CN110093341A

CN110093341A - 一种固定化马铃薯多酚氧化酶及其农残降解应用

Info

Publication number: CN110093341A
Application number: CN201810097041.5A
Authority: CN
Inventors: 吴非; 刘承帅; 高庭; 吕亚辉; 李芳柏
Original assignee: Guangdong Institute of Eco Environmental Science and Technology
Current assignee: Guangdong Institute of Eco Environment and Soil Sciences; Guangdong Institute of Eco Environmental Science and Technology
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2018-01-31
Publication date: 2019-08-06

Abstract

本发明提供了一种固定化马铃薯多酚氧化酶及其农残降解应用。使用本发明的固定化多酚氧化酶及降解农产品残留农药污染的方法，在短时间内对农产品残留农药的降解率均达60％以上，能够简单快速有效地去除农产品中的农药残留，不需要进行酶的失活处理，也不需要调整pH值，处理过程简单易操作，且不会产生二次污染。本发明的固定化多酚氧化酶的制备方法原料来源简单，廉价易得，产量大，固定化效率高、稳定性好。本发明的固定化马铃薯多酚氧化酶属于食品级，可直接喷洒在农产品表面，或者直接在农产品采摘后的加工过程中添加，对农药的降解效果稳定，对环境具有较强的适应性，应用前景良好。

Description

一种固定化马铃薯多酚氧化酶及其农残降解应用

技术领域

本发明属于农产品残留农药降解领域，特别涉及一种固定化马铃薯多酚氧化酶及其农残降解应用。

背景技术

作为一个农业大国，我国农药的使用量居世界首位，高达每年80～100万吨。由于使用的不规范，许多农产品遭受到了严重的农药污染。农药残留超标是威胁食品安全的最主要因素。农产品的残留农药能在人体内长期蓄积，从而引起慢性中毒，诱发各种慢性病。残留的农药甚至还可以通过母体转移到下一代，同时可能致畸、致癌、致突变。

农产品采摘后残留农药的降解脱毒对于农产品安全尤为重要，尤其是在食用前的降解脱毒，是保障人们安全食用农产品的“最后屏障”。常用的采后农产品残留农药降解脱毒技术主要包括物理、化学以及生物降解脱毒方法。物理方法包括洗涤、去壳、剥皮、加热以及超声洗涤等；化学方法包括光解、水解以及氧化分解；生物方法是指针对性的微生物菌剂对残留农药的降解脱毒。针对农作物残留农药去除的技术比较多的是将果蔬等农产品收获后采用各种清洗剂或农药分解剂去除残留农药；另外有部分现有技术通过研制各种无害无毒或者低毒农药替代高毒性农药，从而减少有毒农药残留。但是，就总体而言，以上所述方法对残留农药的降解脱毒效率有限，食用的农产品中仍然存在较高的毒害风险，同时所述的化学和微生物方法使用过程复杂，并可能引入新的毒害物，难以推广应用。因此，研发简单高效的产后残留农药降解脱毒方法，是目前我国农产品安全的一个重要补充。

多酚氧化酶是一类含铜的氧化还原酶，在自然界中普遍存在。在有氧条件下，多酚氧化酶能催化氧化酚类化合物生成醌，从而达到降解污染物的目的，同时不会产生二次污染。由于利用电子转移将有机污染物转化为水分子，多酚氧化酶催化氧化过程温和，被认为是理想的绿色催化剂。目前，应用多酚氧化酶处理污染物的缺点主要是价格高、酶性质不稳定、受环境影响很大、容易失活，产物无法分离，难以重复利用或连续性使用。

与游离酶相比，将酶固定在固态基质上，可提高其高效、专一及温和的酶催化反应特性，同时也可进一步使酶稳定性高、容易回收、可实现连续反应和分批式反应等。常用于固定酶的载体包括ABTS、紫丁香醛、丁香酸甲酯、树脂、陶瓷材料等。但是这些载体存在稳定性差、价格昂贵、可能产生毒性产物等缺点，目前在农药降解方面尚未有应用。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，在于提供固定化马铃薯多酚氧化酶在降解残留农药中的应用，使用本发明的固定化多酚氧化酶及降解农产品残留农药污染的方法，能有效降解农产品中的残留农药，使用流程简单，且无二次污染。

本发明的另一目的提供一种固定化马铃薯多酚氧化酶的制备方法，以壳聚糖为载体，利用化学交联法制备了壳聚糖固定化多酚氧化酶。

本发明的再一目的在于提供所述的通过所述制备方法制得的固定化马铃薯多酚氧化酶，所述的固定化多酚氧化酶固定化效率高、稳定性好。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

固定化马铃薯多酚氧化酶在降解残留农药中的应用。

所述的残留农药是指农产品的残留农药。

所述的农药包括但不限于：氯酚类农药、毒死蜱、克百威等。

所述的氯酚类农药包括五氯酚、2,4-二氯酚等。

所述的应用的具体方法为：将所述的固定化马铃薯多酚氧化酶投加至含有农药的溶液中进行反应。

所述的振荡反应优选为在摇床进行。

所述的固定化马铃薯多酚氧化酶的投加量优选为5～10U·L^-1。

所述的农药的浓度优选为5～10mg·L^-1。

所述溶液优选为pH 4～9的缓冲液；所述的缓冲液优选为磷酸盐缓冲液；所述的磷酸盐缓冲液pH优选为pH 4～9。

所述的反应的温度优选为25～60℃。

所述的反应的时间优选为1～6h。

一种固定化马铃薯多酚氧化酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)取壳聚糖，加入的戊二醛溶液，搅拌反应6～24h，低温静置12h，离心、洗涤、干燥；

(2)加入磷酸盐缓冲液和马铃薯多酚氧化酶，搅拌反应2～10h，低温静置，洗涤至洗涤液中检测不到多酚氧化酶为止，即得所述的固定化马铃薯多酚氧化酶。

步骤(1)中所述的壳聚糖的分子量优选为10～35万，脱乙酰度优选为90％。

步骤(1)中所述的干燥优选为冷冻干燥。

步骤(1)中所述的壳聚糖的用量优选按每0.1g壳聚糖配比10mL 5％的戊二醛溶液计算。

步骤(1)中所述的壳聚糖优选先进行纯化，所述的纯化的具体操作步骤为：将壳聚糖溶于浓度为0.5～2％(v/v)的冰醋酸溶液中，调节pH至4.5～5.3，使其产生白色絮状沉淀，离心、洗涤、冷冻干燥后得到纯化的壳聚糖。

所述的调节pH优选采用NaOH溶液进行调节；进一步优选采用2mol/L NaOH溶液。

步骤(2)中所述的马铃薯多酚氧化酶优选采用磷酸盐-丙酮法制得，具体步骤如下：

①马铃薯洗净后在低温下保存，再去皮切成小块，加入磷酸盐缓冲液，高速匀浆，低温离心后取上清液；

②在步骤①中的上清液中加入冷丙酮，剧烈搅拌，密封低温浸提；低温离心，取沉淀冷冻干燥，即得所述的马铃薯多酚氧化酶。

步骤①中所述的高速匀浆的时间优选为2min。

步骤①中所述的高速匀浆优选使用高速匀浆机或高速组织破碎机。

步骤①中所述的低温离心的条件优选为在-4℃，9500rpm下离心10min。

步骤②所述的冷丙酮优选为-20℃的丙酮。

步骤②中所述的剧烈搅拌的时间优选为15min。

步骤②中所述的浸提的时间优选为3h。

步骤(2)中所述的低温静置的时间优选为至少12h。

步骤(2)中所述的搅拌反应的温度优选为20～60℃，进一步优选为25℃。

步骤(2)中所述的搅拌反应的时间优选为6h。

步骤(2)中所述的磷酸盐缓冲液的pH值优选为4～9；进一步优选为5。

步骤(2)中所述的洗涤液优选为磷酸盐缓冲液。

通过所述制备方法制得的固定化马铃薯多酚氧化酶。

本发明中所涉及的酶活性的测定：以每分钟催化氧化0.2mol/L邻苯二酚溶液所需酶量为一个酶活单位(U)；固定化多酚氧化酶用单位质量载体的酶活单位(U/g)表示。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供了一种降解农产品残留农药的酶制剂及其使用方法，该酶制剂和方法在短时间内对农产品残留农药的降解率均达60％以上。本发明能够简单快速有效的去除农产品中的农药残留，不需要进行酶的失活处理，也不需要调整pH值，处理过程简单易操作，且不会产生二次污染。

(2)本发明所用的多酚氧化酶廉价易得，广泛存在于植物体的各种器官或组织中，来源简单，廉价易得，产量大。且多酚氧化酶属于食品级，可直接喷洒在农产品表面，或者直接在农产品采摘后的加工过程中添加，且不需要调整原有工艺或添加仪器设备。

(3)本发明所用的固定化多酚氧化酶性质稳定，酶活性损失小，对农药的降解效果稳定，对环境具有较强的适应性。

附图说明

图1是本发明的固定化多酚氧化酶在25℃下于不同pH(3～8)的缓冲液体系中的酶活结果分析图。

图2是本发明的固定化多酚氧化酶在pH值为6.0时在不同温度(20～60℃)下的酶活结果分析图。

图3是本发明的固定化多酚氧化酶分别在室温、4℃和-20℃下保藏一个月的存储稳定性结果分析图。

图4是本发明的固定化多酚氧化酶在4℃下分别于不同pH缓冲液中的酶活结果分析图。

图5是本发明的固定化多酚氧化酶在不同温度下(25～60℃)降解五氯酚的结果分析图。

图6是本发明的固定化多酚氧化酶在pH值分别为4～8的缓冲液体系中降解五氯酚的结果分析图。

图7是本发明的固定化多酚氧化酶在pH值分别为4～8的缓冲液体系中降解2,4-二氯酚的结果分析图。

图8是本发明的固定化多酚氧化酶在存在不同酸根离子的钠盐体系中降解2,4-二氯酚的结果分析图。

图9是本发明的固定化多酚氧化酶在不同温度下(25～55℃)降解毒死蜱的结果分析图。

图10是本发明的固定化多酚氧化酶在不同温度下(25～55℃)降解克百威的结果分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1马铃薯多酚氧化酶的制备

将马铃薯用清水洗净，沥干，置于-20℃冰箱中冷冻12h。将冷冻过的马铃薯去皮切成小块，称取100g，加入不溶性PVP(平均分子量为58000)2g(先用蒸馏水浸泡，过滤除去杂质)，加入pH值为7的磷酸盐缓冲液100mL，用高速组织破碎机匀浆2min，2层纱布过滤，9500rpm离心10min。取上清液，加入20mL冷丙酮(-20℃)，剧烈搅拌15min，密封置于4℃冰箱中浸提3h。在-4℃下，9500rpm离心10min，取沉淀，冷冻干燥，即得马铃薯多酚氧化酶粗酶。于-20℃保存。

马铃薯多酚氧化酶活性的测定：在1cm的比色皿中，加入0.20mL的2mol/L邻苯二酚溶液(底物)，2.7mL的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)，最后加入0.1mL4mg/mL的所制得的马铃薯多酚氧化酶。设定参比溶液为3.0mL的0.2mol/L邻苯二酚溶液，入射光波长为400nm。马铃薯多酚氧化酶溶液加入后立即开始计时，每15s记录1次吸光度。平行测定3次，计算其活性。

酶活性的测定：以每分钟催化氧化0.2mol/L邻苯二酚溶液所需酶量为一个酶活单位(U)；固定化多酚氧化酶用单位质量载体的酶活单位(U/g)表示。

所得马铃薯多酚氧化酶呈白色粉末状，酶活为0.666U·g^-1·min^-1。

实施例2壳聚糖固定马铃薯多酚氧化酶条件优化

(1)将壳聚糖溶于0.5～2％(v/v)的冰醋酸溶液中配成5％(w/v)的壳聚糖原液，加入2mol/L NaOH溶液调节pH至4.5～5.3，使其产生白色絮状沉淀，离心、洗涤、干燥后获得纯化的壳聚糖。

(2)取0.1g纯化的壳聚糖，加入10mL 5％的戊二醛溶液，搅拌反应6～24h，-4℃静置12h，离心、洗涤干燥。加入2mL磷酸盐缓冲液(pH 4～9)和实施例1制得的5mL 1.4mg/mL的马铃薯多酚氧化酶，在20～60℃条件下搅拌反应2～10h，-4℃静置12h，用缓冲液洗涤，直至洗涤液中检测不到多酚氧化酶为止，即得固定化多酚氧化酶。

壳聚糖固定马铃薯多酚氧化酶的优选条件为：壳聚糖与戊二醛搅拌反应时间为12h，固定化温度为25℃，固定化时间为6h，缓冲液pH值为5.0。优化条件下所得固定化多酚氧化酶活性为0.536U·g^-1·min^-1，固定化效率为80.48％。

实施例3固定化多分氧化酶的酶学性质

(1)在1cm的比色皿中，加入0.2mL的0.2mol/L邻苯二酚溶液，2.7mL的磷酸盐缓冲溶液(pH为4～8)，最后加入0.1mL 4mg/mL的多酚氧化酶。在25℃下搅拌反应5min，冰浴终止反应10min，用紫外分光光度计测定400nm处的吸光度，计算酶活。

(2)在温度为25℃的条件下，测定固定化多酚氧化酶在不同pH(3～8)的缓冲液体系中的酶活。

(3)在pH值为6.0的条件下，按上述测定方法，测定固定化多酚氧化酶在不同温度(20～60℃)时的活性。

(4)将固定化多酚氧化酶置于不同条件(室温、冷藏4℃、冷冻-20℃)下保存一个月，观察酶的存储稳定性。

(5)将酶液置于不同pH缓冲液中在4℃下处理30min，然后取0.1mL的酶液分析酶的剩余活性。

固定化多分氧化酶的酶学性质结果如图1～4所示。由图1和图2可知，本发明的固定化多分氧化酶的最适pH为6.5，最适温度为30℃。由图3可知，室温条件下，在20天内固定化多酚氧化酶完全丧失了活性。在4℃和-20℃储存一个月后，固定化多酚氧化酶的剩余活性分别为25％和82％。图4反映了固定化多分氧化酶在不同pH缓冲液中处理30min后(4℃)，酶活在pH 5～8范围内都较为稳定，在pH低于4时，酶的稳定性被破坏。

实施例4固定化多酚氧化酶降解五氯酚

(1)配置10mg/L五氯酚的磷酸盐溶液(pH＝6.0)，加入固定化多酚氧化酶，用量为5U/mL，将反应体系置于25～60℃水浴中反应1h。用液相色谱(岛津LC-15C)分析反应体系中五氯酚的浓度。固定化多分氧化酶对五氯酚的降解效果如图5所示，当温度为45℃时，五氯酚的去除率达到最大(56％)。当温度过高或过低时，多酚氧化酶的活性降低，对污染物的去除率降低。

(2)配置10mg/L五氯酚的磷酸盐溶液(pH值为4～8)，加入固定化多酚氧化酶，酶用量为5U/mL，反应在室温下进行。实验结果显示(图6)，当反应体系pH值为5时，五氯酚的去除为61％。

实施例5不同环境条件下固定多酚氧化酶降解2,4-二氯酚

(1)配置10mg/L 2,4-二氯酚的磷酸盐溶液(pH值为4～8)，加入固定化多酚氧化酶，酶用量为5U/mL，反应在室温下进行，反应时间为1h。用液相色谱(岛津LC-15C)分析反应体系中2,4-二氯酚的浓度。固定化多分氧化酶对五氯酚的降解效果如图7和图8所示，当温度为pH值为7时，2,4-二氯酚的去除率达到72％。

(2)在实际氯酚类污水处理中，除了氯酚类化合物外，往往还含有各种盐类。这些盐类对多酚氧化酶降解氯酚类有机物可能存在促进或者抑制作用。配置10mg/L 2,4-二氯酚的磷酸盐溶液(pH值为7)，加入不同酸根离子的钠盐(氯化钠、硫酸钠、碳酸氢钠)，终浓度均为0.1mol·L^-1。加入固定化多酚氧化酶，酶用量为5U/mL，反应在室温下进行。实验结果显示，硫酸根离子对反应过程起到明显的促进作用，2,4-二氯酚的去除率达79％。氯离子、碳酸氢根对反应过程有明显的抑制作用。

实施例6固定化多分氧化酶降解毒死蜱

(1)分别配置10mg/L毒死蜱和克百威的磷酸盐缓冲液，磷酸盐溶液pH值为7。

(2)加入固定化多酚氧化酶，酶的添加量为10U/mL。

(3)将反应体系置于25～60℃的水浴中反应1h。通过标准曲线法，用液相色谱(岛津LC-15C)测定反应体系中毒死蜱和克百威的浓度。固定化多分氧化酶对两种农药的降解效果如图9和图10所示，当反应温度为35℃时，毒死蜱和克百威的降解率都达到了最大值，分别为63％和68％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.固定化马铃薯多酚氧化酶在降解残留农药中的应用。

2.根据权利要求1所述的固定化马铃薯多酚氧化酶在降解残留农药中的应用，其特征在于：

所述的残留农药是指农产品的残留农药。

3.根据权利要求1所述的固定化马铃薯多酚氧化酶在降解残留农药中的应用，其特征在于：

所述的农药为氯酚类农药、毒死蜱、克百威。

4.根据权利要求1所述的固定化马铃薯多酚氧化酶在降解残留农药中的应用，其特征在于：

所述的固定化马铃薯多酚氧化酶的投加量为5～10U·L^-1；

和/或所述的农药的浓度为5～10mg·L^-1。

5.根据权利要求1所述的固定化马铃薯多酚氧化酶在降解残留农药中的应用，其特征在于，具体应用方法为：

将所述的固定化马铃薯多酚氧化酶投加至含有农药的溶液中进行反应。

6.一种固定化马铃薯多酚氧化酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的固定化马铃薯多酚氧化酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的壳聚糖先进行纯化，所述的纯化的具体操作步骤为：

将壳聚糖溶于浓度为0.5～2％(v/v)的冰醋酸溶液中，调节pH至4.5～5.3，使其产生白色絮状沉淀，离心、洗涤、冷冻干燥后得到纯化的壳聚糖。

8.根据权利要求6所述的固定化马铃薯多酚氧化酶的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的搅拌反应的温度为20～60℃；

和/或步骤(2)中所述的搅拌反应的时间为6h；

和/或步骤(2)中所述的磷酸盐缓冲液的pH值为4～9。

9.根据权利要求6所述的固定化马铃薯多酚氧化酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的马铃薯多酚氧化酶采用磷酸盐-丙酮法制得，具体步骤如下：

10.一种固定化马铃薯多酚氧化酶，其特征在于：

通过权利要求6～9任一项所述的制备方法制备得到。