CN107686834A - 脱脂棉固定化脂肪酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了脱脂棉固定化脂肪酶及其制备方法和应用，依据脂肪酶的水/油界面活化机制为理论基础，以乙醇处理的脱脂棉纤维代替界面上的水分子，并作为固定化载体，通过物理吸附使脂肪酶溶液中的酶吸附在脱脂棉纤维上，经恒温脱水挥发，可使脂肪酶固定在脱脂棉上，得到脱脂棉固定化脂肪酶。该固定化脂肪酶适于催化非水相的酯化反应，特别是转酯反应，典型代表是脂肪酸乙烯酯与醇类之间的反应。相对于脂肪酶粉，相应的脱脂棉固定化脂肪酶的非水相催化活性和稳定性显著增加。

Description

脱脂棉固定化脂肪酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及非水酶学领域，具体说，涉及一类以脱脂棉为载体的固定化脂肪酶，以及通过简单、安全和有效的方式，制备高非水活性和稳定性的脱脂棉固定化脂肪酶的方法和应用。

背景技术

脂肪酶是一类有重要工业应用价值的生物催化剂：脂肪酶可以催化合成高级香料、药物中间体、高档液晶材料和生物柴油等，特别是催化合成酯类化合物。近些年来，酯类化合物在食品、饮料、化妆品、医药工业等领域的应用越来越多，纯度要求也越来越高，如乙酸己酯、乙酸癸酯和乙酸肉桂酯等。传统的合成方法是化学合成，使用酸或无机金属化合物作为催化剂，通常要求加热到较高的温度才能使反应能够有效进行，而且会有较多的副产物生成，产物的分离也有一定困难，因此化学法合成酯类化合物消耗能量多，对设备腐蚀严重，且产物的纯度难以达到理想的目标。脂肪酶作为绿色催化剂，可以在常温下进行催化有机化学反应，而且因为脂肪酶对于酯键有相对专一选择性，所以催化反应时，能量消耗少，副产物少，产物易于分离提纯。脂肪酶因有区域选择性和立体异构选择性，也应用于手性醇和羧酸的酶促拆分，为药物中间体领域和手性材料领域提供高化学纯和高光学纯的手性中间体。尤其是在无水或近无水的非水相环境中，脂肪酶仍然表现出催化作用。非水环境，通常是有机液相环境，非常有利于脂肪酶催化合成酯类化合物。

脂肪酶在非水相中催化有机化学合成反应更为有利。脂肪酶在含有一定量水的环境中和非水的有机环境中都表现出催化活性。在水和不溶于水的有机相共存的体系中，存在水/油(有机相)界面环境，在这种界面上，脂肪酶表现出较高的催化活性。这是因为大部分脂肪酶是水溶性的，其活性部位是一个疏水的区域，疏水的底物分子进入后，发生催化反应，在其活性部位上方有一段可以移动的且具有两亲性的α-螺旋，像一个盖子。在界面上，水相可以优化并保持脂肪酶蛋白的构象，阻止有机溶剂对酶蛋白的变性作用；有机相可以通过疏水作用打开盖子结构，使疏水的活性部位敞开，允许底物分子能够进入活性部位，而发生催化作用，因此脂肪酶一般具有优异的界面催化活性。但是，在界面上，因水的存在，不能有效地进行酯合成反应。而在有机相中，因水的缺乏，可以避免水解反应、外消旋反应和聚合反应等的发生，而且产物易于分离和纯化，非常有利于酯合成反应、酯交换反应以及转酯反应，使反应的热力学平衡向酯合成的方向进行，可以催化脂溶性的底物分子，并可以通过溶剂工程控制或修饰酶的催化选择性，抑制依赖于水的副反应的发生，提高酶的热稳定性，从而也减少了酶催化反应受污染的机会。然而，在非水相中，脂肪酶的蛋白结构容易被有机溶剂所变性，构象发生改变，失去部分催化活性，所以脂肪酶在有机相中通常表现出较低的催化活性和稳定性，这为脂肪酶合成酯的工业应用带来的极大的不变，这是实现脂肪酶催化合成酯类化合物的工业应用的瓶颈。因此，脂肪酶非水相催化研究的核心工作是提高脂肪酶的非水相催化的活性和稳定性。

酶的固定化技术是提高脂肪酶非水相催化活性和稳定性的有效手段。为了使脂肪酶在有机相中保持较高的催化活性和稳定性，以提高催化效率和降低酶的使用成本，通常有两种手段：一是通过蛋白质工程，设计和改造产酶微生物的基因序列，表达出耐有机溶剂，尤其是活性中心耐有机溶剂的高非水活性的脂肪酶；二是通过物理和化学的方法稳定脂肪酶的优势构象，较实用的途径是制备固定化脂肪酶。蛋白质工程改造酶，一般主要在实验室中进行，需要高端的技术设备以及大量的人力和物力，蛋白质工程改造酶分子的研究是进一步提高脂肪酶稳定研究的基础和前提，不是最终的研究结果，还需要外在的物理和化学手段，如制备固定化酶，使脂肪酶的催化性能更好更稳定，实用性更强。制备固定化酶的策略通常有物理吸附、包封、共价键连和交联，其目的在于在有机溶剂中稳定酶的催化作用，其机理在于模拟脂肪酶的界面催化机制。大量的研究表明，尽管脂肪酶在有机相中表现出催化作用，但催化活性远低于其在水/油界面上的催化活性，其原因在于酶的本质是蛋白质，其三维构象的维持需要酶分子表面结合一层水分子，如同脂肪酶在界面上的情况。这层水分子通过氢键作用与酶蛋白表面的氨基酸基团结合，达到维持脂肪酶构象和酶分子柔性的作用效果，以利于其催化作用。这层水分子在有机相中很容易被有机溶剂夺去，特别是极性的亲水有机相。结果酶分子因失去表面的必须的少量的水分子而变性失活。酶固定化技术，正是选择适宜的载体材料通过物理和化学键合的方法将酶分子固定在载体材料上，通过载体材料与酶分子间的氢键、硫键、静电作用和范德华力等作用，维持酶的正确构象，而提高酶的非水相催化活性和稳定性。物理吸附固定化是最常用的固定化方法，吸附作用条件温和，吸附作用包括非特异性物理吸附，特异性生物吸附、氢键、亲和作用、静电(离子)作用和疏水作用等。相比较于其他的固定化技术，吸附固定化在下列方面是比较有利的：作用条件温和，容易操作，载体材料和操作程序的花费较低，吸附过程中，不需要添加其它化学成分，载体容易再生而重复利用，有较高的酶活力回收率。共价连接固定化过程中，酶的构象和活性会受到一定影响。包埋固定化脂肪酶的主要问题在于其传质限制。横向键连固定化，是通过化学试剂的作用将酶蛋白分子链接成空间网状结构，但通常键连率不够理想，而且酶的活性也会受到一定的影响。

酶固定化研究中依然存在亟待解决的问题，研究的关键在于寻找适宜的固定化材料并简化固定化程序。至今，对脂肪酶的固定化研究已进行了大量的研究工作，至于固定化酶在工业上的应用，仍然有几个缺点：固定化过程尤其是共价作用固定化中酶活力损失较大；载体材料的费用不菲；反应体系中稳定性较差；还需建立适宜的反应器，提高酶与底物分子的充分接触率。其中固定化材料是最为关键的，人们曾探索了多种类型的固定化载体，如聚合树脂、硅藻土、硅胶、陶磁、碳纳米管、磁性粒子和微球等。另外，基于工业上的应用，载体材料必须费用低，固定化程序必须容易操作，酶活的回收率要高，固定化酶的活性要有一定的稳定性，能在有机相中保持较长的时间。通常为达到这种效果，人们不断地提高固定化技术，优化转酯过程，发展新的生物反应器，并强化工艺的集成化以减少操作消耗。

脱脂棉是一种更为理想的固定化载体。脱脂棉固定化脂肪酶的制备方法简单，其设计思想符合脂肪酶在非水相中的作用条件。综合脂肪酶非水相催化的大量研究来看，脂肪酶在有机相中发挥较好的催化活性并保持较大的稳定性，需要少量的水分子与酶分子作用，保持酶分子的正确构象和柔性，其核心问题是一种外在的分子作用力在起作用，维持酶的构型并不影响酶分子的柔性。大量的固定化研究已经证明，制备固定化酶，适宜的固定化材料与酶分子间的作用起到了一定的维持酶构象的效果，交联固定化方法，也一定程度上保留了酶的柔性。尽管如此，选择适宜的固定化材料，通过固定化，维持酶的构象和催化稳定性，仍然是一个非常有挑战性的问题。基于以上脂肪酶非水相催化活性的活化机制、脂肪酶固定化研究的发展趋势、以及使用羧甲基纤维素进行器壁固定化研究的实验基础，选择具有柔性的和具有羟基的亲水性大分子，特别是天然、稳定和价廉的大分子作为固定化载体进行固定化是最为适宜的。脱脂棉经乙醇处理后，其主要成分为纤维素(C₆H₁₀O₅)_n，恰好能够满足这种要求。脱脂棉纤维价廉易得，具有天然的柔性，不溶于一般的有机溶剂，性质稳定，含有丰富的羟基，羟基与酶蛋白的作用与水分子与酶蛋白的作用类似，都可以通过氢键而发生分子间作用，而且脱脂棉纤维是超分子结构，其羟基不参与脂肪酶催化的酯合成反应，且更有利于借助于自身的大分子结构而稳定酶分子结构。因而脱脂棉是一种理想的固定化载体。又，酯合成反应为非水相催化反应体系，所以通过简单的吸附固定化操作即可制备脱脂棉固定化脂肪酶，制备的固定化脂肪酶因脱脂棉纤维的柔性，在摇瓶反应中，反应液的剪切力会极大地被缓冲而降低，可以避免脂肪酶从脱脂棉上脱落，其毛细结构有也利于降低酶催化反应过程中的扩散限制。在脱脂棉固定化脂肪酶催化反应后，一般情况下，反应液从含脱脂棉固定化脂肪酶的反应器中倒出，适量溶剂洗涤反应器和脱脂棉固定化脂肪酶，即可完成反应液与脱脂棉的分离，反应液再经减压蒸发即可得到合成的酯。实验证明，脱脂棉固定化脂肪酶选材科学，制备简单，使用方便，非水相催化活性和稳定性较高，非常适于工业化应用。

发明内容

本发明目的是克服脂肪酶非水相催化活性低和稳定性差的不足之处，提供一种制备方法简单、非水相催化活性和稳定性高的脱脂棉固定化脂肪酶及其制备方法和应用。

为解决上述技术问题，最关键的科学任务是选择出适宜的材料，能够代替水分子，发挥水/油上水对酶蛋白的优化作用，以遏制有机溶剂对酶蛋白的变性作用，而又不溶于有机溶剂，不参与反应，不影响反应。本发明制备脱脂棉固定化脂肪酶的科学思想是，选用天然纤维——脱脂棉，作为固定化用载体材料，脱脂棉纤维为亲水性大分子，含较多羟基，亲水性强，与酶蛋白的亲和作用强，性质稳定，不溶于一般的有机溶剂。以脱脂棉代替水/油界面上的水分子，用以分散、优化和稳定化脂肪酶的构象。通过简单的物理吸附，制备脱脂棉固定化脂肪酶。当脱脂棉固定化酶用于非水相催化时，有机相则打开脂肪酶活性部位上的盖子结构，使得底物可以有效地进入酶的活性部位，而脱脂棉纤维的天然柔性，又能保证脂肪酶的柔性。因此，可以间接地模拟脂肪酶的界面活化机制，提高脂肪酶的非水相催化活性与稳定性。

制备脱脂棉固定化酶所采用的技术方案是：脱脂棉固定化脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：

1.脱脂棉固定化脂肪酶的制备：将30～500mg脂肪酶粉，加入到50～250mL的三角烧瓶或其他器皿中，加入0.5～5mL蒸馏水。摇匀成酶溶液后，加入20～300mg处理过的脱脂棉，充分吸附酶溶液。固定化器皿敞口固定在恒温振荡培养器或放在烘箱中，在20～50℃、120～220rpm条件下保持3～30h，或在30～50℃的烘箱中烘干3h以上，至固定化装置恒重，即得脱脂棉固定化脂肪酶。

2.在脱脂棉固定化脂肪酶的制备中，使用的脱脂棉在作为固定化载体使用之前，用无水乙醇进行处理。将10g脱脂棉放在100～200mL的无水乙醇中浸泡10～30h，然后在同体积的乙醇中洗涤2次。滤除乙醇，在30～50℃烘干，用干净的金属丝敲打至蓬松，备用。

3.在脱脂棉固定化脂肪酶的制备中，如果固定化装置是锥形瓶，在摇瓶固定化操作中，随着水分逐渐挥发完后，大部分脂肪酶吸附在脱脂棉纤维上，底部的脱脂棉吸附在锥形瓶底，少部分脂肪酶吸附在锥形瓶的器壁上，形成了一种以脱脂棉固定化脂肪酶为主的简易生物反应器，可加入反应液，直接用于非水相催化酯化反应，尤其是酯转化反应。

4.在脱脂棉固定化脂肪酶的制备中，制备的脱脂棉固定化脂肪酶可以在原锥形瓶中使用，也可以取出在另一容器中使用。

5.在脱脂棉固定化脂肪酶的制备中，制备的脱脂棉固定化酶有较高的非水相活性和稳定性，主要在于脱脂棉纤维对脂肪酶的分散、优化和稳定化作用，加之脱脂棉纤维本身的柔性和毛细结构，使酶蛋白在有机反应体系中不易于被有机溶剂所变性，而能保持稳定的优势蛋白构象，并能有效降低催化过程中酶与反应液之间的扩散限制。

6.在脱脂棉固定化脂肪酶的制备中，制备方法简单，其工艺设计在于，将脂肪酶首先溶于水形成酶溶液，然后加入适量脱脂棉，将酶溶液吸附在脱脂棉纤维上，然后在较低温度下，将酶溶液中的水分挥发掉，以达到酶固定在脱脂棉上，以脱脂棉代替水稳定酶分子的目的。

7.在脱脂棉固定化脂肪酶的制备中，制备的脱脂棉固定化脂肪酶可用于在非水相中催化酯化反应，尤其是无水生成的转酯反应中，典型的是催化脂肪酸乙烯酯与脂肪醇反应合成香精等的反应中。相对于酶粉，脱脂棉固定化脂肪酶的非水相催化活性和稳定性可以显著提高。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

实施例1

脱脂棉固定化脂肪酶PCL在三角烧瓶中的制备：将100mg PCL脂肪酶粉，加入到100mL的三角烧瓶中，加入2mL蒸馏水。摇匀成酶溶液后，加入50mg乙醇处理过的脱脂棉。烧瓶敞口固定在恒温振荡培养器中，在40℃、150rpm条件下，保持12h，至固定化装置恒重。用干净的镊子将瓶底的脱脂棉向上拉起，使固定后的脱脂棉尽可能蓬松，即得脱脂棉固定化脂肪酶PCL。

实施例2

脱脂棉固定化脂肪酶PCL在表面皿中的制备：将90mg PCL脂肪酶粉，加入到直径120mm的表面皿中间，加入2mL蒸馏水。摇匀成酶溶液后，加入50mg乙醇处理过的脱脂棉，充分吸附酶溶液。将此表面皿在烘箱中恒温40℃，保持5h以上，至培养皿连同吸附有酶的脱脂棉恒重。用干净的镊子将脱脂棉向外拉伸至蓬松，得脱脂棉固定化脂肪酶PCL。

实施例3

脱脂棉固定化脂肪酶PFL烧杯中的制备：将80mg PFL脂肪酶粉，加入到50mL的小烧杯中，加入3mL蒸馏水。摇匀成酶溶液后，加入70mg乙醇处理过的脱脂棉。烧杯敞口放置在烘箱中，在37℃条件下，保持7h，至固定化装置恒重。用干净的镊子将脱脂棉拉开，使固定后的脱脂棉尽可能蓬松，即得脱脂棉固定化脂肪酶PFL。

实施例4

脱脂棉固定化脂肪酶PFL在表面皿中的制备：将85mg PFL脂肪酶粉，加入到直径120mm的表面皿中间，加入3mL蒸馏水。摇匀成酶溶液后，加入70mg乙醇处理过的脱脂棉。此表面皿敞口放置在烘箱中，在35℃条件下，保持4h以上，至固定化装置恒重。用干净的镊子将脱脂棉拉开，使固定后的脱脂棉尽可能蓬松，即得脱脂棉固定化脂肪酶PFL。

实施例5

脱脂棉固定化脂肪酶PSL在培养皿中的制备：将150mg PSL脂肪酶粉，加入到直径120mm的培养皿中间，然后小心加入2.5mL蒸馏水。轻轻摇匀成酶溶液后，加入100mg乙醇处理过的脱脂棉，充分吸附酶溶液。连同此培养皿一起放在烘箱中，在50℃条件下，保持3h以上，至固定化装置恒重。用干净的镊子将脱脂棉拉开，使固定后的脱脂棉尽可能蓬松，即得脱脂棉固定化脂肪酶PSL。

实施例6

脱脂棉固定化脂肪酶PCL催化合成乙酸己酯：如实施例1所示的含脱脂棉固定化脂肪酶的三角烧瓶中，加入乙酸乙烯酯和正己醇各15mL，烧瓶口用橡皮塞塞住并用封口膜密封，在37℃、150rpm的条件下，反应2h，取样2μL，用1mL正己烷稀释，0.25μm滤膜过滤，气相色谱(GC)分析，正己醇转化率为58％。如果是等量的酶粉在同样条件下催化该反应体系，转化率为2％。相对于酶粉，从初期催化反应的转化率来看，脱脂棉固定化酶PCL的活性是PCL酶粉的29倍。催化10h，转化率可达到99％。

每次催化6小时进行重复使用实验，以第一次的转化率为催化活性的参照(100％)，根据转化率的降低值计算，脱脂棉固定化脂肪酶的催化活性的半衰期约为340h。同样条件下，酶粉的半衰期约为6.5h。二者相比，脱脂棉固定化脂肪酶PCL的稳定性是酶粉的52倍。

实施例7

低温静置条件下脱脂棉固定化脂肪酶PCL催化合成乙酸己酯：如实施例6，向含脱脂棉的三角烧瓶中，加入反应液并封口后，放在4℃冰箱中，静置5天，分析，反应转化率大于99％。同样条件下，改用酶粉催化，底物转化率仅为2％。

实施例8

脱脂棉固定化脂肪酶PCL催化合成乙酸癸酯：如实施例1所示的含脱脂棉固定化脂肪酶的三角烧瓶中，加入正癸醇19mL，乙酸乙烯酯20mL。烧瓶口用橡皮塞塞住并用封口膜密封，反应温度、摇床转速和分析方法同实施例6。反应1小时，转化率达62％。如果是等量的酶粉在同样条件下催化该反应体系，转化率为4.5％。相对于酶粉，从初期催化反应的转化率来看，脱脂棉固定化酶PCL的活性是PCL酶粉的13.8倍。催化5h，转化率可达到98％。

每次催化5小时进行重复使用实验，根据转化率的降低值计算，脱脂棉固定化脂肪酶的催化活性的半衰期约为386h。同样条件下，酶粉的半衰期约为21h。二者相比，脱脂棉固定化脂肪酶PCL的稳定性是酶粉的18倍。

实施例9

低温静置条件下脱脂棉固定化脂肪酶PCL催化合成乙酸癸酯：如实施例1所示的含脱脂棉固定化脂肪酶的三角烧瓶中，加入正癸醇19mL，乙酸乙烯酯20mL。烧瓶口用橡皮塞塞住并用封口膜密封，4℃冰箱中静置4天，正癸醇转化率达99％。等质量的酶粉在同样条件下，催化反应相同的时间，转化率为6％。脱脂棉固定化酶PCL相对酶粉，催化活性提高了16倍以上。

实施例10

脱脂棉固定化脂肪酶PFL催化合成乙酸癸酯：如实施例3，在烧杯中制备的脱脂棉固定化脂肪酶PFL取出，放入100mL的三角烧瓶中，加入正癸醇19mL，乙酸乙烯酯20mL。烧瓶口用橡皮塞塞住并用封口膜密封，在40℃、170rpm的条件下，反应2h，如实施例6取样，GC分析，正癸醇转化率为72％。如果是等量的酶粉在同样条件下催化反应，转化率为19％。相对于酶粉，脱脂棉固定化酶PFL的活性是PFL酶粉的3.8倍。脱脂棉固定化PFL催化7h，转化率可达到99％。

每次催化7小时的重复使用证明，根据转化率的降低程度计算，脱脂棉固定化脂肪酶PFL的催化活性的半衰期为358h。同样条件下，酶粉的半衰期约为67h。二者相比，脱脂棉固定化脂肪酶的稳定性是酶粉的5.3倍。

实施例11

脱脂棉固定化脂肪酶PFL催化合成乙酸肉桂酯：如实施例4，在表面皿中制备的固定化脂肪酶取出，放入100mL的三角烧瓶中，加入肉桂醇13.4g，乙酸乙烯酯20mL。烧瓶口用橡皮塞塞住并用封口膜密封，在40℃、200rpm的条件下，反应2h，如实施例6取样，GC分析，肉桂醇转化率为34％。如果是等量的酶粉在同样条件下催化，转化率为5.8％。相对于酶粉，脱脂棉固定化酶PFL的活性是PFL酶粉的5.9倍。催化16h，转化率达到99％。

每次催化6小时的重复使用证明，根据转化率的降低程度计算，脱脂棉固定化脂肪酶的催化活性的半衰期为410h。同样条件下，酶粉的半衰期约为32h。二者相比，脱脂棉固定化脂肪酶PFL的稳定性是酶粉的12.8倍。

实施例12

脱脂棉固定化脂肪酶PCL催化合成乙酸肉桂酯：如实施例2，在表面皿中制备的固定化脂肪酶取出，放入100mL的三角烧瓶中，加入肉桂醇13.4g，乙酸乙烯酯20mL。烧瓶口用橡皮塞塞住并用封口膜密封，在37℃、160rpm的条件下，反应2h，如实施例4取样，并用GC分析，肉桂醇转化率为57％。如果是等量的酶粉在同样条件下催化，转化率为13％。相对于酶粉，脱脂棉固定化酶PCL的活性是PCL酶粉的4.4倍。催化12h，转化率达到99％。

每次催化8小时的重复使用证明，根据转化率的降低程度计算，脱脂棉固定化脂肪酶PCL的催化活性的半衰期为403h。同样条件下，酶粉的半衰期约为47h。二者相比，脱脂棉固定化脂肪酶PCL的稳定性是PCL酶粉的8.6倍。

实施例13

脱脂棉固定化脂肪酶PSL催化合成乙酸异戊酯：如实施例5，制备的固定化脂肪酶从表面皿中取出，放入100mL的三角烧瓶中，加入异戊醇15mL，乙酸乙烯酯20mL。烧瓶口用橡皮塞塞住并用封口膜密封，25℃放置在恒温箱中静置，3天后，GC分析，异戊醇转化率达99％，等质量的酶粉在25℃和静置的条件下，催化反应相同的时间，转化率为13％。脱脂棉固定化脂肪酶PSL相对于PSL酶粉，活性提高7.6倍多。

实施例14

脱脂棉固定化脂肪酶PSL催化拆分2-辛醇：如实施例5制备的固定化脂肪酶放在100mL的三角烧瓶中，加入2-辛醇15mL，辛酸乙烯酯12mL。烧瓶用橡皮塞和封口膜封口，放入恒温振荡培养器，在37℃和180rpm条件下催化反应。3h后，如实施例6，取样并GC分析，转化率33.4％。同质量的PSL酶粉催化，转化率为2.6％。相对于酶粉，固定化酶的活性提高了12.8倍。催化24h，GC分析，(S)-2-辛醇的ee_s为98％。

每次催化24h的重复使用证明，根据转化率的降低计算，脱脂棉固定化脂肪酶PSL的催化活性的半衰期为210h。同样情况下，PSL酶粉的半衰期为43h。

实施例15

脱脂棉固定化脂肪酶PSL催化拆分1-氯-3-(1-萘氧)-2-丙醇：如实施例5中制备的固定化酶，放入100mL的三角烧瓶中，再加入1-氯-3-(1-萘氧)-2-丙醇2.36克、醋酸乙烯酯20mL。烧瓶用橡皮塞塞上并用封口膜密封后放在恒温振荡培养起中，条件为45℃、190rpm。24h后，转化率达到50％，同量的PSL酶粉催化，在相同条件下，转化率约3.3％。

在此催化反应中，脱脂棉固定化酶PSL相对于酶粉的活性提高了15倍。反应液从反应器中倒出，用20mL的乙酸乙酯冲洗2次，洗液和反应液混合后减压旋转蒸发，剩余物柱层析(石油醚/乙酸乙酯，v/v，6∶1)，分离得到1.02g(R)-1-氯-3-(1-萘氧)-2-丙醇。可用于进一步与异丙胺反应，合成手性心血管药物(S)-心得安及(S)-心得安盐酸盐，经结晶后，(S)-心得安盐酸盐，化学纯度达99％+，光学纯度达99％ee。

以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

Claims (8)

1.脱脂棉固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，将30～500mg脂肪酶粉，加入到50～250mL的三角烧瓶或其他器皿中，加入0.5～5mL蒸馏水，摇匀成酶溶液后，加入20～300mg处理过的脱脂棉，随后器皿敞口固定在恒温振荡培养器或放置在烘箱中，在20～50℃、120～220rpm条件下，保持3～30h，至恒重，即得脱脂棉固定化脂肪酶。

2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，脱脂棉在使用之前，要进行预处理：10g市售脱脂棉放在100～200mL的无水乙醇中浸泡10～30h，然后在同体积的乙醇中洗涤2次，滤除乙醇后，在30～60℃烘干，再用干净的金属丝敲打至蓬松状，备用。

3.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，制备的脱脂棉固定化脂肪酶，在使用时，可以从固定化操作所用的器皿中取出使用，如果是三角烧瓶，也可以直接使用，将反应液加入此三角烧瓶中催化反应。

4.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，固定化时，可在三角烧瓶中进行，也可在平口瓶、烧杯和培养皿等器皿配制酶溶液，加入脱脂棉吸附酶溶液，后放置在烘箱中，在20～50℃烘干3～6h，制备脱脂棉固定化脂肪酶。

5.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，脂肪酶是有非水相催化活性且可溶于水不溶于有机相的脂肪酶，如Pseudomonas cepacia lipase(PCL)、Pseudomonas fluorescenslipase(PFL)、Pseudomonas sp.lipase(PSL)、Aspergillus niger lipase(ANL)或Candidarugosa lipase(CRL)等。

6.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，脂肪酶粉与脱脂棉的质量关系比例范围为30～500∶20～300，在此质量范围内，制备的脱脂棉固定化酶的非水相催化活性和稳定性比较理想。

7.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，固定化时间3～30h，与蒸馏水用量(0.5～5mL)、温度(20～50℃)、及振荡速度(120～220rpm)相关，以脱脂棉中的水分完全挥发掉、至固定化装置恒重为准。

8.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，制备的脱脂棉固定化脂肪酶适于催化非水相酯化反应，尤其是脂肪酸乙烯酯与醇之间的转酯反应，相对于酶粉，其非水相催化活性提高到2～29倍，半衰期一般在30～440h，有效使用温度在4～50℃之间，且转化率容易达到99％。