DE1917057C2

DE1917057C2 - Wasserunlösliche Enzympräparate für die Aufspaltung von Penicillinverbindungen und seine Verwendung zur Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure

Info

Publication number: DE1917057C2
Application number: DE1917057A
Authority: DE
Inventors: Thomas Ronald Goring-by-Sea Sussex Carrington; Lawson William Worthing Sussex Powell; Thomas Adrian Steyning Sussex Savidge
Original assignee: BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Current assignee: BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Priority date: 1968-04-05
Filing date: 1969-04-02
Publication date: 1983-09-08
Also published as: IL31925A0; SE359550B; RO57877A; IE33023B1; NL6904995A; CH549602A; IL31925A; BE730997A; DE1917057A1; ES365631A1; FR2005645A1; AT286498B; GB1193918A; IE33023L

Description

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Die Erfindung betrifft bestimmte wasserunlösliche Enzympräparate, die sich von die Amidbindung von Penicillinen spaltenden Desacylaseenzymen ableiten und nach ihrer praktischen Verwendung wieder aus der fieaktionsmischung zwecks erneuter Verwendung abtrennen lassen. Außerdem lassen sich die erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Enzympräparate sehr gut lagern und eigenen sich gut zum Transport des Enzyms.

Es ist bekannt, daß man 6-Aminopenicillansäure, die für die Synthese von neuen Penicillinverbindungen sehr wichtig ist. durch enzymatische Abspaltung der Seitenkette von natürlich vorkommenden Penicillinen gewinnen kann.

In der Praxis traten jedoch bei der Durchführung eines solchen Enzym-Spaltungsverfahrens beträchtliche Schwierigkeiten auf, vor allem, weil die freigesetzte Seitenkettensäure durch Zusatz von Alkali laufend neutralisiert werden muß, da das Enzym nur innerhalb eines engen pH-Bereiches wirksam ist. Hierfür kann jedoch im allgemeinen weder NH3 noch NaOH verwendet werden, da diese Alkalien das Enzym abbauen und dann proteinhaltige Verunreinigungen in die als Endprodukt zu isolierende 6-Aminopenicillansäure geraten, wodurch deren Qualität stark beeinträch- so tigt wird. Man hatte daher schon versucht, Natriumaluminat für die Neutralisation der freigesetzten Seitenkettensäure einzusetzen, wodurch aber andererseits die Gefahr einer Ausflockung des Enzyms besteht, das sich als Niederschlag an den Wänden des Reaktiunsgefäßes wiederfindet und damit unwirksam geworden ist.

Aus der GB-PS 10 62 596 ist es zwar bekannt, proteolytische Enzyme, wie Trypsin oder Ribonuclease. dadurch unlöslich zu machen, daß man sie über funktionell Gruppen des Enzymmoleküls, die für die Enzymaktivität nicht notwendig sind, an Cellulose bindet. Dadurch soll einer Selbstzersetzung der Enzyme entgegengewirkt und eine bessere Lagerstabilität erreicht werden. Das spezielle nur bei der enzymatischen Spaltung von Penicillinen auftretende technische Problem wird aber in dieser Vorveröffentlichung nicht angesprochen, so daß der Leser aus ihr auch keine Anregung zur Lösung dieses Problems entnehmen

konnte.

Überraschenderweise wurde nun festgestellt, daß man die Amidbindung von Penicilline spaltenden Desacylaseenzyme durch Binden an eine inerte polymere Substanz nicht nur unlöslich machen kann, wobei das Enzympräparat die volle Spaltaktivität behält, sondern daß das bis dahin benötigte Neutralisationsmittel bei der enzymatischen Abspaltung der Seitenkette von Penicillinen zur Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure entfallen kann.

Die Erfindung betrifft daher ein wasserunlösliches Enzympräparat für die Aufspaltung von Penicillinverbindungen unter Bildung von 6-Aminopenicillansäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es ans einem die Amidbindung von Penicillin spaltenden Desacylaseenzym besteht, welches durch Umsetzen mit einer wasserunlöslichen inerten polymeren Substanz an diese gebunden worden ist

Überraschenderweise läßt sich das erfindungsgemäße wasserunlösliche Enzympräparat wiederholt zur Spaltung von Penicillinen einsetzen, wodurch seine Spaltaktivität sehr wirksam ausgenützt wird, ohne daß jedoch Abbauprodukte in die als Endprodukte gewünschte 6-Aminopenicillansäure eingeschleppt werden. Auch sind in der mit dem erfindungsmäßen Enzympräparat hergestellten 6-Aminopenicillansäure keine Enzymspuren mehr nachweisbar, da durch das Umsetzen des Enzyms mit der Trägersubstanz verhindert wird, daß das Enzym durch Elution desorbiert wird.

Ein weiterer wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß bei der Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure durch Spaltung von Penicillinen kein Neutralisationsmittel mehr zugesetzt werden muß. da das an die Trägersubstanz fest gebundene Enzym nicht mehr für die Hydrolyse und/oder Zersetzung durch die freigesetzte Seitenkette anfällig ist.

Vorzugsweise wird das Desacylaseenzym aus Bakterien gewonnen, beispielsweise aus Stämmen von Escherichia coli, insbesondere wenn das Enzympräparat anschließend zum Aufspalten von Benzylpenicillin zwecks Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure verwendet werden soll. Falls für den gleichen Zweck Phenoxymethylpenicillin eingesetzt wird, so stammt das Desacylaseenzym zweckmäßig von Pilzen und Actinohiyceten.

Als wasserunlösliches inertes polymeres Material eignet sich insbesondere Bromacetylcellulose und Azido-Carboxymethylcellulose. Derartige wasserunlösliche Substanzen lassen sich beispielsweise nach den in den britischen Patentschriften Nr. 9 16 931 und 10 62 596 beschriebenen Arbeitsweisen erhalten. Das betreffende Enzym kann beispielsweise in Anwesenheit einer zur Amidbildung befähigten Verbindung, insbesondere in Anwesenheit eines Carbodiimids. mit Bromacetylcellulose oder einer Ionenaustauschsubstanz auf der Basis von dreidimensional vernetztem Dextran umgesetzt werden. Als wasserunlösliche inerte polymere Substanz eigenen sich im Rahmen der Erfindung außerdem aktivierte lonenaustauschharze, beispielsweise das Säurechlorid eines Acrylsäureharzes, sowie mit Hydrazin vernetzte Harze aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid und Carboxymethylcellulose. Bei den erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Enzympräparaten ist es möglich, diese in der wasserunlöslichen Form einzusetzen, wobei jedoch die Aktivität des zugrunde Hegenden Enzyms erhalten bleibt. Auf diese Weise lassen sich kontinuierliche Verfahren in FüllkörDersäu-

len und ähnlichen Vorrichtungen durchführen.

Die Erfindung bezieht sich außerdem auf die Verwendung der neuen wasserunlöslichen Enzympräparate zur Aufspaltung von Benzylpenicillin oder Phenoxymethylpenicillin, weiche in der freien Säureform oder als Salz vorliegen, unter Bildung von 6-Aminopenicillansäure. Die bei der enzymatischen Spaltung gebildete 6-Aminopenicillansäure wird dann aus der Reaktionslösung, welche von dem festen Enzympräparat abgetrennt worden ist, isoliert

Falls ein von E. coil erzeugtes Desacylaseenzym eingesetzt werden soll, so kann das wasserunlösliche Enzympräparat erhalten werden, indem man zunächst das freie Enzym isoliert und reinigt und es anschließend mit dem wasserunlöslichen, inerten polymeren Material umsetzt

Das freie Enzym kann dabei isoliert werden, indem man die Zellen von E. coli aus dem Fermentationsmedium abtrennt, dann diese Zellen mittels wäßrigem Formaldehyd abtötet und schließiich die toten Zellen abfiltriert oder abz^ntrifugiert Die Zellen werden dann zerrissen und das freigesetzte Enzym wird aus den Zeilröckständen durch Zentrifugieren abgetrennt, sowie durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat und anschließende Chromatographie gereinigt Durch eine Elektrophorese kann nachgewiesen werden, daß das so erhaltene Enzym ganz rein ist und eine hohe spezifische Aktivität in bezug auf die Spaltung von Benzylpenicillin aufweist

In den nachstehenden Ausführungsbeispielen entspricht der numerische Wert für die Amidaseeeinheit derjenigen Menge an 6-Aminopenicillansäure, ausgedrückt in μg/ml, weiche unter den Versuchsbedingungen erzeugt wird. Die enz/matische Behandlung wird dabei 1 '/2 Stunden lang bei einem pi Ϊ-Wert .on 7,9 und einer Temperatur von 37°C an einer 2,3%igen Benzylpenicillinlösung durchgeführt

Beispiel 1

Ein aus E coli gewonnenes Enzym wird in wäßriger Lösung 30 Stunden lang bei einem pH-Wert von 5,8 und bei Zimmertemperatur mit Bromacetylcellulose gerührt. Man erhält so Enzympräparate mit Aktivitäten von 30 000 bis 250 000 Desacylaseeinheiten/g. Man lagert diese Präparate 12 Stunden lang bei einer Temperatur von 4° C und einem pH-Wert von 8,9, wodurch man Präparate mit Aktivitäten von 13 000 bis 100 000 Desacylaseeinheiten/g erhält. Durch eine 24 Stunden dauernde Behandlung bei 4°C mit wäßriger, 0,05 molarer Äthanolaminlösung werden die Enzympräparate von nicht umgesetztem Brom befreit, anschließend werden sie zweimal mit 0,15 molarer wäßriger Natriumchloridlösung und dann mit V/asser gewaschen.

Mittels eines auf diese Weise hergestellten Enzympräparate mit einer Aktivität von 40 000 Einheiten/g trockene Bromacetylceüulose werden vier aufeinanderfolgende enzymatische Behandlungen mit 2%igem wäßrigen Benzylpenicillin unter Standardbedingungen durchgeführt. Jede enzymatische Behandlung verläuft befriedigend und das bei der letzten Behandlung abgetrennte Enzympräparat zeigt noch eine befriedigende Aktivität für die Wiederverwendung. Auf diese Weise läßt sich 6-Aminopenicillansäure mit einem Reinheitsgrad von über 98% aus den Reaktionsgemischungen gewinnen.

Beispiel 2

30 g einer in bekannter Weise hergestellten Azido-Carboxymethylcellulose werden in 3000 ml einer 0,05 molaren Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 8,7 eingerührt und dann setzt man 5XlO⁶ Einheiten eines reinen aus E. coli gewonnenen Atüdaseenzyms hinzu. Diese Mischung wird 24 Stunden lang bei einer Temperatur von 4° C gerührt Dann wird das aktive Enzympräparat abzentrifugiert und nacheinander mit 1 molarer Natriumchloridlösung, 0,5 molarer Natriumbicarbonatlösung, 1 molarer Natriumchloridlösung und schließlich mit Wasser gewaschen. Durch Abzentrifugieren und schließlich mit Wasser gewaschen. DvTch Abzentrifugieren erhält man, ein Enzympräparat mit einer Aktivität von 100 COO Einheiten/g trockene Azido-Carboxymethylcellulose.

Ein auf entsprechende Weise hergestelltes, wasserunlösliches Enzympräparat mit einer Aktivität von 34 3Ö0 Einheiten/g trockene Azide Carboxymethylcellulose wird für zwei aufeinanderfolgende enzymatische Behandlungen von 400 ml einer 2%igen Benzylpenicillinlösung bei einem pH-Wert von 7,8 und einer Temperatur von 37° C verwendet Nach der ersten enzymatischen Behandlung wird das aktive Enzympräparat abgetrennt und dann für die zweite enzymatische Behandlung eingesetzt Es werden vergleichbare enzymatische Behandlung eingesetzt Es werden vergleich-

bare enzymatische Wirksamkeiten bei beiden Versuchen beobachtet (67 bzw. 70%).

Beispie! 3

200 mg eines Äthylen-Maleinsäureanhydrid-Polyrrerharzes werden in 25 ml eines Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,6 bei 5° C eingerührt Dann setzt man 2 ml einer l%igen Hydrazinhydratlösung als Vernetzungsmittel hinzu und nach 1 bis 2 Minuten setzt man 10 mg eines reinen aus E. coli gewonnenen Amidaseen-

zyms mit einer Aktivität von 5,7 χ 10⁷ Einheiten/g hinzu, welches in einer kleinen Menge Phosphatpuffer gelöst ist Diese Mischung wird 2 Stunden lang in einem Eisbad gerührt und dann über Nacht auf einer Temperatur von 5° C gehalten. Man trennt das so gewonnene aktive

Enzympräparat ab und wäscht es gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 2. Man erhält so ein Endprodukt mit einer Aktivität von 360 000 Einheiten/g trockenes Harz. In der gleichen Weise werden in anderen Versuchen Enzympräparate mit Aktivitäten im Bereich von

100 000 bis 600 000 Einheiten/g trockenes Harz hergestellt.

Beispiel 4

Ein Ionenaustauscher auf der Basis von Acrylsäureharz wird unter Rückflußbedingungen mit Thionylchlorid und Dimethylformamid in Chloroform behandelt, wodurch das Austauscherharz, welches in der Säureform vorliegt, in die entsprechende Säurechloridform umgewandelt wird. Der Chlorgehalt wird anschließend zu 14% bestimmt. Zu 30 ml eines Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,6, welcher 250 000 Einheiten reines aus E. coli gewonnenes Amidaseenzym enthält, wird 1 g dieses lonenaastauscherharzes in der Säurechloridform hinzugesetzt und die Reaktionsmischung wird 5 Stunden lang bei 5°C gerührt. Anschließend Kennt man das aktive Enzympräparat ab und wäscht es Kemäß der Arbeitsweise von Beispiel 2. Das Endprodukt hat eine Aktivität von 119 000 Einheiten/g trockenes Ionenaustauscherharz.

Beispiel 5

Ein Styrolaustauscherharz wird durch Erhitzen mit Phosphoroxychlorid unter Rückflußbedingungen in die

Sulfonylchloridform umgewandelt Der Chlorgehalt wird anschließend zu 12£% bestimmt Zu 3OmI Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8,5, welcher 270 000 Einheiten eines reinen aus E. coli gewonnenen Amidaseenzyms enthält wird 1 g des Austauscherhar- *" zes in der Sulfonylchloridform hinzugesetzt und diese Reaktionsmischung wird 5 Stunden lang bei 5° C gerührt Anschließend wird das aktive Enzympräparat gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 2 abgetrennt und gewaschen. Das Endprodukt hat eine Aktivität von 4800 "' Einheiten/g trockenes Ionenaustauscherharz in der Sulfonylchloridform.

Beispiel 6

Carboxymethylcellulose wird durch Reaktion mit Thionylchlorid und Dimethylformamid in Pyridin in die Säurechloridform überführt Der Chlorgehalt wird anschließend zu 9,9% bestimmt Zu 30 ml Phosphatpuffer mn einem pH-Wert von 8,5, welche 270 000 Einheiten eines reinen aus E. coli gewonnenen Amidaseen- ²" zyms enthalten, werden 1,0 g der Carboxymethylcellulose in der Säurechloridform hinzugesetzt und diese Reaktionsmischung wird 2'/? Stunden bei 5° C gerührt Anschließend wird das aktive Enzympräparat gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 2 isoliert und gewaschen. Das Endprodukt hat eine Aktivität von 11 900 Einheiten/g trockene Carboxymethylcellulose in der Säurechioridform.

Beispiel 7

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2-Amino-4,6-dichlor-13^-triazin wird in bekannter Weise hergestellt und an Diäthylaminoäthylcellulose gebunden. 125 g dieses Präparats werden in 150On-! 0,05 m Boratpuffer, pH 8.75,der UxIO⁸ Einheiten einer teilweise gereinigten Penicillinamidase enthält, suspendiert Die Aufschlämmung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH-Wert durch Zugabe von verdünnter Natronlauge gehalten wird Das unlösliche Amidasepräparat wird abfiltriert und zweimal mit 0,02 m Phosphatpuffer. pH 7.8. der 1 m NatriumchJorid enthält und zweimal mit Puffer allein gewaschen. Das Endprodukt (125 g) wird in Puffer bei 4° C gelagert. Die Aktivität des unlöslichen Enzyms beträgt 2,6 χ IO⁶ Einheiten je Gramm trockenes Enzym.

In zwölf aufeinanderfolgenden Versuchen bei pH 7,8 und einer Temperatur von 37° C werden mit 85,2 g des feuchten Enzyms (Gesamtaktivitä? 59,Ox 10⁶ Einheiten) in einem Liter einer 7gewichtsprozentigen Lösung von Kaliumbenzylpenicillin die Phenacetylgruppen abgespalten. Die durchschnittliche Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure beträgt 90 Prozf n:.

Beispiel 8

50 ml einer unter 5°C abgekühltem 2 m Salzsäure werden mit 1 g eines hydrophilen Copolymerisate auf ⁵' Acrylamid-Basis, in dem die funktioneile Kupplungsstelle ein Säurehydrazid ist. versetzt. Unter Rühren werden langsam 40 ml einer unter 5°C abgekühlten 2prozentigen Natriumnitritlösung hinzugegeben. Es wird weitere 15 Minuten gerührt, dann wird der Feststoff abfiltriert ^h0 und viermal mit 0,05 m Phosphatpuffer, der 2 χ 10* Einheiten einer teilweise gereinigten Penicillinamidase enthält, gewaschen und 24 Stunden gerührt. Nach dem Abfiltrieren wird der Feststoff mit 20 ml 0,01 Prozent Phenol in 10 Prozent Natriumacetat 15 Minuten gerührt. ¹^ Das unlösliche Enzym wird dann mit 0,05 m Phosphatpuffer, pH 7,5, der 0,3 m Natriumchlorid enthält, und mit Puffer ohne Salz gewasrhen. Man erhält 5,81 g feuchtes Enzym mit einer Aktivität von 4,8 χ ι O⁵ Einheiten je Gramm.

Beispiel 9

Beispiel 8 wird mit einem hydrophilen Copolymerisat auf Acrylamid-Basis, in dem die funktioneile Kupplungsstelle eine aromatische Aminosäure ist wiederholt Man erhält 3,04 g Produkt mit einer Aktivität v/jin 1,6 χ 10⁴ Einheiten je Gramm.

Beispiel 10

4 ml einer teilweise gereinigten Amidaselösung werden mit 1 g (trocken gewogen) Carboxymethylcellulose und unter Rühren mit einer Lösung von 400 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 1 ml Tetrahydrofuran und 2 ml Wasser versetzt Das Gemisch wird weitere 4 Tage bei 4° C gerührt Das unlösliche Enzym wird dann abfiltriert und dreimal 5 Stunden lang mit Wasser gewaschen. Man erhält 636 mg eines Produkts, das eine Aktivität von 2,8 χ 10* Einheiten je Gramm trockenes Enzym iiat

Beispie! 15

Beispiel 10 wird mit Aminoäthylcellulose wiederholt Man erhält 410 mg eines Produkts, das eine Aktivität von 1,2 χ 10* Einheiten je Gramm trockenes Enzym hat

Beispiel 12

Polystyrolperlen (Molekulargewicht etwa 100 000) werden in einer Kolloidmühle gemahlen, in Polynitropolystyrol und schließlich in Polyamiiiopolystyrol in bekannter Weise übergeführt

20 g dieses Produkts werden in 1 Liter einer auf 0 bis 5° C gekühlten 2 η Salzsäure suspendiert. Durch tropfenweise Zugabe unter Rühren von 15OmI einer vorgekühlten 14prozentiger. Natriumnitratlösung erhält man das Diazoderivat Nach 20 Minute ι wird die überschüssige salpetrige Säure durch Zugabe von 200 ml 6prozentigem vorgekühltem Harnstoff zerstört Das Gemisch wird eine weitere Stunde gerührt dann auf - 10⁰C abgekühlt Der pH-Wert wird durch Zugabe von 1 η Natronlauge unter starkem Rühren auf 4,0 eingestellt 120 ml einer teilweise gereinigten Amidaselösung in 1 Prozent Natriumchlorid werden zugegeben. Der pH-Wert wird durch Zugabe von Njtriumacetai schnell auf 6,0 eingestellt. Das Gemisch wird über Nacht bei O⁰C gerührt. Nach Einstellen des pH-Wertes auf 8,0 mit verdünnter Natriumcarbonatlösung wird das Gemisch weitere 24 Stunden bei 0⁰C gerührt Das Produkt wird dann abfiltriert, mit 0,9 Prozent Natriumchlorid gewaschen und in 0,05 m Phosphatpuffer, pH 7,6, gelagert. Man erhält 20 g unlösliches Enzym mit einer Aktivität von 4,2 χ 10* Einheiten je Gramm.

Beispiel 13

Durch Lösen von 45 g Acrylamid, 3 g N,N'-Me;hylenbis-acrylamid und 15 g Maleinsäure in 35OmI 0,05 m Phosphatpuffer, pH 7,6, und Vermischen unter Stickstoff mit 15 ml einer 5prozentigen Ammoniumperoxiddisulfatlösung erhält man ein Polymerisat mit Carboxy-Ianhydridgruppen. Das Reaktionsgemisch wird kurz auf 80⁸C erhitzt. Nach 15 Stunden wird das gelartige Polymerisat durch ein Sieb mit einer M?,schenweite von 0,5 mm gedrückt und nach vorsichtigem Waschen mit Wasser gefriergetrocknet Anschließend wird das Polymerisat 2 Stunden lang bei 180⁰C unter vermindertem Druck erhitzt.

15 mg gereinigte Penicillinacylase aus Escherichia coli

mit einer spezifischen Aktivität von 1,5 χ ΙΟ⁵ Deacylaseeinheiten/mg werden in 20 ml Wasser gelöst und bei pH 5,8 und einer Temperatur von 4°C mit 1,5 g Polymerisat unter Rühren versetzt. Der pH-Wert des Gemisches wird durch Zugabe von verdünnter Natronlauge auf 5.8 gehalten. Nach 24 Stunden wird das unlösliche Enzym abfiltriert und nacheinander mit 100 ml Wasser. 300 ml 0,5 m Natriumchloridlösung und schließlich mit 100 ml Wasser gewaschen. Man erhält 30 g des feuchten, an das Polymerisat gebundenen Eniyms mit einer spezifischen Aktivität von 5,0x IO⁵ Einheiten/Gramm.

Eine öprozentige wäßrige Lösung des Kaliumsalzes von Benzylpenicillin wird unter Standardbedingungen zehnmal hintereinander mit dem Enzympräparat behandelt. Nach der letzten enzymatischen Behandlung zeigt das Enzympräparat immer noch genügend Aktivität, um weiter verwendet werden zu können.

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In einem Erlenmeyer-Kolben, der mit einem Magnetrührer ausgerüstet ist, werden bei Raumtemperatur 20 ml 0.05 m Phosphatpuffer, pH 43,1 g eines perlenähnlichen Copolymerisats aus 19 Prozent Acrylsäure und 81 Prozent Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 20 ml einer -⁵ wäßrigen Lösung von Penicillinacylase aus E. coli mit einer Aktivität von 2,95 χ 10⁵ Einheiten/ml und 50 mg Isobutyraldehyd als 5prozentige wäßrige Lösung 1 Stunde lang gerührt. Dann wird das Gemisch mit 0,5 ml einer frisch hergestellten 20prozentigen Lösung von 3-Morpholinopropylisonitril in Wasser versetzt. Das Gemisch wird 22 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird das Harz abgesaugt und mit 0,05 m Phosphatpuffer, pH 7,5, der I Mol Natriumchlorid je Liter enthält, und mit Phosphatpuffer ohne Salz gewaschen. Der Rückstand und die Waschwässer enthalten 8,2 χ 10⁵ Einheiten (14 Prozent), das gewaschene an das Harz gebundene Enzym enthält 3,5 χ 10" Einheiten, das sind 59 Prozent der ursprünglichen Penicillinacylase-Aktivität.

Beispiel 15

In einen 250 ml fassenden Kolben werden I g eines Copolymerisaiis aus 15 Prozent Glycidylmethacrylat und 85 Prozent Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 100 ml einer Penicillinacylaselösung in 0,025 m Phosphatpuffer, pH 8,0, mit einer Enzymaktivität von 5,5 χ ΙΟ⁶ Einheiten und 1 ml Toluol als Bakteriostat eingefüllt. Der Kolben wird verschlossen und 3 Tage lang bei 34°C langsam geschüttelt. Das Harz wird dann abfiltriert und nacheinander mit 0.5 m Natriumchloridlösung und 0,05 m Phosphatpuffer, pH 7.5, gewaschen. Das gewaschene an das Harz gebundene Enzym hat eine Aktivität von 1.45 χ IO⁵ Einheiten, das sind 26 Prozent der ursprünglichen Enzymaktivität.

Claims

Patentansprüche:

1. Wasserunlösliches Enzympräparat für die Aufspaltung von Penicillinverbindungen unter BiI- s dung von 6-Aminopenicillansäure, dadurch gekennzeichnet, da B es aus einem die Amidbildung von Penicillin spaltenden Desacylaseenzym besteht, welches durch Umsetzen mit einer wasserunlöslichen inerten polymeren Substanz an diese gebunden worden ist.

2. Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wasserunlösliche, polymere Substanz Bromacetylcellulose, Azido-Carboxymethylcellulose, ein mit Hydrazin vernetztes Harz aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid oder Carboxymethylcellulose ist

3. Verwendung eines Enzympräparates nach Anspruch 1 und 2 zur Aufspaltung von Benzylpenicillin oder Phenoxymethylpenicillin, weiche in der freien Säureform oder als Salz vorliegen, unter Bildung von 6-Aminopenicillansäure.