DE1252364B

DE1252364B - Verfah ren zur Gewinnung des Kallikrem Inakti vators in kristallisierter Form

Info

Publication number: DE1252364B
Application number: DENDAT1252364D
Authority: DE
Inventors: Wuppertal-Sonnborn Dr FvUz Schultz
Original assignee: Farbenfabriken Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1966-02-23
Publication date: 1967-10-19
Also published as: DK116675B; AT267050B; FR1512258A; NL6702824A; SE325369B; NO119755B; IL27383A; YU29467A; BE694474A; FI45827C; CH483258A; YU33199B; FI45827B; ES337146A1; GB1134486A; US3558773A; FR7027M; LU53052A1

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. α.:

A6f K -

Deutsche Kl.: 30 h - 2/04

Nummer: 1 252 364

Aktenzeichen: F 48504IV a/30 h

Anmeldetag: 23. Februar 1966

Auslegetag: 19. Oktober 1967

Der Kallikrein-Inaktivator ist ein Polypeptid von annäherndem Molgewicht 6500, dessen Aminsäuresequenz identisch ist mit der des Pankreastrypsin-Inhibitors von K u η i t ζ und N ο r t r ο p. Bei beiden Polypeptiden handelt es sich um denselben Stoff, der im folgenden mit seinem älteren Namen als Kallikrein-Inaktivator bezeichnet wird.

Der Kallikrein-Inaktivator ist eine starke Base.

Es ist bisher nicht gelungen, den Kallikrein-Inaktivator als solchen in kristallisierter Form darzustellen, es ist lediglich bekannt, bei schwach saurem pH-Wert den Kallikrein-Inaktivator bzw. den Kunitz-Inhibitor mit Magnesiumsulfat oder Ammonsulfat kristallisiert abzuscheiden (F. Schultz, H. Kraut und N. Bhargava, Naturwissenschaften, 50, S. 375 [1963]). Diese Kristalle stellen sechskantige Prismen dar. Sie enthalten etwa 50°/₀ Magnesiumsulfat bzw. Ammonsulfat. Will man daraus den reinen Wirkstoff gewinnen, so müssen diese Salze erst wieder entfernt werden, was nur nach Wiederauflösen gelingt. ao

Es wurde nun gefunden, daß man den reinen Kallikrein-Inaktivator in kristallisierter Form dadurch gewinnen kann, daß man seine wäßrige Lösung durch Zusatz von Basen oder durch Austausch der Anionen durch OH-lonen auf einen pH-Wert von mindestens 9 einstellt und gegebenenfalls einengt, bis eine Konzentration von mindestens 5000 KIE erreicht ist.

Der Wirkstoff kristallisiert in vierkantigen Säulen. Gelegentlich sind eine oder mehrere Kanten abgeschrägt. Die Löslichkeit der Kristalle in Wasser von 20⁰C beträgt etwa 0,3%, wogegen die Löslichkeit der mit Magnesiumsulfat oder Ammonsulfat gewonnenen Kristalle bei dieser Temperatur etwa 30% beträgt.

Die spezifische Wirksamkeit der über Phosphorpentoxid getrockneten Substanz liegt bei etwa 0,14 γ\ KIE. Die Suspension der Kristalle in Wasser hat einen pH-Wert von rund 10. Fügt man etwas Säure hinzu, so gehen sie in Lösung bei einem pH-Wert von etwa 9 und darunter.

Die Durchführung des Verfahrens geschieht vorzugsweise durch Einstellung des pH-Wertes mit Ammoniak. Aber auch andere anorganische oder organische Basen können Verwendung finden. Besonders hohe Ausbeuten werden erzielt bei Verwendung von Ammoniak und einem pH-Wert von 11 und darüber. Ein großer Teil ist schon nach einer Stunde auskristallisiert, die maximale Ausbeute wird in der Regel nach 10 Stunden erreicht. Die Kristallisation kann durch Kühlen unterstützt werden.

Die günstigste Konzentration zur Durchführung der Kristallisation liegt zwischen 1 und 5%, bei Verfahren zur Gewinnung des
Kallikrein-Inaktivators in kristallisierter Form

Anmelder:

Farbenfabriken Bayer Aktiengesellschaft,
Leverkusen

Als Erfinder benannt:

Dr. Fritz Schultz, Wuppertal-Sonnborn

niedrigeren Konzentrationen wird die Ausbeute schlechter.

Verwendet man statt Ammoniak andere Basen, so ist das Optimum des einzustellenden pH-Wertes naturgemäß verschieden, kann aber durch Ausprobieren leicht ermittelt werden. Bei einer Endkonzentration von 1% bei Natronlauge, Kalilauge, Calciumhydroxyd und Barytwasser ist der günstigste pH-Wert für die Kristallisation 11.

Bei den organischen Basen liegt das pH-Optimum ebenfalls in der Nähe von 11. Die stärkste Kristallisation wird erzielt mit Äthylendiamin; gute Werte ergeben ferner Methylamin, Trimethylamin, Triäthylamin, Piperidin u. dgl.

Dampft man eine neutrale oder saure Lösung des Kallikrein-Inaktivators im Vakuum ein, so erhält man auch in höchster Konzentration keine Kristalle des Wirkstoffes. Läßt man die Lösung jedoch langsam durch eine mit einem stark basischen Anionenaustauscher beschickte Säule fließen, so erhält man eine stark alkalische Lösung, aus der beim Einengen der Inaktivator in seiner basischen Form in hoher Ausbeute bei einem pH-Wert zwischen 9 und 10 auskristallisiert.

Als Ausgangsmaterial dienen am besten Präparate des Kallikrein-Inaktivators, die weitgehend von unwirksamen Begleitstoffen befreit sind. Je weiter die Reinigung fortgeschritten ist, desto höher ist die Ausbeute bei der Kristallisation.

Die Durchführbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens war nicht vorauszusehen. Es ist kein Beispiel aus der Literatur bekannt, wonach ein Polypeptid mit so großem Molekulargewicht wie dem des Kallikrein-Inaktivators (6500) durch einfaches Einstellen eines bestimmten pH-Wertes in kristallisierter Form hätte gewonnen werden können.

Es ist ferner überraschend, daß sich der Inaktivator bei einem pH-Wert über 9 so stabil erweist. Es ist

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nämlich mehrfach in der Literatur erwähnt worden, daß der Inaktivator im alkalischen Bereich unstabil ist. Es wird daher in der Literatur empfohlen, Lösungen des Inaktivators zu neutralisieren, da er empfindlich gegen alkalische pH-Bereiche sei.

Durch die Kristallisation der Base läßt sich der Kallikrein-Inaktivator von Fremdproteinen und anderen Begleitstoffen befreien.

B e i s ρ i e 1 1

4,48 g eines lyophilisierten Kallikrein-Inaktivatorpräparates vom Reinheitsgrad 0,16 y/KIE = 28 Mega KIE werden in 56 ecm aqua redestillata gelöst. 1 ecm enthält also 500 000 KIE.

Dann werden 56 ecm reines 25 %iges Ammoniak hinzugefügt.

Nach 24stündigem Stehen bei 20° C hat sich ein dicker Kristallbrei ausgeschieden, der über einem gehärteten Filter abgesaugt, mit 12 ecm aqua redestillata gewaschen und im evakuierten Phosphorpentoxyd-Exsikkator getrocknet wird.

Erhalten werden 3,096 g Kristalle = 22,12 Mega KIE vom Reinheitsgrad 0,14 y = 79% Ausbeute.

Beispiel2

20 ecm = 2 Mega KIE vom Reinheitsgrad 0,16 y/ KIE werden mit 0,63 ecm gesättigtem Barytwasser versetzt.

Nach lOstündigem Stehen bei 4° C werden die entstandenen Kristalle über gehärtetem Filterpapier abfiltriert, mit Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxid im Vakuum getrocknet. Erhalten werden 129 mg Kristalle = 920 000 KIE. Das entspricht einer Ausbeute von 46% bei einem Reinheitsgrad von 0,14 y/KIE.

Beispiel 3

0,48 g Kallikrein-Inaktivator vom Reinheitsgrad 0,16 y/KIE werden in Wasser gelöst und mit 0,39 ecm Äthylendiamin versetzt.

Bereits nach 15 Minuten beginnt die Kristallisation. Nach 24 Stunden wird der erhaltene Kristallbrei abgetrennt, mit wenig Wasser gewaschen und getrocknet. Erhalten werden 239 mg Kristalle mit einem Reinheitsgrad von 0,142 y/KIE. Das entspricht einer Ausbeute von 56%.

Beispiel 4

1 g eines lyophilisierten Kallikrein-Inaktivatorpräparates vom Reinheitsgrad 0,2 y/KIE = 5 Mega KIE werden gelöst in 10 ecm aqua redestillata. Dann werden 0,6 ecm Ammoniak zugesetzt. Nach 24stündigem Stehen bei +- 4° C werden die Kristalle abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Erhalten werden 210 mg Kristalle mit einem Reinheitsgrad von 0,15 y/ KIE. Das entspricht einer Ausbeute von 28 %.

Beispiel 5

3,4 g lyophilisierter Kallikrein-Inaktivator vom Reinheitsgrad 0,17 y werden in 150 ecm Wasser gelöst. Der pH-Wert ist 6,5. Dann werden 50 ecm des stark basischen Anionenaustauschers Amberlite IRA 410 hinzugefügt. Die Suspension wird 10 Minuten gerührt und 24 Stunden stehengelassen. Die Suspension zeigt dann einen pH-Wert von 10,5. Durch Aufschlämmen und Sieben wird die Kristallsuspension vom Austauscher abgetrennt, die Kristalle abfiltriert, mit wenig Wasser gewaschen und getrocknet.

Erhalten werden 2,03 g Kristalle vom Reinheitsgrad 0,145 y/KIE = 70% Ausbeute.

Beispiel 6

15,41 einer stark sauren Lösung des Kallikrein-Inaktivators, die 295 000 000 KlE vom Reinheitsgrad 0,16 y/KIE enthält, läßt man innerhalb von 6 Stunden durch eine Austauschersäule fließen, die mit 5 1 des stark basischen Anionenaustauschers Amberlite IRA 410 beschickt ist.

Die erhaltene stark alkalische Lösung wird in einem Vakuum-Umlaufverdampfer auf 1,5 1 eingeengt. Schon während des Konzentrierens beginnt die Lösung sich zu trüben und scheidet schließlich 71% des eingesetzten Inaktivators in kristallisierter Form aus.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung des Kallikrein-Inaktivators in kristallisierter Form, dadurch gekennzeichnet, daß man seine wäßrige Lösung entweder durch Zusatz von Basen oder durch Austausch der Anionen durch OH-Ionen auf einen pH-Wert von mindestens 9 einstellt, gegebenenfalls einengt und bei einer Konzentration von mindestens 5000 KIE/ccm den Inaktivator auskristallisieren läßt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Base Ammoniak verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man organische Basen, wie Äthylendiamin, Methylamin, Dimethylamin, Triäthylamin, Piperidin u. dgl., verwendet.