒｐ、 、ミル７オード、マサチューセッツ州）の商標
名）１５００ゴで洗った。その後、この細胞ペーストを
７０’Ｃで１時間加熱した。加熱処理した細胞（約３０
〜４０チの固形分を含有する）は４０００ ｐｓｉ（２
７，５７８８Ｎ／ｄ）でフレンチプレス（アメリカンー
インスツルメント社、シルバースプリング、メリーラン
ド州）上の押出管（内径０．７６２鵡）ヲ通してアセト
ン８００ｄ中に押出した。アセトン浴中で１時間脱水し
た後、この押出物全集め、真空オーブン内でさらに２〜
３時間乾燥して残留アセトンを除き、次いでワーリング
プレンダ−（３Ｘ５秒パルス）を用いて粒子状にし、そ
して篩分けした。５００〜８４０ミクロンの粒子を架橋
および安定性試験のために使用した。
架橋
細胞粒子７ｐ’１ｐＨ８，０のグルタルアルデヒド溶液
（２５％グルタルアルデヒド４．２ｄ、水１６．８ｍお
よび０．２Ｍ燐酸カリウム２１ｄを含有する）４２麓ｌ
中に加えた。これｔ−ｚｏｏｒｐｍの振とう浴中２５℃
で１時間インキュベートした。
（２５％グルタルアルデヒド４．２ｄ、水１６．８ｍお
よび０．２Ｍ燐酸カリウム２１ｄを含有する）４２麓ｌ
中に加えた。これｔ−ｚｏｏｒｐｍの振とう浴中２５℃
で１時間インキュベートした。
生成した架橋粒子をガラスｆ過器上に集め、ミリーＱウ
ォーター３ Ｘ ２００ ｅｌｌで洗い、真空オーブン
内室温で２４時間乾燥した。粒子を再び篩分けし、５０
０〜８４０ミクロンの画分を塔反応器での実験に使用し
た。固定化酵素（ＩＭＥ）のグルコースイソメラーゼ活
性は、０．２５Ｍマレイン酸塩緩衝液中に５チグルコー
ス、５０ｍＭＭｇ＋＋および１ ｍＭ Ｃｏ＋＋ｆ含有
する基質ｉ ｐＨ６，５，７０℃でバッチ検定すること
により測定して、６３±３ＧＩＵ／ｐであった（ Ｉ
ＧＩＵは標準検定条件下で１分あたり１マイクロモルの
グルコースのフルクトースへの異性化を触媒するグルコ
ースイソメラ−ゼ（ＧＩ）活性として定義される）。
ォーター３ Ｘ ２００ ｅｌｌで洗い、真空オーブン
内室温で２４時間乾燥した。粒子を再び篩分けし、５０
０〜８４０ミクロンの画分を塔反応器での実験に使用し
た。固定化酵素（ＩＭＥ）のグルコースイソメラーゼ活
性は、０．２５Ｍマレイン酸塩緩衝液中に５チグルコー
ス、５０ｍＭＭｇ＋＋および１ ｍＭ Ｃｏ＋＋ｆ含有
する基質ｉ ｐＨ６，５，７０℃でバッチ検定すること
により測定して、６３±３ＧＩＵ／ｐであった（ Ｉ
ＧＩＵは標準検定条件下で１分あたり１マイクロモルの
グルコースのフルクトースへの異性化を触媒するグルコ
ースイソメラ−ゼ（ＧＩ）活性として定義される）。
固定化酵素の半減期（ｔ％）の安定性は逆流式％式％
って６０℃、流速３０！／／時間、および滞留時間約２
０分で測定した。この実験で使用した基質は高フルクト
ース含量コーンシロップの生産者が使用するものと同様
に、５０チグルコース（重量／容量）、３ｍＭＭｇ’ｉ
含んでいた。アジ化ナトリウム（０，０２％）を抗菌剤
として加えた。
０分で測定した。この実験で使用した基質は高フルクト
ース含量コーンシロップの生産者が使用するものと同様
に、５０チグルコース（重量／容量）、３ｍＭＭｇ’ｉ
含んでいた。アジ化ナトリウム（０，０２％）を抗菌剤
として加えた。
０．２５ ＣＭ−ＰＥＩにより凝結し且つ架橋したアン
プラリエラ３８７６細胞の半減期はｐ！（８，２におい
て１４８４時間であると概算され、これに対して凝結剤
としてポリエチレンイミン製品のＰＥエーロ００〔コル
ドパ・ケミカル社（Ｃｏｒｄｏｖａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｍｐａｎｙ ） 、マスキーガン、ミシガン州〕を
使って同様に調製した対照のｔ％は６６９時間であった
（表り参照）。
プラリエラ３８７６細胞の半減期はｐ！（８，２におい
て１４８４時間であると概算され、これに対して凝結剤
としてポリエチレンイミン製品のＰＥエーロ００〔コル
ドパ・ケミカル社（Ｃｏｒｄｏｖａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｍｐａｎｙ ） 、マスキーガン、ミシガン州〕を
使って同様に調製した対照のｔ％は６６９時間であった
（表り参照）。
表■
ｐＨ８，２，６０℃における部分カルボキシメチル化ポ
リエチレンイミ／で凝結し且つグルタルアルデヒドで架
橋したアンプラリエラ細胞の安定性０．２５
１４８４０．５
１１８１１．０ ９８３２．
０ ３１０実施例２ （ＣＭ対ＰＥ工の比０．５）’に用いて凝結し、上記の
ように１５チグルタルアルデヒドを用いて架橋した。
リエチレンイミ／で凝結し且つグルタルアルデヒドで架
橋したアンプラリエラ細胞の安定性０．２５
１４８４０．５
１１８１１．０ ９８３２．
０ ３１０実施例２ （ＣＭ対ＰＥ工の比０．５）’に用いて凝結し、上記の
ように１５チグルタルアルデヒドを用いて架橋した。
こうして調製されたＩＭＥのｔ％は９５８時間であった
。
。
上記実施例において調製された酵素触媒は暗褐色をした
円筒形である。粒子のサイズは直径が約５００〜８４０
ミクロンであり、長さが）０．２５４０（９，１インチ
）である。これは塔反応器内での２０００時間以上の連
続作業に対して十分な物理的安定性を有している。
円筒形である。粒子のサイズは直径が約５００〜８４０
ミクロンであり、長さが）０．２５４０（９，１インチ
）である。これは塔反応器内での２０００時間以上の連
続作業に対して十分な物理的安定性を有している。
実施例３
実施例１および２に記載の方法に従ってアンプラリエラ
３８７６の完全細胞を完全にカルボキシメチル化したＰ
ＥＩで凝結し且つグルタルアルデヒドで架橋した場合、
実施例１および２に記載の部３８７６と比較して、安定
性がより劣った固定化グルコースイソメラーゼが得られ
た。ｔ３ＡはｐＨ８，２において３１０時間であると概
算された。
３８７６の完全細胞を完全にカルボキシメチル化したＰ
ＥＩで凝結し且つグルタルアルデヒドで架橋した場合、
実施例１および２に記載の部３８７６と比較して、安定
性がより劣った固定化グルコースイソメラーゼが得られ
た。ｔ３ＡはｐＨ８，２において３１０時間であると概
算された。
実施例４
アンプラリエラ３８７６の完全細胞を表■に示した６％
凝結剤（細胞物質の全乾燥重量基準）を用いて凝結し且
つ実施例１に記載の方法に従って１５％グルタルアルデ
ヒドで架橋した。こうして得られたアンプラリエラ３８
７６の固定化細胞の半減期は実施例１と同じ方法でｐＨ
６，６，６０℃において測定した（表Ｉ参照）。
凝結剤（細胞物質の全乾燥重量基準）を用いて凝結し且
つ実施例１に記載の方法に従って１５％グルタルアルデ
ヒドで架橋した。こうして得られたアンプラリエラ３８
７６の固定化細胞の半減期は実施例１と同じ方法でｐＨ
６，６，６０℃において測定した（表Ｉ参照）。
表 ｌ
ｐＨ６，６，６０℃における種々の凝結剤を用いての固
定化アンプラリエラ３８７６の安定性比較ｐｇ工
１５６０．２５ ＣＭ−ｐ
Ｈ：Ｉ ３５２０．４（！Ｍ−
ＰＥ工 ３５７ｏ、ｓ ６’Ｍ
−ｐｚ工 ６８３プリフロックＣ！−
３１２２１ ０，２５ＣＭ−プリフロック０−３１ ３２
９０．１００Ｍ−プリフロック（！−３１２９８実施例
５−架橋前の色層 実施例１に記載のようにして調製した凝結段階の粒子を
、部分修飾したＣ！Ｍ−１：ｒ （ＣＭ対Ｎの比０．４
）の溶液（細胞物質１ｙあたりＦＢＩ ６％含有）中に
浸漬した。蒸発および一晩凍結乾燥することにより大部
分の水を除去し、色層および凝結した粒子を次のように
してグルタルアルデヒドで架橋した。
定化アンプラリエラ３８７６の安定性比較ｐｇ工
１５６０．２５ ＣＭ−ｐ
Ｈ：Ｉ ３５２０．４（！Ｍ−
ＰＥ工 ３５７ｏ、ｓ ６’Ｍ
−ｐｚ工 ６８３プリフロックＣ！−
３１２２１ ０，２５ＣＭ−プリフロック０−３１ ３２
９０．１００Ｍ−プリフロック（！−３１２９８実施例
５−架橋前の色層 実施例１に記載のようにして調製した凝結段階の粒子を
、部分修飾したＣ！Ｍ−１：ｒ （ＣＭ対Ｎの比０．４
）の溶液（細胞物質１ｙあたりＦＢＩ ６％含有）中に
浸漬した。蒸発および一晩凍結乾燥することにより大部
分の水を除去し、色層および凝結した粒子を次のように
してグルタルアルデヒドで架橋した。
架橋−一色層した粒子５ｙ’ｉ０．１Ｍ燐酸カリウム緩
衝液（ｐａ８．０）中のグルタルアルデヒド０．７５Ｆ
含有架橋用溶液１５ｍｊに加えた。これを２００ ｒｐ
ｍの振とう器上２５℃で１時間インキュベートした。架
橋完了時にこれヲミリーＱウォーター３Ｘ１００ｍ／で
洗い、真空オープン内で十分に乾燥した。粒子を再び篩
分けし、５００〜８４０ミクロンの両分を塔反応器での
安定性試験に使用した。
衝液（ｐａ８．０）中のグルタルアルデヒド０．７５Ｆ
含有架橋用溶液１５ｍｊに加えた。これを２００ ｒｐ
ｍの振とう器上２５℃で１時間インキュベートした。架
橋完了時にこれヲミリーＱウォーター３Ｘ１００ｍ／で
洗い、真空オープン内で十分に乾燥した。粒子を再び篩
分けし、５００〜８４０ミクロンの両分を塔反応器での
安定性試験に使用した。
安定性試験−一固定化グルコースイソメラーゼ（工ＭＧ
Ｉ）調製物４１をグルコース基質（３ｍＭＭｇＳＯ４お
よび０．０２％アジ化ナトリウムを含有する５０％セル
ロースデキストロースＣＭ量／容量〕、ｐＨ６，６）に
浸漬した。２時間後、これをテフロン塔（１，２７Ｘ３
０．４８ｃｎｌ（０，５Ｘ１２インチ））の中に装填し
、そして酵素失活のための偽−次反応速度論を想定して
、ＩＭＧ工の半減期（ｔ％）ｔ−５０％グルコース溶液
による逆流式連続方法において測定した。結果を表■に
示す。
Ｉ）調製物４１をグルコース基質（３ｍＭＭｇＳＯ４お
よび０．０２％アジ化ナトリウムを含有する５０％セル
ロースデキストロースＣＭ量／容量〕、ｐＨ６，６）に
浸漬した。２時間後、これをテフロン塔（１，２７Ｘ３
０．４８ｃｎｌ（０，５Ｘ１２インチ））の中に装填し
、そして酵素失活のための偽−次反応速度論を想定して
、ＩＭＧ工の半減期（ｔ％）ｔ−５０％グルコース溶液
による逆流式連続方法において測定した。結果を表■に
示す。
実施例６−架橋後の色層
実施例１に記載の方法に従って調製した０、２５℃Ｍ−
ＰＥＩで凝結し且つグルタルアルデヒドで架橋したアン
プラリエラの試料４．（ｌｔ−１実施例５に記載の方法
により部分カルボキシメチル化ｐＥ工（ＣＭ：Ｎ ＝
０．４ ； ＦＢＩ Ｏ，２４〕含有）で色層した。
ＰＥＩで凝結し且つグルタルアルデヒドで架橋したアン
プラリエラの試料４．（ｌｔ−１実施例５に記載の方法
により部分カルボキシメチル化ｐＥ工（ＣＭ：Ｎ ＝
０．４ ； ＦＢＩ Ｏ，２４〕含有）で色層した。
この色層した工ＭＧ工ｉ０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液中
５％グルタルアルデヒドを用いてｐＨ８，０で３０分間
架橋した。処理ＩＭＧＩおよび未処理ＩＭＧＩの安定性
を慣用方法で試験した。ｐＨ６，６および６０℃での５
０％グルコース基質による試験において、処理工ＭＧＩ
のｔ％が１０１８時間であるのに対して未処理ＩＭＧＩ
は３５０時間であった。
５％グルタルアルデヒドを用いてｐＨ８，０で３０分間
架橋した。処理ＩＭＧＩおよび未処理ＩＭＧＩの安定性
を慣用方法で試験した。ｐＨ６，６および６０℃での５
０％グルコース基質による試験において、処理工ＭＧＩ
のｔ％が１０１８時間であるのに対して未処理ＩＭＧＩ
は３５０時間であった。
固定化アンプラリエラ３８７６細胞の安定性に関する部
分カルボキシメチル化ＰＥ工色層の効果は表■に示す。
分カルボキシメチル化ＰＥ工色層の効果は表■に示す。
表■
ｐＨ６，６，６０℃における固定化アンプラリエラ３８
７６細胞の安定性（ｔ３Ａ？ｒ測定）に対する部分カル
ボキシメチル化ＰＥ工色層の効果凝結 剤
包 膜 半減期時間）６％０．２５℃Ｍ−
ＰＩＩＣＩ なし ３５２６チ０２５ＣＭ−Ｐ
１１ ６％０．６２５（：！Ｍ−ＰＥ工
９１４６％０．２ＣＭ−ＰＥＩ ６％０．４
Ｃ！Ｍ−ＰＥＩ ８５５６％０．２１：
！Ｍ−ＰＥ工 ６％０．６２５０！Ｍ−ＰＫ工
８４９６％０．２ＣＭ−ＰＥＩ
６％０．５ＣＭ−ＰＥＩ ６７９６％０．
２５℃Ｍ−ＰＥＩ ９％０．６２５（！Ｍ−ＰＥ
工 ９２８６％０．２５℃Ｍ−ＦＢＩ
１８％０．６２５０！Ｍ−ＰＥ工 １０４２
６％プリフロックＣ−３１＊ な し
２２１６％プリフロックＣ−３１６％０
．４ＣＭ−ＰＥＩ ６６７６％プリフロッ
ク０−３１ １２％０．４ＣＭ−ＰＥＩ １
０８７６チブリフロツクＣ−３１１８％０．４Ｃ！Ｍ−
ＰＥ工 １０４７６％０．２５ ＣＭ プリフロックＣ−３１な し ３
２９６％０．２５ ＣＭ プリフロック０−３１ ６％０．６２５ｃＭ−ｐＥ工
１１３１６％０．１５ ＣＭ プリフロックＣ−３１な し ２
９８６％０．１５ プリフロックＣ−３１６％０．６２５℃Ｍ−ＰＥＩ
８１９（注）全ての固定化細胞は安定性の試験
前に最終工程においてグルタルアルデヒドで架橋した。
７６細胞の安定性（ｔ３Ａ？ｒ測定）に対する部分カル
ボキシメチル化ＰＥ工色層の効果凝結 剤
包 膜 半減期時間）６％０．２５℃Ｍ−
ＰＩＩＣＩ なし ３５２６チ０２５ＣＭ−Ｐ
１１ ６％０．６２５（：！Ｍ−ＰＥ工
９１４６％０．２ＣＭ−ＰＥＩ ６％０．４
Ｃ！Ｍ−ＰＥＩ ８５５６％０．２１：
！Ｍ−ＰＥ工 ６％０．６２５０！Ｍ−ＰＫ工
８４９６％０．２ＣＭ−ＰＥＩ
６％０．５ＣＭ−ＰＥＩ ６７９６％０．
２５℃Ｍ−ＰＥＩ ９％０．６２５（！Ｍ−ＰＥ
工 ９２８６％０．２５℃Ｍ−ＦＢＩ
１８％０．６２５０！Ｍ−ＰＥ工 １０４２
６％プリフロックＣ−３１＊ な し
２２１６％プリフロックＣ−３１６％０
．４ＣＭ−ＰＥＩ ６６７６％プリフロッ
ク０−３１ １２％０．４ＣＭ−ＰＥＩ １
０８７６チブリフロツクＣ−３１１８％０．４Ｃ！Ｍ−
ＰＥ工 １０４７６％０．２５ ＣＭ プリフロックＣ−３１な し ３
２９６％０．２５ ＣＭ プリフロック０−３１ ６％０．６２５ｃＭ−ｐＥ工
１１３１６％０．１５ ＣＭ プリフロックＣ−３１な し ２
９８６％０．１５ プリフロックＣ−３１６％０．６２５℃Ｍ−ＰＥＩ
８１９（注）全ての固定化細胞は安定性の試験
前に最終工程においてグルタルアルデヒドで架橋した。
実施例７−市販酵素の色層
ノボ・スイートザイムＱ （ＮｏｖＯＳｗｅｅｔｚｙｍ
ｅＱ；グルコースイソメラーゼ調製物に対するノボ・イ
ンダストＩＪ −Ｘ Ａ ／ Ｂ （／（ｆスハート、
テンマーク）の商標名〕の試料３ｆｆｐＨ７の部分カル
ボキシメチル化ＰＫＩ溶液（ＣＭ ： Ｎ＝０．４ ；
ＰＥＩ０．１８ｊｇ含有）１２ｄの中に浸漬した。過
剰の液体を窒素下で蒸発させ、−晩凍結乾燥することに
より大部分の水を除去した。次にＣ！Ｍ −ＰＥＩで色
層したスイートザイムＱ粒子を実施例１に記載の方法に
従ってグルタルアルデヒドを用いて架橋した。但し５％
グルタルアルデヒドヲ使用し、反応時間を３０分に短縮
した。ＣＭ−ＦＢＩにより色層したスイートザイムＱの
安定性は、逆流式連結塔反応器（９ｘ１ｓｏｍｓ）？使
って６０℃、流速３０ｄ／時間、および滞留時間約２０
分で測定した。この実験で使用した基質は高フルクトー
ス含量コーンシロップの生産者が使用するものと同様に
、５０％（重量／容量）グルコース、３ ｍＭＭｇ＋＋
、 ＠含有していた。アジ化ナトリウム（０，０２％）
を抗菌剤として添加した。ｐＨ６，６，６０℃での５０
チグルコース基質によるｔ３Ａは２９１時間であり、未
処理スイートザイムＱのｔ％は７０〜１１５時間であっ
た。
ｅＱ；グルコースイソメラーゼ調製物に対するノボ・イ
ンダストＩＪ −Ｘ Ａ ／ Ｂ （／（ｆスハート、
テンマーク）の商標名〕の試料３ｆｆｐＨ７の部分カル
ボキシメチル化ＰＫＩ溶液（ＣＭ ： Ｎ＝０．４ ；
ＰＥＩ０．１８ｊｇ含有）１２ｄの中に浸漬した。過
剰の液体を窒素下で蒸発させ、−晩凍結乾燥することに
より大部分の水を除去した。次にＣ！Ｍ −ＰＥＩで色
層したスイートザイムＱ粒子を実施例１に記載の方法に
従ってグルタルアルデヒドを用いて架橋した。但し５％
グルタルアルデヒドヲ使用し、反応時間を３０分に短縮
した。ＣＭ−ＦＢＩにより色層したスイートザイムＱの
安定性は、逆流式連結塔反応器（９ｘ１ｓｏｍｓ）？使
って６０℃、流速３０ｄ／時間、および滞留時間約２０
分で測定した。この実験で使用した基質は高フルクトー
ス含量コーンシロップの生産者が使用するものと同様に
、５０％（重量／容量）グルコース、３ ｍＭＭｇ＋＋
、 ＠含有していた。アジ化ナトリウム（０，０２％）
を抗菌剤として添加した。ｐＨ６，６，６０℃での５０
チグルコース基質によるｔ３Ａは２９１時間であり、未
処理スイートザイムＱのｔ％は７０〜１１５時間であっ
た。
実施例８−別の市販酵素の色層
タカ−スィート［Ｔａｋａ −８ｗｅｅｔ ；グルコー
スイソメラーゼ調製物に対するマイルス・ラボラトリー
ズ社（エルクハート、インジアナ州）の商標名］の試料
２７ｋ、先の実施例に従って部分カルボキシメチル化Ｐ
ＥＩ溶液（ＣＭ ： Ｎ＝０．４ ｉ ＰＢｆ：工０．
１２Ｆ含有）で処理した。塔反応器中ｐＨ６，６゜６０
℃で５０％グルコース基質を使って測定したｔ％は未処
理タカ−スィートが３３３〜４０６時間であるのに対し
て処理タカ−スィートは７２５時間であった。
スイソメラーゼ調製物に対するマイルス・ラボラトリー
ズ社（エルクハート、インジアナ州）の商標名］の試料
２７ｋ、先の実施例に従って部分カルボキシメチル化Ｐ
ＥＩ溶液（ＣＭ ： Ｎ＝０．４ ｉ ＰＢｆ：工０．
１２Ｆ含有）で処理した。塔反応器中ｐＨ６，６゜６０
℃で５０％グルコース基質を使って測定したｔ％は未処
理タカ−スィートが３３３〜４０６時間であるのに対し
て処理タカ−スィートは７２５時間であった。
実施例９
上記実施例に記載の方法で調製したグルコースイソメラ
ーゼとＤ−グルコースとを水性媒体中で接触させること
により、Ｄ−グルコースをＤ−フルクトースに転化した
。作業温度は４５〜８５℃であり、ｐＨ範囲は６〜８．
５であった。生産されたＤ−フルクトースは当分野でよ
く知られた方法により回収した。
ーゼとＤ−グルコースとを水性媒体中で接触させること
により、Ｄ−グルコースをＤ−フルクトースに転化した
。作業温度は４５〜８５℃であり、ｐＨ範囲は６〜８．
５であった。生産されたＤ−フルクトースは当分野でよ
く知られた方法により回収した。
（外５名）
Claims (11)
- （１）細胞から分離されていない活性酵素を有する完全
な微生物細胞または破壊した微生物細胞を、部分的に修
飾した陽イオン性高分子電解質と接触させることからな
る、前記微生物細胞の安定化および凝結方法。 - （２）（イ）凝結した微生物細胞を部分修飾した陽イオ
ン性高分子電解質で包膜し；そして （ロ）包膜した微生物細胞を架橋する； ことからなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （３）凝結した微生物細胞を包膜の前後で架橋する特許
請求の範囲第２項記載の方法。 - （４）微生物細胞がグルコースイソメラーゼ産生性細胞
である特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載
の方法。 - （５）部分修飾した陽イオン性高分子電解質が部分修飾
したポリアミンである、特許請求の範囲第１〜４項のい
ずれか１項に記載の方法。 - （６）部分修飾した陽イオン性高分子電解質が部分カル
ボキシアルキル化または部分ホスホノアルキル化した陽
イオン性高分子電解質であり、ここでアルキルは−（Ｃ
Ｈ＿２）＿π−（ｎ＝１〜３）または−（ＣＨＲ）−（
ＣＨ＿２）＿ｎ−（Ｒ＝メチル、エチル、プロピルまた
はイソプロピル、およびｎ＝１または２）である、特許
請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載の方法。 - （７）部分カルボキシアルキル化した陽イオン性高分子
電解質が部分カルボキシメチル化したポリエチレンイミ
ンである、特許請求の範囲第６項記載の方法。 - （８）部分修飾した陽イオン性高分子電解質の修飾量が
凝結工程では高分子電解質の０．１〜１．０当量であり
、包膜工程では高分子電解質の０．２〜１．０当量であ
る特許請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の方
法。 - （９）部分修飾した陽イオン性高分子電解質がイミンの
０．２５〜０．５当量の範囲でカルボキシメチル化され
たポリエチレンイミンである、特許請求の範囲第８項記
載の方法。 - （１０）（イ）部分修飾した陽イオン性高分子電解質で
凝結し；且つ（ロ）架橋したグルコースイソメラーゼ産
生性の完全なまたは破壊した微生物細胞を、Ｄ−グルコ
ースと接触させることからなる、Ｄ−グルコースからの
Ｄ−フルクトースの製造方法。 - （１１）使用する微生物細胞は部分修飾した陽イオン性
高分子電解質で包膜され、再度架橋されたものである特
許請求の範囲第１０項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US70777385A | 1985-03-04 | 1985-03-04 | |
| US707773 | 1985-03-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61234781A true JPS61234781A (ja) | 1986-10-20 |
Family
ID=24843111
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61046041A Pending JPS61234781A (ja) | 1985-03-04 | 1986-03-03 | 細胞内酵素の安定化 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0195304A3 (ja) |
| JP (1) | JPS61234781A (ja) |
| CA (1) | CA1267618A (ja) |
| DK (1) | DK85086A (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5462990A (en) * | 1990-10-15 | 1995-10-31 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Multifunctional organic polymers |
| US5410016A (en) * | 1990-10-15 | 1995-04-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Photopolymerizable biodegradable hydrogels as tissue contacting materials and controlled-release carriers |
| US5626863A (en) * | 1992-02-28 | 1997-05-06 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Photopolymerizable biodegradable hydrogels as tissue contacting materials and controlled-release carriers |
| US5573934A (en) * | 1992-04-20 | 1996-11-12 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Gels for encapsulation of biological materials |
| WO1993017669A1 (en) | 1992-02-28 | 1993-09-16 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Photopolymerizable biodegradable hydrogels as tissue contacting materials and controlled-release carriers |
| AT401653B (de) * | 1994-10-05 | 1996-11-25 | Avl Verbrennungskraft Messtech | Verfahren zur immobilisierung biologischer komponenten in einer polymermatrix sowie biosensoren unter verwendung derartiger immobilisate |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4060456A (en) * | 1973-01-02 | 1977-11-29 | R. J. Reynolds Tobacco Company | Glucose isomerization process |
| GB2019410B (en) * | 1978-04-19 | 1982-06-03 | Novo Industri As | Immobilized enzyme products |
| GB8304069D0 (en) * | 1983-02-14 | 1983-03-16 | Ici Plc | Production of immobilised glucose isomerase |
-
1986
- 1986-02-11 CA CA000501549A patent/CA1267618A/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-02-24 DK DK85086A patent/DK85086A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-03-03 JP JP61046041A patent/JPS61234781A/ja active Pending
- 1986-03-04 EP EP86102808A patent/EP0195304A3/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0195304A3 (en) | 1988-07-20 |
| CA1267618A (en) | 1990-04-10 |
| DK85086D0 (da) | 1986-02-24 |
| EP0195304A2 (en) | 1986-09-24 |
| DK85086A (da) | 1986-09-05 |
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