JPS6222599B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPS6222599B2 JPS6222599B2 JP54046799A JP4679979A JPS6222599B2 JP S6222599 B2 JPS6222599 B2 JP S6222599B2 JP 54046799 A JP54046799 A JP 54046799A JP 4679979 A JP4679979 A JP 4679979A JP S6222599 B2 JPS6222599 B2 JP S6222599B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glutaraldehyde
- polyamine
- microbial cell
- cells
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 33
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 33
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 33
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 25
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 24
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 claims description 23
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 19
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 19
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 claims description 14
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 12
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 10
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 claims description 9
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 6
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010059881 Lactase Proteins 0.000 claims description 5
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 5
- 229940116108 lactase Drugs 0.000 claims description 5
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 claims description 5
- 241000193395 Sporosarcina pasteurii Species 0.000 claims description 4
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 229920001281 polyalkylene Polymers 0.000 claims description 4
- 239000010802 sludge Substances 0.000 claims description 4
- 125000001302 tertiary amino group Chemical group 0.000 claims description 4
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims description 3
- 108090000073 malolactic enzyme Proteins 0.000 claims description 3
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 2
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 claims description 2
- 238000005469 granulation Methods 0.000 claims description 2
- 230000003179 granulation Effects 0.000 claims description 2
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 claims 2
- 241000894007 species Species 0.000 claims 2
- 238000007873 sieving Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 45
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 37
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 28
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 17
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 229940056367 penicillin v Drugs 0.000 description 8
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 description 6
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930195708 Penicillin V Natural products 0.000 description 5
- BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N phenoxymethylpenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 241000235650 Kluyveromyces marxianus Species 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 3
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 3
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000192134 Oenococcus oeni Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 2
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- VATYWCRQDJIRAI-UHFFFAOYSA-N p-aminobenzaldehyde Chemical compound NC1=CC=C(C=O)C=C1 VATYWCRQDJIRAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 1-methylsulfonylpiperidin-4-one Chemical compound CS(=O)(=O)N1CCC(=O)CC1 RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N anhydrous glutaric acid Natural products OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000012070 reactive reagent Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
本発明はグルタルアルデヒドに対して感受性で
ある特殊な範疇の細胞内酵素の固定化（immobili
―zation）に関する。この範疇に属する酵素（後
記する）はしばしばチオール酵素であり、これは
酵素分子の活性部位に又は酵素分子の活性部位の
極く近傍に―SH基を持つ酵素であり、故にこれ
はチオール―反応性試薬、たとえばグルタルアル
デヒドによつて不活性化されるであろう。典型的
な例はウレアーゼである。 固定化された酵素の種々の製造方法がメソツド
オブエンチモロジー（Methods of
Enzymology）、第44巻（1977）（Academic
Press）に記載されている。これらの方法の大抵
のものは高い価格の担体及び酵素活性の高い希釈
を回避できないという固有の欠点を持つ粒状担体
が関与する。 グルコースイソメラーゼ含有細胞をグルタルア
ルデヒドにより架橋することによつてグルコース
イソメラーゼをいかにして固定化するか及び更に
その後の処理についても記載されている。たとえ
ば米国特許明細書第3980521号参照。グルコース
イソメラーゼはグルタルアルデヒドに対して非常
に感受性ではない酵素であり、従つて固定化収率
はこの固定化によれば高い。グルタルアルデヒド
は種々の理由から好ましい架橋剤である。それは
健康権威者によつても認められており、又製造及
び経済的観点からも今日最も良く知られた架橋剤
である。 しかしながら本発明はグルタルアルデヒドに対
して感受性である細胞内酵素の固定化に関する。
これまで所望されない高い程度の希釈率（dilu―
tion）を伴なうことなくこの種の酵素を固定化す
ることは困難であつた。何故ならばこの範疇の酵
素の常用のグルタルアルデヒド処理は常に酵素活
性の殆んど完全な損失をもたらす故に固定化のた
めにグルタルアルデヒド法を使用することは可能
ではなかつたからである。故にグルタルアルデヒ
ドに対して感受性である酵素の固定化はグルタル
アルデヒドに対して感受性でない酵素の固定化と
は完全に異なつた状況にある。ここに、用語“グ
ルタルアルデヒド感受性酵素”とはそれが米国特
許明細書第3980521号、及び西ドイツ公開公報第
2223340号に記載の固定化法に従つて該酵素を含
有する細胞のグルタルアルデヒド処理により固定
化されて工業的用途（たとえば連続法又は容器中
でバツチ法に使用するため）に対して許容し得る
物理的強度の粒状生成物を形成する場合にその元
の活性の75％より多く損失されるグルタルアルデ
ヒド感受性酵素を意味する。 本発明の目的は架橋剤としてグルタルアルデヒ
ドを使用し、固定化された酵素を非常に高い収率
で、比較的低い価格で且つ酵素活性の比較的小さ
な希釈率で製造することができる、細胞内グルタ
ルアルデヒド感受性酵素の固定化方法を提供して
工業的用途に十分に適した固定化された酵素より
成る生成物の製造を可能ならしめることである。 本発明の１つの観点に従えば細胞内グルタルア
ルデヒド感受性酵素の固定化方法であつて、細胞
内グルタルアルデヒド感受性酵素を含有する微生
物細胞（後記する）を水性媒体中で有義な含有率
の第１アミノ基を持つポリアミンの存在下にグル
タルアルデヒドと反応させること及び得られる固
定化された微生物細胞の単離より成る方法を提供
する。本明細書において、用語“微生物細胞”は
全微生物細胞（whole microbial cells）、全微生
物細胞から製造し得る均質物（homogenate）、及
びそれらの中間の何れかのもの、即ち部分的に破
裂した（ruptured）微生物細胞を意味するのに
使用される。本明細書中で、用語“第１アミノ基
の有義な含有率”とは、第１、第２及び第３アミ
ノ基の全含有率に対して第１アミノ基の有義な含
有率を意味するのに使用される。有利には第１ア
ミノ基の含有率は第１、第２及び第３アミノ基の
全含有率の５％、好ましくは20％を越える。典型
的な場合には、第１、第２及び第３アミノ基間の
割合はポリアミンとして分岐状ポリエチレンイミ
ンが使用される場合には１：２：１であることが
できる。第１アミノ基はグルタルアルデヒドと反
応性であり、それにより安定な架橋が形成される
ものと推測され、これは第１アミノ基が重要であ
る理由である。第１（及び第２アミノ）基をエポ
キシ化合物と反応させることにより変性されたポ
リエチレンイミンにより行なわれる実験はかかる
変性されたポリエチレンイミンが作用しないこと
を示した。 反応は水性媒体中で行なわれるので、本発明に
従い使用されるポリアミンは水溶性であるべきで
あることが理解されるべきである。 驚くべきことに、ポリアミンの存在は酵素活性
の非常に高い回収率をもたらす。該ポリアミンを
用いなければ酵素活性の収率は約０〜15％の大き
さの程度であり、これに対してポリアミンを用い
る場合の収率は30〜70％の大きさの程度であり得
る。不活性な粒状担体は必要ではなく、故に酵素
活性の希釈率は小さい。 固定化を行なう場合に、ポリアミンはグルタル
アルデヒドの前又はと同時に微生物細胞に加えら
れる。グルタルアルデヒドが最初微生物細胞に加
えられるならば固定化された生成物中の酵素活性
の回収率は、グルタルアルデヒド添加後ポリアミ
ンが非常に速く加えられない限りPH、温度、濃度
及び同様なパラメータに依存して減少するであろ
う。 微生物細胞、グルタルアルデヒド及びポリアミ
ンの相対的量は固定化された酵素より成る生成物
が工業的目的に十分適するように、即ち高い酵素
活性、高い活性収率（固定化前の全酵素活性と比
較して）、高い酵素安定性及び高い機械的安定性
を持つべきように選ばられるべきである。 本発明の好ましい態様は全微生物細胞を反応さ
せることより成る。 本発明の更に１つの好ましい態様はバクテリア
菌株（bacterial strain）NRRL11240〔又はその
突然変異株（mutants）及びその変種
（variants）を含めてそれと本質的に同じである
菌株〕により製造されたグルタルアルデヒド感受
性ペニシリンＶ―アシラーゼ（penicillin Ｖ―
acylase）の固定より成る。本発明の更に好まし
い態様は種バチルスパスチユーリ（Bacillus
pasteurii）に属する菌株により製造されたウレ
アーーゼ、種クリユイベロマイセスフラジリス
（Kluyveromyces fragilis）に属する菌株により
製造されたラクターゼ及び種ロイコノストツクエ
ノス（Leuconostoc oenos）に属する菌株によつ
て製造されたマロラクチツク酵素（malolactic
enzyme）の固定化より成る。 本発明好ましい態様は水性媒体として醗酵ブロ
スの水性部分の使用より成る。この態様はグルタ
ルアルデヒドによる醗酵ブロスの直接処理より成
り、故に非常に簡単で経済的な固定化方法を構成
する。しかしながら、細胞はたとえば遠心分離に
より醗酵ブロスから分離することができ、次いで
水又はPH５〜10の適当な緩衝液中に懸濁すること
ができ、この懸濁液の水性部分は後にグルタルア
ルデヒドにより処理される水性媒体である。同様
に、細胞スラツジの水性部分、該細胞スラツジは
たとえば遠心分離によつて醗酵ブロスから分離さ
れ且つ歯摩きの如きコンシステンシーを持つ、は
その後にグルタルアルデヒドによつて処理される
水性媒体として使用することができる。 アルキレン部分が２〜４個の炭素原子を含有す
る場合のポリアルキレンイミン、好ましくは分岐
状ポリアルキレンイミンをポリアミンとして使用
するのが好ましい。 ポリアミンとして分岐したポリエチレンイミン
又はポリアルキレンポリアミンを使用するのが好
ましい。 本発明の更に好ましい態様においては500〜
100000ダルトンの分子量を有する分岐したポリエ
チレンイミンがポリアミンとして使用される。
0.01：１〜10：１、好ましくは0.1：１〜１：１
の範囲の第１アミン当量／アルデヒド当量の割合
を使用するのが好ましい。 本発明の好ましい態様はポリアミンを微生物細
胞と共に水性媒体に加え、次いでグルタルアルデ
ヒドを加えるシーケンスより成る。 好ましくは、本発明の方法においては、0.01：
１〜100：１、好ましくは0.1：１〜10：１のグル
タルアルデヒド／微生物細胞（Ｗ／Ｗ）の割合を
使用することができる。 本発明の更に好ましい態様においては、単離さ
れた固定化された細胞は好ましくは粒状化又は押
出しにより賦形される。他の態様においては洗浄
され単離された固定化された細胞は乾燥し、ミル
で粉砕しそして篩にかけて100〜1000μ、好まし
くは200〜700μの範囲の粒径とすることにより賦
形される。 本発明の第２の観点に従えば本発明の方法によ
り製造される固定化された酵素生成物が提供され
る。 本発明の第３の観点は本発明の第２の観点に従
う固定化された生成物の使用より成り、それによ
り固定化された生成物はバツチ式で又は連続的
に、後者の場合には好ましくはカラム中で使用す
ることができる。 本発明に従う固定化された生成物の使用の好ま
しい態様は菌株NRRL11240（又はその突然変異
体及び変種を包含するそれと本質的に同じの菌
株）により製造された固定化されたペニシリンＶ
―アシラーゼの使用より成り、それにより固定化
されたペニシリンＶ―アシラーゼが連続的に使用
される。グルタルアルデヒド感受性酵素との組合
わせにおけるポリアミンの驚くべき活性保存効果
を証明するために下記比較実験を参照されたい。 ａ バチルスパスチユーリ（Bacillus
pasteurii）ATCC11859（PH７にて6200IU／
ｇ）からの噴霧乾燥したウレアーゼ含有細胞２
ｇを10μＭ β―メルカプトエタノールと共に
水98ml中に懸濁した。細胞懸濁液のPHは1.6ml
の25％グルタルアルデヒドを撹拌しながら加え
た場合に7.7であつた。室温で20分間撹拌の後
PH値は6.9に下がつた。固定化された細胞を
過し水中の1mM β―メルカプトエタノール
溶液0.5で２回洗浄した。真空乾燥の後（約
50℃で90分）、固定化された調製物0.7ｇを125
〜300μの粒径に対して最適条件で測定して
64IU／ｇの活性で得られる。これは0.3％の活
性収率に等しい。 ｂ 上記ａに記載されたものと同じ細胞懸濁液を
上記ａに記載の処理の代わりにPH７に調節した
10％ポリエチレンイミン（分子量60000、Dow
Chemicals PEI600）４mlで処理し、しかる後
25％グルタルアルデヒド2.75mlを加えた。撹拌
を室温で60分間続けた。上記ａにおける如き
過、洗浄及び乾燥の後得られる0.75ｇの固定化
された細胞は5600IU／ｇ（125〜300μ）の活
性を有し、即ち活性収率は34％であつた。 下記実施例における酵素の初期酵素活性の単位
の定義は下記表に示される。 表 酵素 初期酵素活性の決定 ウレアーゼ PH7.0及び30℃での1N HClによるPH―スタツト
滴定。0.2Mリン酸塩緩衝液中の３％（0.5M）尿
素が基質として使用され、１単位は加水分離され
た尿素１μモル／分である。 ペニシリンＶアシラーゼ 0.2Mリン酸塩緩衝液PH7.5中で３％ペニシリン
Ｖを使用する40℃でのインキユベーシヨン。細胞
を取り出して後生成した６―APAをバラシンガ
ム（Balasingham）等（1972）、Biochem.
Biophys.Acta276、250―56に従つてｐ―アミノ
ベンズアルデヒドを用いて決定した。１単位＝生
成した６―APA1μモル／分。 固定されない細胞はPH７を持つ0.1Mリン酸塩
緩衝液中約８％１―ブタノールにより室温で20分
間処理することにより先ず開放する（open）。ミ
ルクバツフア（milk buffer）PH6.5中の4.75％
（Ｗ／Ｖ）ラクトースによるクリユイベロマイセ
ス フラジリス ラクターゼ（Kluyveromyces
fragilis lactase）に対する37℃でのインキユベー
シヨン（Das grosse Melkerei Lexikon，
Schultz 1965、Vol.2、Ｍ―Zp.740）。細胞を取り
出して後生成したグルコースをベーリンガーマン
ハイムの血糖試薬（Boehringer Mannheim′s
Blood Sugar reagent）により決定した（GOD―
Perid法）。１単位＝生成したグルコース１μモ
ル／分。 マロラクチツク酵素 0.1Mリン酸塩緩衝液PH５中の33mML―マレエ
ート1.67mM NAD+及び0.7mM MnCl2を用いて
30℃でのインキユベーシヨン。細胞を取り出して
後生成したラクテートをGutmann，I.and
Wahlefeld.A.W.（1974）in Method of
Enzymatic Analysis，2nd ed.Vol3，（H.U.
Bergmeyer，ed.）、Academic Press，p.1463―
67.に従つてLDH＋NAD+により決定した。１単
位＝生成したラクテート１μモル／分。 下記実施例により本発明を更に説明する。実施
例の主要な内要は下記の表からわかる。
ある特殊な範疇の細胞内酵素の固定化（immobili
―zation）に関する。この範疇に属する酵素（後
記する）はしばしばチオール酵素であり、これは
酵素分子の活性部位に又は酵素分子の活性部位の
極く近傍に―SH基を持つ酵素であり、故にこれ
はチオール―反応性試薬、たとえばグルタルアル
デヒドによつて不活性化されるであろう。典型的
な例はウレアーゼである。 固定化された酵素の種々の製造方法がメソツド
オブエンチモロジー（Methods of
Enzymology）、第44巻（1977）（Academic
Press）に記載されている。これらの方法の大抵
のものは高い価格の担体及び酵素活性の高い希釈
を回避できないという固有の欠点を持つ粒状担体
が関与する。 グルコースイソメラーゼ含有細胞をグルタルア
ルデヒドにより架橋することによつてグルコース
イソメラーゼをいかにして固定化するか及び更に
その後の処理についても記載されている。たとえ
ば米国特許明細書第3980521号参照。グルコース
イソメラーゼはグルタルアルデヒドに対して非常
に感受性ではない酵素であり、従つて固定化収率
はこの固定化によれば高い。グルタルアルデヒド
は種々の理由から好ましい架橋剤である。それは
健康権威者によつても認められており、又製造及
び経済的観点からも今日最も良く知られた架橋剤
である。 しかしながら本発明はグルタルアルデヒドに対
して感受性である細胞内酵素の固定化に関する。
これまで所望されない高い程度の希釈率（dilu―
tion）を伴なうことなくこの種の酵素を固定化す
ることは困難であつた。何故ならばこの範疇の酵
素の常用のグルタルアルデヒド処理は常に酵素活
性の殆んど完全な損失をもたらす故に固定化のた
めにグルタルアルデヒド法を使用することは可能
ではなかつたからである。故にグルタルアルデヒ
ドに対して感受性である酵素の固定化はグルタル
アルデヒドに対して感受性でない酵素の固定化と
は完全に異なつた状況にある。ここに、用語“グ
ルタルアルデヒド感受性酵素”とはそれが米国特
許明細書第3980521号、及び西ドイツ公開公報第
2223340号に記載の固定化法に従つて該酵素を含
有する細胞のグルタルアルデヒド処理により固定
化されて工業的用途（たとえば連続法又は容器中
でバツチ法に使用するため）に対して許容し得る
物理的強度の粒状生成物を形成する場合にその元
の活性の75％より多く損失されるグルタルアルデ
ヒド感受性酵素を意味する。 本発明の目的は架橋剤としてグルタルアルデヒ
ドを使用し、固定化された酵素を非常に高い収率
で、比較的低い価格で且つ酵素活性の比較的小さ
な希釈率で製造することができる、細胞内グルタ
ルアルデヒド感受性酵素の固定化方法を提供して
工業的用途に十分に適した固定化された酵素より
成る生成物の製造を可能ならしめることである。 本発明の１つの観点に従えば細胞内グルタルア
ルデヒド感受性酵素の固定化方法であつて、細胞
内グルタルアルデヒド感受性酵素を含有する微生
物細胞（後記する）を水性媒体中で有義な含有率
の第１アミノ基を持つポリアミンの存在下にグル
タルアルデヒドと反応させること及び得られる固
定化された微生物細胞の単離より成る方法を提供
する。本明細書において、用語“微生物細胞”は
全微生物細胞（whole microbial cells）、全微生
物細胞から製造し得る均質物（homogenate）、及
びそれらの中間の何れかのもの、即ち部分的に破
裂した（ruptured）微生物細胞を意味するのに
使用される。本明細書中で、用語“第１アミノ基
の有義な含有率”とは、第１、第２及び第３アミ
ノ基の全含有率に対して第１アミノ基の有義な含
有率を意味するのに使用される。有利には第１ア
ミノ基の含有率は第１、第２及び第３アミノ基の
全含有率の５％、好ましくは20％を越える。典型
的な場合には、第１、第２及び第３アミノ基間の
割合はポリアミンとして分岐状ポリエチレンイミ
ンが使用される場合には１：２：１であることが
できる。第１アミノ基はグルタルアルデヒドと反
応性であり、それにより安定な架橋が形成される
ものと推測され、これは第１アミノ基が重要であ
る理由である。第１（及び第２アミノ）基をエポ
キシ化合物と反応させることにより変性されたポ
リエチレンイミンにより行なわれる実験はかかる
変性されたポリエチレンイミンが作用しないこと
を示した。 反応は水性媒体中で行なわれるので、本発明に
従い使用されるポリアミンは水溶性であるべきで
あることが理解されるべきである。 驚くべきことに、ポリアミンの存在は酵素活性
の非常に高い回収率をもたらす。該ポリアミンを
用いなければ酵素活性の収率は約０〜15％の大き
さの程度であり、これに対してポリアミンを用い
る場合の収率は30〜70％の大きさの程度であり得
る。不活性な粒状担体は必要ではなく、故に酵素
活性の希釈率は小さい。 固定化を行なう場合に、ポリアミンはグルタル
アルデヒドの前又はと同時に微生物細胞に加えら
れる。グルタルアルデヒドが最初微生物細胞に加
えられるならば固定化された生成物中の酵素活性
の回収率は、グルタルアルデヒド添加後ポリアミ
ンが非常に速く加えられない限りPH、温度、濃度
及び同様なパラメータに依存して減少するであろ
う。 微生物細胞、グルタルアルデヒド及びポリアミ
ンの相対的量は固定化された酵素より成る生成物
が工業的目的に十分適するように、即ち高い酵素
活性、高い活性収率（固定化前の全酵素活性と比
較して）、高い酵素安定性及び高い機械的安定性
を持つべきように選ばられるべきである。 本発明の好ましい態様は全微生物細胞を反応さ
せることより成る。 本発明の更に１つの好ましい態様はバクテリア
菌株（bacterial strain）NRRL11240〔又はその
突然変異株（mutants）及びその変種
（variants）を含めてそれと本質的に同じである
菌株〕により製造されたグルタルアルデヒド感受
性ペニシリンＶ―アシラーゼ（penicillin Ｖ―
acylase）の固定より成る。本発明の更に好まし
い態様は種バチルスパスチユーリ（Bacillus
pasteurii）に属する菌株により製造されたウレ
アーーゼ、種クリユイベロマイセスフラジリス
（Kluyveromyces fragilis）に属する菌株により
製造されたラクターゼ及び種ロイコノストツクエ
ノス（Leuconostoc oenos）に属する菌株によつ
て製造されたマロラクチツク酵素（malolactic
enzyme）の固定化より成る。 本発明好ましい態様は水性媒体として醗酵ブロ
スの水性部分の使用より成る。この態様はグルタ
ルアルデヒドによる醗酵ブロスの直接処理より成
り、故に非常に簡単で経済的な固定化方法を構成
する。しかしながら、細胞はたとえば遠心分離に
より醗酵ブロスから分離することができ、次いで
水又はPH５〜10の適当な緩衝液中に懸濁すること
ができ、この懸濁液の水性部分は後にグルタルア
ルデヒドにより処理される水性媒体である。同様
に、細胞スラツジの水性部分、該細胞スラツジは
たとえば遠心分離によつて醗酵ブロスから分離さ
れ且つ歯摩きの如きコンシステンシーを持つ、は
その後にグルタルアルデヒドによつて処理される
水性媒体として使用することができる。 アルキレン部分が２〜４個の炭素原子を含有す
る場合のポリアルキレンイミン、好ましくは分岐
状ポリアルキレンイミンをポリアミンとして使用
するのが好ましい。 ポリアミンとして分岐したポリエチレンイミン
又はポリアルキレンポリアミンを使用するのが好
ましい。 本発明の更に好ましい態様においては500〜
100000ダルトンの分子量を有する分岐したポリエ
チレンイミンがポリアミンとして使用される。
0.01：１〜10：１、好ましくは0.1：１〜１：１
の範囲の第１アミン当量／アルデヒド当量の割合
を使用するのが好ましい。 本発明の好ましい態様はポリアミンを微生物細
胞と共に水性媒体に加え、次いでグルタルアルデ
ヒドを加えるシーケンスより成る。 好ましくは、本発明の方法においては、0.01：
１〜100：１、好ましくは0.1：１〜10：１のグル
タルアルデヒド／微生物細胞（Ｗ／Ｗ）の割合を
使用することができる。 本発明の更に好ましい態様においては、単離さ
れた固定化された細胞は好ましくは粒状化又は押
出しにより賦形される。他の態様においては洗浄
され単離された固定化された細胞は乾燥し、ミル
で粉砕しそして篩にかけて100〜1000μ、好まし
くは200〜700μの範囲の粒径とすることにより賦
形される。 本発明の第２の観点に従えば本発明の方法によ
り製造される固定化された酵素生成物が提供され
る。 本発明の第３の観点は本発明の第２の観点に従
う固定化された生成物の使用より成り、それによ
り固定化された生成物はバツチ式で又は連続的
に、後者の場合には好ましくはカラム中で使用す
ることができる。 本発明に従う固定化された生成物の使用の好ま
しい態様は菌株NRRL11240（又はその突然変異
体及び変種を包含するそれと本質的に同じの菌
株）により製造された固定化されたペニシリンＶ
―アシラーゼの使用より成り、それにより固定化
されたペニシリンＶ―アシラーゼが連続的に使用
される。グルタルアルデヒド感受性酵素との組合
わせにおけるポリアミンの驚くべき活性保存効果
を証明するために下記比較実験を参照されたい。 ａ バチルスパスチユーリ（Bacillus
pasteurii）ATCC11859（PH７にて6200IU／
ｇ）からの噴霧乾燥したウレアーゼ含有細胞２
ｇを10μＭ β―メルカプトエタノールと共に
水98ml中に懸濁した。細胞懸濁液のPHは1.6ml
の25％グルタルアルデヒドを撹拌しながら加え
た場合に7.7であつた。室温で20分間撹拌の後
PH値は6.9に下がつた。固定化された細胞を
過し水中の1mM β―メルカプトエタノール
溶液0.5で２回洗浄した。真空乾燥の後（約
50℃で90分）、固定化された調製物0.7ｇを125
〜300μの粒径に対して最適条件で測定して
64IU／ｇの活性で得られる。これは0.3％の活
性収率に等しい。 ｂ 上記ａに記載されたものと同じ細胞懸濁液を
上記ａに記載の処理の代わりにPH７に調節した
10％ポリエチレンイミン（分子量60000、Dow
Chemicals PEI600）４mlで処理し、しかる後
25％グルタルアルデヒド2.75mlを加えた。撹拌
を室温で60分間続けた。上記ａにおける如き
過、洗浄及び乾燥の後得られる0.75ｇの固定化
された細胞は5600IU／ｇ（125〜300μ）の活
性を有し、即ち活性収率は34％であつた。 下記実施例における酵素の初期酵素活性の単位
の定義は下記表に示される。 表 酵素 初期酵素活性の決定 ウレアーゼ PH7.0及び30℃での1N HClによるPH―スタツト
滴定。0.2Mリン酸塩緩衝液中の３％（0.5M）尿
素が基質として使用され、１単位は加水分離され
た尿素１μモル／分である。 ペニシリンＶアシラーゼ 0.2Mリン酸塩緩衝液PH7.5中で３％ペニシリン
Ｖを使用する40℃でのインキユベーシヨン。細胞
を取り出して後生成した６―APAをバラシンガ
ム（Balasingham）等（1972）、Biochem.
Biophys.Acta276、250―56に従つてｐ―アミノ
ベンズアルデヒドを用いて決定した。１単位＝生
成した６―APA1μモル／分。 固定されない細胞はPH７を持つ0.1Mリン酸塩
緩衝液中約８％１―ブタノールにより室温で20分
間処理することにより先ず開放する（open）。ミ
ルクバツフア（milk buffer）PH6.5中の4.75％
（Ｗ／Ｖ）ラクトースによるクリユイベロマイセ
ス フラジリス ラクターゼ（Kluyveromyces
fragilis lactase）に対する37℃でのインキユベー
シヨン（Das grosse Melkerei Lexikon，
Schultz 1965、Vol.2、Ｍ―Zp.740）。細胞を取り
出して後生成したグルコースをベーリンガーマン
ハイムの血糖試薬（Boehringer Mannheim′s
Blood Sugar reagent）により決定した（GOD―
Perid法）。１単位＝生成したグルコース１μモ
ル／分。 マロラクチツク酵素 0.1Mリン酸塩緩衝液PH５中の33mML―マレエ
ート1.67mM NAD+及び0.7mM MnCl2を用いて
30℃でのインキユベーシヨン。細胞を取り出して
後生成したラクテートをGutmann，I.and
Wahlefeld.A.W.（1974）in Method of
Enzymatic Analysis，2nd ed.Vol3，（H.U.
Bergmeyer，ed.）、Academic Press，p.1463―
67.に従つてLDH＋NAD+により決定した。１単
位＝生成したラクテート１μモル／分。 下記実施例により本発明を更に説明する。実施
例の主要な内要は下記の表からわかる。
【表】
すべての下記実施例において、ポリエチレンイ
ミンのPH値は添加前に約７に調節した。しかしな
がら満足すべき固定化した酵素は他のPH値、たと
えば約４〜９の間のPH値を用いてポリエチレンイ
ミンにより得ることもできる。 なお、以下で利用したBacterial菌株
NRRL11240、Kluyveromyces fragilis
ATCC34439菌株（NRRL Y1109菌株）、Bacillus
pasteurii ATCC 11859菌株及びLeucorostoc
oenos DSM20252菌株は、夫々、NRRL、ATCC
及びDSMから自由に入手可能な公知菌株であ
る。 実施例 １ 約１％の乾燥細胞及び1.5ペニシリンＶアシラ
ーゼ単位／mlを含有する菌株NRRL11240の醗酵
ブロス１に、10％ポリエチレンイミン（ダウケ
ミカルスからの分岐した分子量60000、PEI600）
30mlを撹拌しながら加え続いて５分後に25％グル
タルアルデヒド25mlを加える。更に60分間室温で
撹拌を続け、次いで固定化した細胞を別し、リ
ン酸塩緩衝液（50mMPH７）で洗浄しそして空気
乾燥した。14.2ｇの乾燥した固定化した細胞が
180〜420μの粒径に対して71単位／ｇの活性を伴
なつて得られ、即ち活性収率は65％であつた。 実施例 ２ 菌株NRRL11240の醗酵ブロス1.5（0.68ペニ
シリンＶアシラーゼ単位／ml）に、10％ポリエチ
レンイミン（Dow Chemicals社製の分岐した、
分子量600、PEI6）45mlを撹拌しながら加えそし
て４℃で25％グルタルアルデヒド30mlを加えた。
更に60分間減少した速度で撹拌を続け、次いで生
成した多細胞粒子（multi―cell particles）を
過し、リン酸塩緩衝液PH７で洗浄し、そして空気
乾燥した。乾燥した沈殿（21ｇ）は200〜700μの
粒径に対してペニシリンＶアシラーゼ活性14.5単
位／ｇを持ち、即ち活性収率は30％であつた。 実施例 ３ 菌株NRRL11240の醗酵ブロス380（2.5ペニ
シリンＶアシラーゼ単位／ml）を約15℃に冷却
し、そして40の10％ポリエチレンイミン
（Polymin Ｐ、BASF）を撹拌しながら加え、続
いて25％グルタルアルデヒド（Union Carbide）
9.4を加えた。次いで更に45分間減少した速度
で撹拌を続け、しかる後ベーターメルカプトエタ
ノールを加えて25mMの最終濃度とし、固定化し
た細胞をフイルタープレス上で分離した。湿つた
フイルターケーキを粒状化し、粒状物を50―55℃
で流動床中で乾燥した。55単位／ｇを有する乾燥
した調製物7.1Kg（未分別粒子）が得られ、この
ものは41％の活性収率に等しい。 実施例 ４ 実施例３に記載したのと同じ菌株NRRL11240
の醗酵ブロスからの一連の固定化された調製物は
グルタルアルデヒドの一定の添加におけるポリエ
チレンイミンの濃度の変化の影響を示す。結果を
表に示す。
ミンのPH値は添加前に約７に調節した。しかしな
がら満足すべき固定化した酵素は他のPH値、たと
えば約４〜９の間のPH値を用いてポリエチレンイ
ミンにより得ることもできる。 なお、以下で利用したBacterial菌株
NRRL11240、Kluyveromyces fragilis
ATCC34439菌株（NRRL Y1109菌株）、Bacillus
pasteurii ATCC 11859菌株及びLeucorostoc
oenos DSM20252菌株は、夫々、NRRL、ATCC
及びDSMから自由に入手可能な公知菌株であ
る。 実施例 １ 約１％の乾燥細胞及び1.5ペニシリンＶアシラ
ーゼ単位／mlを含有する菌株NRRL11240の醗酵
ブロス１に、10％ポリエチレンイミン（ダウケ
ミカルスからの分岐した分子量60000、PEI600）
30mlを撹拌しながら加え続いて５分後に25％グル
タルアルデヒド25mlを加える。更に60分間室温で
撹拌を続け、次いで固定化した細胞を別し、リ
ン酸塩緩衝液（50mMPH７）で洗浄しそして空気
乾燥した。14.2ｇの乾燥した固定化した細胞が
180〜420μの粒径に対して71単位／ｇの活性を伴
なつて得られ、即ち活性収率は65％であつた。 実施例 ２ 菌株NRRL11240の醗酵ブロス1.5（0.68ペニ
シリンＶアシラーゼ単位／ml）に、10％ポリエチ
レンイミン（Dow Chemicals社製の分岐した、
分子量600、PEI6）45mlを撹拌しながら加えそし
て４℃で25％グルタルアルデヒド30mlを加えた。
更に60分間減少した速度で撹拌を続け、次いで生
成した多細胞粒子（multi―cell particles）を
過し、リン酸塩緩衝液PH７で洗浄し、そして空気
乾燥した。乾燥した沈殿（21ｇ）は200〜700μの
粒径に対してペニシリンＶアシラーゼ活性14.5単
位／ｇを持ち、即ち活性収率は30％であつた。 実施例 ３ 菌株NRRL11240の醗酵ブロス380（2.5ペニ
シリンＶアシラーゼ単位／ml）を約15℃に冷却
し、そして40の10％ポリエチレンイミン
（Polymin Ｐ、BASF）を撹拌しながら加え、続
いて25％グルタルアルデヒド（Union Carbide）
9.4を加えた。次いで更に45分間減少した速度
で撹拌を続け、しかる後ベーターメルカプトエタ
ノールを加えて25mMの最終濃度とし、固定化し
た細胞をフイルタープレス上で分離した。湿つた
フイルターケーキを粒状化し、粒状物を50―55℃
で流動床中で乾燥した。55単位／ｇを有する乾燥
した調製物7.1Kg（未分別粒子）が得られ、この
ものは41％の活性収率に等しい。 実施例 ４ 実施例３に記載したのと同じ菌株NRRL11240
の醗酵ブロスからの一連の固定化された調製物は
グルタルアルデヒドの一定の添加におけるポリエ
チレンイミンの濃度の変化の影響を示す。結果を
表に示す。
【表】
各々の場合に指示された量のポリアミンＰ
（BASF）を菌株NRRL11240の醗酵ブロス（2.5ペ
ニシリンＶアシラーゼ単位／ｇ）0.5に10％溶
液として撹拌しながら加え、続いて25％グルタル
アルデヒド10mlを加えた。撹拌は更に60分間減少
した速度で続け、しかる後細胞を別し、50mM
リン酸塩緩衝液PH7.5中の25mMベーターメルカ
プトエタノールで溶浄し、空気乾燥した。約９ｇ
の乾燥した材料が各々の調製物から得られた。 実施例 ５ 菌株NRRL11240の醗酵ブロス（2.0ペニシリン
Ｖアシラーゼ単位／ml）２に10％ポリエチレン
イミン（ポリミンＰ、BASF）200mlを加え、次
いで細胞を元の容量の約1/10に濃縮した。25％グ
ルタルアルデヒド６mlを撹拌しながら細胞スラツ
ジに加え、撹拌を更に60分間減少した速度で続け
た。次いで固定化した細胞を過し、50mMリン
酸塩PH7.5中の25mMベーターメルカプトエタノ
ールでガラス過器上で洗浄した。室温で空気乾
燥後、65単位／ｇ（200〜400μ）を持つ調製物20
ｇが得られた。これは約33％の活性収率に等し
い。 前記したのと同様な方法で作つたしかし種々の
量のグルタルアルデヒドを使用する固定化した一
連の調製物はポリエチレンイミンの一定添加及び
その後の濃縮後のグルタルアルデヒド濃度の変化
の影響を示す。結果は下記表に示されている。
（BASF）を菌株NRRL11240の醗酵ブロス（2.5ペ
ニシリンＶアシラーゼ単位／ｇ）0.5に10％溶
液として撹拌しながら加え、続いて25％グルタル
アルデヒド10mlを加えた。撹拌は更に60分間減少
した速度で続け、しかる後細胞を別し、50mM
リン酸塩緩衝液PH7.5中の25mMベーターメルカ
プトエタノールで溶浄し、空気乾燥した。約９ｇ
の乾燥した材料が各々の調製物から得られた。 実施例 ５ 菌株NRRL11240の醗酵ブロス（2.0ペニシリン
Ｖアシラーゼ単位／ml）２に10％ポリエチレン
イミン（ポリミンＰ、BASF）200mlを加え、次
いで細胞を元の容量の約1/10に濃縮した。25％グ
ルタルアルデヒド６mlを撹拌しながら細胞スラツ
ジに加え、撹拌を更に60分間減少した速度で続け
た。次いで固定化した細胞を過し、50mMリン
酸塩PH7.5中の25mMベーターメルカプトエタノ
ールでガラス過器上で洗浄した。室温で空気乾
燥後、65単位／ｇ（200〜400μ）を持つ調製物20
ｇが得られた。これは約33％の活性収率に等し
い。 前記したのと同様な方法で作つたしかし種々の
量のグルタルアルデヒドを使用する固定化した一
連の調製物はポリエチレンイミンの一定添加及び
その後の濃縮後のグルタルアルデヒド濃度の変化
の影響を示す。結果は下記表に示されている。
【表】
９〜11ｇ間の乾燥した材料が醗酵ブロス１に
つき各調製物から得られた。 実施例 ６ 菌株NRRL11240の醗酵ブロス350（2.4ペニ
シリンＶアシラーゼ単位／ml）を約15℃に冷却
し、そして24.5の10％ポリエチレンイミン24.5
〔太平産業株式会社（Taihei Sangyo
Kaisha）製の分岐状の分子量約700、PEI15T〕
を撹拌しながら加え、続いて50％グルタルアルデ
ヒド（Union Carbide）3.5を加えた。次いで
更に45分間減少した速度で撹拌を続け、しかる後
ベーターメルカプトエタノールを加えて25mMの
最終濃度とし、そして固定化した細胞を膜プレス
（membrane press）により分離した。フイルタ
ーケークを押出し（500μオリフイス）、粒子を50
―55℃で流動床中で乾燥した。収率は85ペニシリ
ンＶアシラーゼ単位／ｇ（粒径500μ以下）を持
つ乾燥調製物6.2Kgであり、これは63％の活性収
率に対応する。 実施例 ７ 実施例３及び４におけると同じ菌株
NRRL11240の醗酵ブロスからの固定した一連の
調製物は種々のタイプのポリエチレンイミンを使
用することの影響を示す。
つき各調製物から得られた。 実施例 ６ 菌株NRRL11240の醗酵ブロス350（2.4ペニ
シリンＶアシラーゼ単位／ml）を約15℃に冷却
し、そして24.5の10％ポリエチレンイミン24.5
〔太平産業株式会社（Taihei Sangyo
Kaisha）製の分岐状の分子量約700、PEI15T〕
を撹拌しながら加え、続いて50％グルタルアルデ
ヒド（Union Carbide）3.5を加えた。次いで
更に45分間減少した速度で撹拌を続け、しかる後
ベーターメルカプトエタノールを加えて25mMの
最終濃度とし、そして固定化した細胞を膜プレス
（membrane press）により分離した。フイルタ
ーケークを押出し（500μオリフイス）、粒子を50
―55℃で流動床中で乾燥した。収率は85ペニシリ
ンＶアシラーゼ単位／ｇ（粒径500μ以下）を持
つ乾燥調製物6.2Kgであり、これは63％の活性収
率に対応する。 実施例 ７ 実施例３及び４におけると同じ菌株
NRRL11240の醗酵ブロスからの固定した一連の
調製物は種々のタイプのポリエチレンイミンを使
用することの影響を示す。
【表】
【表】
各々の場合において指示された量のポリエチレ
ンイミンを10％溶液として撹拌しながら菌株
NRRL11240の醗酵ブロス0.5（2.5ペニシリンＶ
アシラーゼ単位／ml）に加え、続いて25％グルタ
ルアルデヒド10mlを加えた。更に45分間減少した
速度で撹拌を続けた。しかる後細胞を別し、
50mMリン酸塩緩衝液PH7.5中の25mMベーターメ
ルカプトエタノールで洗浄して空気乾燥した。 実施例 ８ 実施例１に記載の固定化した細胞10ｇを50mM
リン酸塩緩衝液PH7.5中の３％（Ｗ／Ｖ）粗製Ｋ
―ペニシリンV200mlに加えた。脱アシル化を
150rpmの撹拌速度及び7.5の一定PH（4N NaOH
による滴定によつて）を用いて40℃で実施した。
95％のペニシリンを2.5時間で６―APAに転化し
た。この操作は転化率の何らの実質的減少なしで
少なくとも20回新たなペニシリンＶを用いて繰り
返すことができた。転化の程度はHPLC（高圧液
体クロマトグラフイー）、ウオーターズμボンダ
パクＣ―18（Waters′ μBondapak、Ｃ―18）
カラムによる反応混合物の分離〔水中の20％メチ
ルアルコールから水中の50％メチルアルコールま
での勾配により溶出し、ウオーターズピツクＡ試
薬（Water′s Pic Ａ reagent）によるイオン対
形成及びその後の紫外線検出〕により決定され
た。Waters Associates′ information booklet
Paired―Ion Chromatography，D61 May1976，
Printed in USA（Maple Street，Milford，
Mass.）参照。３％（Ｗ／Ｖ）Ｋ―ペニシリンＶ
の40℃における６―APAへの転化結果を表に
示す。
ンイミンを10％溶液として撹拌しながら菌株
NRRL11240の醗酵ブロス0.5（2.5ペニシリンＶ
アシラーゼ単位／ml）に加え、続いて25％グルタ
ルアルデヒド10mlを加えた。更に45分間減少した
速度で撹拌を続けた。しかる後細胞を別し、
50mMリン酸塩緩衝液PH7.5中の25mMベーターメ
ルカプトエタノールで洗浄して空気乾燥した。 実施例 ８ 実施例１に記載の固定化した細胞10ｇを50mM
リン酸塩緩衝液PH7.5中の３％（Ｗ／Ｖ）粗製Ｋ
―ペニシリンV200mlに加えた。脱アシル化を
150rpmの撹拌速度及び7.5の一定PH（4N NaOH
による滴定によつて）を用いて40℃で実施した。
95％のペニシリンを2.5時間で６―APAに転化し
た。この操作は転化率の何らの実質的減少なしで
少なくとも20回新たなペニシリンＶを用いて繰り
返すことができた。転化の程度はHPLC（高圧液
体クロマトグラフイー）、ウオーターズμボンダ
パクＣ―18（Waters′ μBondapak、Ｃ―18）
カラムによる反応混合物の分離〔水中の20％メチ
ルアルコールから水中の50％メチルアルコールま
での勾配により溶出し、ウオーターズピツクＡ試
薬（Water′s Pic Ａ reagent）によるイオン対
形成及びその後の紫外線検出〕により決定され
た。Waters Associates′ information booklet
Paired―Ion Chromatography，D61 May1976，
Printed in USA（Maple Street，Milford，
Mass.）参照。３％（Ｗ／Ｖ）Ｋ―ペニシリンＶ
の40℃における６―APAへの転化結果を表に
示す。
【表】
実施例 ９
実施例２から固定された細胞9.7ｇを50mMリ
ン酸塩緩衝液PH7.5中の３％（Ｗ／Ｖ）Ｋ―ペニ
シリンV100mlに加えた。150rpmの撹拌速度及び
PH―スタツトによる7.5の一定PHにより40℃で脱
アシル化を行なつた。90％より多くのペニシリン
が３時間で６―APAに転化された。10回の逐次
的バツチ後転化時間は約3.5時間に増加し、そし
て20バツチ後４時間に増加した。 実施例 10 100ｇの乾燥重量に対応し且つ実施例６の生成
物を起源とする固定化した細胞を50mMベーター
メルカプトエタノールを含有するPH7.5の50mM
リン酸塩緩衝液中に再膨潤せしめ、10cmの直径を
持つカラム（床容量400ml）中に充填した。上記
のものと同じメルカプトエタノール含有緩衝液
1.5中の粗製Ｋ―ペニシリンV65ｇを予備加熱
器を通してカルム（35℃に保持された）に再循環
し、貯蔵器（12℃に保持した）に戻し、そこで
4M NaOHによる滴定によつてPHを7.5に連続的に
調節した。時間当り14床容量の循環速度でペニシ
リンＶの６―APAへの98％転化率が４時間後に
得られた。10回の逐次的運転後反応時間を６時間
に増加させねばならなかつた。 実施例 11 クリユイベロマイセスフラジリス（Kluyvero
―myces fragilis）ATCC34439（NRRL
Y1109）の醗酵ブロス500ml（PH7.5に調節）に撹
拌しながら40mlの10％ポリエチレンイミン
（Taihei Sangyo Kaisha製の分岐した分子量
700、PEI15T）40mlを加え、続いて25％グルタル
アルデヒド16mlを加えた。60分後、室温で撹拌し
ながら、粒子を過し、粒状化し、そして空気乾
燥した。得られた乾燥材料6.5ｇは約500単位／ｇ
のラクターゼ活性を持ち、これはもとの活性の約
30％に相当する。 実施例 12 バチルスパスチユーリ（Bacillus pasteurii）
ATCC11859の６倍濃縮醗酵ブロス300ml（6.3ｇ
乾燥細胞、9300ウレアーゼ単位／ｇ）に、撹拌し
ながら18mlの10％ポリエチレンイミン（Dow
Chemicals製分岐状の分子量60000、PEI600）を
加え、続いて25％グルタルアルデヒド20mlを加え
た。室温で更に60分撹拌後、固定化した細胞を
別し、空気乾燥した。乾燥した固定化した細胞
13.8ｇが300〜700μの粒径に対して1900単位／ｇ
のウレアーゼ活性を伴ない得られた。これは約45
％の活性収率に相当する。 実施例 13 230ウレアーゼ単位／mlを持つバチルスパスチ
ユーリ（Bacillus pasteurii）ATCC11859の４％
（Ｗ／Ｖ）水性懸濁液100mlに撹拌しながら10％ポ
リエチレンイミン32ml（ポリミンHS、BASF）
を加え、続いて25％グルタルアルデヒド５mlを加
えた。４℃で１時間撹拌を続け、しかる後細胞を
別し、空気乾燥した。乾燥調製物2.3ｇは3100
単位／ｇのウレアーゼ活性（粒径300〜700μ）を
含有しており、これは31％の活性収率に相当す
る。 実施例 14 実施例12に記載の固定化した細胞0.5ｇをカラ
ム（１cmφ×10cm）に充填し、PH９に調節した１
％尿素（0.01％MgCl2、10mMベーターメルカプ
トエタノール）を含有する基質を40℃で床を通過
させ、尿素98％を50ml／hrの流速で加水分解する
ことができ、酵素活性の半減期は約1000時間であ
つた。 実施例 15 14単位マロラクチツク活性／を持つNaOHに
よりPH6.5に調節したロイコノストツクエノス
（Leuconostoc oenos）DSM20252の醗酵ブロス
0.25に、撹拌しながら３mlの10％ポリエチレン
イミン（ポリミンＰ、BASF）を加え、続いて１
mlの25％グルタルアルデヒドを加えた。４℃で更
に30分間撹拌を続け、しかる後、固定化した細胞
を別し、PH６の0.1Mリン酸塩緩衝液及び水で
洗浄し、次いで凍結乾燥した。乾燥した細胞は
3.4単位／ｇのマローラクチツク活性を持ち、こ
れは約40％の活性収率に相当する。 実施例 16 96単位マローラクチツク活性／ｇを持つロイコ
ノストツクエノスDSM20252の湿潤した細胞1.6
ｇを16ml水中に懸濁させ、PHを7.0に調節した。
1.7mlの10％ポリエチレンイミン（ポリミンＰ、
BASF）を撹拌しながら加え、続いて1.5mlの25
％グルタルアルデヒドを加えた。撹拌を室温で１
時間続け、しかる後固定化した細胞を過し、水
で洗浄し、空気乾燥した。乾燥生成物（0.5ｇ）
は53単位／ｇのマローラクチツク活性を持ち、こ
れは28％の活性収率に相当する。 実施例 17 実施例15に記載した固定化した細胞の乾燥重量
で４ｇを85μモルNAD+及び35μモルMnCl2と共
にPH5.0の0.1Mリン酸塩中の25mM Ｌ―マレエー
ト50mlに加えた。マレエートのラクテートへの全
転化は３時間で達成された。この操作は反応時間
を何ら増加させることなしに少なくとも５回繰返
すことができた。 実施例 18 実施例16からの調製物0.35ｇを17μモルNAD+
及び７μモルMnCl2と共にPH4.0の0.1Mリン酸塩
中の33mM Ｌ―マレエート10mlに加えた。マレ
エートのラクテートへの全転化は６時間で得ら
れ、この操作は反応時間を何ら増加させることな
く新たなマレエート、NAD+及びMnCl2を用いて
少なくとも５回繰り返すことができた。
ン酸塩緩衝液PH7.5中の３％（Ｗ／Ｖ）Ｋ―ペニ
シリンV100mlに加えた。150rpmの撹拌速度及び
PH―スタツトによる7.5の一定PHにより40℃で脱
アシル化を行なつた。90％より多くのペニシリン
が３時間で６―APAに転化された。10回の逐次
的バツチ後転化時間は約3.5時間に増加し、そし
て20バツチ後４時間に増加した。 実施例 10 100ｇの乾燥重量に対応し且つ実施例６の生成
物を起源とする固定化した細胞を50mMベーター
メルカプトエタノールを含有するPH7.5の50mM
リン酸塩緩衝液中に再膨潤せしめ、10cmの直径を
持つカラム（床容量400ml）中に充填した。上記
のものと同じメルカプトエタノール含有緩衝液
1.5中の粗製Ｋ―ペニシリンV65ｇを予備加熱
器を通してカルム（35℃に保持された）に再循環
し、貯蔵器（12℃に保持した）に戻し、そこで
4M NaOHによる滴定によつてPHを7.5に連続的に
調節した。時間当り14床容量の循環速度でペニシ
リンＶの６―APAへの98％転化率が４時間後に
得られた。10回の逐次的運転後反応時間を６時間
に増加させねばならなかつた。 実施例 11 クリユイベロマイセスフラジリス（Kluyvero
―myces fragilis）ATCC34439（NRRL
Y1109）の醗酵ブロス500ml（PH7.5に調節）に撹
拌しながら40mlの10％ポリエチレンイミン
（Taihei Sangyo Kaisha製の分岐した分子量
700、PEI15T）40mlを加え、続いて25％グルタル
アルデヒド16mlを加えた。60分後、室温で撹拌し
ながら、粒子を過し、粒状化し、そして空気乾
燥した。得られた乾燥材料6.5ｇは約500単位／ｇ
のラクターゼ活性を持ち、これはもとの活性の約
30％に相当する。 実施例 12 バチルスパスチユーリ（Bacillus pasteurii）
ATCC11859の６倍濃縮醗酵ブロス300ml（6.3ｇ
乾燥細胞、9300ウレアーゼ単位／ｇ）に、撹拌し
ながら18mlの10％ポリエチレンイミン（Dow
Chemicals製分岐状の分子量60000、PEI600）を
加え、続いて25％グルタルアルデヒド20mlを加え
た。室温で更に60分撹拌後、固定化した細胞を
別し、空気乾燥した。乾燥した固定化した細胞
13.8ｇが300〜700μの粒径に対して1900単位／ｇ
のウレアーゼ活性を伴ない得られた。これは約45
％の活性収率に相当する。 実施例 13 230ウレアーゼ単位／mlを持つバチルスパスチ
ユーリ（Bacillus pasteurii）ATCC11859の４％
（Ｗ／Ｖ）水性懸濁液100mlに撹拌しながら10％ポ
リエチレンイミン32ml（ポリミンHS、BASF）
を加え、続いて25％グルタルアルデヒド５mlを加
えた。４℃で１時間撹拌を続け、しかる後細胞を
別し、空気乾燥した。乾燥調製物2.3ｇは3100
単位／ｇのウレアーゼ活性（粒径300〜700μ）を
含有しており、これは31％の活性収率に相当す
る。 実施例 14 実施例12に記載の固定化した細胞0.5ｇをカラ
ム（１cmφ×10cm）に充填し、PH９に調節した１
％尿素（0.01％MgCl2、10mMベーターメルカプ
トエタノール）を含有する基質を40℃で床を通過
させ、尿素98％を50ml／hrの流速で加水分解する
ことができ、酵素活性の半減期は約1000時間であ
つた。 実施例 15 14単位マロラクチツク活性／を持つNaOHに
よりPH6.5に調節したロイコノストツクエノス
（Leuconostoc oenos）DSM20252の醗酵ブロス
0.25に、撹拌しながら３mlの10％ポリエチレン
イミン（ポリミンＰ、BASF）を加え、続いて１
mlの25％グルタルアルデヒドを加えた。４℃で更
に30分間撹拌を続け、しかる後、固定化した細胞
を別し、PH６の0.1Mリン酸塩緩衝液及び水で
洗浄し、次いで凍結乾燥した。乾燥した細胞は
3.4単位／ｇのマローラクチツク活性を持ち、こ
れは約40％の活性収率に相当する。 実施例 16 96単位マローラクチツク活性／ｇを持つロイコ
ノストツクエノスDSM20252の湿潤した細胞1.6
ｇを16ml水中に懸濁させ、PHを7.0に調節した。
1.7mlの10％ポリエチレンイミン（ポリミンＰ、
BASF）を撹拌しながら加え、続いて1.5mlの25
％グルタルアルデヒドを加えた。撹拌を室温で１
時間続け、しかる後固定化した細胞を過し、水
で洗浄し、空気乾燥した。乾燥生成物（0.5ｇ）
は53単位／ｇのマローラクチツク活性を持ち、こ
れは28％の活性収率に相当する。 実施例 17 実施例15に記載した固定化した細胞の乾燥重量
で４ｇを85μモルNAD+及び35μモルMnCl2と共
にPH5.0の0.1Mリン酸塩中の25mM Ｌ―マレエー
ト50mlに加えた。マレエートのラクテートへの全
転化は３時間で達成された。この操作は反応時間
を何ら増加させることなしに少なくとも５回繰返
すことができた。 実施例 18 実施例16からの調製物0.35ｇを17μモルNAD+
及び７μモルMnCl2と共にPH4.0の0.1Mリン酸塩
中の33mM Ｌ―マレエート10mlに加えた。マレ
エートのラクテートへの全転化は６時間で得ら
れ、この操作は反応時間を何ら増加させることな
く新たなマレエート、NAD+及びMnCl2を用いて
少なくとも５回繰り返すことができた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 細胞内グルタルアルデヒド感受性酵素の固定
化方法において、細胞内グルタルアルデヒド感受
性酵素を含有する微生物細胞を第１アミノ基の有
義な含有量を持つポリアミンの存在下にグルタル
アルデヒドと水性媒体中で反応させること及び得
られる固定化された酵素の単離より成ることを特
徴とする方法。 ２ 該微生物細胞が全微生物細胞である特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ３ 該微生物細胞が菌株NRRL11240（又はその
突然変位体及び変種を包含する本質的にそれと同
一の菌株）の微生物細胞であり、且つペニシリン
Ｖ―アシラーゼを含有する特許請求の範囲第１又
は２項記載の方法。 ４ 該微生物細胞が種バチルスパスチユーリに属
する菌株の微生物細胞であり且つウレアーゼを含
有する特許請求の範囲第１又は２項記載の方法。 ５ 該微生物細胞が種クリユイベロマイセスフラ
ジリスに属する菌株の微生物細胞であり且つラク
ターゼを含有する特許請求の範囲第１又は２項記
載の方法。 ６ 該微生物細胞が種ロイコノストツクエノスに
属する菌株の微生物細胞であり、且つマロラクチ
ツク酵素を含有する特許請求の範囲第１又は２項
記載の方法。 ７ 該水性媒体が該発酵ブロスの水性部分である
特許請求の範囲第１〜６項の何れかに記載の方
法。 ８ 該水性媒体が細胞スラツジの水性部分であ
り、該細胞スラツジは該発酵ブロスから分離され
たものである特許請求の範囲第１〜６項の何れか
に記載の方法。 ９ 該ポリアミン中の第１アミノ基の含有率が第
１、第２及び第３アミノ基の全含有率の５％を越
え、好ましくは20％を越える特許請求の範囲第１
〜８項の何れかに記載の方法。 １０ 第１アミノ基の実質的含有率を持つポリア
ミンが、そのアルキレン部分が２〜４個の炭素原
子を含有するポリアルキレンイミンであり、好ま
しくは分岐したポリアルキレンイミンである特許
請求の範囲第１〜９項記載の方法。 １１ 該ポリアミンが分岐したポリエチレンイミ
ンである特許請求の範囲第１〜１０項の何れかに
記載の方法。 １２ 該ポリアミンがポリアルキレンポリアミン
である特許請求の範囲第１〜１０項記載の何れか
に記載の方法。 １３ 該分岐したポリエチレンイミンが500〜
100000ダルトンの分子量を有する特許請求の範囲
第１〜１１項の何れかに記載の方法。 １４ 第１アミン当量／アルデヒド当量の比が
0.01：１〜10：１、好ましくは0.1：１〜１：１
の範囲にある特許請求の範囲第１〜１３項の何れ
かに記載の方法。 １５ 該方法が微生物細胞を持つ水性媒体への該
ポリアミンの添加及びその後のグルタルアルデヒ
ドの添加より成るシーケンスによつて行なわれる
特許請求の範囲第１〜１４項の何れかに記載の方
法。 １６ グルタルアルデヒド／微生物細胞（Ｗ／
Ｗ）の比が0.01：１〜100：１の範囲にあり、好
ましくは0.1：１〜10：１が使用される特許請求
の範囲第１〜１５項記載の何れかに記載の方法。 １７ 該単離され固定化された酵素が好ましくは
粒状化又は押出しにより賦形される特許請求の範
囲第１〜１６項の何れかに記載の方法。 １８ 洗浄され単離された固定化された酵素が乾
燥、ミル粉砕及び100〜1000μ、好ましくは200〜
700μの範囲の粒径に篩い分けることにより賦形
される特許請求の範囲第１〜１６項の何れかに記
載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB1552178 | 1978-04-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS54163888A JPS54163888A (en) | 1979-12-26 |
| JPS6222599B2 true JPS6222599B2 (ja) | 1987-05-19 |
Family
ID=10060596
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4679979A Granted JPS54163888A (en) | 1978-04-19 | 1979-04-18 | Production and use of fixed enzyme product |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4288552A (ja) |
| JP (1) | JPS54163888A (ja) |
| AT (1) | AT364880B (ja) |
| BE (1) | BE875657A (ja) |
| CH (1) | CH640882A5 (ja) |
| DE (1) | DE2915135A1 (ja) |
| DK (1) | DK146942C (ja) |
| FR (1) | FR2423497B1 (ja) |
| IT (1) | IT1116501B (ja) |
| NL (1) | NL7902860A (ja) |
| SE (1) | SE465965B (ja) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5836959B2 (ja) * | 1980-08-21 | 1983-08-12 | 三井製糖株式会社 | 固定化α−グルコシルトランスフエラ−ゼによるパラチノ−スの製造法 |
| US4347320A (en) * | 1980-11-24 | 1982-08-31 | Miles Laboratories, Inc. | Immobilization of microorganisms in gelled carrageenan |
| US4337313A (en) * | 1980-12-08 | 1982-06-29 | Miles Laboratories, Inc. | Immobilization of biocatalysts |
| US4355105A (en) * | 1981-03-30 | 1982-10-19 | Miles Laboratories, Inc. | Glutaraldehyde/polyethylenimine immobilization of whole microbial cells |
| US4486408A (en) * | 1981-04-07 | 1984-12-04 | Kiel Johnathan L | Insoluble crosslinked cytotoxic oxidase-peroxidase system |
| US4390627A (en) * | 1981-10-26 | 1983-06-28 | Miles Laboratories, Inc. | Immobilization of the sucrose mutase in whole cells of protaminobacter rubrum |
| DE3222912A1 (de) * | 1982-06-18 | 1983-12-22 | Basf Ag, 6700 Ludwigshafen | Unloeslicher biokatalysator |
| JPS5951790A (ja) * | 1982-09-20 | 1984-03-26 | Nok Corp | 酵素固定膜の製造法 |
| US4760024A (en) * | 1983-08-10 | 1988-07-26 | Miles Inc. | Immobilization of enzymes |
| CA1210717A (en) * | 1983-08-10 | 1986-09-02 | Oreste J. Lantero, Jr. | Immobilization of biocatalysts |
| DE3408299A1 (de) * | 1984-03-07 | 1985-09-12 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Verfahren zur immobilisierung von zellen und enzymen |
| US4898827A (en) * | 1984-10-17 | 1990-02-06 | Advanced Mineral Technologies, Inc. | Metal recovery |
| USRE33441E (en) * | 1985-06-14 | 1990-11-13 | Novo Industri A/S | Immobilization of biologically active material with glutaraldehyde and polyazaetidine |
| DK152764C (da) * | 1985-06-14 | 1988-10-03 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt |
| IT1204845B (it) * | 1986-03-25 | 1989-03-10 | Foscama Biomed Chim Farma | Procedimento per preservare l'attivita' fosforilante del lievito di birra,applicato alla produzione di fruttosio-1,6-difosfato |
| JPH0424967Y2 (ja) * | 1987-07-16 | 1992-06-15 | ||
| DK589389D0 (da) * | 1989-11-23 | 1989-11-23 | Novo Nordisk As | Immobiliseret enzympraeparat |
| US6551804B2 (en) | 1999-07-12 | 2003-04-22 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for preparing 4-cyanopentanoic acid |
| US7964415B2 (en) | 2006-04-26 | 2011-06-21 | Cardiogenics Inc. | Stable water-soluble polyethylenimine conjugates and methods of use thereof |
| DE102006028817A1 (de) * | 2006-06-21 | 2007-12-27 | Evonik Degussa Gmbh | Aufarbeitung von Reaktionslösungen aus Ganzzell-Biotransformationen |
| US7695945B2 (en) * | 2007-10-31 | 2010-04-13 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Immobilized microbial nitrilase for production of glycolic acid |
| US7741088B2 (en) | 2007-10-31 | 2010-06-22 | E.I. Dupont De Nemours And Company | Immobilized microbial nitrilase for production of glycolic acid |
| CN104114700A (zh) * | 2011-11-11 | 2014-10-22 | 吉尔德联合有限公司 | 一种可生物降解的固定化酶及其制备方法 |
| CN107238645B (zh) * | 2017-05-11 | 2019-04-30 | 山东省科学院生物研究所 | 在线监测用葡萄糖氧化酶丝网印刷电极及其制备方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2035774A2 (en) * | 1969-03-19 | 1970-12-24 | Anvar | Active protein product - with polymeric carrier |
| US3796634A (en) * | 1970-03-19 | 1974-03-12 | Us Health Education & Welfare | Insolubilized biologically active enzymes |
| US3779869A (en) * | 1971-05-13 | 1973-12-18 | Miles Lab | Enzyme stabilization |
| BE785810A (fr) * | 1971-07-09 | 1973-01-04 | Reynolds Tobacco Co R | Procede de transformation enzymatique |
| GB1400468A (en) * | 1972-07-22 | 1975-07-16 | Beecham Group Ltd | Enzyme preparation and use thereof |
| GB1444539A (en) * | 1972-09-11 | 1976-08-04 | Novo Industri As | Immobilised enzymes |
| US3957580A (en) * | 1974-03-27 | 1976-05-18 | Pfizer Inc. | Immobilized microbial cells |
| US3989596A (en) * | 1974-03-28 | 1976-11-02 | R. J. Reynolds Tobacco Company | Aggregate of dried flocculated cells |
| US3980521A (en) * | 1974-08-28 | 1976-09-14 | Novo Industri A/S | Immobilization of glucose isomerase |
| JPS51144778A (en) * | 1975-06-07 | 1976-12-13 | Res Inst For Prod Dev | A process for immobilizing microorganisms |
-
1979
- 1979-04-06 DK DK141779A patent/DK146942C/da not_active IP Right Cessation
- 1979-04-10 CH CH339479A patent/CH640882A5/de not_active IP Right Cessation
- 1979-04-11 NL NL7902860A patent/NL7902860A/xx active Search and Examination
- 1979-04-11 US US06/029,156 patent/US4288552A/en not_active Expired - Lifetime
- 1979-04-12 DE DE19792915135 patent/DE2915135A1/de active Granted
- 1979-04-17 AT AT0284879A patent/AT364880B/de not_active IP Right Cessation
- 1979-04-17 SE SE7903357A patent/SE465965B/sv not_active IP Right Cessation
- 1979-04-18 FR FR7909800A patent/FR2423497B1/fr not_active Expired
- 1979-04-18 IT IT48765/79A patent/IT1116501B/it active
- 1979-04-18 JP JP4679979A patent/JPS54163888A/ja active Granted
- 1979-04-18 BE BE0/194672A patent/BE875657A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NL7902860A (nl) | 1979-10-23 |
| DK146942B (da) | 1984-02-20 |
| IT1116501B (it) | 1986-02-10 |
| FR2423497B1 (fr) | 1986-01-03 |
| ATA284879A (de) | 1981-04-15 |
| JPS54163888A (en) | 1979-12-26 |
| SE465965B (sv) | 1991-11-25 |
| AT364880B (de) | 1981-11-25 |
| DK146942C (da) | 1984-07-30 |
| US4288552A (en) | 1981-09-08 |
| CH640882A5 (de) | 1984-01-31 |
| SE7903357L (sv) | 1979-10-20 |
| DE2915135C2 (ja) | 1988-09-01 |
| FR2423497A1 (fr) | 1979-11-16 |
| DE2915135A1 (de) | 1979-10-31 |
| BE875657A (fr) | 1979-10-18 |
| IT7948765A0 (it) | 1979-04-18 |
| DK141779A (da) | 1979-10-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS6222599B2 (ja) | ||
| US4950596A (en) | Stabilization of intracellular enzymes | |
| WO1989000195A1 (en) | Process for immobilization of biological material by cross-linking with polyazetidine | |
| US4978619A (en) | Enzyme immobilization by entrapment in a polymer gel matrix | |
| EP0024182B1 (en) | Thermo-stable micro-organism and proteolytic enzyme prepared therefrom, and processes for the preparation of the micro-organism and the proteolytic enzyme | |
| EP0104571B1 (en) | Immobilization of biocatalysts on granular carbon | |
| KR910002854B1 (ko) | 효소의 고정방법 | |
| US4390627A (en) | Immobilization of the sucrose mutase in whole cells of protaminobacter rubrum | |
| JP2901286B2 (ja) | 酵素含有バイオ触媒、その製法及びその使用による生化学反応法 | |
| EP0043169B1 (en) | Inulinase | |
| DE3438960C2 (ja) | ||
| JPH0622761A (ja) | 固定化酵素 | |
| CA1245590A (en) | PROCESS FOR THE ENZYMATIC HYDROLYSIS OF D-.alpha.-AMINO- ACID AMIDES | |
| JPS60203192A (ja) | 細胞及び／又は酵素の固定化方法 | |
| CA1267618A (en) | Stabilization of intracellular enzymes | |
| US4411999A (en) | Immobilization of enzymes on granular gelatin | |
| JPH04229190A (ja) | セファロスポリン誘導体をグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体に連続転化する方法 | |
| JPH0369278B2 (ja) | ||
| Kennedy et al. | Immobilization of enzymes on crosslinked gelatin particles activated with various forms and complexes of titanium (IV) species | |
| KR101252928B1 (ko) | ｐＨ 민감성 고분자 담체에 고정된 고정화 효소 및 상기 고정화 효소를 이용한 선형 알파－１，４－글루칸의 제조방법 | |
| JPH06125774A (ja) | レバンサッカラーゼ酵素、その製造方法、それを産生する微生物およびそれを含む組成物 | |
| JP3083554B2 (ja) | 凝集剤特性を有する菌の細胞壁物質、その生成のための方法 | |
| JP3632242B2 (ja) | パラチノースおよびトレハルロースの製造方法 | |
| CA1165708A (en) | Method for disinfecting immobilized enzyme reactors | |
| JP3399595B2 (ja) | εーポリーＬーリジンの製造方法 |