DE2424118B2 - Verfahren zur herstellung von hochreinem kallikrein - Google Patents

Description

Präparaten zu entfernen.

Die herkömmlichen Verfahren weisen außer den vorgenannten Nachteilen noch weitere Schwierigkei-

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel- 25 ten auf. So hat das Verfahren der JA-PS 1 30 506, lung von hochreinem Kallikrein. bei dem das Kallikrein mit einem wasserlöslichen

Kallikrein, ein Protein mit teleangiektatischer Wir- organischen Lösungsmittel gefällt wird, das Ziel, kung, wird aus dem Pankreas der Submaxillarisdrüse, Proteine von Lipiden zu trennen. Dieses Verfahren dem Urin oder Blut von Säugetieren gewonnen. Es ist jedoch nicht in der Lage, die wirksamen Proteinwird zur Behandlung von Kreislaufstörungen verwen- 30 bestandteile von Fremdproteinen zu trennen. Demdet. Im allgemeinen wird es dabei injiziert oder oral gemäß spielt dieses Verfahren lediglich eine Rolle verabreicht. bei der Vorbehandlung. Dabei besteht jedoch die

Bei Arzneipräparaten, die direkt durch Injektion Gefahr der Denaturierung von Proteinen durch das verabfolgt werden, kommt es stark auf die Reinheit organische Lösungsmittel, wodurch die pharmakoloan. Deshalb sollen diese Präparate keine Beimischun- 35 gische Aktivität von Kallikrein verringert wird,
gen von Verunreinigungen enthalten. Die JA-PS 4 04 256 beschreibt ein Verfahren zur

Da Kallikrein jedoch aus Tierorganen gewonnen Reinigung von Kallikrein unter Verwendung von wird, ist es schwierig, das aktive Protein von anderen Cellulose mit basischen Substituenten. Jedoch lassen unerwünschten Proteinen, die dem Kallikrein in ver- sich bei diesem Verfahren keine Autolysate von schiedenen Eigenschaften ähnlich sind, vollständig 40 Tierorganen und/oder menschlichem Urin, die große zu trennen. Bei Injektionspräparaten, die zu thera- Mengen an Verunreinigungen enthalten, direkt auf peutischen Zwecken längere Zeit verabfolgt werden, das Celluloseharz aufbringen. Deshalb ist es erforderführen diese Fremdproteine zu ernsthaften Neben- lieh, das Autolysat und den Urin einer Vorbehandwirkungen, beispielsweise zu Antigen-Antikörper- lung zu unterziehen. Ferner läßt das Celluloseharz Reaktionen. Demgemäß wurden verschiedene Ver- 45 in bezug auf seine physikalischen Eigenschaften (Zäfahren zur Reinigung von Kallikrein vorgeschlagen. higkeit) zu wünschen übrig, so daß es nicht mehr-Im Verlauf der Untersuchungen, die zur vorliegen- mais verwendet werden kann. Außerdem bildet das den Erfindung führten, wurde versucht, rohe KaIIi- Celluloseha-z leicht Zusammenballungen mit festen kreinpräparate, die nach bekannten Verfahren, bei- Bestandteilen des Autolysats oder des menschlichen spielsweise gemäß den JA-PS 1 30 506 und 4 04 256 50 Urins, die in Extrakten auf Grund ihrer geringen hergestellt worden waren, von ihren Verunreinigun- Teilchengröße auftreten. Durch diese Zusammenbalgen zu trennen. Insbesondere wurden von rohem lungen wird die Elution stark erschwert, und es Kallikrein elektrophoretisch unter Verwendung von kommt zu Verstopfungen. Aus diesem Grunde läßt Cellulosegel-Folien, die aus reinem Celluloseacetat sich das vorgenannte Verfahren nicht zur großtechmit feiner Porenstruktur bestehen, verschiedene Korn- 55 nischen Kallikreinherstellung anwenden,
ponenten abgetrennt. Diese Komponenten wurden Es wurden also umfangreiche Untersuchungen

auf ihre pharmakologische Wirksamkeit untersucht. durchgeführt, um ein Verfahren zur Herstellung von Dabei wurde festgestellt, daß bei der Elektrophorese hochreinem Kallikrein zur Verfugung zu stellen, bei an Cellulosegel-Folien eine wirksame Komponente dem die vorgenannten Schwierigkeiten vermieden (im folgenden mit »Λ« bezeichnet) am weitesten zur 60 werden und bei dem sich hochreines Kallikrein in Anode wandert. Diese wirksame Komponente hat großtechnischem Maßstab unter geringen Kosten hereinen ähnlichen Ä_m-Wert, wie menschliches Serum- stellen läßt. Dabei wurden verschiedene Ionenausalbumin. Weitere drei Komponenten, im folgenden tauscherharze, die sich durch gute Beständigkeit, gemit »ß«, »C« und »D« bezeichnet, befinden sich ringen Preis und leichte Handhabbarkeit auszeichnen, zwischen der Komponente »A« und der Aufsetz- 65 auf ihre Eignung zur selektiven Adsorption und EIustelle. Eine Komponente »£« bleibt an der Aufsetz- tion von Kallikrein und dementsprechend zur Abstelle. Schließlich gibt es eine zur Kathode wandernde trennung der vorgenannten Verunreinigungen unterKomponente »F« mit einem /?_m-Wert ähnlich dem sucht. Beispielsweise wurde bei Verwendung eines

ivsats von Schweinepankreas als Ausgangsniate- Waschens nicht verloren und läßt sich zu 95 Fro-

• ι md eines basischen Harzes auf Polystyrolgrund- zent durch Elution mit einem Elutionsmittel gewin-

m Polvamintyp als lonenaustauscherharz ein nen. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß das

*^%\ ^V t von 13 Prozent der Gesamtmenge der wirk- dabei erhaltene Kallikrein bei der Analyse mittels

Komponente während der Adsorption und 5 Elektrophorese an Cellulosegel-Folien sich als hoch-

^m\, Λ des Waschens festgestellt. Ferner konnte die reines Kallikrein, d.h. als Komponente A, erweist,

jhiprte Substanz nach Elution mit einem EIu- bei dem die Verunreinigungen B und C lediglich in

ttel in einer Menge von nur 55 Prozent der einer Menge von 4 Prozent vorhanden sind (vgl.

tjonsmu _Gesamtmenge erhalten werden. Dabei Kurve für das Präparat von Beispiel 6 in Fig. I)-

eingeset" _{nenten B} c, D, E und F als Ver- io Die Reinheit bzw. die spezifische Aktivität der Kom-

^WMenfT t A iht Wrt on 2081 bis 43072 ku/mg.

Die Reinheit bzw. die spezifische A

fenTiihaUen ponente A erreicht Werte von 20,81 bis 43,072 ku/mg.

te Verwendung eines porösen Harzes mit ter- Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren

Amiueruppen als Ionenaustauschergruppen zur Herstellung von hochreinem Kallikrein, das aa- «Prozent d-sr Gesamtmenge der wirksamen durch gekennzeichnet ist, daß man Autolysate aus Snente während der Adsorption und während 15 Säugetierorganen, menschlichem Urin oder L°sun-Waschens verloren. Bei Verwendung eines ma- gen, die Kallikrein geringer Reinheit enthalten, zur Ssen Hartes mit primären und sekundären Adsorption des Kallikreins mit einem stark vernetz-CruDDen betrug der Verlust bei der Adsorption ten makroporösen Anionenaustauscherharz mit terhP?m Waschen lediglich 2 Prozent der Gesamt- tiären Amingruppen als Austauschergruppen in Kone Ted^chkonnten^gmit verschiedenartigen EIu- *o takt bringt und das an diesem Anionenaustauscher SiUeIn bei verschiedenen Konzentrationen nur harz adsorbierte Kallikrein mit «ner Bektrol>lösung Äzen? der ursprünglichen Aktivität erhalten mit einer Konzentration von mindestens 0,6 Molelu α η Ferner enthielt das Eluat die Komponen- iert oder daß man das an diesem Anionenaus auweiden. r^f^ve^reinieunffen scherharz adsorbierte Kallikrein mit einer höchstens

^tU2 %^a5iS äSfV HWrt 60 ^

ieunffen scherharz adsorbierte Kallikr

S äSfstVrol-Divinylbenzol- ^₅ 0,3-m-Elektrolyüösung vom pH-Wert 6,0 mit quartären Amingruppen als wäscht und mit einer mindestens 0,6-m-E

R_eideVerwendung eines porösen Ionenaustau- 30 gleich zu herkömmlichen Verfahren,

scherharzes rTquartlSen Amfngruppen als austau- der Fällung mit Aceton, J« ^ «ηγΡ^^^

Senden Gruppen und eines stark vernetzten makro- tivität und Reinheit von 4,47 b s 13 59 ku/mg^e zie

fahren keine deutlichen Vorteile bietet. den die rrapa _y { _{ffer vom pH}-Wert 8,6

Bei dieser Sachlage konnte man annehmen, daß dunj5 xon 0,07 m vero ρ ^ ^^ _ßp_

sich Ionenaustauscherharze zur Reinigung von Kai- 2«/,: unden be 1 0 W rnA^cm g ^ _pon_

Lein nicht eignen, überraschenderweise wurde ^ endbgung d«r E ekt ophor«e^» ^^ _um

doch bei weiteren Untersuchungen festgestellt daß 50 ceatM R ™B^e£^r« _{urchsichlig zu ma}chen. Anschlieein stark vernetztes makroporoses Harz das aus die;Fohe torn«« | _{bten Pr0}.

■ Sa₅ST mi

SfSS

Märzes mit tertiären Amingruppen als Hauptaustau- ren näher erlauten.

schergruppen (Amingehalt: 8O°/o) erhalten, das eine 65 Ein Autolysat, das durch Behandlung von Tierähnliche Struktur wie das vorstehende Styrol-Divinyl- Organen auf übliche Weise, beispielsweise durch Be-

1 1 /^„„^„m^ricnt aufweist. Das heißt, die Aktivi- handlung mit verdünnter Essigsäure, erhalten worden

les ist, wird zur Adsorption des Kallikreins mit einem

stark vernetzten makroporösen Anionenaustauscherharz mit tertiären Amingruppen als Austauschergruppen in Kontakt gebracht. Anschließend kann gemäß der Erfindungsdefinition gewaschen werden. Bei dieser Behandlung werden Lipide und Fremdproteine abgetrennt. Anschließend wird eine Elektrolytlösung mit einer Konzentration von mindestens 0,6 m verwendet, um das hochreine Kallikrein in Lösung zu bringen.

Zur Adsorption des Kallikreins am Ionenaustauscherharz kann das Harz direkt in ein Autolysat von tierischen Organen gegeben werden, wobei die Adsorption absatzweise durchgeführt wird. Eine andere Möglichkeit besteht darin, das Autolysat über eine mit dem Harz beschickte Säule zu geben. Ferner können das absatzweise und das säulenchromatographische Verfahren kombiniert werden.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete, stark vernetzte makroporöse lonenaustauscherharz, das tertiäre Amingruppen als Austauschergruppen enthält, kann durch Behandlung eines vorhandenen Ionenaustauscherharzes erhalten werden, indem man es auf physikalischem Wege makroporös macht und tertiäre Amingruppen als Austauschergruppen einführt. Beispiele für Ionenaustauscherharze, die sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen, sind stark vernetzte makroporöse Harze auf der Basis eines Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisats mit tertiären Amingruppen oder stark vernetzte makroporöse Harze mit tertiären Amingruppen al: Hauptaustauschergruppen (Amingehalt: 80, 90 bzw 10O⁰Zo).

Beispiele für Elcktrolyte, die im erfindungsgemä ßen Verfahren eingesetzt werden können, sind wäß rige Lösungen von Ammoniumsalzen oder Alkali nietallsalzen, wie Natrium- oder Kaliumsalzcn, vor organischen Säuren, wie Ameisensäure oder Essig säure, oder von anorganischen Säuren, wie Salzsäure Schwefelsäure oder Phosphorsäure. Der Elektroly kann je nach seiner Molarität gemäß der Erfindungsdefinition als Waschflüssigkeit oder als Elutionsmittc venvendet werden. Der pH-Wert der Elektrolytlösung liegt vorzugsweise im Bereich von 6,0 bis 8,5 wobei das Kallikrein nicht beeinträchtigt wird.

Das auf diese Weise nach entsprechender Aufarbeitung erhaltene Kallikreinpulver kann direkt füi Injektionszwecke verwendet werden. Gegebenenfall; kann jedoch das erfindungsgemäße Verfahren wiederholt werden, um die Reinheit des Kallikreins zu steigern.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet große Vorteile bei der großtechnischen Herstellung von hochreinem Kallikrein. In der Tabelle wird das erfindungsgemäße Verfahren mit dem Verfahren dei JA-PS 4 04 256 verglichen. In letzterem Verfahren wird ein gemäß der JA-PS 1 30 506 erhaltenes KaI-likreinpräparat mit einer spezifischen Aktivität von 7,77 ku/mg eingesetzt.

Tabelle

Erfindungsgemäßes Verfahren Verfahren der JA-PS 1 30 506

Ausgangsmaterial
Autolysebedingungen

Abtrennung von Fremdproteinen

Isolation der aktiven Komponente

Dialyse

Spezifische Aktivität Elektrophorese

Ausbeute Bemerkungen

Arbeitsweise

Autolysat

Nach 5stündiger Autolyse bei 15⁰C mit 0,05 η-Essigsäure wird abfiltriert.

Verschiedene Proteine werden an einem stark vernetzten makroporösen Harz auf der Basis eines Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisats mit tertiären Amingruppen adsorbiert und anschließend unter Verwendung einer 0,1- bis 0,25-m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,5 eluiert. Es sind bis 12 Stunden erforderlich.

Das Kallikrein wird mit einer 0,6-bis 1,0-m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,5 eluiert. Es sind 8 bis 12 Stunden erforderlich.

Entsalzen und Dialyse. Zeitbedarf: 48 Stunden.

20,81 bis 35,26 ku/mg Siehe F i g. 1

80 bis 94«/o

Das Anionenaustauscherharz kann leicht regeneriert und wiederholt eingesetzt werden.

einfach Autolysat

Nach 48- bis 72stündiger Autolyse bei 37⁰C mit 0,02 η-Essigsäure wird abfiltriert.

Es wird dialysiert und anschließend mit der gleichen Volumenmenge Aceton versetzt. Die erhaltene Lösung wird zur Ausfällung des Kallikreins 8 bis 12 Stunden stehengelassen.

Das Kallikrein wird unter Verwendung einer 1/3 n-Natriumhydrogencarbonatlösung extrahiert. Das unlösliche Material wird entfernt. Dieses Verfahren wird dreimal wiederholt. Insgesamt sind dazu 8 bis 12 Stunden erforderlich.

Entsalzen und Dialyse. Zeitbedarf: 48 Stunden.

4,47 bis 13,59 ku/mg Siehe F i g. 1

65 bis 75 ⁰Zo

Es sind große Acetonmengen erforderlich, deren Rückgewinnung schwierig ist.

kompliziert

(ο

Tabelle (Fortsetzung)

Erfmdungsgcmüßcs Verfahren Verfahren gemäß JA-PS 4 04 256

Ausgangsmaterial

Abtrennung von
Fremdproteinen

Isolation der aktiven
Komponente

Dialyse

Spezifische Aktivität
Elektrophorese
Ausbeute

Kallikrcin (bzw. eineKallikreinlösung), das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde.

Das vorgenannte Produkt wird in einer verdünnten Salzlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst und an einem stark vernetzten makroporösen Harz auf der Basis eines Styrol-Divinylbenzol-Copolymcrisats mit tertiären Amingruppcn adsorbiert. Anschließend wird zur Entfernung von Fremdproteinen mit einer verdünnten Salzlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,5 gewaschen.

Die aktive Komponente wird mit einer 0,6- bis 1,0-m Salzlösung vom pH-Wcrt 6,0 bis 8,5 eluieü.

Entsalzen und Dialyse
103,78 bis 146,82 ku/mg Siehe F i g. 1
95 bis 96⁰O Kallikrein, das gemäß JA-PS 1 30 506 erhalten wurde.

Das Kallikrein wird an einem Celluloseharz, das mit 0,01-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 äquilibriert ist, adsorbiert. Anschließend wird zur Entfernung von Fremdproteinen mit einem Gemisch aus 0,01-m PhosphatpufTer und O,4°/oiger wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen.

Die aktive Komponente wird mit einem Gemisch aus 0,05-m Phosphatpuffer und einer 5ⁿ/oigen wäßrigen Natriumchloridlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert.

Entsalzen und Dialyse 38,87 bis 92.88 ku/mg Siehe Fig. 1
85 bis 87 »,Ό

Die gemäß den folgenden Beispielen 6 und 7 erhaltenen Kallikreinpräparate werden auf ihre steigernde Wirkung der Blutflußgeschwindigkeit bei Hunden untersucht und mit den Produkten der JA-PS 4 04 256 und 1 30 506 verglichen. Von den Kallikreinproben wird jeweils eine vorbestimmte Menge in physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Die erhaltene Lösung wird erwachsenen Hunden injiziert, und die Steigerung der Blutflußgeschwindigkeit wird an einem Hinterfuß bestimmt. Die Versuchsergebnisse sind in Fi g. 2 zusammengestellt, wobei auf der Abszisse die Kallikrcindosis und auf der Ordinate die Blutflußgeschwindigkeit aufgetragen ist. Wie aus F i g. 2 hervorgeht, ist die steigernde Wirkung auf die Blutflußgeschwindigkeit des gemäß Beispiel 6 erhaltenen Kallikreinpräparats 201 mal größer als die entsprechende Wirkung des gemäß der JA-PS 1 30 506 erhaltenen Präparats. Ferner ist festzustellen, daß das Präparat von Beispiel 6 in seiner Wirkung dem gemäß der JA-PS 4 04 256 erhaltenen Präparat entspricht. Schließlich ist nach Verabreichung des Kallikreinpräparats von Beispiel 7 die Blutflußmenge 3,8mal größer als nach Verabreichung des Präparats von Beispiel 6 und 3,13mal größer als nach Verabreichung des gemäß der JA-PS 4 04 256 erhaltenen Präparats.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1

6 kg Schweinepankreas werden in Streifen geschnitten und 5 Stunden unter Rühren bei 15° C in 20 Liter einer 0,05-m Essigsäurelösung autolysicrt. Anschließend werden die Pankreasstreifen und das Fett aus der Lösung abfiltriert. Der pH-Wert des FiI-trats wird auf 6,5 eingestellt. Sodann wird die erhal tene Lösung auf eine mit 1,4 Liter eines stark vernetzten makroporösen Harzes auf der Basis eines Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisats mit tertiären Amingruppen beschickte Säule der Abmessungen 6 X 70 cm aufgesetzt. Die Säule wird mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,5 bis 2.0 Liter/ Stunde betrieben. Anschließend wird die Säule mit einer 0,25-m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,5 so lange gewaschen, bis die Extinktion des Waschwassers bei 280 nm den Wert 1,0 erreicht. Sodann wird die aktive Komponente mit 0,8-m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,5 eluiert. Das Eluat wird mittels eines TJltrafilters entsalzt. Die erhaltene Lösung, die das Kallikrein enthält, wird zu 8.99 g Kallikrein gefriergetrocknet. Die spezifische Aktivität bzw. Reinheit beträgt 20,76 ku/mg und die Gesamtaktivität 186 632,4 ku. Die Ausbeute, bezogen auf die ursprüngliche Aktivität des Autolysats. beträgt 85 Prozent. In bezug auf das Autolysat wird eine 1207fache Reinigung erzielt.

55

Beispiel 2

1,58 g gemäß Beispiel 1 erhaltenes gefriergetrocknetes Kallikreinpulver mit einer spezifischen Aktivi tat von 20,76 ku/mg werden in 50 ml einer 0,2-rr Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,5 gelöst Die erhaltene Lösung wird auf eine mit 240 ml eine; stark vernetzten makroporösen Harzes auf der Basi: eines Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisats mit ter tiären Amingruppen beschickte Säule der Abmessun gen 3 X 40 cm aufgesetzt. Während der Adsorptions phase wird die Säule mit einer Durchflußgeschwin digkeit von 200 bis 300 ml/Stunde betrieben. An schließend wird mit 0,2-m Ammoniumchloridlösun vom pH-Wert 6,5 und schließlich mit einer 0,3-r

ίο

Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,5 gewaschen, bis die Extinktion der Waschflüssigkeit einen Beispiel 6
Wert von 0,8 erreicht. Sodann wird mit 0,6-m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,5 eluiert. Das 7,2 kg Schweinepankreas werden 5 Stunden bei erhaltene Eluat wird mit Hilfe eines Ultrafilters ent- 5 15⁰C in 25 Litern einer 0,05-n Essigsäurelösung salzt. Nach dem Gefriertrocknen des Filtrats erhält autolysiert. Anschließend wird das erhaltene Automan 0,216 g Kallikrein mit einer spezifischen Akti- lysat mit einer Geschwindigkeit von 1 Liter, Stunde vität von 146,82 ku/mg und einer Gesamtaktivität auf eine mit 900 ml eines stark vernetzten makrovon 31 708,8 ku. Die Ausbeute beträgt 96 Prozent porösen Harzes auf der Basis eines Styrol-Divinyl- und der Reinigungsgrad, bezogen auf das Ursprung- ₁₀ benzol-Copolymerisats mit tertiären Amingmppen Hch eingesetzte Kallikreinpulver, 7,07. beschickte und vorher mit 0,25-m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0 äquilibnerle Säule auf-

Beispiel 3 getropft. Anschließend wird zur Entfernung von verschiedenen Fremdproteinen mit einer 0,25-m Am-

Aus 120 g Schweinepankreas wird gemäß Bei- ,₅ moniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0 gewaschen,

spiel 1 ein Autolysat hergestellt. Daraus werden ge- Der Waschvorgang wird abgebrochen, wenn die Ex-

mäß Beispiel 1 unter Verwendung eines stark ver- tinktion der Waschflüssigkeit unter 3 sinkt. Anschlie-

netzten makroporösen Harzes mit tertiären Amin- ß_end wird das Kallikrein unter Verwendung einer

gruppen als Hauptaustauschergruppen (Amingehalt: 0,8-m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0

8O°/o), 55 mg Kallikrein mit einer spezifischen Ak- ₂₀ eluiert. Die erhaltene Lösung wird entsalzt und durch

tivität von 35,19 ku/mg und einer Gesamtaktivität Elektrodialyse oder Filtration mit einem Durchfluß-

von 1936 ku hergestellt. Die Ausbeute beträgt 96 Pro- membranfilter teilweise eingeengt. Nach dem Gefrier-

zent. In bezug auf das Autolysat wird eine 2046fache trocknen erhält man 7,39 g Kallikrein mit einer spe-

Reinigung erzielt. zifischen Aktivität von 27,33 ku/mg und einer Ge-

25 samtaktivität von 201968,7 ku. In bezug auf das

Beispiel 4 Autolysat wird eine 3178fache Reinigung erzielt.

Als Ausgangsmaterial werden 1,6 Liter Urin von _R ■ -17

erwachsenen, männlichen Personen verwendet. Der e 1 s ρ 1 e 1

pH-Wert des Urins wird auf 7,0 eingestellt. Sodann ₃₀ Das gemäß Beispiel 1 erhaltene Kallikreinpulver

wird er auf eine mit einem stark vernetzten makro- wird auf eine mit 500 ml eines stark vernetzten

porösen Harz auf der Basis eines Styrol-Divinyl- makroporösen Harzes auf der Basis eines Styrol-

benzol-Copolymensats mit tertiären Amingmppen Divinylbenzol-Copolymerisats mit tertiären Amin-

beschickte Säule der Abmessungen 25 X 25 cm auf- _grupp_en beschickte Säule der Abmessungen 4,2

gesetzt. Wahrend der Adsorptionsphase wird die ₃₅ χ 3,6 cm mit einer Geschwindigkeit von 'l Liter/

Säule mit einer Durchnußgeschwind.gke.t von Stunde aufgetropft. Anschließend wird das Harz mit

1 Liter/Stunde betneben. Nach beendeter Adsorption 0,25-m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0

wird zur Entfernung der Fremdproleine solange mit gewaschen. Sodann wird das Kallikrein mit einer

0,3-m Ammoniumchloridlösung gewaschen, bis die 0,8-m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0

Extinktion der Waschflüssigkeit einen Wert von 0,7 ₄o eluiert. Das Eluat wird entsalzt und durch Dialyse

erre.cht. Anschließend wird mit 0,8-m Ammonium- oder unter Verwendung eines Durchfiußmembran-

chlondlosung vom pH-Wert 6,5 eine Kai ikrein ent- filters eingeengt. Nach dem Gefriertrocknen erhält

haltende Losung eluiert. Diese Losung wird entsalzt man 1,0 g Kallikrein mit einer spezifischen Aktivität

und gefnergetrocknet. Man erhalt 242 mg Kallikrein von 103,78 ku/mg und einer Gesamtaktivität von

von einer spezifischen Aktivität von 0 91 ku/mg und 45 103 780,0 ku. In bezug auf das ursprünglich einge-

einer Gesamtaktivitat von 220 ku In bezug auf den setzte Pulver wird eine 3,80fache Reinigung erzielt. ursprunglich eingesetzten Urin wird eine 198fache

Reinigung erzielt. _ .

Beispiel 8

^Beispie15 so Ig Kallikreinpulver mit einer spezifischen Aktivität

3 bis 5° C unter Ruhren nut 300 ml eines stark ver- Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0 gelöst, netzten rnakroporosen Harzes mit tertiären Amin- 55 Die erhaltene Lösung wird auf e^ne mü212 ml eines

8SiWLS Sr ZfTSSfSST %^ngi^{alt: stark vem}^t_en wLpubJL XS auf d_er »&

SiiiS?,nH?J? n\nA^™!? S ^^{HarZ eineS} Sty^l-Divinylbenzol-Copolymerisats mit ter-

abfiltnert und mit 0 3-m Arnmoniumchlondlosung tiären Amingmppen beschickte Säule der Abmessun-

vom pH-Wert 6,5 gewaschen, bus eine Extinktion des gen 3 X 30 cm aufgetropft. Die Säule wird mit einei

Waschwassers von 1,0 erreicht wird. Sodann wird 60 Durchflußgeschwindigkeit von 200 bis 250 ml/Stunde

nut einer 0,8-m Aminoniumchlondlosung vom pH- betrieben. Anschließend wird mk einer 0,25-n

Wert 6,5 eine kallikremhalüge Losung eluiert Diese Aminoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0 gewä- Losung wird entsalzt und gefnergetrocknet. Man er- sehen. Sodann wird das KaIHIc^n mit einer 0 6-ir

hält 800 rnl Kallikrein mit einer spezifischen Akti- AmrooniumSioridlung vcT?H-\iert "Telüfert

Ti:S^l^i^ZST^ ⁶ SAfV W Mar

_beZUg auf das Autolysat wird ein/1072,7f ache Rei- S2 ^JSfg^^MbÄ ragung erzielt bezug auf das ursprüngliche Pulver beträgt 93,4 Vo

Beispiel 9

Das gemäß Beispiel 8 erhaltene Kallikreinpulver mit einer spezifischen Aktivität von 43,072 ku/mg wird in 20 ml einer 0,2-m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0 gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf eine mit 188 ml eines stark vernetzten makroporösen Harzes auf der Basis eines Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisats mit tertiären Amingrujppen beschickte Säule der Abmessungen 2 X 60 cm aufgesetzt. Die Säule wird mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 150 bis 180 ml/Stunde betrieben. Anschließend wird mit einer 0,25-m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0 gewaschen. Das Kallikrein χήτά sodann mit einer 0,6-m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0 eluiert. Das erhaltene Eluat wird entsalzt und gefriergetrocknet. Man erhält 56,8 mg Kallikreinpulver mit einer spezifischen Aktivität von 121,75 ku/mg. Die Ausbeute in bezug auf das ursprüngliche Pulver beträgt 95,28%.

Vergleichsbeispiel

Der technische Fortschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber dem Verfahren, der DT-OS 16 17 476 ergibt sich aus einer Vergleichsuntersuchung an Kallikrein, das einerseits nach dem Beispiel des Verfahrens der DT-OS 16 17 476 und andererseits nach Beispiel 1 des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wurde. Dabei wurde das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Ausgangsmaterial durch Korrektur dem Beispiel der DT-OS angepaßt.

Die im Vergleichsversuch erhaltenen Ergebnisse an Kallikrein sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt:

	Erfindungs	Verfahren der
	gemäßes	DT-OS 16 17 476
	Verfahren
5 Aktivitätsgrad (0Zo) *)	83,3	22,4
Reinheit des	47,1	14,7
Proteins (%>)**)
Spezifische Aktivität	20,8	5,9
ίο (ku/mg)***)
Ausbeute· 103ku***)	446	381

Die Werte in der vorstehenden Tabelle errechnen sich auf folgende Weise:

*) Aktivitätsgrad

Aktivitätseinheiten der Esterase
nach Zugabe eines Inhibitors (α)

Aktivitätseinheiten der Esterase
vor Zugabe eines Inhibitors (α)

(α) = Sojabohnentrypsin als Inhibitor

♦*) Reinheit des Proteins

bei der Cellulose-Gel-Folie-Elektrophorcse
Färbebereich der aktiven Proteinfraklion

Färbebereich der gesamten Proteinfraktion

***) Die spezifische Aktivität und Ausbeute wurde an Hanc der Blutflußgeschwindigkeit am Hinterfuß bestimmt.

Beim Vergleich der Werte ergibt sich, daß das erfindungsgemäße Verfahren gegenüber dem Verfahrer der DT-OS 16 17 476 ein Produkt mit einem 3,7-fach höheren Reinheitsgrad, einer 3,2fach höherer Reinheit des Proteins, 3,5fach höheren spezifischet Aktivität und in 1,17fach höherer Ausbeute liefert.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. von Trypsin. Die letztgenannten Komponenten sind

   Patentanspruch: Fremdproteine, die nicht die pharmakologische Wir

   kung von Kallikrein aufweisen.

   Verfahren zur Herstellung von hochreinem Ferner wurde festgestellt, daß bei der Anfärbung

   Kallikrein, dadurch gekennzeichnet, 5 mit dem Dinatriumsalz von 1-Pseudocumylazodaß man Autolysate aus Säugetierorganen, 2-naphthnl-3.6-disulfonsäure (Rot Nr. 502, Ponceau menschlichem Urin oder Lösungen, die Kallikrein 3 R) zur Bestimmung der Proteinmengen unter Vergeringer Reinheit enthalten, zur Adsorption des wendung eines Densitometers die Gesamtmenge der Kallikreins mit einem stark vernetzten makro- Fremdproteine B, C, D, E und F ein Mehrfaches des porösen Anionenaustauscherharz mit tertiären 10 Proteins A beträgt (vgl. F i g. 1).
   Amingruppen als Austauschergruppen in Kon- Es ist also nach den genannten herkömmlichen

   takt bringt und das an diesem Anionenaustau- Verfahren unmöglich, die wirksame Komponente von scherharz adsorbierte Kallikrein mit einer Elek- Kallikrein abzutrennen und zu reinigen. Bei Anwentrolytlösung mit einer Konzentration von minde- dung des vorgenannten analytischen Verfahrens auf stens 0,6 Mol eluiert oder daß man das an diesem 15 handelsübliche Präparate, die eine Kallikreinwirkung Anioneiiaustauscherharz adsorbierte Kallikrein oder eine ähnliche Wirkung aufweisen, wurde festmit einer höchstens 0,3 m Elektrolytlösung vom gestellt, daß sämtliche Präparate die Proteine B, C, D pH-Wert 6,0 bis 8,5 wäscht und mit einer minde- und E und gelegentlich auch den Bestandteil F als stens 0,6-m-Elektrolytlösung vom pH-Wert 6,0 Verunreinigung enthalten. Dies zeigt, wie schwierig bis 8,5 eluiert. 20 es ist, im großtechnischen Maßstab die pharmakolo-

   gisch unwirksamen Fremdproteine aus den Kallikrein-