SU654170A3 - Способ получени 6-аминопенициллановой кислоты - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 6-АМИНОПЕНИЦИЛЛАНОВОЙ КИСЛОТЫ аиипазы, адсорбированной на полимере ипи сополимере метакриловой кислоты и поперечно-сшитой с помо.щью агента, образующего поперечные св зи и выбранного из группы, включающей альдегид гп -таро вой киспоты, глиоксапь ипи формальдегид. Особенность предлагаемого способа - использование в качестве полимерного субстрата полимера ипи сополимера мет акриловой киспоты. При осуществлений способа желательно использовать пенициллиновую ацилазу со степенью чистоты в пределах 1530 мкмоль/мп протеина в 1 мин. В качестве субстрата можно использовать сополимер метакриловой киспоты и дивинипбензола или полимер или сополимер , содержащий бензолсульфонипьные группы. Обычно используют субстрат, имеющий макропористую форму. При этом ферментный комплекс предпочтительно использовать в виде тонко измельченных частиц размерами 2,О-О,01 мм. Процесс желательно вести при 30-5О С и рН 7,0 8,5 при непрерывном ипи периодическом

добавлении гидроокиси натри .

Пенициллиновую ацилазу получают предпочтительно с помощью бактерий Eschetichioi Coti при применении ее дл  получени  6-АПК из бензилпеницил ина или с помощью грибов,и актиномицетов при применении феноксиметилпенициллина в качестве исходного продукта.

Установлено, что эффективность реакции образовани  поперечных св зей и удельна  активность полученного нерастворимо го в воде энзима улучшаютс  при увеличении степени чистоты иЯ)Ходного энзима. Однако при чрезмерной чистоте этого энзима эффективность указанной реакции и активность полученного энзима yxyif шаютс , поэтому необходим экономически выгодный предел степени очистки исходного энзима. Обычно чистота ацилазы 0,15 - 50 мкмоль/мг протеина в минут} предпочтительно 1,5-30 мкмоль/мг протеина в минуту.

Очистка энзима перед адсорбцией и сшиванием достигаетс  при нагревании раствора энзима в течение короткого периода при температуре, равной примерно 50°С, например в течение ЗО мин с последукнцей ультрафильтрацией. Дл очист ки энзима можно также примен ть фракционированное осаждение или обработку ионообменными целлюлозами или Срфа- дексом. 6

бенно пригодны сополимеры под торговым .наименованием Амберлит 3RC 50 фирмы энд Гасс комп.., США, а также сополимер метакриповой кислоты, выпущенный недавно в продажу под торговым наименованием Цеокарб 227 фирмой Пермутит . Последний представл ет собой сополимер дивинилбензола и метакриловой кислоты , содержащий также бензолсульфонипьные группы. Предпочтительны полимерные субстраты в виде тонко измельченных частиц или грануд, проход щих через сито с отверсти ми диаметром 2,0 мм. Однако частицы получаемого комплекса не должны быть настолько мелкими, чтобы их нельз  было выделить из реакционной смеси фильтрованием или применить в колонном реакторе. Частицы полимера должны быть размерами больше О,О1 мм. Выбор размеров частиц зависит от примен емой системы реакторов.

Дл  контактировани  с полимером пенициллиновую ацилазу деализируют в вогь ном растворе до уменьшени  ионной проводимости от обычной величины 5-Юммо до 0,1-4 ммо, предпочтительно до 1 ммо, рН раствора энзима 4,5-7,0. Дл  достижени  максимальной адсорбции и активности энзима эмпирически подбирают и устанавливают величину рН в указанных пределах. Обычно оптимальна  величина рН 5,2-6,5. Дл  обеспечени  максималь04 Подход щим субстратом  вл етс  полимер ипи сополимер метакриповой кислоты . Такие попимеры или сополимеры могут содержать свободные карбокси ь- ные группы, которые сообщают полимеру кислотную функцию. Макропористые полимеры и сополимеры метакриповой киспоты более предпочтительны, чем геле- образные полимеры и сополимеры этой кислоты. Пригодны полимеры метакриловой кис- оты, не растворимые в воде и потому обычно в виде поперечно-сшитых сополимеров , например сополимеров метакриловой кислоты и дивинилбензола, или диэфиров гликол  и метакриловой кислоты, например диэфира этиленгликол  и мет. акриловой кислоты. Дл  приготовлени  сополимеров можно использовать и {фугие мономеры, например эфиры метакриловой киспоты. Одним из преимуществ данного изобретени   вл етс  возможность применени  полимерных субстратов в виде продуктов, используемых в промьпиленности дл  других целей, например катионообменных смол слабо кислотного типа, Осо- ной адсорбции энзима полимер обрабатывают раствором энзима в течение 2-16 После адсорбции на субстрате энзим обрабатьгеают агентом, образующим поперечные св зи, в виде альдегида гпутаровой кислоты, глиоксал . или формальдегид Предпочтительно примен ть альдегид или глиоксаль. При применении альдегида глу таровой кислоты получаетс  энзим, обладающий наилучшими свойствами при приГОТОВ7ЮНИИ 6-АПК. Агенты, образук цие попер ечные св зи, обычно примен ют в водном растворе при концентрации 0,1- 15 вес.% предпочтительно 0,5-5,0 вес.% По окончании реакции образовани  попе речных св зей желательно удалить или сделать неактивным агент, образующий сетчатую структуру. Избыток его можно удалить при промывке водой илк раствором амина; очень эффективна в этом отношении мочевина. Перед применением энзимного ком пекса дл  получени  необходимо тщательно довести его рН йо величины, необходимой дл  этого процесса, что достигаетс  обычно при добавлении щеиочк в конце реакции образовани  поперечных св зей. Эта величина лежит в пределах 6,О-9,О, но обычно 7,,5 в и предпочтительно равна 7,8. Пра таком прй менении комплекс контактируют с водным раствором бензилпеницйлпина и й фенокси метилпенициплина йгга их сопью  ра определенной величине рН. Температуру реакции обычно поддерживают в.нрёцепах ЗО-5ОС,предпочтитепьно 37С. Во врем  реакции из бензилпеиициллина выце л етс  фенилуксусна  кислота, а из фенок симетилпенициплина феноксиуксусна  киолота . Эти кислоты непрер гено или периодически нейтрализуют ди  поддержани  определенного передела рН реакционной смеси. Выбор необходимой дл  нейтрализации щелочи не имет решающего значени . Обычно примен ют раствор гидроокиси натри -, хот  при желании можно примен ть такое летучееоснование, как аммиак ИГО триэтипамин. Водорастворимые энзимные компгюксы обычно настолько стабильны механически и биологически, что их можно примен ть по крайней мере дл  40 поспедоватепьных расщеплений пенициллина, проводимых в реакторе периодического действи . При осуществлении приведенных в примерах опытов примен ют частично очищенный энзим, выдепеиньй механически в гомоге низаторе из клеток вырабатывающего auiiлазу штамма EscherJchia Coti MCIB 8734. Остатки клеточной ткани удал ют фигаьт рованием после установлени  рН 5,0 и раствор энзима очищают до достижени : необходимой удельной активности, т. е. 1,5-ЗО мкмолей/мг протеина в I мин. Затем раствор энзима диализуют до доотижени  проводимости, равной примерно 1 ммо. Пример 1. Аликвотные количества (2О-25 г или 5О г) указанных катионных и анионных ионообменных смоп суспендируют в шютиллированной воде (примерно 10О-5ОО мп) н устанавиивают рН в пределах ,3 в случае катионных смол и 6, в случае анионных смо , добавл ют гидроокись  атрк  или сол ную кислоту при энергичном пере-мешивании . Затем смолы OTpensnor фильтрованием , тщатепьио промывают дистнл- пированной водой, суспеннйрукэт в растворе частично очищенной пеницилпиновой аци ааы 6О-1ОО, 25О и и 5ОО мл; удельна  активность 3,85-6,75 кмопъ/мг протеина s i мйН| проводимость менее 1 ммо) и устанавниваюг требуе {ук вели- чЕцу рН, Количество энзима, адсс б1фованного смолой в пределах ьжмоль смолы в 1 мин. Адсорбщс  происход т при легком перемешива 51и в течение примерно 16 ч и при подаержани   рН добавгюнкем тнтрованного раствс а. Затем смолу отдел ют фильтрованием, вновь суспендируют в водном растворе апьдегнда глу- TapoBOHKHcaoiM (10Омл;О,825-3,3 вес.% по объему) и провод т реакцию в течение примерно 16 ч. Полученные комплексы энзим-смопа выдеп ют,.триждьт промывают пистйп ированной водой, снова суспендируют в воде ИЛИ 0,2 М фосфатном буфере с рК 7,8.Довод т рН до 7,8, обрабатывают в течение 1 ч водным раствором мочевины (10О ыщ 0,1 М; рН 7,8) и, наконец, промывают трижды дистиллированной водой. Каждый из попученпых энзимных комплексов примен ют дп  получени  6-АПК из бензиппенициппина в стандартных услови х при рН 7,8 и температуре . Активности этих комплексов указаны таб. 1. Активности относ тс  к комплексам , прнготовпенным при рН, оптимальом дл  адсорбции энзима и сохранени  его активности. Смопы Бйо-Рекс и Чепекс - продукты ирмы Био-Рад Лабораторис ов Калифорни , США, смолы Леватит - ьродукты

76541706

фирмыБайер А.Г., ФРГ cMonbiLleoKafi6 ии смопы Амберпит - ироцукты фирмы Ром

Церолит - продукты фирмы ПермутиткомпУ зенд Гаас, Фипадепьфи , США.

.Таблица

Продолжение табп. 1

Прим

Примеры 2-5. В этих примерах показано вли ние разной степени чистйты пенициппиновых энзимов на стадии адсорбции . Опыты провод5гг аналогично примеру 1. Энзимы абсорбируют прирН 5,7 и комплекс энзим-смола обрабатывают 3,3вес.% (по объему) раствором альдегида гпутаровой :киспоты. Примен ют смолу Амберпит 1R.C5 ,0, которую промывают щелочью, а за- тем кислотой.

Полученные удельные активности комп .лексов приведены в табл. 2. Эти результаты показывают, что прн увеличении сте пени чистоты исходного энзима в определенных пределах увеличиваетс  удельна  активность комплекса.

Claims (7)

1. Таблица 2 ечани :Д- результаты очень разные; указанные величины - средние нескольких определений; - строение полимера неизвестно; f- смолы нет в продаже; - размеры частиц О,О74-0,149 мм; смолы А-Б сильно анионные, Г-Е слабо анионные. Ж-М сильна катионные, П-Ц слабо катионные. Примеры 6-15. В этих примерах пЪказано значение величины рН, при которой энзим адсорбируетс  на смопе. А. Устанавливают рН п ти аликвотны количеств смолы Амберлит 84 ,9j 5,1 5,3 5,5 и.5,7. Смолу высушивают и каждый образец добавл ют к створу частично очищенной пеницилпи .новой ацилазы (активность 6О,9 мкмоль /мл в 1 мин, 95 мл; 16,8 мкмоль/м71 протеина в 1 мин; проводимость О,55м конечный объем раствора 2ОО мл). Пос ле адсорбции при подход щей величине рН в течение 16 ч комплекс обрабатьь . вают внаногично примеру 1. Б. Еще п ть аликвотных количеств той же смолы обрабатьгаают таким же способом, но адсфбци; , проходит при рН 5,7-6,5. Испопьэованный энзим имеет следутаие характеристики: 105 мл, акти ность 54,7 fкмoль/мл в 1 мин; ;9,ОЗ мкмопь/мп протеина в 1 кдан; про водимость 0,75 ммо). Реаупьтаты экспериментов приведены табл. 3. Иа тв6п{шы йидно, чтооптималь;на  дл  ацсорбцив вепвчина рН 5,2-5,8 Таблица 3. Примеры 16 17. Эти примеры показывают вли ние частиц смолы разны размеров. Примен ют смолу Амберлит хроматографического сорта, т. е. смолу Амберлит CG-5O типа 1 с частицами, проход щими через сито с отверсти ми диаметром 0,149 мм,но за держиваемыми на сите с отверсти ми диаметром 0,074 мм. Аликвотные количества (15 г) смолы адсорбируют энзим (200 мл; 23, мкмоль/ /мл в 1 мин; 3,86 мкмоль/мг протеина в 1 мин) при рН 6,3 в течение 3 ч. Полученные комплексы отдел ют и промывают аналогично примеру 1. Активность продукта (21 г) равна 114,5 мкмоль/г в минуту (сухой вес), При сравнении этого продукта с продуктом полученным в цримере 2 при применении Амберлита JRC-50 с частицами, размеры диаметров которых 0,297-1,41 мм, установлено, что лучшие результаты достигаютс  при применении смолы с меньшими размерами частиц.. Этот эксперимент повтор ют ..с применением смолы Амберлит фармацевтического сорта, т. е. Амберлит ШР-64 с частицами диаметром 0,037-0,149 мм. Смола адсорбирует энзим (3920 мкмоль/г в 1 мин) при рН 6,3. Энзимный комплекс реагирует с алшегидом глутаровой кислоты (3,3 вес.%, по объему). Затем его обрабатывают аналогично примеру 1. Полученный комплекс энзим/смола имеет удельную активность, равную 478,4 мкмоль/г , в 1 мин при сухом весе. Пример 18. Устанавливают рН 5,5 смолы АмберпитЗНС-50 промывкой О,2М фосфатным буфером с такой величиной или при суспендировании ее в дистиллированной , вода с добавлением раствора гищзоокиси натри . Затем смолу дополнительно промывают дистиллированной водой по посто$шной проводимости воды. Сырую воду (1ОО г) добавл5пот к пеницилииновой ацилазе с активностью 5,25 мкмоль/мг протеина в 1 мин в 5ОО мл О,О2 М фосфатного буфера при рН 5,5 и перемешивают 2О -ч при комнатной температуре . Отделенное фильтрованием твердое вещество снова суспендируют в 50О мл 0,25%-ного (по весу на объем) расг-., вора альдегида глутаровой кислоты в фосфатном растворе и дополнительно перемешивают 20 ч при комнатной температуре. Полученный комплекс отдел ют фильтрованием и промьгеают О,2 М раствором фосфатного буфера при рН 7,8 до установлени  этой величины рН во всей массе смолы.. Полученный комплекс смола-энзим 15 г) используют дл  реакции с 200мл 6,25%-ного водного раствора бензилпеницшшина в 0,О2М растворе фосфатного буфера при рН 7,8 в течение 2 ч при 13 37°С. Установпено, что этот комплекс можно легко отдел ть дл  использовани  еще 25 раз, так как он механически и биологически прочен. Пример 19. В этом примере пок зана возможность применени  энзимного комплекса дл  произопдства 6-АПК в большом масштабе при многократном использовании в этих услови х. Комплекс приготовл ют из смолы Амберлит 3 ЕС-5О. Активность смолы 26,3 мкмоль/г в 1 минуту. В качестве исходного продукта используют 4О л 6,5%-.ного раствора бензилпениыидлина в 0,02 М фосфатном буфере. Комплекс удерживают в реакционном сосуде с помощью проволочной сетки. По окончании реакции раствор полученной 6-АПК профильтровывают , комплекс промьтают водой и используют дл  следующей реакции . Средн   эффективность конверсии до 6-АПК при 50 последовательных реак ци х в течение 6 ч равна 95%. При мер 2 О. В этом примере сра ниваетс  механическа  стабильность энзи ного комплекса, предусмотренного данным изобретением и приготовленного согласно примеру 1 из смолы Амберлит TRC-5O, и комплекса, приготовленного тем же способом, но из полимерного субстрата с нейтральной активностью, а именно из смолы ХАБ -7, т. е. поперечно-сшитого акрилатного эфира фирмы Ром энд Гаас США. Образцы каждого комплекса (1,6 г) суспендируют в 8л О,2 М фосфатного буфера при рН 7,8 и 37°С,и затем каждую суспензию перемешивают 72 ч при 2ОО об/мин в бродильном чане с перегородками . Пробы отбирают через каждые 4 ч и визуально наблюдают разрушение частиц смолы. Разрушений частиц XAD 7 значительно большеj чем частиц 3RC-60. Проба последней смолы, отобранна  через 64, ч показьгоает большую механическую прочность смопьтЗКС. -50. Пример21. Амберпит DRD 5О (235 г; 39,4 мкмоль/г в 1 мин) приготовл ют аналогично примеру 1 и используют дл  реакции с 6,25%-ным раствором натриевой сопи бензилпенициплина при 10 последовательных экспериментах. Каждый эксперимент провод т, примен   1 л раствора бензилпенициллина при реак ции в течение 2 ч ЗО мин при .37С и рН 7,8. По окончании каждой реакции смолу отфильтровьтают и промьгоают дистиллированной водой. Фильтрат и промыв170 ную воду концентрируют во вращающемс  BaKyyivf-испар тела. Концентрат смещивают с равным объемом метилизобутипкетона, охлаждают до и подкисл ют дп  осаждени  6-аминопенициплановой кислоты . Эту кислоту промьгеают небольшим количеством аистиллированной воды, ополаскивают .ацетоном и сушат. Средний выход 6-аминопенициплановой кислоты в 10 экспериментах равен 91,3%. Пример 22. Адсорбци  ацилазного энзима на полиэтилене, покрытом мочевиной. Частицы поггаэтипена низкой плотнооти (примерно 400 мкмоль покрьтают полимером уретана (Уретан 641W фирмы Трей Валли Продактс Лимитед) исушат в течение 10 дней. Этот продукт промь вают в течение 1 ч 2О%-ным по объему ВОЩ1ЫМ ацетоном, затем тщательно днотиплированной водой и аликвотные коли1чества (5 г) используют дп  адсорбции энзима (125 мл; 54,0 мкмоль/мл а 1 мин;. 3,8О мкмоль/мг протеина в 1 мин) g течение 5 ч при рН 4,8-9,0. Покрытые уретаном частицы отфильтроьтают , обрабатывают в течение 3 ч аствором альдегида глутаровой кислоты (75 мл;3,3 вес.%, по обьему) и довод т х рН до 7,8 аналогично примеру 1, Несмотр  на то, что покрытые уретаом частицы меньших размеров, чем чаойцыЗЙО-5О , достигщта  удегаьна  акивности в 2-3 piaaa меньше активности, олученной пра применении3R.C-5О. Результаты приведены в табл. 4. П p и M e p 23. Адсорбци  ацилааы на найлоне. Оргопак (порошкообразный найпон 6,, диаметр частиц 30 мкмогсь,фирма Ато Шимм Лимитеи (Вепикобритани ),промьгвают в течение 1 ч раствором муравьиной кислоты, а затем тшатепьно дистиллированной водой. Атшквотные кол чества продукта (Ю г) используют дл  адсорбировани  энзима (100 ищ 50,9 мкмоль/мл в 1 мин; 4,7 мкмоль/м протеина в 1 мин в течение 16 ч прирН 4,8-9,0. Порошкообразный найлон отфипьтровьгеают , обрабатьгвают ашздегидом гпутаровой кислоты (100 мп; 3,3%-ный раствор) в течение 3 Ч|Выдел ют и пром вают аналогично примеру 1. Достигают высшую активность, равную 41,7 мкмол в 1 мин при рН 4,8 и сопоставимую с обычно достигаемой-при применении IRCОднако с учетом разницы размеров частиц найлона и ORC -50 последн   смола дает лучшие результаты. Так, например IRP-64 (фармацевтический сорт 1RC 5О; размеры частиц О,О37-0,149 мм) ;можно сочетать с ацилазой ЯПЯ получени  препаратов с удельной активностью 478 мкмопь/г в 1 мин в сыром весе, т. е. более чем в одиннадцать раз превышающей активность найлоновых препаратов . Результаты приведены в табл. 5. Т.. а б л и ц а 5 Формула изобретени  1.Способ получени  6-аминопенЙциплановой кислоты путем обработки водного раствора бензилпенициппина или феноксиметиппенициллина или их соли при РН 6,О-9,0 нерастворимым в воде ферментным комплексом, состо щим из пенициллиновой ацилазы, адсорбированной на нераСтворицбм в воде полимерном субстрате , и поперечно-сшитой с помощью агенту ,, образующего поперечные св зи и выбранного из группы, включакщей альдегид глутаровой кислоты, гпиоксапь или формальдегид , отличающийс  тем,. что, с цепью упрощени  процесса и улучшени  качества продукта, в качестве попимерного субстрата . используют полимер или сополимер метакриловой кислоты.
2. 2.Способ по п. 1, о т л и ч а ю- щ и и с   тем, что используют пенициллиновую аципазу со степенью чистоты в пределах 15-ЗО мкмоль/мг протеина в минуту.
3. 3.Способ по ПП.1 и 2, отличающийс  тем, что используют субстрат Jимеющий макропористую форму.
4. 4.Способ по пп. 1, 2 или 3, о тличающийс  тем, что в качестве субстрата используют сополимер метакриловой кислоть и дивинилбензола.
5. 5.Способ по п, 4, о т л и ч а ющ и и с   тем, что указанный полимер и/га сополимер содержит бензоасульфонильные группы.
6. 6.Способ по пп. 1-5, отличающийс  тем, что ферментный комплекс примен ют в виде тонко измельченных частиц размерами 2,0-0,01 мм.
7. 7.Способ по пп. 1-6, отличающийс  тем, что процесс ведут при ЗО- 7,0-8,5 при непрерывном или периодическом добавлении гидроокиси нат -РИЯ . Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1. Выложенна  за вка ФРГ №2143062, кл. С 12 D 13/10, О2 03 02.03.72.