CN104114700A - 一种可生物降解的固定化酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固定化酶和包括一种具有支撑材料的交联酶的固定化酶材料,所述支撑材料包括不同于最初所述酶来源的生物质的生物质材料。优选的,所述固定化酶还包括一种聚合材料和/或最初取得所述酶的生物质,所得到的固定化酶材料可以是可生物降解的。本发明还公开了制备和使用所公开的固定化酶材料的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请涉及并且要求申请日为2011年11月11日,申请号为61/558,758的美国临时专利申请的优先权。
技术领域
要求保护的技术总体上涉及诸如酶的生物催化剂,尤其涉及酶的固定化。
背景技术
业已发现了固定化的生物催化剂在需要特殊化学转化的多种行业中的应用。食品和制药行业的特大规模的实施例包括用于将葡萄糖转化成果糖的固定化的葡萄糖异构酶和用于制备青霉素衍生物的固定化的青霉素酰化酶。固定化酶可用于大规模生物修复,如降解不需要的化合物。另一种用途涉及用于诊断反应的小规模固定化酶,其中,所述生物催化剂能促进产生可检测的化学成分或其他化学变化的化学反应。将来很可能开发出固定化酶的更多用途。
相对存在于溶液中的生物催化剂,例如那些以液体形式提供或是以需要溶解的干燥形式提供的生物催化剂,固定化的生物催化剂(酶)具有诸多优点。固定化酶可以方便地从液体中分离,因此可以再利用这些酶,从而降低所述酶在制备产品中的成本。在上文引用的两个实施例中,固定化酶被用于填充柱中,泵送反应溶液通过填充柱,当所述溶液离开时,需要的化学反应完成。在该过程中,所述酶以高浓度被多次使用,以实现对所述酶的有效利用。
除了便于分离之外,固定化酶还具有其他潜在优点,包括在储存和使用期间的更高的热稳定性和pH稳定性等。与溶液中的酶相比,固定化的生物催化剂在各种溶剂中还具有更高的活性。其物理形态通常具有优点,因为固定化的生物催化剂能够以颗粒形式提供,它减少了粉尘,并且改善了产品的操控性。与干燥的酶类似,单位质量的固定化酶的活性可以根据特定用途的需要而改变。
固定化酶可以由与固体基质结合的酶材料组成,所述酶通过化学或物理方式与所述固体基质结合或固定。所述酶可以结合在所述基质表面,或者如果所述基质的孔隙足以允许底物扩散,则所述酶可以分布在所述基质中。多种用于生物催化剂的固定化方法被提出,包括将所述酶包埋在凝胶中,通过共价,疏水,静电,和其他方法将所述酶结合在无机或有机固体上。所述酶与全细胞,酶晶体等的交联可以通过使用诸如戊二醛(GA)和聚氮丙啶(PEI)的试剂实现。
生物催化剂转化成固定化形式可能需要更多的处理,因此可能会提高这种酶形式的生产成本。任何增加的成本都必须通过提高生产率,货架期,在溶剂中使用或某些其他优点来补偿。因此,固定化的成本是生产固定化酶时的一个重要考虑因素。因此,较低的固定化成本可实现固定化酶的更经济的利用。
在所提出的用于酶固定化的方法中,交联全细胞的使用是成本效益最高的方法之一。该方法所使用的全细胞是用于制备所述酶的微生物,因此,能够零成本使用,或者如果存在与处理所述细胞物质相关的成本的话甚至为负成本。
业已提出了多种酶固定化的方法,包括结合在二氧化硅支撑材料上。该方法涉及微生物发酵,以便生产所述酶,从所述生物质中分离(或纯化)所述酶,将所述酶化学结合或包埋在所述基质中,以及生产最终形式的产品。所述固定化的缺陷是会产生结合所述酶的所述基质的成本。从发酵生物质中进一步分离所述酶会产生某些酶和酶活性的损失,以及相关的纯化处理成本。通过直接利用用于生产所述酶的生物质固定所述酶可以克服这些缺陷。
某些酶底物在水中具有有限的溶解度,而在有机溶剂或有机溶剂与水的混合物中具有更好的溶解度。例如,由于上述特性,有机溶剂溶液通常被用于清洗有机磷化合物或有机溶剂被用于甘油三酸酯的处理。可溶性酶在有机溶剂或混合物中通常是失活的或是惰性的;不过,与可溶性酶相比,固定化酶能够保持一些活性。因此,固定化酶在这样的溶剂中能够与更高浓度的它们的底物起反应。
固定化酶的应用可能需要在使用之后处理所述酶。例如,用于塔式反应器的固定化酶在使用之后需要处理。另外,也有一些固定化酶可以考虑在环境中直接利用。例如,固定化的OPH酶可以分散在农田中,以便对农药或其他有机磷化合物进行降解。
发明内容
在随后的权利要求书中提出了要求保护的技术,而下面的说明不是要以任何方式限定、确定或以区域方式界定法律保护的范围。一般来说,所公开的技术涉及固定化酶和生产这种酶的方法。
所公开的技术的一个方面提供了多种固定化酶,这些酶利用一种或多种生物材料作为支撑基质的成分。因此,所公开的技术降低了成本并且简化了生产。有利的是,所述固定化酶稳定并且能够在多种条件下工作,特别是在存在多种溶剂的条件下,在各种pH值下,以及在大田中所遭遇的温度下工作。在某些场合下,所述固定化酶和固定化酶材料还是可生物降解的。本发明提供了特殊的固定化酶,它们能够将有机磷酸盐和相关的有毒材料转化成危害较小/无害材料,并且能够选择性地为生物降解,以便进一步影响并简化修复工作。本发明还提供了用于制备和使用所述固定化酶的方法。
总之,本发明所公开的技术提供了一种固定化酶材料。所述材料可以是固定化的有机磷降解酶材料。所述酶材料可以包括具有支撑基质的交联酶,所述支撑基质包括生物材料。所述生物材料可以是不同于所述酶来源的生物质(Biomass materials)。所述交联酶可以通过让所述酶与至少两种多功能材料反应生成。
可用于所公开的技术的固定化酶中的酶包括,但不局限于,选自下列一组类型的酶:氧化还原酶,转移酶,水解酶,裂解酶,异构酶和连接酶。可以使用有机磷降解酶,如有机磷水解酶(OPH),有机磷酸酐水解酶(OPAA),二异丙基氟磷酸酶(DFPase)等。还可以使用诸如乳糖酶,葡萄糖异构酶,过氧化物酶,醇脱氢酶,木聚糖酶,丙酮酸脱羧酶,过氧化氢酶,转化酶,肌醇六磷酸酶,淀粉葡萄糖苷酶,葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等的酶。与游离的酶相比,所公开的技术中的固定化酶改善了对的温度的稳定性。优选的,所公开的技术适应并用于两种或两种以上酶的组合。因此,所公开的技术提供了低成本酶产品的可能性,其中,所述酶可以是有机磷水解酶和/或其他酶。所述产品可用于分解有机磷化合物,以及用于其他化学转化。所公开的技术提供了一种酶产品,该产品在储存和使用条件下都是稳定的。另外,所公开的技术提供了一种酶产品,其中,所述酶在一些溶剂中是有活性的,在所述溶剂中某些有机磷化合物的溶解度更高或在所述溶剂中可进行其他化学转化。另外,所公开的技术提供了多种固定化酶产品,用于有机磷分解以及其他酶用途,这些用途需要对所述酶进行处理或留在环境中分解。所述产品是适合生物降解的。
在所公开的技术中,与游离的酶相比,所述固定化酶材料可以在实质上更宽的pH范围内起作用,在存在多种溶剂的条件下,以及与游离的酶相比,在更高的温度下起作用。
被用于所述支撑材料的生物质可以包括不同于所述酶来源的生物质的生物质。在这点上,它可以包括不同于所述酶来源的生物质的生物质和与所述酶来源的生物质相同的生物质的组合,只要至少某些所述生物质不同于所述酶来源的生物质即可。
使用不同于所述酶来源的生物质的生物质具有优势。在这点上,一个好处是不同于所述酶来源的生物质的生物质可能是废产物,换句话说废物必须要进行处理。另一个优点是,生物质的特性可以根据固定化酶的预期用途进行选择。例如,所述固定化酶可以制成生物可降解的形式。当所述固定化酶被用于清除环境灾难时该特征是有用的,所述灾难包括某些形式的农药和化学战剂,并可用于生产用途,其中,随后必须处理所述固定化酶。例如,处理被有机磷农药污染的农田,可以通过将生物可降解形式的固定化酶喷洒在田面上排除污染。一旦降解完成,所述生物可降解的固定化酶只需随着时间的推移而降解,因此无需进一步清除/排除。在某些实施例中,最终固定化酶材料的物理特性可以通过生物质的选择进行改良。例如,可以使所述材料具有更高或更低的刚性,以提高其对各种反应器构造的适应性。刚性更高的颗粒适用于填充床反应器构造。类似地,固定化酶材料特性,如孔隙度,疏水性和溶解度也可以通过生物质的选择改良,以适应特定反应条件。一般,与局限于用于制备所述酶的生物质的特性的全细胞固定化相比,采用不同于所述酶来源的生物质的额外生物质,提供了特别适应所述固定化酶材料的额外选项。
合适的支撑材料具有多个能够与所述交联材料反应的胺基或其他官能团。支撑材料可以包括一种或多种生物质,如几丁质,黑曲霉(Aspergillus niger)细胞和羊毛等。一种类型的合适的生物质具有多个能够与所述交联材料反应的官能团。业已使用了含有氨基的生物质,例如聚胺。所述合适的生物质支撑材料的实施例包括,但不局限于,黑曲霉(Aspergillus niger)细胞,酵母细胞,纤维素,葡聚糖,淀粉琼脂(starch agar,),藻酸盐(alginate),卡拉胶(carrageenans),胶原,明胶,白蛋白(albumin)和铁蛋白(ferritin)。其他生物质,如棉和羊毛可选择性地使用,只要提供了至少某些具有多个官能团的支撑材料以支撑交联。支撑材料还可以包括合成和/或聚合材料,如聚氮丙啶(polyethylenimine),壳多糖(chitosan),聚吡咯(polypyrrole),或其他合适材料。优选的,所述支撑材料包括一种或多种生物质和/或一种或多种聚合支撑材料的组合。合适的聚合支撑材料可以包括聚胺,例如,聚氮丙啶,聚吡咯,蛋白,明胶等。一般来说,合适的生物质可以包括一般没有官能团并且最低限度参与所述交联结构的生物质,具有多个参与必要交联的官能团的生物质及其组合。合适的交联材料包括能够与所述支撑材料反应的多官能团。
合适的交联材料还可以包括能够与所述支撑材料反应的多官能团,例如,戊二醛,二醛,有机二羧酸,辛二酸二琥珀酰亚胺,庚二亚氨酸二甲酯,二亚胺代己二酸二甲酯,氰尿酰氯,琥珀酸,六亚甲基二异氰酸酯等。还可以使用能够与胺交联的其他试剂。
优选的,利用生物质作为支撑基质的固定化酶为可生物降解的。在其他实施例中,所述生物质是不可溶解的。因此,所公开的技术的固定化酶可以是可生物降解的。合适的可生物降解的支撑材料包括,但不局限于,处理过或未处理过的外骨骼(矿物质或有机物),骨骼,几丁质(可溶的或不可溶的)和黑曲霉细胞等。
在所述固定化酶被用于对环境开放的大面积区域的用途中,所述固定化酶如果是可生物降解的将是有利的。因此,在所公开的技术的具体实施例中,所述固定化酶是可生物降解的,可用于需要处理的多种酶或分散在环境中的酶。
所述固定化酶材料还可以包括溶剂。该溶剂可以是适合要溶解转化的材料的溶剂。溶剂可以包括,但不局限于,己烷,甲苯,甲醇,二甲基亚砜等。与所述游离的酶相比,所述固定化酶可表现出改良的温度稳定性。
大体上,所公开的技术还提供了一种用于制备固定化酶材料的方法。在一个实施例中,所述方法包括以下步骤:提供一种酶,一种支撑材料和一种交联材料,并且将所述支撑材料和所述交联材料与所述酶的水悬浮液混合。所述材料能够以任意顺序混合;在某些场合下,所述支撑材料在先于所述交联材料添加,而在其他场合下,所述交联材料在先于所述支撑材料添加,以使活性最大化。所述混合材料的步骤可适当形成絮凝产物。所述产物可直接使用或根据预期的用途进行分离、干燥、并且制成具有所需大小和形状的颗粒。所述支撑材料可以包括一种生物质支撑材料。还可以额外提供除生物质支撑材料之外的支撑材料,并且加入所述酶的水悬浮液中。优选的,所述交联材料提供在合适的溶剂中,如水,酒精,DMSO等。
由此生产的所述固定化酶材料可经受较高温度处理。与未经较高温度处理的类似固定化酶相比,经受较高温度处理的所述固定化酶一般可提高所述固定化酶的活性。
大体上,所公开的技术还提供了一种利用所述固定化酶材料转化对酶转化敏感的材料的方法。所述固定化酶材料能够以可生物降解的形式提供。在一个实施例中,所述方法包括提供所述固定化酶材料,其中,所述酶为适合接触所述对酶转化敏感的材料并且适合实现所希望的转化的形式,以及让所述固定化酶材料与所述对酶转化敏感的材料接触。在某些实施例中,所述接触包括将所述对酶转化敏感的材料溶解在一种溶剂中,以便形成溶液,并且让所述固定化酶材料与所述溶液接触。在涉及环境修复的用途中,接触可能包括将所述固定化酶材料分散在土壤中,并且根据土壤中的湿度起着溶剂的作用,溶解所述对酶转化敏感的材料。在其他实施例中,当所述对酶转化敏感的材料不可溶于水或无水可用时,就需要提供一种溶剂。在其他实施例中,所述希望的转化可以在塔,容器,或其他反应器中进行,在这里,所述固定化酶材料和所述对酶转化敏感的材料与一种溶剂混合,所述对酶转化敏感的材料在所述溶剂中至少具有一定的溶解度。在某些实施方案中,所述转化包括将一种选自农药,化学战剂和神经毒剂等的材料转化或降解成低毒/无害成分。一般来说,所述转化可以是分解成低毒/无害成分或转化成需要的化合物。
本发明的第一方面是提供固定化的有机磷降解酶。在一个实施例中,交联的有机磷降解酶(ODE)表现为通过让OPH与支撑材料和交联材料起反应形成的有机磷水解酶(OPH),而在其他实施例中,可以使用其他ODE。合适的支撑材料选择性具有多个胺基。支撑材料可以包括生物质,如几丁质,黑曲霉细胞和羊毛等。另外,支撑材料可以是聚胺,如聚氮丙啶,聚吡咯,蛋白,明胶等。合适的交联材料可以包括能够与所述支撑材料反应的多官能团,例如,戊二醛,辛二酸二琥珀酰亚胺,庚二亚氨酸二甲酯等。
在另一个实施例中,所述交联的OPH材料可以包含包括生物质的支撑基质。所述生物质可以是用于生产所述OPH的生物质,另一种生物质,或其组合。生物质构成的合适的支撑材料的例子包括,但不局限于几丁质,黑曲霉细胞和羊毛等。固定化酶利用生物质作为支撑基质,并且所述支撑材料优选为可生物降解的。在其他实施例中,所述生物质是不可溶解的。
在另一个实施例中,所述交联的OPH材料还可以包括一种溶剂,优选的,所述溶剂为具有适合溶解需要转化的材料的溶剂。溶剂可以包括,但不局限于己烷,甲苯,甲醇,二甲基亚砜等。与所述游离的酶相比,所述固定化的OPH酶具有改善的温度稳定性。
本发明的另一方面包括具有一种支撑基质的固定化酶,所述支撑基质包括不同于所述酶来源的生物质的生物质。在这样一个实施例中,所述固定化酶可以是通过让一种酶与一种支撑材料和一种交联材料起反应形成的,其中,所述支撑材料包括一种生物质。所使用的生物质可以包括不同于所述酶来源的生物质的生物质,与所述酶来源相同的生物质,或其组合,只要至少某些所述生物质不同于所述酶来源的生物质即可。一种类型的合适的生物质具有能够与所述交联材料反应的多个官能团。业已使用了含有氨基的生物质,例如,聚胺。所述合适的生物质支撑材料的实施例包括,但不局限于黑曲霉细胞,酵母细胞,纤维素,葡聚糖,淀粉琼脂,藻酸盐,卡拉胶,胶原,明胶,白蛋白和铁蛋白。其他生物质,如棉和羊毛可选择性使用,只要提供了至少某些具有多个官能团的支撑材料以支撑交联即可。合适的支撑材料还可以包括聚胺,例如,聚氮丙啶,聚吡咯,蛋白,明胶等。合适的交联材料可以包括能够与所述支撑材料反应的多官能团。适合与含有胺的支撑材料起反应的交联材料可以包括戊二醛,辛二酸二琥珀酰亚胺,庚二亚氨酸二甲酯等。可以参入所述固定化酶的酶的某些实施例包括选自下列一组的类型的酶:氧化还原酶,转移酶,水解酶,裂解酶,异构酶,和连接酶。与所述游离的酶相比,上述固定化酶可能具有改善的温度稳定性。
本发明的另一方面包括可生物降解的固定化酶。所述可生物降解的酶包括具有支撑基质的交联酶,所述支撑基质来自包括生物质和交联材料的支撑材料。合适的生物质支撑材料选择性具有能够与所述交联材料反应的多个官能团。业已使用了含有氨基的某些生物质,例如,聚胺。在其他实施例中,根据需要,所使用的生物质是可溶于水或不可溶于水的。所述合适的生物质支撑材料的其他实施例包括,但不局限于黑曲霉细胞或其他细菌细胞材料,酵母细胞或其他真菌细胞材料,纤维素,葡聚糖,淀粉琼脂,藻酸盐,卡拉胶(carrageenans),胶原,明胶,白蛋白,和铁蛋白。其他生物质,如棉和羊毛可选择性使用。合适的交联材料可选择性包括能够与所述支撑材料反应的多官能团。在其他实施例中,可以使用杂官能的交联材料,就是说交联材料包括两种或两种以上不同的官能团。某些适合与含有胺的支撑材料起反应的交联材料可以包括戊二醛,辛二酸二琥珀酰亚胺,庚二亚氨酸二甲酯等。可以掺入所述固定化酶的某些酶包括选自下列一组的类型的酶:氧化还原酶,转移酶,水解酶,裂解酶,异构酶和连接酶。与游离的酶相比,所述生物可降解的固定化酶可能具有改善的温度稳定性。
本发明的另一方面涉及一种制备固定化酶的方法,其中,所述支撑材料的至少一部分是生物质。在一个实施例中,所述方法包括以下步骤:提供一种酶,一种生物质支撑材料和一种交联材料,将所述生物质支撑材料和所述交联材料添加到所述酶的水悬浮液中,搅拌以形成絮凝物。水悬浮液可以包括含有至少某些水的任何悬浮液。还可以提供除了生物质支撑材料之外的生物质,并且添加到所述酶的水悬浮液中。支撑材料还可以包括选自下列一组的聚胺:聚氮丙啶,聚吡咯,聚乙烯亚胺;聚氮丙啶(例如,聚二乙撑三胺,聚三乙撑四胺,聚五乙撑六胺或聚六亚甲基二胺);聚亚甲基二环己基胺;聚亚甲基双苯胺;聚四乙基五胺;聚苯二胺,两种或两种以上所述聚胺化合物的混合物等。另一个实施例包括一种制备生物可降解的固定化酶的方法,该方法包括以下步骤:提供一种或多种可生物降解的支撑材料和交联剂。合适的可生物降解的支撑材料包括,但不局限于处理过的(通过研磨,粉碎,或其他机械方法)或未处理过的外骨骼(矿物质或有机物),骨骼,几丁质(可溶的或不可溶的)和黑曲霉细胞等。合适的交联材料包括,但不局限于戊二醛,二醛,有机二酸,辛二酸二琥珀酰亚胺,和庚二亚氨酸二甲酯,多官能醛,多官能有机卤化物,多官能酸酐,多官能偶氮化合物,多官能异硫氰酸盐,多官能异氰酸盐,两种或两种以上所述胺反应材料的混合物,丁二醛,对苯二甲醛,双-重氮对二氨基联苯-2,2'-二磺酸,4,4'-二氟-3,3'-二硝基二苯砜,二苯基-4,4'-二硫氰酸-2,2'-二磺酸酯,3-甲氧基-二苯甲烷-4,4'-二异氰酸酯,甲苯-2-异氰酸-4-异硫氰酸酯,甲苯-2,-4-二异硫氰酸酯,重氮对二氨基联苯,重氮对二氨基联苯-3,3'-邻联茴香胺,N,N'-环已烷二碘代乙酰胺,六亚甲基二异氰酸酯,氰尿酰氯,1,5-二氟-2,4-二硝基苯,两种或两种以上所述胺反应材料的混合物等。所述交联材料科选择性地提供在合适的溶剂中,如水,酒精,DMSO等。所述方法可用于生产选自下列一组的类型的固定化酶:氧化还原酶,转移酶,水解酶,裂解酶,异构酶,和连接酶。与未进行较高温度处理的类似的固定化酶相比,在分离之后对所述固定化酶进行较高温度的处理,可提供所述固定化酶活性。
本发明的另一方面涉及一种利用可生物降解的酶转化对酶转化敏感的材料的方法。在这样一个实施例中,所述方法涉及提供一种可生物降解的酶,其中,所述酶为适合接触所述对酶转化敏感的材料并且适合实现所希望的转化的形式,并且让所述生物可降解的固定化酶与所述对酶转化敏感的材料接触。所述接触选择性包括将所述对酶转化敏感的材料溶解在一种溶剂中,以便形成溶液,并且让所述可生物降解的固定化酶与所述溶液接触。在涉及环境修复的用途中,接触可能包括将所述生物可降解的固定化酶材料分散在土壤中,并且根据土壤中的湿度起着溶剂的作用,溶解所述对酶转化敏感的材料。在其他实施例中,当所述对酶转化敏感的材料不可溶于水或无水可用时,就需要提供一种溶剂。
特别是,有机磷化合物是有效的神经毒素,常被用作农药,杀虫剂和化学战剂。尽管将有机磷酸盐用作化学战剂业已受到国际条约的限制;将这些化合物用作农业和家庭虫害防治引起了关注土壤和水系的污染,以及被污染设备和容器的修复的法律关注。很多有机磷酸盐可以用化学去污剂分解,如氢氧化钠,氢氧化钾,次氯酸盐,和过氧化氢或可以用去污剂和水处理一个区域以排除污染。尽管上述每一种方法在处理污染方面都在一定程度上是有效的,但在应用时还存在必须考虑的其他问题。例如,其中的某些材料本质上是腐蚀性的,并且来自所述处理的所有废物必须做完有害废物处理。
为了保持化学处理的效果并改进处理方法的废物处理特征,考虑过利用有机磷解酶(ODE)对有机磷酸盐进行去污。ODE是一种类型酶的统称,用于表示能够催化多种有机磷酸三酯环绕有机磷氟化物的水解作用的酶。业已证实芳二烷基磷酸酶(E.C.3.1.8.1)和二异丙基-氟磷酸酶(E.G.3.1.8.2)能够裂解P-O,P-F,P-S,P-CN键,使其能够与多种有机磷农药起反应,如:乙酰甲胺磷,蝇毒磷,内吸磷,二嗪农,毒死蜱,马拉硫磷,对氧磷,对硫磷,甲基对氧磷,和甲基对硫磷;以及化学战剂,包括:沙林,索曼和VX。
在其他实施例中,希望的转化可以在塔,反应床,容器,或其他反应器中进行,在这里,所述可生物降解的固定化酶和所述对酶转化敏感的材料与一种溶剂混合,所述对酶转化敏感的材料在该溶剂中具有至少一定的溶解度。在上述两个实施例中,与游离的酶相比,所述生物可降解的固定化酶可以在存在多种溶剂的条件下,在相当宽的pH范围内起作用,以及与游离的酶相比,在更高的温度下起作用。合适的溶剂的例子包括,但不局限于己烷,甲苯,甲醇,二甲基亚砜等。
通过本文所提供的说明书、附图和权利要求书,可以了解所公开的技术其他目的,实施方案,形式,效果,方面,特征和优点。
附图说明
图1是表示细胞悬浮液中的OPH酶的吸收率与时间数据关系的曲线图。
图2是表示固定化形式的OPH酶的吸收率与时间数据关系的曲线图。
图3是表示细胞悬浮液中的和固定化形式的具有不同粒度的OPH酶在接受52.5℃温度处理4小时之后的吸收率与时间数据关系的曲线图。
图4是表示悬浮在甲醇溶液中的细胞悬浮液中的OPH的吸收率与时间关系的曲线图。
图5是表示悬浮在甲醇溶液中的固定化形式的OPH的吸收率与时间关系的曲线图。
图6是表示悬浮在甲醇溶液中的具有不同粒度固定化形式的OPH的吸收率与时间关系的曲线图。
图7A是表示细胞悬浮液中的OPH在接受65℃温度处理不同时间之后的吸收率与时间数据关系的曲线图。
图7B是表示固定化形式的OPH在接受65℃温度处理不同时间之后的吸收率与时间数据关系的曲线图。
图8是表示可溶性OPH酶的吸收率与时间数据关系的曲线图。
图9是表示固定化形式的OPH酶的吸收率与时间数据关系的曲线图。
图10是表示悬浮在10%甲醇溶液中的细胞悬浮液中的OPH的吸收率与时间数据关系的曲线图。
图11是表示悬浮在20%甲醇溶液中的细胞悬浮液中的OPH的吸收率与时间数据关系的曲线图。
图12是表示悬浮在30%甲醇溶液中的细胞悬浮液中的OPH的吸收率与时间数据关系的曲线图。
图13是表示悬浮在40%甲醇溶液中的细胞悬浮液中的OPH的吸收率与时间数据关系的曲线图。
图14是表示悬浮在10%甲醇溶液中的固定化的OPH的吸收率与时间关系的曲线图。
图15是表示悬浮在20%甲醇溶液中的固定化的OPH的吸收率与时间关系的曲线图。
图16是表示悬浮在30%甲醇溶液中的固定化的OPH的吸收率与时间关系的曲线图。
图17是表示悬浮在40%甲醇溶液中的固定化的OPH的吸收率与时间关系的曲线图。
图18是表示相对其在无溶剂溶液中的活性,游离OPH酶的活性随接触乙二醇溶液的时间变化的曲线图。
图19是表示相对其在无溶剂溶液中的活性,OPH酶的OPH-7固定化形式的活性随接触乙二醇溶液的时间变化的曲线图。
图20是表示相对其在无溶剂溶液中的活性,OPH酶的OPH-14固定化形式的活性随接触乙二醇溶液的时间变化的曲线图。
图21是表示相对其在无溶剂溶液中的活性,OPH酶的OPH-15固定化形式的活性随接触乙二醇溶液的时间变化的曲线图。
图22A是表示干燥晶体形式的或悬浮在缓冲液中的游离的PO在接受65℃温度处理不同时间之后的吸收率与时间数据关系的曲线图。
图22B是表示干燥粉末形式的或悬浮在缓冲液中的固定化形式的PO在接受65℃温度处理不同时间之后的吸收率与时间数据关系的曲线图。
具体实施方式
为了帮助理解所公开的技术的原理并且提供目前所理解的最佳实施方式,参见在附图中示出的实施方案,并且用特定语言说明这些实施方案。然而,应当理解的是,不是要以这种方式限定所公开的技术的范围,所公开的技术领域的相关技术人员通常可以提出对本文所公开的装置的改变和进一步改进,以及所公开的技术原理的其他用途。
所公开的技术要解决的问题是,提供:(a)能够促进多种需要的转化的固定化酶,所述酶具有包括生物质的支撑基质;(b)制备所述固定化酶的方法,和(c)利用所述固定化酶的方法。本发明的固定化酶具有较低的材料成本,良好的热稳定性,在存在多种溶剂的条件下,在较宽的pH范围内具有良好的活性,并且具有生物可降解性。合适的生物质可以包括总体上没有官能团并且最低限度参与所述交联结构的生物质,具有多个官能团参与必须的交联的生物质,及其组合。一个实施例涉及交联的固定化酶,包括有机磷水解酶,并且能够将多种农药,和神经毒剂等转化或降解成低毒/无害成分。所述固定化的有机磷水解酶的形式可以是可生物降解的。
用于制备本发明的固定化酶的通用方法包括:提供所述酶,所述生物质,所述支撑材料,和所述交联材料,将所述酶悬浮在水介质中,并且与用于形成絮凝物的其他材料混合,所述絮凝物可以通过标准方法分离。基于处理效率和活性考虑,在某些场合下,所述支撑材料应当先于所述交联材料添加,而在其他场合下,所述交联材料应当先于所述支撑材料添加。根据预期的用途,所述含水絮凝物可以直接使用或经过分离、干燥并制成具有需要的大小和形状的颗粒。当在较高温度下加热所述固体时,某些固定化酶的活性可显著地并且令人惊讶地提高。
下面定义的术语被用于本发明并且赋予它们本文专门描述的含义。
支撑基质:用于形成一种颗粒的一种或多种材料,能够赋予可以包括在所述颗粒内的酶机械和酶学稳定性,交联剂,反应性聚合物,支撑材料和生物质。
生物质:由生物学资源,如微生物,植物,和/或其他生物机体,如软体动物,昆虫,或甲壳类,或有机体的一部分,如外骨骼和/或外壳(有机型和矿物质-型)生产的材料。所述材料可以是机械处理过的(研磨和粉碎等),但未经化学处理或处理过的。
支撑材料:单独或组合用于支撑基质中的材料,如生物质,合成生产的聚合物,和/或其他非有机材料。
交联剂:包含两种或两种以上反应性端基的化学试剂,所述端基用于将特殊官能团共价连接在酶和支撑材料上,例如,使胺基与乙醛结合。
反应性聚合物:包括具有能够与交联剂起反应的反应性侧基的聚合物
固定化方法
下面的实施例是用于说明本发明的,而不是要以任何方式限定本发明。正如随后的实施例所证实的,来自包括氧化还原酶,转移酶,水解酶,裂解酶,异构酶,和连接酶在内的多种类型酶的可用于本发明中。用于以下实施例中的ODE酶是固定化的,利用宿主细胞作为细胞悬浮液或裂解的细胞材料。在某些实施例中,使用纯化的酶。支撑材料还可以包括合成材料和/或聚合材料,如聚氮丙啶,壳多糖,聚吡咯或其他合适材料。所述支撑材料可选择性包括一种或多种生物支撑材料和/或聚合支撑材料的组合。交联包括多功能材料,如戊二醛(GA),辛二酸二琥珀酰亚胺(DSS),庚二亚氨酸二甲酯(DMP),二亚胺代己二酸二甲酯(DMA),氰尿酰氯(CyC),琥珀酸(SA),己二异氰酸酯(HDI)和/或能够与胺交联的其他试剂。
提供了一种酶(分离的或包含在可能含有其他蛋白或细胞悬浮液的菌丝体混合物中),并且悬浮在含水缓冲溶液中。添加支撑物,同时搅拌并且持续大约1小时,直到该溶液充分混合。优选的,根据需要可添加一定体积的额外去离子水。添加交联剂,同时持续搅拌,以使所述固定化酶絮凝。所述固体可以是分离的并且利用标准方法干燥。这仅是通用固定化方法的一个实施例。在其他实施例中,所述成分能够按不同的顺序添加,两种或两种以上成分可同时添加,和/或所述步骤能够用更长或更短的时间完成。提供以下实施例仅仅是出于说明目的,而不是要以任何方式限定所公开的技术。
有机磷水解酶固定化方法
在以下实施例中,所使用的OPH酶是在美国专利申请号12/241,574('574号申请)中所公开的类型,该申请的发明名称为Differentially Fluorescent YeastBiosensors for the Detection and Biodegradation of Chemical Agents,申请日为2008年9月30日。本文所公开的方法和技术还可应用于其他类型的OPH和/或应用于利用不同于'574号申请所述方法的方法生产的各种OPH。本文所公开的方法和技术还可应用于除了OPH之外的酶。还可以使用有机磷降解酶,如其他芳二烷基磷酸酶(E.C.3.1.8.1)和二异丙基-氟磷酸酶(E.C.3.1.8.2)等。在某些实施例中,有机磷降解酶是一种能够作用于连接磷一个原子和一个分子的一种或多种键的酶,尽管所公开的技术还可应用于利用不同的分子机理降解或裂解有机磷酸盐的酶。优选的,本文所公开的技术和方法适应并应用于两种或两种以上酶的组合。在其他实施例中,本文所公开的方法和技术可单独适应并应用于两种或两种以上酶,然后将所得到的固定化酶组合,以便用于特定用途。
在一个实施例中,所述酶是利用先前用于生产所述酶的生物质固定化的。在这一特定实施例中,所述酶通过发酵生产的,发酵生成含有所述酶的发酵液和生成所述酶的生物的生物质。将所述发酵液从发酵罐中取出,干燥固体材料,并且选择性处理,以便得到具有期望大小的颗粒。在干燥之前,可选择性地从所述溶液中除去小分子。另外,酶辅助因子,在取出发酵液之前,可将构成含有所述生物质和酶的固体材料,或其他物质添加到所述发酵罐中,和/或根据需要,在干燥之前或之后直接添加到所述固体材料中。
通过所述方法生产的固定化酶可能比通过其他固定化方法生产的酶更便宜,因为不存在用于支撑所述酶的固体基质材料成本。另外,当所述酶保留在所述生物质中时,酶和酶活性损失较少。
与游离的酶相比,这种固定化酶可表现出更高的热稳定性。因此,在储存和使用期间它能够承受更大的温度波动,而依然保持活性。所述固定化酶还可在溶剂溶液中表现出更高的活性。在除了水之外的溶剂中具有较高的活性是有利的,因为某些有机磷化合物在除了水之外的溶剂中溶解度更高。可以考虑使用的溶剂有酒精/水混合物,如用水配制的20%甲醇以及其他溶剂。
本发明的另一方面是提供一种廉价的固定化酶,它在各种环境条件下都表现出较高的生物降解能力。在某些实施例中,在生物可降解的固定化酶产品中,固定化酶中所包含的大部分或全部化学成分都表现出较高的生物降解能力。在一个实施例中,酶是利用用于生产所述酶的生物质固定化的,而所述生物质本身是生物可降解的。在其他实施例中,来自其他发酵的生物质可用于固定首先用其他方法生产的可溶性酶。在其他实施例中,所使用的生物质在水中是不可溶解的或具有有限的溶解度。
以下实施例介绍了利用所述酶OPH进行酶固定化的方法。出于方便考虑,在所述实施例中使用一种特殊的酶(OPH)。所公开的用于固定化酶的方法和技术不局限于OPH。应当理解的是,本领域普通技术人员能够利用所公开的方法和技术固定多种其他的酶,包括,但不局限于,乳糖酶,葡萄糖异构酶,过氧化氢酶,转化酶,肌醇六磷酸酶,淀粉葡萄糖苷酶,葡萄糖氧化酶,青霉素酰化酶等。
含酶细胞的固定化
细胞生长,酶生产,初步制备
在一个实施例中,由工程大肠杆菌(E.coli)生产OPH,始于培养原液的制备。起始溶液,125mL,由25g/L LB发酵液组成,在121℃下灭菌15分钟。灭菌之后,让其冷却,并且在无菌条件下将50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素添加到所述原液中。用2mL该原液以及从事先用需要的大肠杆菌生物划线或接种的琼脂平板上收集的1个大肠杆菌集落制备种子培养物。所述2mL溶液在37℃下在振动台上以150RPM速度振动培养24小时。在培养期结束之后,种子培养液以无菌方式按1%v/v的比例添加到较大体积的(20mL)被称为起始培养液的培养原液中。然后,所述起始培养液在37℃下在振动台上以150RPM速度振动培养24小时。
将由15g L葡萄糖,10g/L酵母抽提物,和5μg/L Pharmamedia组成的用自来水配制的所述发酵液导入14升发酵容器(10升工作容积)New BrunswickBioFlo3000发酵罐。所述溶液在121℃下在所述发酵容器中消毒15分钟。消毒之后,让容器冷却,并且在无菌条件下将50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素添加到发酵液中。发酵控制点被设定为37℃,pH7.0,35%溶解氧,8SLPM过滤的干燥空气,并且以100-600rpm的速度搅拌。所述搅拌被用于控制溶解氧,温度是通过改变冷却水进入所述发酵罐的速度控制的。使所述容器在温度,溶解氧,pH和其他化学特征方面平衡。然后用起始培养液以1%v/v接种所述发酵容器。通过从所述发酵容器中取样,定期监测所述发酵液的OD600,同时保持所述容器无菌。利用Pharmacia Ultrospec III分光光度计测定600nm下的光透射。当OD600的值超过3.5时,通过无菌添加47.7mg/L IPTG和13.0mg/L CoCl2诱导大肠杆菌产生OPH。诱导发酵进行4小时,在该时间点收获所述发酵液。从所述发酵罐中收获的体积大约为7.75升。
使用0.14μm陶瓷微量过滤器,通过微孔过滤和膜渗滤用PBS将收获的发酵液浓缩5-倍。通过所述微量过滤器的膜渗滤除去了所述溶液中的可溶性盐和聚合物。所述酶包含在大肠杆菌细胞中,因此,被微量过滤器留下。分析所述过滤器渗透液,确定在该过滤步骤中损失的酶很少。浓缩的微量过滤的细胞的体积为大约1.5升。所述浓缩的发酵液随后以大约50mL等分试样形式以大约3000xG的速度离心30分钟,并且倒掉上清液。来自该方法的细胞团在-20℃下保存待用。
实施例1
利用PEI和戊二醛的细胞固定化方法
对固定化方法来说,将一个或多个冷冻细胞团从冷冻机中取出以便解冻。将10g解冻的细胞团重新悬浮在100mL的pH7.0磷酸缓冲液(PBS)中。用1分钟时间缓慢添加戊二醛(GA)至所述体积,使终浓度为0.2%(v/v),并且在室温下混合1小时。然后用2倍体积的去离子水稀释该溶液,使总体积为大约300ml,并且将高达0.075%(v/v)的不同量的聚氮丙啶(PET)缓慢滴入该溶液,使细胞絮凝。通过以750xG的速度离心10分钟,收集固定化的细胞块,得到大约10g湿的固定化细胞。将得到的固体展开,并且在室温下干燥24小时。然后收集干燥的材料,并且利用研钵和研棒机械研磨或通过在试管中用玻璃珠湿研磨至需要的粒度。如果必要,再次干燥所述颗粒。
该方法的不同变化是可行的,包括添加PEI和GA的顺序,间歇性顺序添加PEI和GA,每次添加的时间间隔,同时添加PEI和GA,所添加PEI和GA的量和浓度等。在该方法的第一种变化形式中,颠倒了添加PEI和GA的顺序,不过所述材料的总浓度保持不变。另外,所述固定化是用相同的方法进行的。相对原始方法的第二种固定化变化形式,涉及使用两倍的GA,同时加入,并且与前面一样反应1小时。相对原始方法的第二种固定化方法的变化形式,使用二分之一原始量的PEI。在另一种变化形式中,GA可以用任何合适的二醛代替。
实施例2
生物可降解的固定化酶
上文讨论的固定化涉及全细胞,PEI和戊二醛。所述全细胞和戊二醛是可生物降解的,而PEI不是。在某些用途中,可能希望所有固定化的颗粒都是可生物降解的。因此,PEI能够用另一种更便于生物降解的材料代替。合适的材料可以包括可生物降解的聚合物,具有能够与戊二醛,如蛋白,明胶,羊毛,几丁质,壳多糖等起反应的化学基团。
为了形成生物可降解的全细胞固定化酶,上述固定化方法是用壳多糖(CHI)取代PEI进行的。对于固定化方法来说,将一个或多个冷冻细胞团从冷冻机中取出以便解冻。将10g解冻的细胞团重新悬浮在100mL的pH7.0PBS中。用1分钟时间缓慢添加GA至所述体积,使终浓度为0.2%(v/v),并且在室温下混合1小时。然后用2倍体积的去离子水稀释该溶液,使总体积为大约300ml,并且将高达1g的不同量的CHI缓慢滴入该溶液,使细胞絮凝。通过以750xG的速度离心10分钟,收集固定化的细胞块,得到大约10g湿的固定化细胞。将得到的固体展开,并且在室温下干燥24小时。然后收集干燥的材料,并且利用研钵和研棒机械研磨或通过在试管中用玻璃珠湿研磨至需要的粒度。如果必要,再次干燥所述颗粒。
实施例3
可溶性OPH酶的固定化
有时候,酶是以可溶的形式提供的(例如,所述酶是由产生所述酶的微生物分泌的)。可生物降解的固定化酶可能是使用所述可溶性酶的理想产物。全细胞固定化的一个优点是,廉价的可生物降解的生物质来自产生所述酶的生物。例如,还可以通过利用所述可溶性酶,来自其他发酵的生物质(通常是废物),壳多糖,和戊二醛形成固定化酶,以形成廉价的生物可降解的固定化酶。
可溶性OPH酶的初步制备
可溶性OPH酶是通过化学裂解和层析方法从所述冷冻细胞团中收获的。冷冻细胞团在室温水浴中解冻5分钟。首先,每克细胞团用5mL裂解缓冲液(98.8%YPER,1%蛋白酶抑制剂,0.2%DNAse I)裂解细胞。用涂有Teflon的刮勺分散所述细胞团,并且用另外3-5mL裂解缓冲液将所述刮勺上的细胞材料漂洗下来,并入其余裂解液中。所述裂解液随后置于冰上,放在回旋振荡器上温育40分钟。在温育之后,通过在4℃下以20,000xG的速度离心20分钟,澄清所述裂解液。收集来自所述离心的上清液,并且于4℃保存待用。
对于所述层析方法来说,以每2mL制备的NTA-Nickel树脂8mL裂解液的用量将裂解液添加到离心管中。所述裂解液树脂混合物于4℃在回旋振荡器上温育30分钟。温育之后,所述混合物以800xG的速度离心5分钟,并除去上清液。以每2mL树脂13mL结合缓冲液(50mM磷酸缓冲液,500mM NaCl)的用量添加到层析柱中。轻柔地重新悬浮所述树脂并使其沉降,然后以800xG的速度离心5分钟。再次除去上清液,并且以每2mL树脂13mL洗涤缓冲液(30mM咪唑,50mM磷酸缓冲液,500mM NaCl)的用量添加。在重新悬浮所述树脂并使其沉降之后,以800xG的速度离心5分钟,并除去上清液。用所述洗涤缓冲液重复以上过程一次。在洗涤步骤之后,以每2mL树脂的用量添加3mL洗脱缓冲液(250mM咪唑,50mM磷酸缓冲液,500mM NaCl)。该最终混合物在室温下在回旋振荡器上温育10分钟。在让树脂沉降之后,以800xG的速度离心5分钟,收集上清液(洗脱级份),并且于4℃保存待用。
通过用10,000kDa过滤器离心过滤浓缩洗脱级份中的可溶性酶。这一过程还能起到交换含有所述蛋白的缓冲溶液的作用。将12mL洗脱级份添加到每一个过滤装置中,并且以5000xG的速度离心,将所述材料浓缩至1mL(~10分钟)。除去渗透液,并且用储存缓冲液(50mM磷酸缓冲液,500mM NaCl)将滤液再次稀释到12mL。以上过程重复两次,然后收集滤液,并且于4℃保存待用。
利用可溶性OPH的固定化方法
为了固定化所述可溶性酶,用DI水将0.5mL浓缩的OPH滤液稀释到1.5mL。将6mg壳多糖添加到该溶液中,并混合30分钟。然后用DI水将所述溶液进一步稀释到5mL,并将高达12μL的25%GA溶液缓慢滴入该溶液。在与GA反应之后,让所述材料重力沉降若干小时,并小心除去~4mL的上清液,以便保持固定化的固体未受扰动。该材料于4℃保存待用。这种固定化方法的一种变化形式涉及在添加壳多糖之后,再添加165mg消毒的黑曲霉菌丝体(~12%固体)。
实施例4
细胞中的OPH的固定化变化形式
用100mLPBS(pH7.5)制备含有OPH的细胞悬浮液和相关细胞。添加戊二醛,并且在室温下搅拌所述悬浮液1小时。添加去离子水(200mL),随后添加壳多糖。絮凝反应开始,并在持续搅拌若干分钟中持续进行。当絮凝反应结束后,分离固体,并且利用以下两种方法之一干燥。第一种方法,通过将分离的材料转移到离心管并以750-1000xG的速度下离心大约10分钟。颗粒状团块的干燥是通过风干24小时进行的。如果需要,在干燥之前先将湿润的固体形成小球状。另一种方法,取出所述絮凝产物,并将其转移到冷冻干燥试管中,并且使用标准技术冷冻干燥,直到获得干燥产物。通过机械研磨采用上述任一种方法获得的干燥产物至需要的尺寸,都可以获得粉末状材料。
用戊二醛作交联剂制备若干固定化的OPH酶,使用的支撑材料包括聚氮丙啶,壳多糖,聚吡咯和生物质,所述生物质包括含有OPH的干燥细胞。每一种方法开始时都是将一定量的OPH酶悬浮在作为起始缓冲液的磷酸缓冲盐溶液中,并且,让所述方法持续到足以使最终固定化酶基本上完全絮凝的程度。下面的图表1提供了与制备所述固定化的变体相关的信息。用于每一个实施例的方法的差异在下图表中标注。
图表1
缩写
OPH—有机磷水解酶
GA—戊二醛
EC—大肠杆菌细胞
CHI—壳聚糖
PPY—聚吡咯
YE—酵母抽提物
PM—pharmamedia
AN—黑曲霉菌丝体
DMP—庚二亚氨酸二甲酯
DSS—辛二酸二琥珀酰亚胺
SA—琥珀酸
CC—氰尿酰氯
DCH—1,6异氰酸六亚甲酯
方法注释
a–将OPH和生物支撑物悬浮在在起始缓冲液中
b–添加GA并且混合大约1小时
c–添加PEI并且混合大约1小时
d–添加稀释剂至缓冲溶液中
e–添加AN至稀释缓冲液,并且搅拌大约30分钟
f–添加CHI至稀释缓冲液,并且搅拌大约30分钟
g–添加CHI至稀释缓冲液中
h–缓慢添加PEI
i–缓慢添加GA
j–缓慢添加CHI
k–缓慢添加CHI和PPY
1–缓慢添加PPY
m–缓慢添加YE
n–缓慢添加PM
o–缓慢添加稀释溶液
p–缓慢添加DMP
q–缓慢添加DSS
r–缓慢添加SA
s–缓慢添加CC
t–缓慢添加DCH
实施例5
可溶性木聚糖酶的固定化
用100mLPBS(pH7.5)制备含有的木聚糖酶悬浮液。添加黑曲霉和壳多糖,并且在室温下搅拌所述悬浮液1小时。添加去离子水(200mL),随后添加戊二醛。絮凝反应开始,并在持续搅拌若干分钟中持续进行。当絮凝结束后,分离所述固体并且干燥。通过机械研磨所述干燥材料至需要的尺寸,获得粉末状材料。
除非另有说明,在图表1中所列举的所有实施例都是在25℃的温度下进行的。每一种方法开始时都是将一定量的木聚糖酶悬浮在作为起始缓冲液的去离子水中,并且,让所述方法持续到足以使最终固定化酶基本上完全絮凝的程度。用于每一个实施例的方法的差异在下图表中标注。某些固定化试验是在没有生物质的条件下进行的,以便简化固定化反应条件的研究。
图表2
缩写
XY–木聚糖酶
GA–戊二醛
AN–黑曲霉菌丝体
CHI–壳多糖
DI–去离子水
方法注释
a–添加GA并使其混合大约1小时
b–将CHI悬浮在稀释缓冲液中
c–缓慢添加稀释溶液至起始溶液中
d–将AN悬浮在稀释缓冲液中
e–缓慢添加GA至溶液中
f–将CHI悬浮在在起始缓冲液中
实施例6
可溶性过氧化物酶的固定化
用100mLPBS(pH7.5)制备含有过氧化物酶的悬浮液。添加壳多糖并且在室温下搅拌所述悬浮液15分钟。添加去离子水(50mL),随后添加戊二醛。絮凝反应开始,并在持续搅拌若干分钟中持续进行。当絮凝结束后,使用标准方法分离所述固体并且干燥。通过机械研磨所述干燥材料至需要的尺寸,获得粉末状材料。
除非另有说明,在图表4中所列举的所有实施例都是在25℃的温度下进行的。每一种方法开始时都是将一定量的来自辣根的过氧化物酶悬浮在图表中标注的起始缓冲液中,并且,让所述方法持续到足以使最终固定化酶基本上完全絮凝的程度。用于每一个实施例的方法的差异在下图表中标注。某些固定化试验是在组合物中没有生物质的条件下进行的,以便研究交联剂材料对所述酶的直接作用效果。
图表3
缩写
PO–过氧化物酶(来自辣根(horseradish))
GA–戊二醛
DSS–辛二酸二琥珀酰亚胺
SA–琥珀酸
CC–氰尿酰氯
PPY–聚咇咯
DCH–1,6异氰酸六亚甲酯
AN–黑曲霉菌丝体
CHI–壳多糖
DMP–庚二亚氨酸二甲酯
方法注释
a—在起始缓冲液中混合PO和CHI
b—在起始缓冲液中混合PO,AN,和CHI
c—在起始缓冲液中混合PO和PPY
d—缓慢添加GA至溶液中
e—缓慢添加DMP至溶液中
f—缓慢添加DSS至溶液中
g—缓慢添加SA至溶液中
h—缓慢添加CC至溶液中
i—缓慢添加DCH至溶液中
实施例7
可溶性醇脱氢酶的固定化
用150mLPBS(pH7.5)制备含有醇脱氢酶的悬浮液。添加壳多糖,并且在室温下搅拌所述悬浮液15分钟。随后添加戊二醛。絮凝反应开始,并在持续搅拌若干分钟中持续进行。当絮凝结束后,分离所述固体并且干燥。
除非另有说明,在图表2中所列举的所有实施例都是在25℃的温度下进行的。每一种方法开始时都是将一定量的醇脱氢酶悬浮在作为起始缓冲液的磷酸缓冲盐溶液(pH=7.0)中,并且,让所述方法持续到足以使最终固定化酶基本上完全絮凝的程度。在下面的每一个使用稀释剂的实施例中,所述稀释剂包括100mL去离子水,pH为7.0。用于每一个实施例的方法的差异在下图表中标注。
图表4
缩写
AD—醇脱氢酶
GA—戊二醛
AN—黑曲霉菌丝体
CHI—壳多糖
EC—大肠杆菌细胞
实施例8
可溶性丙酮酸脱羧酶的固定化
150mL HEPES(pH7.5)制备含有醇丙酮酸脱羧酶的悬浮液用。添加壳多糖,并且在室温下搅拌所述悬浮液若干分钟。随后添加戊二醛,絮凝反应开始,并在持续搅拌若干分钟中持续进行。当絮凝结束时,分离所述固体并且干燥。
除非另有说明,在图表3中所列举的所有实施例都是在25℃的温度下进行的。每一种方法开始时都是将一定量的丙酮酸脱羧酶悬浮在作为起始缓冲液的磷酸缓冲盐溶液(pH=7.0)中,并且,让所述方法持续到足以使最终固定化酶基本上完全絮凝的程度。用于每一个实施例的方法的差异在下图表中标注。
图表5
缩写
PDC—丙酮酸脱羧酶
GA—戊二醛
AN—黑曲霉菌丝体
CHI—壳多糖
EC—大肠杆菌细胞
酶活性试验
固定化的一个优点是提高酶的温度稳定性,溶剂活性,以及对酶的特征的其他方面的改进。为了确定所述改进,必须测定所述酶的活性。
有机磷水解酶
OPH能水解很多不同含有正磷酸盐部分的有机化合物,如下面列举的化合物:乙酰甲胺磷,蝇毒磷,内吸磷,二嗪农,毒死蜱,马拉硫磷,对氧磷,对硫磷,甲基对氧磷和甲基对硫磷。下面给出通用反应图式:
其中,X是氧或硫,R和R'是烷基,而Z是芳氧基,氟基,硫醇基或氰化物。可以理解的是,还可以使用其他方法测定酶促活性,包括检验固定化酶水解除了所列举清单之外的有机化合物的能力。
所述酶的活性被定义为单位时间裂解的磷酸键的数量,很大程度上取决于底物。在该试验中,将对氧磷用作选择底物用于所述酶活性的测定,尽管也可以使用其他底物。所述反应检验以下反应式。
对硝基苯能吸收波长410nm的光线,因此,可以作为时间的函数测定该化合物的形成。通过该测定可以计算出所述反应的动力学。速度是根据由于对硝基苯导致的吸收值与时间的曲线图的直线部分计算的。所述直线部分的选择可有所改变,增加了反应速度估算的不确定性。
实验上,在室温下将固定化酶样品(10毫克)添加到pH7.5的底物溶液(12mL)中,并且搅拌。
标准试验溶液由50mM HEPES缓冲液,0.1mM COCl2,和0.1mM对氧磷在去离子水中组成。所述酶的初速度是通过以下方法确定的:对分析溶液取样,并测定分析产物的浓度随时间的变化。因此,对硝基苯的浓度是通过分光光度计在410nm波长下每隔3分钟测量的。所述酶的活性是通过对氧磷的分解测定的(表示为(单位/mg有机磷水解酶))。在25℃和pH7.5的条件下,一个活性单位能导致每分钟分解1.0μmole的对氧磷。固定化酶具有大约200μm的粒度。表5提供了OPH酶活性。也可以使用其他普遍认可的用于测定酶活性的方法。
表1
在检验期间,搅拌溶液,以便减轻外扩散影响。与来自发酵罐的全细胞相比,固定化酶的扩散受到更显著的限制,因为固定化的细胞颗粒明显比全细胞更大,因此,对氧磷必须进一步扩散使酶达到固定化颗粒的中心。还可以计算出所述扩散限制的效果,但不是在本实施例中。还检验了降低粒度的作用,以作为减轻固定化颗粒中的扩散影响的方法。
图1-2示出了来自发酵的全细胞和固定化的全细胞的吸收值与时间的曲线图。应当指出的是,悬浮在溶液中的全细胞和固定化颗粒的存在,对吸收值有轻微影响,即使大部分颗粒在测定吸收值之前已沉降。图1-2所示出的曲线图表示固定化细胞的反应速度更慢。剧烈混合改善了固定化材料的反应速度,不过,可以找到更好的混合条件。
图8-9表示可溶性OPH酶和固定化的可溶性酶变体的吸收值与时间的两幅曲线图。所述溶液的分析与前面公开的分析游离的酶和固定化酶的方法相同。这些曲线图表明,可生物降解的固定化的可溶性酶仍然可实现希望的化学转化。以上数据还表明,与仅有壳多糖的配方相比,壳多糖和黑曲霉配方具有增强的活性,表现为具有较高的反应速度。
木聚糖酶
木聚糖酶(XY)是能够将β-1-4-木聚糖水解成木糖的酶,因此,分解构成植物细胞壁主要部分的线性多糖。所述酶反应具有以下反应式:
木聚糖酶的商业用途包括用于造纸工艺,用作肉类和面包加工的食品添加剂,用于澄清果汁,以及用于由植物材料生产生物燃料。
用于评估木聚糖酶活性的比色测定包括在37℃下,在pH4.5的缓冲溶液中转化木聚糖1小时。在该反应之后,从反应溶液中取样,通过所述酶促反应产生的还原糖在煮沸的碱性溶液中进一步与对羟基苯肼(PAHBAH)反应,它与所述还原糖反应生成吸收410nm波长光线的产物。该吸收值可以与来自还原糖标准曲线的吸收值比较,并且可以计算所述木聚糖酶的活性。因此,所述酶活性可以通过转化成木糖的木聚糖的数量测定(表示为(单位/g)木聚糖酶)。应当指出的是,黑曲霉菌丝体的存在似乎能提高所述木糖读数。固定化酶的粒度大约为200μm。表2提供了所述酶活性((单位/g)固定化的木聚糖酶)。也可以使用其他普遍认可的用于测定酶活性的方法。
表2
醇脱氢酶
醇脱氢酶(ADH)是能够促进多种醇和乙醛或酮之间的相互转化的氧化还原酶,能够还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-ΝΑD+→β-NADH)。所述酶反应具有以下反应式:
其中,R表示烷基,尽管涉及到的醇可优选为伯醇或仲醇,或半缩醛。ADH在酵母和细菌的醇发酵中发挥作用,并且在人体的乙醇处理中起着关键作用。
所述酶的活性可以定义为将乙醇转化成乙醛的能力。ADH的分析是在12mL分析溶液中搅拌进行的,使用10-100mg的固定化酶或1mg/mL酶母液的系列稀释液。标准的分析溶液由50mM焦磷酸钠缓冲液,25%乙醇(v/v)和4mMβ-NAD+组成,pH8.8。所述酶反应的速度是通过每隔2分钟对分析溶液取样并在340nm波长下测量吸收值测定的(相当于β-NADH的浓度)。
所述酶的活性是通过转化成β-NADH的β-ΝΑΕ的数量测定的(表示为单位/g醇脱氢酶)。在25℃和pH8.8的条件下,一个活性单位每分钟将1.0μmole的乙醇转化成乙醛。固定化酶的粒度大约为200μm。表3提供了所述酶的活性。也可以使用其他普遍认可的用于测定酶活性的方法。
表3
丙酮酸脱羧酶
丙酮酸脱羧酶(PDC)是能催化丙酮酸转化成乙醛和二氧化碳的脱羧作用的同源四聚体裂解酶(EC4.1.1.1)。所述酶反应具有以下反应式:
其中,R代表性烷基。PDC在酵母厌氧发酵中发挥重要作用。
用于测定PDC活性的试验采用了一种间接方法,其中,丙酮酸盐转化成乙醛的过程与ADH的活性有关,这种酶是过量使用的,并且将乙醛转化成β-NAD+和乙醇。在340nm波长下监测所述反应,相当于通过ADH驱动的反应形成乙醛时消耗的β-NADH量。为了进行试验,将一种固定化酶样品(~10毫克)添加到pH6.0的12mL溶液中,该溶液中含有200mM柠檬酸缓冲液,34mM丙酮酸钠,0.1mM NAD+和35U/mLADH。所述酶反应的速度是通过每隔3分钟对分析溶液取样,并在340nm的波长下测量吸收值测定的。所述酶的活性是通过转化成β-NAD的β-NADH数量测定的(表示为(单位/g丙酮酸脱羧酶))。在25℃和pH6.0的条件下,一个活性单位每分钟将1.0μmole的丙酮酸转化成乙醛。固定化酶的粒度大约为200μm。表4提供了所述酶的活性,也可以使用其他普遍认可的用于测定酶活性的方法。
表4
过氧化物酶
过氧化物酶(PO)是一个大的酶家族,能够催化以下反应:
ROOR'+2e-(来自电子供体)+2H+(来自氢供体)→ROH+R'OH
其中,R和R'来自多种烷基。对于很多这样的酶来说,最佳的电子供体是过氧化氢,不过,业已证实其他没使用的诸如脂类过氧化物的供体活性更高。POs可以工业化用于工业废水的处理,并且被用作多种刺激性化学物质替代品,所述刺激性化学物质用于粘结剂、计算机芯片和衬里布的生产工艺中。
来自辣根的过氧化物酶被用于这些实施例中。该试验用4-氨基安替比林作为氢供体,用过氧化氢作为电子供体。分析溶液由0.1M磷酸钾缓冲液,0.85mM过氧化氢,1.25mM4-氨基安替比林和85mM苯酚组成,pH7.0。
将固定化酶样品(10毫克)添加到底物溶液中并且搅拌。所述反应的速度是通过每隔2分钟对分析溶液取样,并随着反应的进行,在510nm的波长下测量吸收值测定的。所述酶的活性是通过过氧化氢的分解测定的(表示为(单位/mg过氧化物酶))。在25℃和pH7.0的条件下,一个活性单位每分钟分解1.0μmole的过氧化氢。
固定化酶的粒度大约为200μm。表5提供了所述酶的活性。也可以使用其他普遍认可的用于测定酶活性的方法。
表5
酶热稳定性试验
随着时间推移,特别是当温度升高时,很多酶会丧失活性。当酶可能接触较高温度时,其热稳定性对于储存或使用来说是重要的。按照上述方法将酶固定化,并用于热稳定性试验。在加热条件下测定游离的和固定化酶的长期储存稳定性,包括让含有酶的试管暴露在52.5℃,65℃,和70℃的环境中持续30分钟-24小时。对反应性有效时间的其他影响可以通过类似试验测定,所不同的是,在热处理期间,所述酶材料是在无底物的分析溶液中混合的。对所有评估来说,在热处理之后,将所述材料放在冰浴中冷却10分钟,然后在室温下进行分析。
储存温度试验
图3所示的曲线图表示不同样品在52.5℃下处理4小时之后,作为时间函数的吸收值。以上样品表示三种不同粒度的固定化的OPH样品和一种游离的酶样品。可以看出,非固定化的全细胞酶(图中"游离的酶")在52.5℃的温度下处理4小时之后,失去了其大部分活性,而所述固定化酶(图中的"OPH")保留了明显的活性。还可以看出,粒度越小,活性越高,正如根据质量传递因素所预期的。
在65℃的温度下处理不同时间之后,检验了固定化的形式OPH酶的活性。该实验的结果如图7A和7B所示。类似的,图22A和22B示出了在65℃的温度下处理类似时间之后,固定化的和游离的PO酶活性。数据表明,该壳多糖配方具有良好的温度稳定性,与PEI配方类似。
进一步研究了65℃的温度下处理0-120分钟之后酶材料的比活性,以模拟所述固定化酶的储存稳定性,并且在表6A-C中提供了在较高温度下酶活性随时间推移的变化(与未处理材料的活性对比)。值得注意的是,所述固定化方法似乎能提高在较高温度处理之后的所述酶的活性。活性提高的存在及其程度似乎与配方相关。
表6A
65℃下的时间 | 30min | 60min | 90min | 120min |
游离的酶/细胞悬浮液 | -79.1% | -98.1% | -99.2% | -99.8% |
OPH-5 | -27.4% | -39.7% | -22.4% | -18.8% |
OPH-6 | +24.1% | -9.6% | +14.1% | -16.6% |
OPH-7 | -10.5% | +0.9% | -10.5% | +20.3% |
OPH-8 | -5.2% | -14.9% | -11.1% | -2.3% |
OPH-9A | --- | +0.4% | --- | +8.3% |
OPH-9B | --- | +17.0% | --- | +34.7% |
OPH-12B | --- | +2.1% | --- | -1.4% |
OPH-16B | --- | -8.3% | --- | -1.0% |
表6B
65℃下的时间 | 60min | 120min |
游离的XY酶 | -0.7% | +21.2% |
XY-1 | +31.8% | +16.0% |
XY-2 | +3.1% | -35.6% |
表6C
65℃下的时间 | 60min | 120min |
游离的PO酶 | -7.5% | -48.0% |
PO-1 | +22.8% | -69.3% |
PO-3 | -66.7% | -63.2% |
PO-8 | -10.5% | -2.4% |
工作温度试验
与未处理条件相比,材料的OPH比活性(单位/mg)的降低,是指在10%分析溶液中在65℃温度下处理0-120min,模拟工作半衰期,并且在表7A-C中提供了试验结果。该数据可用于测定由固定化导致的酶反应性半衰期的延长,延长的程度取决于固定化方法和配方。
表7A
65℃下的时间 | 60min | 120min |
游离的酶/细胞悬浮液 | -92.1% | -98.2% |
OPH-6 | -79.8% | -80.3% |
OPH-7 | -52.6% | -77.9% |
OPH-9A | -95.2% | -93.0% |
OPH-9B | -84.6% | -85.3% |
OPH-12B | -53.6% | -73.6% |
OPH-14 | -26.9% | -45.7% |
OPH-15 | -68.9% | -80.9% |
OPH-16B | -74.3% | -86.6% |
表7B
65℃下的时间 | 60min | 120min |
游离的酶 | -54.2% | -38.4% |
XY-1 | -23.2% | -24.2% |
XY-2 | +110.8% | -38.8% |
表7C
65℃下的时间 | 60min | 120min |
游离的PO酶 | -49.1% | -91.8% |
PO-1 | -85.4% | -80.5% |
PO-3 | -70.1% | -83.1% |
PO-8 | -84.2% | -95.4% |
固定化酶溶剂稳定性试验
当水参与了反应(例如OPH催化的水解)以及水可能涉及处于活性状态的酶构型的情况下,很多酶的活性都需要有水的存在。不过,需要针对在水中可溶性有限,但在溶剂-水混合物中可溶性更高的某些化合物的酶活性。因此,如果在这样的溶剂中能够保持酶活性将是有用的。这里进行了在各种溶剂-水溶液中测定所述固定化酶活性和固定化的活性的试验。
在异丙醇-水溶液中的稳定性
首先,在异丙醇/水溶液(10%,20%)中研究了酶的比活性(单位/mg),以确定酶在水-可溶性溶剂溶液中的稳定性。下面的表8中提供了由于接触异丙醇混合物导致的游离的和固定化酶的比活性的变化。变化的百分比是相对所述样品在100%水溶液中的活性。
表8
%异丙醇 | 10% | 20% |
游离的酶/细胞悬浮液 | -69.6% | -90.3% |
OPH-7 | -19.8% | -56.5% |
OPH-14 | -32.4% | -70.0% |
OPH-15 | -61.7% | -84.4% |
通过该数据可以看出,与游离的酶活性的变化相比,所述固定化方法确实能赋予某些针对异丙醇变性作用的抗性。
在甲醇-水溶液中的稳定性
在最初的异丙醇试验之后,研究了所述酶在甲醇/水溶液(0%,10%,和20%甲醇)中的比活性,并且,结果以相对所述材料在100%水溶液的活性变化率的形式在下面的表9中给出。
该数据表明,所述固定化酶的性能与固定化方法的步骤相关。
表9
10%甲醇 | 20%甲醇 | |
游离的酶/细胞悬浮液 | -22.9% | -78.9% |
OPH-4 | -16.9% | -37.2% |
OPH-5 | -91.8% | -88.7% |
OPH-6 | -83.2% | -54.8% |
OPH-8 | -67.7% | -92.6% |
在图4中示出了所述实验的吸收值与时间的曲线图。从曲线图中可以看出,与在10%甲醇中的活性相比,游离的酶在20%甲醇中的活性明显减弱。图5所示出的曲线图表示两种不同的固定化,OPH-5和OPH-6的吸收值与时间的曲线图。用30x30筛孔筛选所述颗粒,以便提供~200μm等效直径的颗粒。可以看出,OPH-5固定化酶在10%和20%甲醇溶液中的活性相当接近。换言之,提高溶液中甲醇的浓度,不会降低该固定化酶的酶活性。
对固定化的OPH-8和OPH-6实施了相同的实验。这两种固定化酶通过两种不同尺寸的筛孔筛选。将OPH-8研磨至粒度为大约100μm,将OPH-6研磨至直径为大约60μm。该实验的结果在图6中示出。可以看出,将甲醇浓度从10%提高到20%较大颗粒的活性在更大程度上降低。
如果需要确定所述酶的活性是否会因为持续接触溶剂的时间推移而降低,可以将所述实验加以变化。所述实验是用全细胞浓缩物和用30x30筛孔筛选的来自OPH-7固定化的固定化颗粒实施的。活性分析是按照类似于前面的试验的方法进行的,所不同的是,该试验的含酶材料用1.2mL由组成50mM HEPES在10%,20%,30%,或40%甲醇中组成的缓冲液溶液预处理。所述预处理持续0-240分钟,随后添加10.8mL含有类似浓度的甲醇的分析溶液,并且调节HEPES,CoCl2和对氧磷的浓度,以便在12mL的最终体积下,该溶液与前面试验过的标准分析溶液匹配。
在甲醇/水溶液(10%-40%)中研究了所述酶的比活性(单位/mg),结果在下面的表10中提供。时间表示在进行分析之前,酶材料接触溶剂的时间。对每一种酶材料来说,变化率是相对在10%甲醇中接触时间为0分钟时的值而言。
表10
%甲醇 | 0min | 60min | 120min | 180min | 240min | |
游离的酶/细胞悬浮液 | 10 | 0.0% | 8.1% | 0.9% | 7.1% | 1.6% |
20 | -57.8% | -60.5% | -69.1% | -68.8% | -67.0% | |
30 | -95.1% | -93.4% | -95.7% | -94.8% | -93.9% | |
40 | -98.0% | -98.1% | -97.6% | -97.6% | -97.9% | |
OPH-7 | 10 | 0.0% | -3.2% | 19.5% | 15.7% | 22.0% |
20 | -28.9% | -44.6% | -34.5% | -42.3% | -44.8% | |
30 | -52.4% | -65.4% | -68.1% | -70.3% | -73.5% | |
40 | -85.8% | -95.9% | -96.9% | -97.3% | -98.5% |
从以上数据可以看出,在接触甲醇时,随着时间推移固定化酶保留了更多的活性。另外,甲醇在最低试验浓度下似乎能够提高固定化酶的活性。图10-17所示曲线图进一步说明了尽管酶活性会随着甲醇(MeOH)浓度的增加而降低,但对于固定化的和全细胞OPH来说,相对接触时间而言,所述酶接触更高浓度的甲醇溶液直到该溶液含有30%或更高的MeOH只有很小的变化。在该水平上,与没有预处理的样品相比,接触所述溶液一小时以上在固定化的样品之间存在显著差异。即使存在这种活性降低,在类似的MeOH浓度下所述固定化的材料仍然胜过所述全细胞,正如吸收值随时间的变化程度所表明的。正如在其他试验中所发现的,固定含有OPH的细胞,能赋予所述酶对分析溶液中较高的甲醇浓度的失活作用以较高的抗性。
在乙二醇-水溶液中的稳定性
用乙二醇-水溶液(10%-40%溶剂)研究了所述酶的比活性(单位/mg),结果在下面的表11中示出。时间表示在进行分析之前酶材料接触溶剂的时间。表中所给出的活性变化是相对特定酶形式在10%乙二醇溶液中在0分钟时间的活性改变。
表11
%乙二醇 | 0min | 60min | 120min | 180min | 240min | |
游离的酶/细胞悬浮液 | 10 | 0.0% | 1.5% | 0.9% | 6.3% | 5.2% |
20 | -68.1% | -62.5% | -57.4% | -69.0% | -60.7% | |
30 | -67.0% | -55.3% | -55.6% | -59.9% | -47.7% | |
40 | -91.5% | -87.3% | -84.6% | -80.9% | -79.9% | |
OPH-7 | 10 | 0.0% | 29.0% | 49.9% | 38.2% | 50.2% |
20 | -80.2% | -53.6% | -68.7% | -71.3% | -66.2% | |
30 | -60.2% | -72.8% | -46.3% | -51.3% | -43.0% | |
40 | -71.3% | -55.9% | -70.3% | -47.2% | -46.5% | |
OPH-14 | 10 | 0.0% | 28.8% | 77.5% | 96.9% | 84.2% |
20 | -77.5% | -73.7% | -62.5% | -65.4% | -60.2% | |
30 | -48.1% | -53.7% | -59.5% | -53.2% | -59.4% | |
40 | -58.4% | -68.5% | -64.4% | -72.4% | -67.6% | |
OPH-15 | 10 | 0.0% | 0.0% | 49.8% | 71.2% | 100.5% |
20 | -74.0% | -80.7% | -70.4% | -68.0% | -66.1% | |
30 | -64.4% | -61.0% | -60.4% | -63.5% | -62.3% | |
40 | -85.2% | -75.9% | -76.4% | -65.8% | -68.0% |
与异丙醇和甲醇溶液试验类似,与所述游离的酶相比,所述酶的固定化形式似乎能赋予针对所述溶剂溶液的变性特性的更高的稳定性或抗性。在某些场合下,所述固定化形式在接触溶剂时似乎会发生提高酶活性的转化,如图18-21所示,图中示出了每一种酶形式的酶促活性,相对其在无溶剂溶液中的活性。
其他溶剂
所述酶的比活性(单位/mg)的研究扩展到包括在10%,40%,90%的溶液混合物中的其他含水溶剂(DMSO)和无水溶剂(环己烷和甲苯)。在下面的表12中提供了与无溶剂溶液中的酶形成的性能比例。
表12
大体上,与游离的酶相比,在含有这些溶剂的溶液中,固定化形式表现更好。与前面试验的溶剂类似,似乎存在固定化酶的活性因为接触溶剂而提高的某些情况。
PH的作用
相关研究在pH大约4.0-10.0的范围内进行
在pH4-10的范围内研究了所述酶的比活性(单位/mg)(包括游离的酶和200μm颗粒形式的酶)。结果以与来自标注分析条件(pH7.5)的活性变化对比的形式在下面的表13中示出。与所述游离的酶相比,尽管活性较低,固定化的材料在偏酸性的pH条件(pH5-6)下确实保留了更高的活性。所述固定化酶活性的变化取决于固定化的配方和工艺,在表14中还比较了一个pH单位的变化导致的比活性(单位/mg)改变情况。
表13
表14
尽管业已在附图和前面的说明中对所公开的技术进行了详细图示和说明,这些图示和说明应当被视为说明而非限制性的。应当理解的是,在前面的说明书中,所述实施方案是以满足最佳方式和实现要求的形式示出和说明的。应当理解的是,本领域技术人员能够对上述实施方案做出近似无限数量的非实质性改变和改进,并且,在本说明书中介绍所有这样的实施方案变化的企图是不现实的。因此,应当理解的是,在所公开的技术构思范围内的所有改变和改进都希望受到保护。
Claims (30)
1.一种固定化酶材料,包括一种具有支撑基质的交联酶,所述支撑基质包括一种生物质,该生物质为不同于所述酶来源的生物质,其中,所述交联酶是通过让所述酶与至少两种多功能材料反应生成的。
2.如权利要求1所述的固定化酶材料,其中,所述酶是有机磷降解酶。
3.如权利要求1或2所述的固定化酶材料,其中,所述生物质是不可溶解的。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的固定化酶材料,所述两种多功能材料中的至少一种选自下列一组:二醛,辛二酸二琥珀酰亚胺,有机二羧酸,戊二醛,庚二亚氨酸二甲酯,氰尿酰氯,琥珀酸,六亚甲基二异氰酸酯,二酰亚胺酯,三嗪,二异氰酸酯,和二(n-羟基琥珀亚胺酯)。
5.如权利要求1-4中任意一项所述的固定化酶材料,所述两种多功能材料中的至少一种是聚胺。
6.如权利要求5所述的固定化酶材料,所述两种多功能材料中的至少一种是选自下列一组的聚胺:聚氮丙啶,聚吡咯,壳多糖,蛋白和明胶。
7.如权利要求1-6中任意一项所述的固定化酶材料,其中,所述生物质选自下列一组:细菌细胞材料,真菌细胞材料,纤维素,葡聚糖,淀粉琼脂,藻酸盐,卡拉胶,胶原,明胶,白蛋白,铁蛋白,棉,几丁质,外骨骼和羊毛。
8.如权利要求1-7中任意一项所述的固定化酶材料,其中,所述固定化酶材料是可生物降解的。
9.如权利要求1-8中任意一项所述的固定化酶材料,其中,所述酶属于选自下列一组的类型:氧化还原酶,转移酶,水解酶,裂解酶,异构酶和连接酶。
10.如权利要求1-9中任意一项所述的固定化酶材料,其中,所述固定化酶材料还包括所述酶来源的生物质。
11.如权利要求1-10中任意一项所述的固定化酶材料,所述两种多功能材料中的至少一种包括其上具有多个胺基的生物质。
12.如权利要求11所述的固定化酶材料,其中,所述至少一种多功能材料包括选自下列一组的生物质:细菌细胞材料,真菌细胞材料,纤维素,葡聚糖,淀粉琼脂,藻酸盐,卡拉胶,胶原,明胶,白蛋白,铁蛋白,棉,几丁质,外骨骼和羊毛。
13.一种制备固定化酶材料的方法,包括:
提供一种酶的水悬浮液,一种生物质,该生物质不同于所述酶来源的生物质,以及至少两种多功能材料;
将所述生物质,和所述两种多功能材料之一添加到所述酶的水悬浮液中,以便形成反应混合物;
将所述第二种多功能材料添加到所述反应混合物中,以便使所述固定化酶材料絮凝。
14.如权利要求13所述的方法,其中,所述方法还包括在将所述第二种多功能材料添加到所述反应混合物中之前搅拌所述反应混合物。
15.如权利要求13或14所述的方法,其中,提供一种生物质和至少两种多功能材料包括提供一种可生物降解的生物质和可生物降解的多功能材料。
16.如权利要求13-15中任意一项所述的方法,其中,提供一种生物质包括提供一种不可溶解的生物质。
17.如权利要求13-16中任意一项所述的方法,其中,提供一种生物质包括提供一种选自下列一组的生物质:细菌细胞材料,真菌细胞材料,纤维素,葡聚糖,淀粉琼脂,藻酸盐,卡拉胶,胶原,明胶,白蛋白,铁蛋白,棉,几丁质,外骨骼和羊毛。
18.如权利要求13-17中任意一项所述的方法,其中,提供一种酶的水悬浮液包括提供一种选自下列一组的类型的酶的水悬浮液:氧化还原酶,转移酶,水解酶,裂解酶,异构酶和连接酶。
19.如权利要求13-18中任意一项所述的方法,其中,提供至少两种多功能材料包括提供一种上面具有多个胺基的额外的生物质。
20.如权利要求19所述的方法,其中,所述额外的生物质选自下列一组:细菌细胞材料,真菌细胞材料,纤维素,葡聚糖,淀粉琼脂,藻酸盐,卡拉胶,胶原,明胶,白蛋白,铁蛋白,棉,几丁质,外骨骼和羊毛。
21.如权利要求13-20中任意一项所述的方法,所述两种多功能材料中的至少一种选自下列一组:二醛,辛二酸二琥珀酰亚胺,有机二羧酸,戊二醛,庚二亚氨酸二甲酯,氰尿酰氯,琥珀酸,六亚甲基二异氰酸酯,二酰亚胺酯,三嗪,二异氰酸酯和二(n-羟基琥珀亚胺酯)。
22.如权利要求13-21中任意一项所述的方法,其中,提供至少两种多功能材料包括提供一种选自下列一组的聚胺:聚氮丙啶,聚吡咯,壳多糖,蛋白和明胶。
23.如权利要求13-22中任意一项所述的方法,其中,所述提供的酶是有机磷降解酶。
24.如权利要求13-23中任意一项所述的方法,其中,所述固定化酶材料还包括所述酶来源的生物质。
25.如权利要求13-24中任意一项所述的方法,所述两种多功能材料中的至少一种是聚胺。
26.一种净化含有对酶促降解敏感材料的区域的方法,包括:
以适合一个区域使用并且适合降解所述材料的形式提供一种可生物降解的固定化酶材料;
让所述区域与所述可生物降解的固定化酶材料接触;
其中,在降解所述材料时,所述可生物降解的固定化酶材料本身发生生物降解,因此无需除去所述酶材料。
27.一种用于转化对酶转化敏感的材料的方法,包括:
以适用于反应室的形式提供一种适合转化所述材料的可生物降解的固定化酶材料;
将所述固定化酶材料放入反应室;
在所述反应室中让所述要转化的材料与所述固定化酶材料接触;
从所述反应室中取出所述固定化酶材料,放置到所述固定化酶材料可以被生物降解的区域。
28.如权利要求27所述的方法,其中,所述反应室是一个反应塔。
29.如权利要求27所述的方法,其中,所述反应室是一个封闭的反应容器.
30.如权利要求27所述的方法,其中,所述反应室是一个填充床。
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