DE2632212C3

DE2632212C3 - Verfahren zur Gewinnung von Urokinase

Info

Publication number: DE2632212C3
Application number: DE2632212A
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Sumiyama; Masaharu Urakawa
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Showa Denko Materials Co ltd
Priority date: 1975-07-16
Filing date: 1976-07-16
Publication date: 1978-06-08
Also published as: US4048014A; FR2318171A1; JPS5737316B2; FR2318171B1; JPS5210486A; DE2632212B2; DE2632212A1; GB1508922A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Urokinase, die als Mittel gegen Thromboembolie oder als Hilfsmittel für ein karzinostatisches Agens zunehmende Beachtung erlangt hat.

Urokinase ist im menschlichen Urin in äußerst niedriger Konzentration vorhanden. Der durch Frauen in 24 Stunden ausgeschiedene Urin soll 5770 ± 1420 Einheiten und der durch Männer ausgeschiedene Urin in 24 Stunden soll 6800 ± 1520 Einheiten enthalten. Man hat deshalb verschiedene Methoden zur Gewinnung von Urokinase aus Humanurin entwickelt, wobei Schwermetalle, Kieselgel oder andere Arten von lonenaustauscherharzen angewandt werden.

Aus Arkiv for Kemi, Band 21, S. 535 bis 546 ist es bekannt. Urin bei einem pH von 6,1 ± 0,4 mit einer Diatomeenerde zu kontaktieren, worauf man dann das Adsorbat mit destilliertem Wasser wäscht und das Enzym eluier;. Nach diesem Verfahren konnten 6000 internationale Einheiten (nachfolgend abgekürzt IU) Urokinase aus 1 I Ausgangsurin gewonnen werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, bei einem Verfahren zur Gewinnung von Urokinase, wobei diese an Diatomeenerde absorbiert wird, bessere Ausbeuten und eine erhöhte spezifische Aktivität der Urokinase zu erhalten.

Dies wird erfindungsgemäß dadurch erzielt, daß man eine teilweise gereinigte Urokinase enthaltene Lösung mit Diatomeenerdc bei einem pH-Wert von 4,0 bis 8,0 kontaktiert und daß man das Adsorbat vor der Elution der Urokinase mit einer Pufferlösung eines pH-Wertes von 6,5 bis 9,0 wäscht.

Gemäß der Erfindung bezeichnet die Angabe »teilweise gereinigte Urokinase enthaltende Lösung« die folgenden Lösungen: beispielsweise eine Urokinase enthaltende Lösung, die durch Einstellung des pH-Wertes des menschlichen Urins auf oberhalb 7,5 mit basischen Lösungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak etc., und anschließendes Zentrifugieren zur Entfernung der hierdurch erzeugten Niederschläge erhalten worde·! ist; eine Urokinase enthaltende Lösung, die durch Behandlung menschlichen Urins nach dem Verfahren der Erfindung erhalten worden ist; und Urokinase enthaltende Lösungen, die durch Reinigung des menschlichen Urins nach anderen bekannten Verfahren erhalten worden sind. Wenn menschlicher Urin auf einen pH-Wert oberhalb 7,5 mit einer basischen Lösung eingestellt wird, werden Proteinniederschlage hervorgerufen, die aus der Lösung wirksam entfernt werden können. Es ist unvorteilhaft, den pH-Wert der Urokinase enthaltenden Lösung auf oberhalb 9,0 zu bringen, da bei einem pH-Wert oberhalb 9,0 die Wirkung bzw. Effizienz der Entfernung der Niederschläge der Proteine nicht erhöht wird und die Urokinase deaktiviert werden könnte. Eine teilweise gereinigte Urokinase enthaltende Lösung wird auf einen pH-Wert von 4,0 bis 8,0 eingestellt und sodann mit Diatomeenerde in Berührung gebracht. Der Kontaktierungsvorgang kann entweder durch Vermischung der Lösung mit Diatomeenerde unter Rührung (ansatzweises Verfahren) oder dadurch durchgeführt werden, daß man die Lösung durch eine mit Diatomeenerde gefüllte Säule (Säulenmethodik) fließen läßt. Im Falle des ansatzweisen Verfahrens kann die Einstellung des pH-Wertes entweder vor oder nach dem Kontaktierungsvorgang durchgeführt werden. Im Falle der Säulenmethodik sollte der pH-Wert notwendigerweise vordem Kontaktierungsvorgang eingestellt werden. Bei pH-Werten unter 4,0 werden Niederschläge erzeugt und es ist schwierig, Urokinase zu adsorbieren, während bei pH-Werten oberhalb 8,0 Urokinase leicht deaktiviert wird. Daher ist die Durchführung bei pH-Werten unter 4,0 oder oberhalb 8,0 aus diesen Gründen unvorteilhaft. Urokinase exzellenter spezifischer Aktiviläl kann in hoher Ausbeute durch Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf 5,0 bis 7,0 erhalten werden. Insbesondere werden bei pH-Werten von 6,0 bis 6,5 die besten Ergebnisse erhalten.

Die Einstellung des pH-Wertes wird mit derartigen Protonensäuren, wie Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure, Oxalsäure etc und Pufferlösungen, wie Phosphatpufferlösung durchgeführt.

Es können Diatomeenerden verschiedener Körnungen verwendet werden. Solche Diatomeenerden sind im Handel erhältlich.

Die Kontaktierungszeit der Lösung mit Diatomeenerde ist nicht begrenzt, beträgt jedoch vorzugsweise mehr als 10 Minuten, insbesondere mehr als 20 Minuten.

Sodann wird die Diatomeenerde, die Urokinase adsorbiert, mit Pufferlösungen, wie beispielsweise Phosphalpufferlösung bei pH 6,5 bis 9,0 gewaschen. Wenn der pH-Wert außerhalb des Bereiches von 6,5 bis 9,0 liegt, kann Urokinase nicht in derartiger Ausbeute und Reinheit erhalten werden, wie es nachstehend beschrieben ist. Vorzugsweise liegt der pH-Wert in einem Bereich von 7,5 und 8,5 und die lonensi.ärke im Bereich von 0,1 und 1,5 (beispielsweise 0,1 oder 0,2 m Phosphatpufferlösung bei pH 7,5). Die Menge an Waschlösung kann vorzugsweise, im Fall des Waschens einer Säule, das 1Ofache Volumen der Diatomeenerde in der Säule betragen. Von Urokinase verschiedene Proteine werden durch diese Waschprozedur im großen Umfang entfernt.

Nach dem Waschen des Adsorbates wird die durch die Diatomeenerde adsorbierte Urokinase eluiert. Die Elution wird mit alkalischen Lösungen, wie wäßrigem Ammoniak oder einer wäßrigen Lösung von Natriumcarbonat durchgeführt. Es ist besonders bevorzugt, wäßrigen Ammoniak in einer Konzentration von mehr als 4% zu verwenden, um Urokinase in hoher Gesamtausbeute zu erhalten.

Die hierdurch erhaltene Urokinase enthaltende Lösung wird mit einer Säure neutralisiert, und auf herkömmliche Weise, wie durch Aussalzen mit mehr als 50% gesättigter, insbesondere 55 bis 65% gesättigter Ammoniumsulfatlösung, Gefriertrocknung, Ultrafiltration, isoelektrische Ausfällung und Ausfällungsmethodiken mit Alkohol konzentriert.

Nach der vorstehend beschriebenen Prozedur kann Urokinase mit 6000 bis 7000 !U/mg spezifischer Aktivität aus menschlichem Urin gewonnen werden, wobei die Ausbeute 7500 lU/l Ausgangsurin beträgt. Die spezifische Aktivität und die Gewinnung bzw. Ausbeute des erfindungsgemäßen Verfahrens sind sehr

Wenn die hierdurch konzentrierte Lösung weiter den erfindungsgemäßen Verfahren (Adsorption mit Diatomeenerde etc.) wiederholt unterworfen wird, können noch effektivere Ergebnisse erzielt werden.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele, die keine Einschränkung darstellen, veranschaulicht.

Beispiel 1

1001 Urin wurden auf pH 8,5 mit einer 4O°/oigen wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid eingestellt. Nach Entfernung der hierdurch erzeugten Niederschläge wurde die erhaltene Lösung auf pH 6,0 mit 9 η-Schwefelsäure eingestellt. Zu dieser Lösung wurde 1 kg Diatomeenerde hinzugefügt und die Lösung hiermit unter Rührung während 30 Minuten in Kontakt gehalten. Hiernach wurde die Diatomeenerde die Urokinase adsorbiert, in eine Säule gefüllt. Sodann wurde das Adsorbat ausreichend mit einer 0,1 m Phosphatpufferlösung (etwa 401) eines pH-Wertes von 8,0 gewaschen und mit 4%igem wäßrigen Ammoniak eluiert. Das Eluat wird auf pH 7,0 mit 9 n-Schwefelsäure neutralisiert. Nach Entfernung der erzeugten Niederschläge mit einer Zentrifuge, war die erhaltene Lösung bei Zugabe von Ammoniumsulfat 60% gesättigt. Nach Stehen über Nacht bei 4° C wurde die ausgesalzene Substanz gesammelt und in 50 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde erneut einer Zentrifugation zur Entfernung der unlöslichen Substanzen unterworfen und das hierdurch erhaltene Filtrat wurde bei 4° C über Nacht dialysiert und unter Erhalt von Urokinase lyophilisiert. Gesamtausbeute 7,5 χ 10⁵ IU. Spezifische Aktivität 6700 IU/mg.

Beispiel 2 ·

1001 Urin wurden auf pH 8,5 mit einer 40%igen wäßrigen Natriumhydroxidlösung eingestellt. Nach Entfernung der erzeugten Niederschläge wurde die Lösung mit 9 η-Schwefelsäure auf pH 6,0 eingestellt. Nach Zufügung von 1 kg Diatomeenerde und Rühren während 30 Minuten wurde die Diatomeenerde gesammelt und in eine Säule eingefüllt. Nach Waschen des Adsorbates mit einer 0,1-m Phosphatpufferlösung (etwa 40 I) eines pH-Wertes von 7,5 wurde die Elution mit einer 4%igen wäßrigen Ammoniaklösung durchgeführt. Nach Neutralisierung des Eluates mit 9 η-Schwefelsäure wurden die erzeugten unlöslichen Niederschläge unter Verwendung einer Zentrifuge entfernt Das Ammoniumsulfat wurde zu dieser Lösung zugegeben, um diese zu 60% zu sättigen. Nach Stehen über Nacht bei 4° C wurden die ausgesalzenen Substanzen gesammelt und in 50 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Diese Lösung wurde erneut einer Zentrifugierung zur Entfernung der unlöslichen Niederschläge unterworfen. Nach Dialysierung des Ritrates bei 4° C über Nacht wurde die dialysierte Lösung unter Erhalt von Urokinase einer spezifischen Aktivität von 6900 IU/mg in einer Ausbeute von 8,0x 10⁵ IU gefriergetrocknet.

Beispiel 3

Das im Beispiel 2 durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat erhaltene Konzentrat wurde durch eine mit 270 ml Celite 545 gefüllte Säule fließen gelassen. Nachdem das Adsorbat ausreichend mit einer 0,1-m Phosphatpufferlösung eines pH-Wertes von 7,5 (etwa 3 1) gewaschen worden war. wurde die Urokinase mit 4%igem wäßrigen Ammoniak eluiert. Nach Neutralisierung des Eluates wurden die unlöslichen Substanzen unter Verwendung einer Zentrifuge entfernt. Die hierdurch erhaltene Lösung wurde über Nacht dialysiert und unter Erhalt von Urokinase einer spezifischen Aktivität von 26 000 IU/mg in einer Gesamtausbeute von 7,3XlO⁵ IU gefriergetrocknet.

Vergleichsbeispiel 1

Nach dem Verfahren des Beispiels 1 wurde das Waschen anstelle mit der Pufferlösung mit entionisiertem Wasser eines pH-Wertes von 5,0 durchgeführt und es wurde Urokinase einer spezifischen Aktivität von 1500 IU/mg in einer Gesamtausbeute von 800000 IU erhalten.

Vergleichsbeispiel 2

Nach dem Verfahren des Beispiels 1, jedoch durch Waschen der Diatomeenerde mit einer Kochsalzlösung eines pH-Wertes von 5,0 anstelle der Pufferlösung, wurde Urokinase einer spezifischen Aktivität von 2000 IU/mg in einer Gesamtausbeute von 790 000 IU erhalten.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Gewinnung von Urokinase, wobei diese an Diatomeenerde adsorbiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß man eine teilweise gereinigte Urokinase enthaltende Lösung mit dieser bei einem pH-Wert von 4,0 bis 8,0 kontaktiert und daß man das Adsorbat vor der Elution der Urokinase mit einer Pufferlösung eines pH-Wertes von 6,5 bis 9,0 wäscht.