DK146942B - Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt - Google Patents

Description

‘ 1 " 146942

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til immobilisering af en særlig kategori af intracellulære enzymer, nemlig de scm er glutaraldehyd-f ølsomme. Enzymer, der hører til denne kategori (en definition deraf vil blive fremsat i det følgende), er meget ofte thiol-enzymer, d.v.s. enzymer med en -SH gruppe i enzymmolekylets aktive center eller meget tæt ved enzymmolekylets aktive center, og de vil derfor inaktiveres af thiol-reaktive midler, f.eks. glutaraldhyd. Et typisk eksempel er urease- I Methods of Enzymology, bind 44 (1977) (Academic Press) er der beskrevet forskellige metoder til fremstilling af immobilise-rede enzymer. De fleste af disse metoder involverer anvendelsen af partikelformede bærere, og de udviser således den inherente ulempe, der omfatter bærerens høje pris og den uundgåelige store fortynding af den enzymatiske aktivitet.

Det er også beskrevet, hvorledes man kan immobilisere glucoseisomerase ved tværbinding af glucoseisomeraseholdige celler må glutaraldehyd og yderligere behandling, jævnfør f.eks. US-patentskrift nr. 3.980.521. Glucoseisomerase er et enzym, der ikke er særligt følsomt overfor glutaraldehyd, og som følge deraf er immobiliseringsudbyttet højt ved denne immobilisering.

Af adskillige grunde er glutaraldehyd det foretrukne tværbindingsmiddel. Det er godkendt af sundhedsmyndighederne og er også i dag ået bedste tværbindirigsmiddel set fra et fremstillingssynspunkt og et økonomisk synspunkt.

Den foreliggende opfindelse omhandler imidlertid immobiliseringen af intracellulære enzymer, der er følsomme overfor glutaraldehyd. Det har hidtil været vanskeligt at immobilisere enzymer af denne art uden en uønsket høj fortyndingsgrad, fordi det ikke har været muligt at anvende glutaraldehydmetoden til immobiliseringen, da en konventionel glutaraldehydbehandling af et enzym af denne kategori altid resulterer i et næsten fuldstændigt tab af enzymaktivitet. Immobiliseringen af enzymer, der er følsomme overfor glutaraldehyd, er derfor principielt forskellig fra immobilisering af enzymer, der ikke er følsomme overfor glutaraldehyd. I denne beskrivelse med krav betyder betegnelsen "et glutaraldehydfølsomt enzym" et glutaraldehydfølsomt enzym, der taber mere en 75% af sin oprinde " 2 ” 146342 lige aktivitet, når det immobiliseres ved glutaraldehydbehandling af de enzymholdige celler i henhold til de immobiliserinqsmetoder, der er beskrevet i US-patentskrift nr. 3.980.521 og DE-offentliggørelsesskrift nr. 2.223.340, til dannelse af et partikelformet produkt med en acceptabel fysisk styrke til industrielle anvendelser (f.eks. anvendelse til kontinuerlig drift eller i beholdere til diskontinuerlig drift).

Det er opfindelsens formål at tilvejebringe en fremgangsmåde til immobilisering af intracellulære, glutaraldehydfølsomme enzymer, hvor man anvender glutaraldehyd som tværbindingsmiddel, og hvor det immobiliserede enzym kan fremstilles i meget højt udbytte, til en relativ lav pris og med en relativ lille fortynding af enzymatisk aktivitet, for at muliggøre fremstillingen af et produkt, der omfatter et immobiliseret enzym, som er velegnet til industrielle anvendelser.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 angivne.

I denne beskrivelse med krav anvendes udtrykket "mikrobielle celler" som betegnelse for hele mikrobielle celler, et homogenat, der kan fremstilles på basis af hele mikrobielle celler, samt alt, hvad der ligger derimellem, d.v.s. delvis sønderslåede, mikrobielle celler.

I denne beskrivelse med krav anvendes udtrykket "betydeligt indhold af primære aminogrupper" som betegnelse for et betydeligt indhold af primære aminogrupper i forhold til det totale indhold af primære, sekundære og tertiære aminogrupper. Med fordel er indholdet af primære aminogrupper over 5%, fortrinsvis 20% af det totale indhold af primære, sekundære og tertiære aminogrupper. I et typisk tilfælde kan forholdet mellem primære, sekundære og tertiære aminogrupper være 1:2:1, når man anvender en forgrenet polyalkylenimin.

Det antages, at de primære aminogrupper reagerer med glutar- aldehydet, hvorved der dannes stabile tværbindinger, og at dette er grunden til, at de primære aminogrupper er vigtige. Forsøg, der er gennemført med polyethyleniminer, som er blevet modificeret ved at omsætte de primære (og sekundære) aminogrupper med en epoxyforbindelse, har vist, at sådanne modificerede polyethyleniminer er inoperative.

‘ 3 “ 146942

Da reaktionen finder sted i et vandigt medium, må det forstås, at den polyimin, der anvendes ifølge opfindelsen, skal være vandopløselig.

Tilstedeværelsen af polyiminen resulterer overraskende i et meget højt aktivitetsudbytte af enzymet. Uden polyiminen kan aktivitetsudbyttet af enzymet være af størrelsesordenen 0 - 15%, hvorimod aktivitetsudbyttet med polyimin kan være af størrelsesordenen 30 - 70%. Man behøver ikke nogen partikel- .· formet bærer, og fortyndingen af den enzymatiske aktivitet er derfor lille.

Når man gennemfører immobiliseringen, tilsættes polyiminen til de mikrobielle celler før eller samtidigt med glutaraldehydet.

Hvis glutaraldehydet tilsættes til de mikrobielle celler først, vil aktivitetsudbyttet af enzymet i det immobiliserede produkt blive reduceret, med mindre polyiminen tilsættes meget hurtigt efter glu-taraldehydtilsætningen, afhængigt af pH, temperatur, koncentration og lignende parametre.

Det må forstås, at de relative mængder af mikrobielle celler, glutaraldehyd og polyimin bør vælges på en sådan måde, at produktet omfattende immobiliseret enzym er velegnet til industrielt formål, hvilket vil sige, at produktet bør have høj enzymatisk aktivitet, højt aktivitetsudbytte (i forhold til den totale enzymatiske aktivitet før immobilisering), høj enzymstabilitet og høj mekanisk stabilitet.

Ved en foretrukken udførelsesform for opfindelsen omsætter man hele mikrobielle celler.

Ved en anden foretrukken udførelsesform for opfindelsen immobiliseres glutaraldehydfølsomt penicillin V-acylase fremstillet ved hjælp af bakteriestammen NRRL 11240 (eller stammer, der i det væsentlige er identiske dermed, herunder mutanter og varianter deraf). Yderligere foretrukne udførelsesformer for opfindelsen omfatter immobilisering af urease fremstillet ved hjælp af en stamme hørende til arten Bacillus pasteurii, af lactase fremstillet ved hjælp af en stamme hørende til arten Kluyveromyces fragilis eller af stammen NRRL B-ll 229 og også af et malolactisk enzym fremstillet ved hjælp af en stamme hørende til arten Leuconostoc oenos.

- 4 - U6942

En foretrukken udførelsesform for opfindelsen omfatter anvendelsen af en vandig del af gæringsvæsken som det vandige medium. Denne udførelsesform, der omfatter den direkte behandling af gæringsvæsken med glutaraldehyd, er derfor en yderst simpel og økonomisk immobiliseringsmetode. Imidlertid kan cellerne separeres fra gæringsvæsken, f.eks. ved centrifugering, og derpå resuspenderes i vand eller en passende stødpude med pH mellem 5 og 10, hvorved den vandige del af denne suspension er det vandige medium, som derpå behandles med glutaraldehyd. På lignende måde kan den vandige del af det celleslam, der er separeret fra gæringsvæsken, f.eks. ved centrifugering, og som har konsistens som en tandpasta, anvendes som det vandige medium, der derefter behandles med glutaraldehyd.

Det foretrækkes, at man som polyalkyleniminen anvender en forgrenet polyalkylenimin, hvori alkylendelen indeholder mellem 2 og 4 carbonatomer.

Det foretrækkes at anvende en forgrenet polyethylenimin som polyalkylenimin.

Ved en yderligere foretrukken udførelsesform for opfindelsen anvendes en forgrenet polyethylenimin med molekylvægte mellem 500 og 100.000 Dalton som polyalkylenimin.

Det foretrækkes at anvende et forhold primære aminækvi-valenter/aldehydækvivalenter i intervallet mellem 0.01 : 1 og 10 : 1, fortrinsvis mellem 0.1 : 1 og 1 : 1.

En foretrukken udførelsesform for opfindelsen omfatter den sekvens, der består i at tilsætte polyalkyleniminen til det vandige medium med de mikrobielle celler og derefter at tilsætte glutaralde-hydet.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan man fortrinsvis anvende et forhold glutaraldehyd/mikrobielle celler (w/w) på mellem 0.01 : 1 og 100 : 1, fortrinsvis mellem 0,1 : 1 og 10 : 1.

Ved en yderligere foretrukken udførelsesform for opfindelsen formgives de isolerede immobiliserede celler, fortrinsvis ved 146942 - 5 - granulering eller ekstrudering. Ved en anden udførelsesfonn formgiver man vaskede og isolerede immobiliserede celler ved tørring, møllebehandling og sigtning til en partikelstørrelse i intervallet mellem 100 og 1000 μ, fortrinsvis mellem 200 og 700 ju.

Ved anvendelsen af det immobiliserede enzymprodukt opnået ifølge opfindelsen kan det immobilise rede enzymprodukt anvendes diskontinuerligt eller kontinuerligt, i sidstnævnte tilfælde fortrinsvis i en søjle.

Ved anvendelsen af det iirmobiliserede enzymprodukt kan man anvende immobiliseret penicillin V-acylase fremstillet ved hjælp af stammen NRRL 11240 (eller stammer, der i det væsentlige er identiske dermed, herunder mutanter og varianter deraf), hvorved man anvender immobili-seret penicillin V-acylase kontinuerligt.

For at påvise den overraskende aktivitetsbevarende virkning af polyalkyleniminen i kombination med de glutaraldehydf^lsorame enzymer skal der henvises til følgende sammenligningsforsøg.

a) 2 g spraytørret urease, der indeholder celler fra Bacil-lis pasteurii ATCC 11859 (6200 IE/g at pH 7) blev suspenderet i 98 ml vand med 10 juM ’fJ-mercaptoethanol. Cellesuspensionens pH var 7,7, når man under omrøring tilsatte 1,6 ml 25% glutaraldehyd. Efter 20 minutters omrøring ved stuetemperatur faldt pH-værdien til 6,9. De immobiliserede celler blev filtreret og vasket 2 gange med 0,5 1 1 mM β-mercaptoethanol i vand. Efter vakuumtørring (90 minutter ved ca. 50°C) fremkom der 0,7 g immobiliseret præparat med en aktivitet på 64 IE/g, målt under optimale forhold, med en partikelstørrelse på 125 - 300 ;u. Dette svarer til et aktivitetsudbytte på 0,3%.

b) En cellesuspension, der er identisk med den ovenfor under a) beskrevne, blev istedet for den under a) beskrevne behandling behandlet med 4 ml 10% polyethylenimin (molekylvægt 60 000, Dow Chemicals PEI 600), hvis pH-værdi var indstillet på 7, hvorefter der tilsattes 2,75 ml af 25% glutaraldehyd. Man fortsatte omrøringen i - 6 - 146942 60 minutter ved stuetemperatur^. Efter' filtrering, vaskning og tørring som under a) havde de resulterende 0,75 g immobiliserede celler en aktivitet på 5600 IE/g (125 - 300 /λ), d.v.s. aktivitetsudbyttet var 34%.

Definitionerne af enhederne for de initiale enzymatiske aktiviteter af enzymerne i de følgende eksempler fremgår af den følgende tabel I.

- 7 - 146942

Tabel I

Enzym Bestemmelse af initiale enzymaktiviteter pH-stat-titrering med 1 N HC1 ved pH 7,0 og 30°C. Man anvendte 3% (0,5 M) urinstof Urease i 0,2 M phosphatstødpude som substrat. 1 enhed er 1 ja mol urinstof hydrolyseret/mi-nut.

Inkubering ved 40°C med 3% penicillin V i 0,2 M phosphatstødpude ved pH 7,5. Efter fjernelse af cellerne blev den fremkomne Penicillin V-acylase 6-APA bestemt med p-aminobenzaldehyd i henhold til Balasingham et al. (1972),

Biochem. Biophys. Acta 276, 250 - 56.

1 enhed 3 1 ju mol 6-APA fremstillet/minut.

Først åbnes ikke immobiliserede celler ved behandling ved stuetemperatur med ca. 8% 1-butanol i 0,1 M phosphatstødpude med pH 7 i 20 minutter. Inkubering (ved 37°C for Kluyveromyces fragilis lactase og ved 60°C for lactasen fra NRRL B-ll, 229) med 4,75% (w/v) lactose i mælkestødpude med Lactase pH 6,5 (Das grosse Melkerei Lexikon, Schultz 1965, bind 2,'M- Z p. 740). Efter fjernelse af cellerne blev den fremstillede glucose bestemt med Boehringer Mannheims blodsukkerreagens (GOD-Perid metode). 1 enhed r 1 ja mol glucose fremstillet/minut.

Inkubering ved 30°C med 33 mM L-malat, 1,67 mM NAD+ og 0,7 mM MnCH^ i 0,1 M phosphatstødpude med pH 5. Efter fjernelse af cellerne blev det fremkomne lactat be-Malolactisk enzym stemt med LDH + NAD+ i henhold til Gutmann, I·,og Wahlefeld, A.W. (1974) i Methods of Enzymatic Analysis, 2. udgave, bind 3, (H.U. Bergmeyer, ed.) Academic Press, side 1463 - 67. 1 enhed = 1 ja mol lactat produ-seret/minut.

- 8 - 1Λ6942

De følgende eksempler illustrerer yderligere den foreliggende opfindelse. Eksemplernes principielle indhold fremgår af den følgende tabel.

Fremstilling af Anvendelse af Enzym immobiliseret immobiliseret Eksempel enzym enzym

Penicillin x___1-7 V-acylase x 8-10 x 11-13

Lactase --- x 13 x 14-15

Urease --- x 16 x 17-18

Malolactisk enzym --- X 19-20

Eksempel 12 omfatter et sammenligningsforsøg uden polyethylenimin.

I alle de følgende eksempler blev pH-værdien af poly-ethyleniminen indstillet på ca. 7 før tilsætningen. Imidlertid kan man også fremstille tilfredsstillende immobiliserede enzymer ved hjælp af polyethyleniminer med andre ρΗ-værdier, f.eks. i intervallet fra ca. 4 til ca. 9.

- 9 - 146942

Eksempel 1.

Til 1 1 gæringsvæske svarende til stammen NRRL 11240, indeholdende ca. 1% tørre celler og 1,5 penicillin V-acylase enheder/ml, tilsatte man under omrøring 30 ml 10% polyethylenimin (forgrenet, molekylvægt 60 000, PEI 600 fra Dow Chemicals), efterfulgt af 25 ml 25% glutaraldehyd efter 5 minutter. Man fortsatte omrøringen i yderligere 60 minutter ved stuetemperatur, og de immo-biliserede celler blev derpå filtreret fra, vasket med phosphat-stødpude (50 mM pH 7) og lufttørret. Der fremkom 14,2 g tørrede immobiliserede celler med en aktivitet på 71 enheder/g med en partikelstørrelse mellem 180 og 420 ja, svarende til et aktivitetsudbytte, på 65%.

Eksempel 2.

Til 1,5 1 gæringsvæske hidrørende fra stamme NRRL 11240 (0,68 penicillin V-acylase enheder/ml) tilsattes under omrøring 45 ml af 10% polyethylenimin (forgrenet, molekylvægt 600, PEI 6 fra Dow Chemicals) og 30 ml 25% glutaraldehyd ved 4°C. Man fortsatte omrøringen under reduceret hastighed i 60 minutter, og de dannede multi-cellepartikler blev derpå filtreret, vasket med phosphatstød-pude med pH 7 og lufttørret. Det tørrede præparat (21 g) havde en penicillin V-acylase aktivitet på 14,5 enheder/g ved en partikelstørrelse på 200 - 700 ja, svarende til et aktivitetsudbytte på 30%.

Eksempel 3.

380 1 gæringsvæske med stammen NRRL 11240 (2,5 penicillin V-acylase enheder/ml) blev afkølet ved ca. 15°C, og der blev tilsat 40 1 10% polyethylenimin (Polymin P, BASF) under omrøring, efterfulgt af 9,4 1 25% glutaraldehyd (Union Carbide). Man fortsatte herefter omrøringen ved reduceret, hastighed i yderligére 45 minutter, hvorpå man tilsatte β-mercaptoethanol til en sluttelig koncentration af 25 mM, og de immobiliserede celler blev separeret på en filterpresse. Den våde filterkage blev granuleret, og granulatet blev tørret som en fluidiseret masse ved 50 - 55°C. Der fremkom 7,1 kg tørt præparat med 55 enheder/g (ikke fraktionerede partikler), hvilket svarer til et aktivitetsudbytte på 41%.

- 10 - 146942

Eksempel 4.

En serie af immobiliserede præparater fra den samme gæringsvæske med stamme NRRL 11240 som eksempel 3 viser påvirkningen af variationer af koncentrationen af polyethylenimin ved en konstant tilsætning af glutaraldehyd. Resultaterne er vist i Tabel II.

Tabel II.

Polyethylenimin Penicillin V-acylase aktivitet, (Polymin P), % w/v enheder/g produkt (200 - 400 /i) 0,2 7 0,5 36 0,8 58 1,0 71 1,2 70 I hvert tilfælde tilsatte man den angivne mængde Polyamin P (BASF) under omrøring som en 10% opløsning til 0,5 1 gæringsvæske med stammen NRRL 11240 (2,5 Penicillin V-acylase enheder/g) efterfulgt af 10 ml 25% glutaraldehyd. Man fortsatte omrøringen ved reduceret hastighed i yderligere 60 minutter, hvorefter cellerne blev filtreret fra, vasket med 25 mM β-mercaptoethanol i 50 mM phosphatstødpude med pH 7,5 og lufttørret. Der fremkom ca. 9 g tørt materiale ved hvert forsøg.

Eksempel 5.

Til 2 1 gæringsvæske med stammen NRRL 11240 (2,0 penicillin V-acylase enheder/ml) tilsattes 200 ml 10% polyethylenimin (Polymin P, BASF), og cellerne blev derpå koncentreret til ca. en tiendedel af det oprindelige volumen. 6 ml 25% glutaraldehyd blev tilsat til celleslammet under omrøring, og man lod omrøringen fortsætte med reduceret hastighed i yderligere 60 minutter. De immobiliserede celler blev derpå filtreret og vasket med 25 mM β-mercaptoethanol i 50 mM phosphatstødpude med pH 7,5 på et glasfilter. Efter lufttørring ved _ U _ 146942 stuetemperatur fremkom der 20 g præparat med 65 enheder/g (200 - 400 ja). Dette svarer til et aktivitetsudbytte på ca. 33%.

En serie immobiliserede præparater, som er fremstillet på lignende måde som angivet ovenfor, men med varierende mængder glutaraldehyd, viser virkningen af variationer af glutaraldehyd-koncentrationen efter en konstant tilsætning af polyethylenimin og påfølgende koncentrering. Resultaterne er vist i den følgende Tabel III.

Tabel III.

Glutaraldehyd, Penicillin V-acylase aktivitet % w/v enheder/g tørt præparat ( 200 - 400 yu).

0,5 106 0,75 65 1.0 56 1,5 37 5.0 3

Der fremkom mellem 9 og 11 g tørt materiale ved hvert forsøg per 1 gæringsvæske.

Eksempel 6.

350 1 gæringsvæske med stammen NRRL 11240 (2,4 penicillin V-acylase enheder/ml) blev afkølet til ca. 15°C, og der tilsattes under omrøring 24,5 1 10% polyethylenimin (forgrenet, molekylvægt ca. 700, PEI 15T fra Taihei Sangyo Kaisha) efterfulgt af 3,5 1 50% glutaraldehyd (Union Carbide). Man fortsatte derpå omrøringen med reduceret hastighed i yderligere 45 minutter, hvorefter der tilsattes β-mercaptoethanol til en sluttelig koncentration af 25 mM, og de immobiliserede celler blev separeret på en membranpresse. Filterkagen blev extruderet (åbning 500 /i), og partiklerne blev tørret i en fluidiseret masse ved 50 - 55°C. Udbyttet var 6,2 kg tørt præparat med 85 penicillin V-acylase enheder/g (partikelstørrelse under 500 ja) svarende til et aktivitetsudbytte på 63%.

146942 - 12 -

Eksempel 7.

En serie af immobiliserefie præparationer fra den samme gæringsvæske med stamme NRRL 11240 som i eksempel 3 og 4 viser virkningen af at anvende forskellige typer af polyethylenimin.

Polyethylenimin Molvægt % Penicillin Udbytte af ln~3 PEI V-acylase tørt præpa- aktivitet, rat, g. enheder/g PEI 600, Dow Che- 60 0,3 103 8 micals

Polymin HS, BASF - 0,8 50 16

Polymin P, BASF - 1,0 70 10

Sediour CL 930, (100) 1,0 50 11

- BASF

PEI 15 T, Taihei

Sangyo Kaisha Ltd. 0,7 0,7 134 7 PEI 210 T, Taihei

Sangyo Kaisha Ltd- 40 - 60 0,9 80 10

Epomin P-1000, Sho- kubai Kagaku Kogyo 60-80 0,9 65 14

Co.

Epomin P-500, Sho- kubai Kagaku Kogyo 30-40 0,9 120 7

Co.

I hvert tilfælde tilsatte man den angivne mængde polyethylenimin under omrøring som en 10% opløsning til 0,5 1 gæringsvæske med stammen NRKL 11240 (2,5 penicillin V-acylase enheder/ml) efterfulgt af 10 ml 25% glutaraldehyd. Omrøringen blev fortsat med reduceret hastighed i yderligere 45 minutten hvorpå cellerne blev filtreret fra, vasket med 25 mM β-mercaptoethanol i 50 mM phosphat-stødpude med pH 7,5 og lufttørret.

Eksempel 8.

10 g af de celler, der er immobiliseret som beskrevet i eksempel 1, blev tilsat til 200 ml 3% (w/v) råt K-penicillin V i 50 mM phosphatstødpude med pH 7,5. Deacylering blev gennemført ved - 13 - 146942 40°C med en omrøringshastighed på 150 omdrejninger/minut og et konstant pH på 7,5 (ved titrering med 4 N NaOH). 95% af penicillinet blev konverteret til 6-APA i løbet af 2,5 timer. Metoden kunne gentages med frisk penicillin V mindst 20 gange uden nogen væsentlig reduktion af konverteringen. Konverteringsgraden blev bestemt ved HPLC (væskekromatografi under højt tryk), separation af reaktionsblandingen på en Waters' juBondapak C-18 søjle (elueret med en gradient fra 20% methylalkohol i vand til 50% methylalkohol i vand, ionpardannelse med Water's Pie A reagens) og påfølgende uv-bestemmelse. Der henvises til Waters Associates' information brochure Paired-Ion Chromatography, D 61 May 1976, trykt i USA (Maple Street, Milford, Mass.). Resultaterne hvad angår konvertering af 3% (w/v) K-penicillin V til 6-APA ved 40°C er vist i Tabel IV.

Tabel IV.

Forsøgsnummer Konverteringsgrad (%) 1 96 2 97 3 98 4 98 5 98 6 98 7 97 8 97 9 98 10 97 11 96 12 97 13 97 14 97 15 96 14 " 146942

Eksempel 9.

9,7 g af de immobiliserede celler fra eksempel 2 blev tilsat til 100 ml 3% (w/v) K-penicillin V i 50 mM phcsphatstød-pude med pH 7,5. Deacyleringen blev gennemført ved 40°C med en omrøringshastighed af 150 omdrejninger/minut og et konstant pH på 7,5 ved hjælp af en pH-stat. Mere end 90% af penicillin blev konverteret til 6-APA i løbet af 3 timer. Efter 10 på hinanden følgende forsøg var konverteringstiden forøget til ca. 3,5 timer og efter 20 på hinanden følgende forsøg til 4 timer.

Eksempel 10.

Immobiliserede celler svarende til en tør vægt på 100 g og hidrørende fra produktet i eksempel 6 blev genkvældet i 50 mM phosphatstødpude med pH 7,5 indeholdende 5 mM β-mercaptoethanol og pakket i en søjle med en diameter på 10 cm (massevolumen 400 ml).

65 g råt K-penicillin V i 1.5 1 af den samme mercaptoethanolholdige stødpude som ovenfor angivet blev recirkuleret gennem en forvarmer til søjlen (hvis temperatur blev holdt på 35°C) og tilbage til et reservoir (hvis temperatur blev holdt på 12° C) i hvilket pH kontinuerligt blev indstillet på 7,5 ved titrering med 4 M NaOH. Med en cirkulationhastighed af 14 massevolumina per time opnåede man en konvertering af penicillin V til 6-APA på 98% efter 4 timers forløb.

Efter 10 på hinanden følgende forsøg måtte reaktionstiden forøges til 6 timer.

Eksempel 11.

Til 500 ml gæringsvæske med Kluyveromyces fragilis NRRL Y 1109 (pH indstillet til 7,5) tilsatte man under omrøring 40 ml 10% polyethylenimin (forgrenet, molekylvægt 700, PEI 15 T fra Taihei Sangyo Kaisha), efterfulgt af 16 ml 25% glutaraldehyd. Efter 60 minutters omrøring ved stuetemperatur blev partiklerne filtreret, granuleret og lufttørret. De fremkomne 6,5 g tørt materiale havde en lactaseaktivitet på ca. 500 enheder/g, svarende til ca. 30% af den oprindelige aktivitet.

" 15 “ 146942

Eksempel 12.

Til 500 ml gæringsvæske med NRRL B-ll, 229 med 5,1 lactaseenheder/ml tilsattes 25 ml 10% polyethylenimin (PEI 15 T fra Taihei Sangyo Kaisha Co.) under omrøring, efterfulgt af 10 ml 25% glutaraldehyd. Omrøringen blev fortsat i 1 time ved stuetemperatur, hvorefter de immobiliserede celler blev filtreret fra og lufttørret. 4,0 g tørret præparat indeholdt 209 lactaseenheder/g, svarende til et udbytte på 33%.

For at påvise virkningen af polyethyleniminen udførtes et sammenligningsforsøg uden polyethylenimin på følgende måde.

Til 500 ml gæringsvæske med NRRL B-ll, 229 med 5,1 lactase-enheder/fril tilsatte man 10 ml 25% glutaraldehyd under omrøring. Omrøringen blev forsat i en time ved stuetemperatur. De behandlede celler blev flokkuleret med 0,5% Superfloc (12,5 ml 20% Superfloc C 521, et kationisk flokkulationsmiddel), filtreret og lufttørret. 3,7 g tørret præparat indeholdt 105 lactaseenheder/g, svarende til et udbytte på 15%.

Eksempel 13.

Til 500 ml gæringsvæske med NRRL B-ll, 229 indeholdende intracellulær lactase tilsattes 50 ml 10% polyethyleniminfl?EI 15 T fra Taihei Sangyo Kaisha) efterfulgt af 14 ml 251 glutaraldehyd. Man fortsatte omrøringen i 30 minutter, oq præparationen blev filtreret og lufttørret. Det viste sig, at de tørrede partikler indeholdt ca. 30% af den oprindelige lactaseaktivitet, og at de kunne anvendes til gentagne diskontinuerlige konverteringer af 4% lactose ved 60°c.

Eksempel 14.

Til 300 ml 6 gange koncentreret gæringsvæske med Bacillus pasteurii ATCC 11 859 (6,3 g tørre celler, 9300 ureaseenheder/g) tilsatte man under omrøring 18 ml 10% polyethylenimin (forgrenet, molekylvægt 60 000, PEI 600 fra Dow Chemicals), efterfulgt af 20 ml 25% glutaraldehyd. Efter yderligere 60 minutters omrøring ved stuetemperatur blev de immobiliserede celler filtreret fra og lufttørret. Der fremkom 13,8 g tørre, immobiliserede celler med en urease-aktivitet på 1900 enheder/g med en partikelstørrelse på 300 - 700 yu.

- 16 - 146942

Dette svarer til et aktivitetsudbytte på ca. 45%.

Eksempel 15.

Til 100 ml af en 4% (w/v) vandig suspension af Bacillus pasteurii ATCC 11 859 med 230 ureaseenheder/ml tilsatte man 32 ml 10% polyethylenimin (Polymin HS, BASF) under omrøring, efterfulgt af 5 ml 25% glutaraldehyd. Man fortsatte omrøringen i en time ved 4°C, hvorefter cellerne blev filtreret fra og lufttørret. 2,3 g tørt præparat indeholdt en ureaseaktivitet på 3100 enheder/g (partikelstørrelse 300 - 700 ju), svarende til et aktivitetsudbytte på 31%.

Eksempel 16.

0,5 g af de celler, der er immobiliseret som beskrevet i eksempel 14, blev pakket i en søjle (1 cm 0 x 10 cm), og et substrat, der indeholder 1% urinstof (0,01% MgCl7, 10 mM β-mercaptoethanol) og hvis pH-værdi var indstillet på· 9, blev ført gennem massen ved 40°C.

98% af urinstoffet kunne hydrolyseres ved en strømningshastighed på 50 ml/h, og halveringstiden af enzymaktiviteten var ca. 1000 timer.

Eksempel 17.

Til 0,25 1 gæringsvæske med Leuconostoc oenos DSM 20252, indstillet på pH 6,5 med NaOH, med 14 enheder malolactisk aktivitet per 1, tilsattes under omrøring 3 ml 10% polyethylenimin (Polymin P, BASF), efterfulgt af 1 ml 25% glutaraldehyd. Omrøringen blev fortsat i yderligere 30 minutter ved 4°C, hvorefter de immobiliserede celler blev filtreret fra, vasket med 0,1 M phosphatstødpude med pH 6 og vand og derpå frysetørret. De tørrede celler havde stadig en malolactisk aktivitet på 3,4 enheder/g, svarende til et aktivitetsudbytte på ca. 40%.

Eksempel 18.

1,6 g våde celler af Leuconostoc oenos DSM 20252 med 96 enheder af malolaktisk aktivitet/g blev suspenderet i 16 ml vand, og pH blev indstillet på 7,0. Man tilsatte 1,7 ml 10% polyethylenimin - 17 - 146942 (Polymin P, BASF) under omrøring, efterfulgt af 1,5 ml af 25% glutaraldehyd. Omrøringen blev fortsat i en time ved stuetemperatur, hvorefter de immobiliserede celler blev filtreret, vasket med vand og lufttørret. Det tørrede produkt (0,5 g) havde en malolactisk aktivitet på 53 enheder pr. g, svarende til et aktivitetsudbytte på 28%.

Eksempel 19.

Immobiliserede celler som beskrevet i eksempel 17 i en mængde svarende til 4 g tørstof blev tilsat til 50 ml mM L-malat i 0,1 M phosphatstødpude ved pH 5,0 sammen med 85jumol NAD+ og 35 jumol MnC^. Der fremkom total konvertering af malat til lactat i løbet af 3 timer. Metoden kunne gentages mindst 5 gange uden nogen forøgelse af reaktionstiden.

Eksempel 20.

0,35 g af præparationen fra eksempel 18 blev tilsat til 10 ml 33 mM L-malat i 0,1 M phosphatstødpude med pH 4,0 sammen med 17 jumol NAD+ og 7 /amol MnC^· Der fremkom total konvertering af malat til lactat i løbet af 6 timer, og metoden kunne gentages med frisk malat, NAD+ og MnCl2 mindst 5 gange uden nogen forøgelse af reaktionstiderne.