NO144633B - Fremgangsmaate for fremstilling av 6-aminopenicillansyre - Google Patents

Description

Søknad 792768 (avdelt fra foreliggende søknad) ved-rører et penicillin-acylasepreparat som er nyttig ved fremstilling av 6-aminopenicillansyre ut fra penicilliner, dvs. un-

der anvendelse av enzymet under slike pH-betingelser at deacy-lering (eller spalting av amidgruppen) av penicillinet finner sted under dannelse av den ønskede 6-aminopenicillansyre. Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av slike acylase-enzy-

mer ved fremstilling av 6-aminopenicillansyre (i det følgende kalt "6-APA").

Selv om slike penicillin-acylase- (eller deacylase-) enzymer enten i cellebundet eller cellefri tilstand er blitt anvendt for det angitte formål siden omkring 1961, opptrer det vanskeligheter under anvendelse av det cellefrie e<*>nzym, da det-

te ikke lett lar seg skille fra reaksjonsblandingen. Videre kan ikke det cellebundne enzym lett brukes om igjen. Videre produ-serer begge enzymtyper 6-APA som kontamineres med spormengder av bakterielt protein. Det er i britisk patentskrift 1 193 918 foreslått å overvinne disse vanskeligheter ved å binde enzymet til en polymerbærer og derved gjøre det vann-uløselig. Imidlertid har slike polymer/enzympreparater vist seg å ha dårlig mekanisk stabilitet når polymerene som anvendes som bærer, er slike som generelt er tilgjengelige i kommersiell målestokk for andre formål. Disse polymerer må konstrueres spesielt og fremstilles på en spesiell måte for dette formål, hvilket er svært kostbart. Videre, når 6-APA fremstilles ved innvirkning av acylase-enzymer, er det nødvendig å regulere reaksjonsblandin-

gens pH-verdi innen et snevert område under hele reaksjonen, og dette krever kontinuerlig tilsetning av et alkali for nøytrali-sering av karboksylsyren som resulterer fra den frigjorte peni-cillinsidekjede. Det har vist seg at man, når acylase-enzymet er direkte bundet ved en kovalent binding til en polymerbærer,

må være omhyggelig når man velger alkali som skal anvendes for en slik nøytralisering, og at vanligvis det alkali som velges, natriumhydroksyd, ikke kan anvendes uten at enzymet hurtig dena-tureres. Følgelig, hvis man må anvende en slik flyktig base som ammoniakk eller trietylamin, kan det være nødvendig med en kost-bar modifikasjon av anlegget som for tiden er i anvendelse for fremstilling av 6-APA ved hjelp av acylase-enzymet i sin cellebundne

form, på grunn av at det med enzymet i cellebundet form ikke er noen vanskelighet med hensyn til å anvende natriumhydroksyd for nøytralisering av den frigjorte sidekjedesyre.

Det er også blitt foreslått, i BRD-off.skrift

2 143 062, å fremstille et vann-uløselig penicillin-acylasepreparat ved å adsorbere acylasen på en bærer og deretter tverrbin-de den ved innvirkning av et vannløselig dialdehyd med og uten dannelse av bindinger mellom polymerbæreren og enzymet. Ved denne fremgangsmåte tverrbindes enzymet hovedsakelig rundt bæreren, snarere enn blir bundet til dette av kovalente bindinger.

I ovennevnte off.skrift er det beskrevet forskjellige bærere, f.eks. anionebytteharpikser, dvs. slike som inneholder basiske grupper, f.eks. primære, sekundære eller tertiære aminogrupper eller lignende nitrogene funksjonelle grupper; eller karboksy-metylcellulose; eller polymerer med nøytral reaksjon, f.eks. på grunn av at de funksjonelle grupper som er til stede, er ester-grupper.

Det er oppdaget at bærere som har negativt ladede funksjonelle grupper, er bærere som har positivt ladede funksjonelle grupper, overlegne. For eksempel ble det utført to for-søk for sammenligning av cellulose som har enten positivt eller negativt ladede grupper, nemlig dietylaminoetyl- (DEAE-) cellulose og karboksymetyl- (CM-)cellulose. Betingelsene for kobling av penicillin-acylase til hver bærer ble optimalisert, og den samme enzymløsning ble anvendt for kobling til hver bærer under anvendelse av disse optimale betingelser. Aktiviteten til det endelige, immobiliserte enzympreparat representerte 11 og 42 % av den opprinnelige totale aktivitet for enzymløsningen for henholdsvis DEAE- og CM-cellulosene. De lavere aktiviteter for DEAE-cellulosepreparatene skyldtes dårlig adsorpsjon av enzymet. Da forsøket ble gjentatt under anvendelse av en annen enzym-løsning, var resultatene 24 og 56 % for henholdsvis DEAE- og CM-cellulosene. Imidlertid har enzympreparatene som fremstilles av cellulose, dårlig mekanisk stabilitet, hvilket er rappor-tert av D.L. Regan, P. Dunnill og M.D. Lilly "Immobilized Enzyme Reaction Stability: Attrition of the Support Material" i. Biotechnology and Bioengineering, bind XVI, s.333-343 (1974).

Videre har de preparater som er fremstilt ved adsorpsjon/tverrbindingsteknikken hvor bæreren er en polymer med nøytral aktivitet, karakteristika med hensyn til reaktivitet og gjenanvendbarhet som også kan betraktes som utilfredsstillende. Eksemplevis var stabiliteten av penicillin-acylase som var adsorbert og tverrbundet på den nøytrale bærer "Amberlite" XAD-7, bestemt ved lagring av det immobiliserte enzympreparat ved en temperatur på 37°C, utilfredsstillende, da aktiviteten falt med 66 % etter 14 dagers lagring.

Det er funnet at hvis teknikken i henhold til ovennevnte off-;skrift anvendes med kopolymerer av metakrylsyre, dvs. polymerer som har en karboksylsyrefunksjon av den alifatiske type, er de resulterende enzympreparater overraskende overlegne med hensyn til å ha en enzymaktivitet som opprettholdes etter gjentatt bruk ved produksjon av 6-APA. Bærere som består av mak-roporøse eller geltype-polymerer av styren, akrylsyre eller fenol/ formaldehyd med enten sulfonsyre-, fosforsyre- eller karboksyl-syref unksjonelle grupper, har vist seg å være markert dårligere enn makroporøse kopolymerer av metakrylsyre. Den meget gode sta-, bilitet hos disse preparater kan også vises ved resultatene fra lagring ved 37°C. I ett slikt forsøk tapte aktiviteten til et immobilisert enzympreparat fremstilt ved adsorpsjon pg tverrbind-.. ing av acylase på en makroporøs polymer av metakrylsyre solgt under handelsbetegnelsen "Amberlite" IRC-50, bare 5 % av sin opprinnelige aktivitet etter 14 dagers lagring ved 37°C.

Slike enzymkomplekser er også i besittelse av øket mekanisk stabilitet. Dette trekk angående mekanisk stabilitet er viktig i enhver omrørt tankreaktor, da behovet for omrøring av reaksjonsmiljøet på kraftig måte i den hensikt å opprettholde

en jevn pH-verdi og å redusere alkalinedbrytningen av penicillin til et minimum, er viktig. Videre, i de forbedrede reaktorsystemer som nå er under utvikling, f.eks. hvor det uløselige enzympreparat tilbakeholdes inne i reaktoren ved hjelp av en sikt med egnet maskestørrelse og hvor reaksjonsmediet tappes fra ved full-førelsen av en reaksjon for produksjon av 6-APA, forblir det uløselige enzympreparat inne i reaktoren ferdig for fornyet bruk. På denne måte reduseres de fysiske tap av enzym som normalt er-fares når hele blandingen fjernes fra karet og det uløselige enzympreparat gjenvinnes ved filtrering eller sentrifugering pg returneres til reaksjonskaret. I tillegg unngås mikrobiell kon-taminering av enzympreparatet under håndteringen. Imidlertid må enzympreparatet ikke bli mekanisk nedbrutt slik at det fin-

ner sted beytdelige tap som et resultat av at det passerer

gjennom den tilbakeholdende sikt. Videre, som vist av Régan, Dunnill og Lilly (loe. eit.), har de små partikler som resulterer fra avslitning fra aminoetyl-cellulose som Ø-galaktosidase var festet til, høyere spesifikke aktiviteter enn de store partikler, og det er sannsynlig at tapet av slike partikler fra reaktoren vil resultere i et tap av total aktivitet som ikke er proporsjonalt med vekten av det tapte materiale.

I et annet reaktorsystem, som er beskrevet i belgisk patentskrift 782646, tilbakeholdes det uløselige enzympreparat i en kolonnereaktor gjennom hvilken substrat sirkuleres med stor strømningshastighet i den hensikt at de nødvendige pH-justeringer kan utføres i et kar separat fra det uløselige enzympreparat. Bæreren må derfor ha slike egenskaper at den ikke blir mekanisk nedbrutt ved de høye trykk som er nødvendige for å opprettholde den hurtigstrømmende reaksjonsblanding. Hvert av disse reaktorsystemer kan være modifisert til å funksjonere som kontinuerli-ge reaktorsystemer, og problemene med adekvat mekanisk stabilitet med enzymreaktivitet og gjenanvendelse er fremdeles tilstede.

En videre fordel ved å anvende kopolymerer av metakrylsyre er at disse harpikser selv har god mekanisk stabilitet.

I tillegg, når enzympreparater som er dannet av dem, har avtatt

med hensyn til aktivitet til en uakseptabel verdi etter gjentatt gjenanvendelse i en reaktor, kan harpiksen bli regenerert ved av-drivning av det gjenværende enzym ved behandling med varm alkali. Friskt enzym kan så knyttes til samme harpiks.

Det er også funnet at når enzympreparatene fremstilles ved adsorpsjon på de før nevnte metakrylsyre-kopolymerer fulgt av tverrbinding med visse tverrbindingsmidler kan det resulterende vann-uløselige enzympreparat anvendes ved fremstilling av 6-APA uten at det er nødvendig å ta særlige forsiktighetsreg-ler ved valget av alkali som er nødvendig for å nøytralisere den frigjorte sidekjedesyre. Det er således funnet at forskjellig fra slike systemer hvor enzymet er bundet direkte til en polymerbærer ved kovalente bindinger, natriumhydroksyd kan anvendes for dette formål, hvilket for tiden er vanlig ved anvendelse av cellebundne enzymer. Følgelig unngås modifisering av de ek-sisterende anlegg for å bli tilpasset flyktige alkalier, hvilket ville være nødvendig hvis ammoniakk eller trietylamin skulle anvendes for nøytralisasjon.

US-patentskrift 3 705 084 beskriver adsorpsjon av enzymer på polymere overflater og den påfølgende tverrbinding av dem. Polymerer og kopolymerer av metakrylsyre angis å være egnet for fremstilling av slike polymere overflater. Patentskrif- -Ly tet spesifiserer imidlertid at de polymere overflater må ha adsorpsjonspåskyndende grupper utvalgt blant nitril (=n),- syre-amido-(-CONH2)- og-ureido(-NHCONH2)-grupper, og før polymerer og kopolymerer av metakrylsyre kan anvendes i henhold til patentet, må derfor karboksylgrupper på polymeren og kopolymeren omvandles til en av disse spesifiserte adsorpsjonspåskyndende grupper. Følgelig kan polymerene og kopolymerene av metakrylsyre som anvendes i henhold til patentet, skjelnes fra dem som anvendes i forbindelse med foreliggende oppfinnelse, ved nærvær av disse spesifikke adsorpsjonspåskyndende grupper. Videre, ved å spesifisere nærværet av disse spesifikke adsorpsjonsgrupper, antyder patentet at modifi-serte polymerer og kopolymerer av metakrylsyre utgjør mer nytti-

ge enzymkomplekser enn de umodifiserte polymerer og kopolymerer.

Patentet lærer derfor bort fra foreliggende oppfinnelse at når det gjelder acylase-enzymer, er det de umodifiserte kopolymerer av metakrylsyre som foretrekkes.

For å vise overlegenheten ved kopolymerer av metakrylsyre i acylase-enzympreparater, ble acylase-preparater fremstilt av nylon og polyuretan, to polymerer som er representative for de fo-retrukne og eksemplifiserte polymerer i henhold til ovennevnte US-patent, under anvendelse av glutaraldehyd som tverrbindingsmid-. del, og deres aktivitet ble sammenlignet med et acylase-enzympreparat fremstilt av "Amberlite" IRC-50 på lignende måte. Når man tok i betraktning den avvikende partikkelstørrelse på enzympreparatene, fant man at "Amberlite" IRC-50-preparatet var to til tre ganger mer aktivt enn polyuretanpreparatet, og så meget som 11 ganger mer aktivt enn nylonpreparatet. Disse resultater er beskrevet i detalj i de spesifikke eksempler lengre ut i denne beskri-velse.

Idéen med å adsorbere et enzym på en bærer og tverrbin-de det in situ, er også beskrevet i britisk patentskrift nr.

1 257 263. Dette refererer imidlertid ikke til penicillin-acylase-enzymer. Heller ikke beskriver det anvendelse av metakrylsyre-kopolymerer som bærere. Det refererer heller ikke til de fordeler som oppnås ved å velge bærere med god mekanisk stabilitet. Ikke desto mindre strekker dets idé seg til tverrbinding av enzymet rundt bæreren ved å anbefale bruken av andre polyfunksjonelle reagenser enn vann-løselige dialdehyder, f.eks. bis-diazo-o-diåhisidihV ~ Likeledes'-kritas' det at idéen ved foreliggende opp-" firinelsé" kari' strekkes vt'il å "inkludere" glyoksal og formaldehyd som ?tvé'rrbiridirigsmidler', T tillegg "til glutaraldehyd.

" - - ) :-<'-' Følgelig benyttes"'ved oppf ihnéiseh et vann-uløselig enzympreparat s°m omfatter "ét périicillinacylase-erizym adsbrbert på eh'; vårin-uTøseTig 'polymerbærer - og tvérrbundét' med glutaraldehyd,'<:> glyoksal eller- formaldehyd", og" fremgangsmåten eir karakterisert ved :åf -'déf" anvendes* éf ehz^prepåråt' hvor polymerbæreren er éri; varin^uoppløselig "måkroporøs'kopoTymér av metakrylsyre og divi:hyibehzén><r>Idet<1> kopolymef en ;ér tiln stede i" form av "f indélte.. pa r tikler^-éilér småskuler' med paftikkélstørrelsé i" området 2,0-0",01!'mm^ j' ' 1 l:- '■'■■• <~ v' :;;v '-: •'• "•-'' ''v::

v" •'-"',:;"Frémstiriingen-av6'-amin6p"eriicillansyre omfatter å behandlé: •berizylperiicilliri éilér* f érioksymétylpéhicillin, eller et salt:derav, :i; vandig løsning ved en''pH-vérdi på 6,0-9,0 med det nevnte'vanir-uløsélige' énzymprepar'at'1' <....<>■.<> >"l ,"; Åcylåsé-érizymet for"anvendelse i forbindelse med oppfinnelsen1'^ oppnås - fortrinnsvis-' f ra slike Bakterier som stammer av Escherichia coli, når det anvendes for fremstilling"av 6-APÅ'fra benzylpériiclliin;"eliér for eksempel fra sopper og actinomyceter når fénoksymetyiperiiciiliri^ahvéndés som utgarigsmatériaie". - oi ~\, •0En2yrhakt i vit étén til' deacylase-éhzymet kan bestemmes i forhold'<:>tll<!->"<:>'déts åvné til^å produsere 6-ÅPA fira berizylpeiricillin. Såiédés'ef-aktiviteten f6r~vdeacyiase-éhzyméhe her registrert som mengden"--åv-^-^PA' '(gitt i" 'mikrbmol',' ymbl)"" produsert fra én løs-ning-"av'-benzylpenic'xllih' ved pH'" 7','8 og"' 37 C pir. minutt og pr. milligram -iproteininnhoid i ' ehzymét", idét^proteininnholdet er analysert ved<0>ståhdardmét6'déri'til LbwryV "Enzymaktiviteten til erizymprepaxatérié'kan likeledes'bé^témmés"på basis av mengden av 6-APA ' (i'-7um6r) -produsert: fra~benzyipéniciliiri ved"pH 7,8 og 37°C ::p^ :;-miriutt'/ men' på :basis av Jvéktén" av" ehzymkomplekset' i" gram.

<::>'v;<->Det°ef-'funnet at både effektivitétén av'adsbrpsjons-tverrbindings-réå^s johén' bg' den spesifikke'aktivitet* til det dan-nede vånh-uiøseiige enzympreparat" forbedres etter hvert som" renheten'til'enzymet som årivéhdes , Øker r 'imidlertid, utover eh viss renhet avtar dé' forbedringer som 'er oppnådd ' for'"eri gitt økning -i'renhet, markért, "og 'det "eir således' en økonomisk grénse "

for deri øriskeligé renhét^' Såiedes 'ligger' 'aktiviteten' fil

deacylase-enzymet i området 1,5-30 umol/min/mg protein.

Det kan således være ønskelig å forbedre renheten til enzymet før adsorpsjon og tverrbinding. Dette kan oppnås ved opp-varming av enzymløsningen ved ca. 50°C i et kort tidsrom, f.eks.

ca. 30 minutter og/eller ved ultrafiltrering. Andre konvensjonelle metoder for enzymrensning, f.eks. fraksjonell utfelling eller behandling med ionebyttecelluloser eller "Sephadex" kan også anvendes .

Bærer for den aktuelle bruk er makroporøse kopolymerer

av metakrylsyre. De inneholder derfor frie karboksylgrupper som gir polymeren syrefunksjon.

Metakrylsyrepolymerene må være vann-uløselige og er

derfor i form av tverrbundne kopolymerer av metakrylsyre med divinylbenzen. En fordel ved foreliggende oppfinnelse er at den tillater bruk av polymerbærere som allerede er kommersielle produkter for andre formål, spesielt som kationebytteharpikser av svakt sur natur. Spesielt egnet er den metakrylsyre/divinylbenzen-kopolymer som selges under handelsbetegnelsen "Amberlite" IRC-50 av Rohm and Haas Co.

Polymerbærerne for den aktuelle bruk har form av findelte partikler eller perler med en slik partikkelstørrelse at de vil passere en 10 A.S.T.M.-sikt, dvs. med partikkelstørrelse-diameter under 2,0 mm. Imidlertid må det resulterende enzymkompleks ikke være så findelt at det ikke kan separeres fra reaksjonsblandingen ved en filtreringsprosess eller anvendes i en kolonnereaktor. Således bør polymeren ha en partikkelstørrelse i overkant av 0,01 mm, dvs. at den i alt vesentlig bør tilbakeholdes på en 800 A.S.T.M.-sikt. Det spesifikke valg av.partikkelstør-reise innen dette område vil være avhengig av typen reaktorsystem som anvendes.

Acylase-enzymet som skal bringes i kontakt med polymeren, bør være en vandig løsning og være blitt dialysert inntil dets ione-^ledningsevne er blitt senket fra den vanlige verdi på

5-10 m.mhos til innen området 0,1-5 m.mhos, fortrinnsvis ca.

1 m.mhos. pH-verdien til enzymløsningen bør være mellom 4,5 og 7,0, og det kan være nødvendig å gjøre noen empiriske forsøk for å bestemme den optimale pH-verdi innen dette område hvis man skal kunne oppnå maksimal adsorpsjon og bevart enzymaktivitet. Imid-lertid er denne optimale verdi vanligvis mellom pH 5,2 og 6,5. Polymeren bør bringes i kontakt med enzymløsningen i et tilstrekkelig langt tidsrom til å sikre maksimal enzymadsorpsjon. Denne oppholdstid er vanligvis mellom 2 og ,16 timer.

Etter sin adsorpsjon på bæreren tverrbindes enzymet

in situ ved behandling med et tverrbindingsmiddel utvalgt blant glutaraldehyd, glyoksal og formaldehyd. Anvendelsen av glutaraldehyd eller qlyoksal foretrekkes, idet glutaraldehyd spesielt resulterer i enzympreparater med de mest fordelaktige egenskaper når de anvendes ved produksjon av 6-APA. Tverrbindingsmidlet anvendes normalt i vandig løsning ved en konsentrasjon mellom 0,1

og 15 vekt%, fortrinnsvis 0,5-5,0 vekt%.

Etter fullførelse av tverrbindingsreaksjonen er det

ønskelig å sikre at noe av tverrbindingsmidlet som ikke har reagert, fjernes eller gjøres uskadelig. Eksempelvis kan over-skuddet av midlet fjernes ved vasking med vann eller med en løs-

ning av en aminforbindelse, og urinstoff har vist seg å være meget effektivt for dette formål.

Før anvejidelse i produksjonen av 6-APA bør pH-verdien

til enzympreparatet justeres omhyggelig til den verdi som skal anvendes i produksjonsprosessen, vanligvis ved tilsetning av alkali ved slutten av tverrbindingsreaksjonen. En slik pH-verdi er i området 6,0-9,0, men er vanligvis mellom pH 7,0 og 8,5, og en pH— verdi på 7, 8 foretrekkes. For en slik anvendelse bringes enzympreparatet i henhold til oppfinnelsen i kontakt med en vandig

løsning av benzylpenicillin eller fenoksymetylpenicillin eller av et salt derav, idet en slik løsning har den ønskede pH-verdi. Reaksjonstemperaturen holdes vanligvis i området 30-50°C, fortrinnsvis 37°C. Under reaksjonen frigjøres fenyleddiksyre fra benzylpenicillin og fenoksyeddiksyre fra fenoksymetylpenicillin, og denne syren nøytraliseres kontinuerlig eller periodevis for regulering av reaksjonsblandingens pH-verdi innen det ønskede område. Som angitt ovenfor, viser valget av alkali for denne nøy-tralisering seg ikke å være kritisk. Derfor anvendes oftest natriumhydroksydløsning, selv om en flyktig aminbase, f.eks. ammoniakk eller trietylamin, kan brukqs om s£ ønskes.

De vann-uløselige enzympreparater sem anvendes i henhold til oppfinnelsen er ofte tilstrekkelig stabile, både mekanisk og biologisk, til at de kan anvendes for å mulig-gjøre minst 40 suksessive spaltninger av penicillin i en batch-reaktor.

Oppfinnelsen skal illustreres ved hjelp av eksempler,

i hvilke det ble anvendt et delvis renset preparat av acylase-enzym som var fremstilt ved frigjøring av enzymet fra cellene fra en acylaseproduserende stamme av Escherichia coli NClB 8734 ad mekanisk vei i en homogenisator.

Cellesedimenter ble deretter fjernet ved filtrering etter justering til pH 5,0, og enzymløsningen ble renset ytterligere etter behov for frembringelse av det ønskede område av spesifikk aktivitet (dvs. 1,5-30 /Umol/min/mg protein). Enzym-løsningen ble deretter dialysert til den hadde en ledningsevne på tilnærmet 1 m.mho.

Eksempel 1 (sammenligning)

Alikvoter (20, 25 eller 50 g) av kommersielt tilgjengelige kationiske og anioniske ionebytteharpikser, som angitt nedenunder, ble suspendert i destillert vann (ca. 100-500 ml) og justert til pH-verdier mellom 4,4 og 6,3 for de kationiske harpiksers vedkommende og til pH-verdier mellom 6,5 og 9,0 for de anioniske harpiksers vedkommende, ved tilsetning av natriumhydroksyd eller saltsyre under kraftig omrøring. Harpiksene ble gjenvunnet ved filtrering, godt vasket med destillert vann og ble igjen suspendert i en løsning av delvis renset penicillin-acylase (60-100, 250 eller 500 ml; spesifikk aktivitet: 3,85-6,75 /umol/ min/mg protein; ledningsevne: <1 mrmho) ...justert til den rette pH-verdi. Mengden av enzym som behandles med harpiksen, ble variert mellom 71 og 308 /umol/min/g harpiks. Enzymet ble tillatt å adsorbere under forsiktig omrøring i ca. 16 timer. Harpiksene ble gjenvunnet ved filtrering, resuspendert i en løsning av glutaraldehyd i vann (100 ml, 0,825-3,3 vekt/volum%) og ble tillatt å reagere i ca. 16 timer. De resulterende enzym-har-pikspreparater ble gjenvunnet, vasket 3 ganger med destillert vann, resuspendert i vann eller 0,2m fosfat-puffer pH 7,8 og justert til pH 7,8, behandlet i 1 time med en vandig løsning av urinstoff (100 ml, 0,lm, pH 7,8) og endelig vasket 3 ganger med destillert vann.

Hvert enzympreparat som var fremstilt på denne måte, ble anvendt for fremstilling av 6-APA ut fra benzylpenicillin under standardbetingelser ved pH 7,8 og 37°C. Aktivitetene til enzympreparatene er gjengitt i tabell I. Aktivitetene refererer til preparater som er fremstilt ved den optimale pH-verdi for enzymadsorpsjon og tilbakeholdt enzym-aktivitet.

"Bio-Rex" og "Chelex"-harpiksene er kommersielle produkter fra Bio-Rad Laboratories, California, U.S.A., "Lewatit"-harpiksene er kommersielle produkter fra Bayer A.G., BRD, "Zeokarb"- og "Zerolit"-harpiksene er kommersielle produkter fra The Permutit Co. Ltd. og "Amberlite"-harpiksene er kommersielle produkter fra Rohm & Haas, Philadelphia, U.S.A. Fordelene ved oppfinnelsen hvor bæreren er en kopolymer av metakrylsyre (for-søk o) fremgår av den følgende tabell.

TABELL I

Fotnoter:

/ X_'\ Resultatene var meget variable, og de angitte verdier

er gjennomsnitt av flere målinger.

Polymerstrukturen er ikke kjent.

/ 3\ Harpiksen er ikke kommersielt tilgjengelig.

/ k\ Maskestørrelse 100-200, kfr. 14,50 for andre harpikser.

Harpiksene a - c er sterkt anioniske.

Harpiksene d - f er svakt anioniske.

Harpiksene g - 1 er sterkt kationiske.

Eksempler 2- 5

Disse eksempler illustrerer effekten av å variere renheten til acylase-enzymet under adsorpsjonstrinnet. Den anvendte fremgangsmåte var som beskrevet i eksempel 1. Enzymet ble adsorbert ved pH 5,7, og enzym- harpikspreparatet ble behandlet med 3,3 vekt/volum% glutaraldehyd. Den anvendte harpiks var "Amberlite" IRC-50, som var vasket med alkali oq deretter med syre. De spesifikke aktiviteter for enzympreparatenel som var oppnådd på denne måte, er som angitt i tabell II nedenunder. Resultatene i tabell II indikerer at økning av renheten til utgangs-enzvmet innen cie>+ te område øker den spesifikke aktivitet for enzympreparatet.

Eksempler 6- 15

Betydningen av pH-verdien ved hvilken enzymet ble adsorbert på harpiksen, ble vist i disse eksempler, hvor: (a) Fem alikvoter av "Amberlite" IRC-50-harpiks (50 g) ble justert til henholdsvis pH 4,9, 5,1, 5,3, 5,5 og 5,7, tørket og deretter ble hver av dem tilsatt til en løs-ning av delvis renset penicillin-acylase (95 ml; aktivitet: 60,9 ^mol/min/ml, 16,8 mg protein/ml; ledningsevne: 0,55 m.mhos; laget istand til et slutt-volum .på 200 ml). Etter adsorpsjon Å 16 timer ved den aktuelle pH-verdi ble enzympreparatet behandlet på den måte som er beskrevet i eksempel 1; eller (b) fem ytterligere alikvoter av den samme harpiks ble behandlet på samme måte med unntagelse av at adsorpsjons-prosessen ble utført i pH-området 5,7-6,5. Enzymet som ble anvendt for disse harpikser, hadde følgende karakteristika: (105 ml; aktivitet: 54,7 /umol/min/ml;

9,03 mg protein/ml; ledningsevne: 0,75 m.mhos).

Resultatene fra disse forsøk er gjengitt i tabell III nedenunder. Disse resultater viser at den optimale pH-verdi for adsorpsjonstrinnet er fra 5,2 til 5,8.

Eksempler 16 og 17

Disse eksempler viser effekten av å anvende den samme harpiks, men med forskjellig partikkelstørrelse. Således ble det anvendt en kromatografikvalitet av harpiksen "Amberlite" IRC-50,

dvs. "Amberlite" CG-50 Type I med en partikkelstørrelse som pas-

serte en 100 A.S.T.M.-sikt, men ble holdt tilbake på en 200 A.S.T.M.-sikt (dvs. en partikkelstørrelse på 0,074-0,149 mm).

En alikvot (15 g) av harpiks ble tillatt å adsorbere

enzym (200 ml, 23,7 umol/min/ml;, 3,86 /.(mol/min/mg protein) ved pH 6,3 i 3 timer. Enzymp<rep>aratet ble gjenvunnet, behandlet med glutaraldehyd (200 ml, 0,825 vekt/volum%) i 16 timer og gjenvun-

net og vasket som beskrevet i eksempel 1. Produktet (21 g) hadde en aktivitet på 114,5 /j.mol/min/g fuktig vekt, og denne verdi må sammenlignes med den som er angitt i eksempel 2, hvor "Amberlite" IRC-50 ble anvendt med en partikkelstørrelse som passerte en 14 A.S.T.M.-sikt, men ble holdt tilbake på en 50 A.S.T.M.-sikt (dvs. med en partikkelstørrelsesdiameter på 0,297-1,41 mm).

Dette viser at det oppnås forbedrede resultater når harpiksen har

den minste størrelse.

Forsøket ble gjentatt under anvendelse av en farma-

søytisk kvalitet av "Amberlite", nemlig "Amberlite" IRP-64 med en partikkelstørrelse som passerte en 100 A.S.T.M.-sikt, men ble holdt tilbake på en 500 A.S.T.M.-sikt, dvs. en partikkelstørrelse på <0,037-0,149 mm i diameter. Harpiksen ble tillatt å adsorbere enzym (3920 ^mol/min/g harpiks; spesifikk aktivitet: 17,4 /umol/

min/mg protein) ved pH 6,3. Enzympreparatet ble så omsatt med glutaraldehyd (3,3 vekt/volum%) og behandlet som beskrevet i eksempel 1. Det resulterende enzym-harpikspreparat hadde en spesifikk aktivitet på 478,4 /.imol/min/g fuktig vekt.

Eksempel 18

pH-verdien til "Amberlite" IRC-50-harpiks ble justert

til 5,5 enten ved vasking med 0,2m fosfatpuffer med den angitte pH-verdi eller ved oppslemming i destillert vann og tilsetning av natriumhydroksydløsning. Harpiksen ble så ytterligere vasket med destillert vann til det ikke var noen forandring i ledningsevnen til vannet.

Den fuktige harpiks (100 g) ble tilsatt til penicillin-acylasen med aktivitet 5,25 M^ol/min/mg protein i 500 ml 0,02m fosfatpuffer med pH 5,5 og omrørt i 20 timer ved romtemperatur.

Det faste stoff ble gjenvunnet ved filtrering, resuspendert i

500 ml 0,25 vekt/volum% glutaraldehyd oppløst i fosfatløsningen og omrørt i ytterligere 20 timer ved romtemperatur. Det resulterende enzympreparat ble så gjenvunnet ved filtrering og vasket med 0,2m fosfatpufferløsning med pH 7,8 inntil harpiksen ble brakt i likevekt ved denne pH-verdi.

Det således fremstilte enzympreparat (15 g) ble så anvendt for spaltning av 200 ml av en 6,25 vekt/volum% vandig løs-ning av benzylpenicillin, 0,02m fosfatpuffer ved pH 7,8 i 2 timer ved 37°C. Det viste seg at enzympreparatet lett kunne gjenvinnes for anvendelse på ny og at dets mejcaniske og biologiske stabilitet ble bevart slik at preparatet- kunne brukes om igjen minst 25 ganger.

Eksempel 19

Dette eksempel viser anvendelsen av et enzympreparat i henhold til oppfinnelsen i en produksjon av 6-APA i stor skala, samt den enestående gjenanvendbarhet av preparatet under disse betingelser.

Det ble fremstilt et enzympreparat under anvendelse av "Amberlite" IRC-50. Det hadde en aktivitet på 26,3 pmol/min/g og ble anvendt for spaltning av 40 liter benzylpenicillinløsning med konsentrasjon 6,5 vekt/volum% tillaget i 0,02m fosfatpuffer. Enzympreparatet ble holdt i karet ved hjelp av en trådduk. Således ble løsningen, av 6-APA produkt filtrert fra da reaksjonen var ferdig, preparatet ble vasket med vann og en reaksjon til ble satt i gang. Den gjennomsnittlige effektivitet for omdannelsen til 6-APA av 50 suksessive, fornyede anvendelser, hver av 6 timers varighet, var 95%.

Eksempel 20 (sammenlikning)

Dette eksempel viser den mekaniske stabilitet til et enzympreparat som anvendes i henhold til oppfinnelsen, fremstilt og beskrevet i eksempel 1, ut fra harpiksen "Amberlite" IRC-50, sammenlignet med et som ble fremstilt på lignende måte, men ut fra et polymer-substrat med nøytral aktivitet, nemlig harpiksen "XAD-7" som er en tverrbundet akrylatester som er kommersielt tilgjengelig fra Rohm & Haas Corp. U.S.A.

Prøver av hvert enzym<p>reparat ( ±te kg) ble suspendert i 8 liter 0,2m fosfatpuffer ved pH 7,8 og 37°C, og hver blanding ble omrørt i 72 timer ved 200 o.p.m. i en "New Brunswick Magnaferm" fermentator med ledeplater. Det ble tatt prøver med

4 timers intervaller, og disse ble visuelt undersøkt med hensyn på nedbrytning av harpiksperler. Nedbrytning av "XAD-7"-perlene var avgjort større enn for "IRC-50"-perlene, slik at en prøve av sistnevnte etter 64 timer lignet en prøve av "XAD-7"-harpiksen tatt etter 8 timer. Disse resultater viste tydelig "IRC-50"-harpiksens større mekaniske styrke.

Eksempel 21

Enzympreparat med "Amberlite" IRC-50 som bærer (235 g,39,4 l%ol/min/g)/ fremstilt som beskrevet i eksempel 1, ble anvendt for spaltning av 6,25 vekt/volum% kalium-benzylpenicillin G i en serie på 10 på hver-

andre følgende forsøk. Hvert forsøk ble utført med 1 liter kalium-benzylpenicillin G i 2,5 timer ved 37°C og pH 7,8.

"Amberlite" IRC-50-harpiksen ble fjernet ved filtrering etter hvert forsøk og vasket med destillert vann. Filtratet og vaske-vannene ble konsentrert ved roterende vakuum-inndampning, konsen-tratet ble blandet med like volumdeler metylisobutylketon, av-

kjølt til 4-l0°C og endelig surgjort for utfelling av 6-aminopenicillansyre. 6-aminopenicillansyren ble vasket med litt destillert vann, skyllet med aceton og ovnstørket. Det gjennomsnittlige vektutbytte av 6-aminopenicillansyre fra de 10 forsøk

var 91,3%.

Eksempel 22 (sammenlikning)

Adsorpsjon av acylase- enzym på uretanbelagt polyetylen

LD-polyetylenpartikler (<C400/um) ble belagt med en uretanpolymer ("Urithane" 641W. Cray Valley Products Limited) og fikk tørke i 10 dager. Materialet ble deretter vasket i 1 time med . 20 volum% vandig aceton, skyllet ekstra godt med destil-

lert vann, og alikvoter på 5 g ble tillatt å adsorbere enzym (125 ml, 54,0 /jmol/min/ml, 3,80 /_<mol/min/mg protein) i 5 timer i området pH 4,8-9,0. De uretanbelagte partikler ble fjernet ved filtrering, behandlet med glutaraldehyd (75 ml, 3,3 vekt/volum%)

i 3 timer og deretter brakt i likevekt til pH 7,8 som beskrevet i eksempel 1.

Til tross for at de uretanbelagte partikler i gjennom-

snitt har mindre størrelse enn "IRC-50", var de oppnådde spesi-

fikke aktiviteter 2-3 ganger mindre enn dem som ble oppnådd under anvendelse av "IRC-50".

Eksempel 23 (sammenlikning)

Adsorpsjon av acylase- enzym på nylon

"Orgolacq" (pulverisert nylon 6, diameter <30^m, Ato

Chimie (U.K.) Limited) ble vasket i 1 time med 65 vekt/volum%

maursyre og deretter skyllet ekstra godt med destillert vann. Alikvoter (10 g) ble tillatt å adsorbere enzym (100 ml, 50,9 IU mol /min/ml, 4,7 umol/min/mg protein) i 16 timer i pH-området 4,8-9,0. Det pulveriserte nylon ble fjernet ved filtrering, behandlet med glutaraldehyd (100 ml, 3,3 vekt/volum%) i 3 timer og gjenvunnet og vasket som beskrevet i eksempel 1. Den høyeste aktivitet som ble oppnådd (pH 4,8) var 41,7 /.mpl/min/g fuktig vekt som var sammenlignbar med.et typisk preparat av _"IRC-50".

Når det imidlertid tas hensyn, til forskjellen i partikkelstør-

relse for nylonet og "IRC-50", viste "IRC-50" seg å være langt overlegen. Således kunne "IRP 64" (farmasøytisk kvalitet "IRC-50", partikkelstørrelse 0,037-0,149 mm) kobles med acylase og gi preparater med spesifikk aktivitet 478 p.mol/min/g fuktig vekt, mer enn 11 ganger større enn nylonpreparatene.

Eksempel 24 (Sammenlikning)

( a). Kobling

Et enzympreparat ble fremstilt i overensstemmelse med eksempel 4 i henhold til BRD-off.skrift nr. 2 215 687 på følgende måte:

100 g polymer fremstilt.i overensstemmelse med eksem-

pel 4a i off.skriftet ble tilsatt til penicillinacylase-enzym-

løsning (5 1,total aktivitet 4 ,992 x 10 enheter), og blandingen ble omrørt i 2o timer. pH-verdien ble holdt på 6,3 ved tilsetning av natriumhydroksyd. Enzym/polymerpreparatet ble utvunnet ved filtrering og vasket med 0,05M fosfatpuffer pH 7,5 inneholdende IM natriumklorid (51) og til slutt med 0,05M fosfatpuffer pH 7,5

(51). Den spesifikke aktivitet for det endelige produkt var

2 91 000 enheter/g.

Et annet enzym/polymerpreparat ble fremstilt i henhold

til foreliggende oppfinnelse på følgende måte: 200 g "Amberlite" IRC-50 ble tilsatt til en løsning av penicillinacylase-enzym (3 lj total aktivitet 2,995 x IO*' enheter)

og blandingen ble omrørt i 18 timer ved pH 5,7 som ble opprett-

holdt ved tilsetning av 1,0M natriumhydroksyd. Enzym/polymer-preparatet ble utvunnet ved filtrering og tilsatt til en 1,25 vekt/vol.% løsning av glutaraldehyd og omrørt i 3 timer. Det tverrbundne enzym/polymerpreparat ble utvunnet ved filtrering og vasket med destillert vann (3x2 1) og resuspendert i 0,25M fosfatpuffer pH 7,8, og suspensjonen ble justert tilbake til pH 7,8

ved tilsetning av IM natriumhydroksydløsning. Det tverrbundne enzym/polymerpreparat ble igjen utvunnet ved filtrering og vasket med destillert vann. Den spesifikke aktivitet for produktet var

307 000 enheter/g.

( b) 6- APA- fremstilling

Til en løsning av 6,25 vekt/vol.% benzylpenicillin

(1 liter) ved 37°C og pufret til pH 7,8 i et glasskår utstyrt med en varme/kjølekappe og en padlerører av rustfritt stål ble tilsatt en mengde av enzym/polymerpreparat som hadde en aktivitet på 50 x 10^ enheter. Blandingen fikk reagere i 2,5 timer.

Under reaksjonsperioden ble væskens pH-verdi holdt på 7,8 ved tilsetning av 10 % natriumhydroksydløsning, og preparatet ble deretter fjernet ved filtrering og filtratet vasket med vann. Aktiviteten til enzym/polymerpreparatet ble så vurdert under anvendelse av paradimetylaminobenzaldehyd-metoden (PDAB), og preparatet ble tilsatt til en ytterligere mengde av penicillin G-løsning for gjentagelse av prosessen.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av 6-aminopenicillansyre, som omfatter å behandle i vandig løsning som holdes ved en pH-verdi på 6,0-9,0, benzylpenicillin eller fenoksymetylpenicillin, eller et salt derav, med et vann-uløselig enzympreparat, idet dette enzympreparat omfatter et penicillin-acylase-enzym som er adsorbert på en vann-uløselig polymerbærer og tverrbundet med glutaraldehyd, glyoksal eller formaldehyd, karakterisert ved at det anvendes et enzympreparat hvor polymerbæreren er en vann-uoppløselig makroporøs kopolymer av metakrylsyre og divinylbenzen, idet kopolymeren er til stede i form av findelte partikler eller små kuler med partikkelstørrelse i området 2,0-0,01 mm.