DE2018588C - Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Insulin - Google Patents

Description

2 018^88

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung tielles Aussalzverfahren zur Insulinreinigung durch

und Reinigung von Insulin. Aussalzen von Insulin aus einem neutralisierten

Kristalline Formen von Insulin sind mehrfach be- Extrakt durch Zusatz von Natriumchlorid, Filtrieren,

schrieben wo-den, z. B. von A be 1, Proc. Nat. Acad., Wiederauflösen des Rückstands und erneutes Aus-Sd. 12, 132 (1926); Biochem. J. 28, S. 1592 bis 1602 5 salzen des Insulins unter Anwendung einer niedrigeren

(1934); und 29, S. 1C48 bis 1054 (1935); USA.-Patent- Natriumchloridkonzentration angegeben. Die vorge-

schrift 2 143 590; Harrington und Scott, Bio- schlagenen Natriumchloridkonzentrationen liegen zwichem. J. 23, S. 384 (1929) und USA .-Patentschriften sehen 25 und 15 Gewichtsprozent.

2 819 999 und 2 836 542. Eine Übersicht wurde von Die USA.-Patentschrift 2 529 152 beschreibt ein

S ch 1 ich tk r u 11, »Insulin Crystals«, Verlag Ejnar io Verfahren zur Abtrennung von Fetten aus Insulin

Munksgaard, Kopenhagen, Dänemark, 1958, ver- durch teilweise Verdampfung des Alkohols aus einem

öffentlicht. Diese und andere Veröffentlichungen wäßrigen insulinhaltigen Säure-Alkohol-Extrakt und

führten zu der Auffassung, daß Insulin nur in Gegen- Abtrennen der Fettfraktion,· die in der verbleibenden

wart bestimmter zweiwertiger Kationen, von denen Mischung unlöslich ist.

Zink, Cobalt, Cadmium, Nickel, Kupfer, Eisen und 15 In der USA.-Patentschrift 2 648 622 ist die Fällung Mangan ausdrücklich genannt sind, Kristalle bildet. von Insulin in Form von zusammengeballten Fäserchen In der VercJfentlichung von Schlichtkrull beschrieben. Vorher isolierte Fäserchen werden zum sind jedoch Insulinkristalle unbekannter Zusammen- Animpfen wäQriger insulinhaltiger Lösungen Versetzung beschrieben, die als Rhombendodecaeder wendet, um das Insulin daraus auszufällen. Die vorliegen. ao Insulinfäserchen werden durch Filtrieren oder Zentri-

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden fugieren isoliert.

in guter Ausbeute die von S c h 1 i c h t k r u 11 be- In der USA.-Patentschrift 2 663 666 ist ein Verfahren

schriebenen Rhombendodecaetcrkristalle von Insulin zur Insulinreinigung beschrieben, bei dem die Azidität

und neuartige Octadecaederkristalle von Insulin er- eines wäßrigen Pankreasextrakts nacheinander auf

halten. Seit der Entdeckung des Insulins als Korn- 35 pH 4,0 bis 5,5, pH 7,0 bis 8,5 und pH 3,0 bis 3,5 einge-

ponente des Pankreas im Jahre 1921 wird die Ent- stellt, die nach jeder Einstellung erhaltene Mischung

Wicklung von Methoden zur Reinigung von Insulin f.ltriert und der bei jeder Filtration erhaltene Rück-

mit beträchtlichem Aufwand betrieben. stand, der aus den unerwünschten sauren und basischen

Für gegenwärtig angt.wandt- technische Verfahren Komponenten des Extrakts besteht, verworfen wird,

zur Reinigung von Insulin sind eine oder mehrere 30 Das Insulin wird dann aus dem letzten Filtrat ge-

Salzfällungen bei verschiedener Salzkonzentration, wonnen.

eine oder mehrere isoelektrische Fällungen und wenig- In der USA.-Patentschrift 2 636 228 wird die Fällung

stens eine Zinkkristallisation typisch. von Zink-Insulin aus einem Zitronensäure-Zitrat-

In der USA.-Patentschrift 1 469 994 ist ein Reini- Puffer als Maßnahme zur Abtrennung von Insulin gungsverfahren beschrieben, bei dem die Verunreini- 35 von einem glycogenolytische:^ Faktor vorgeschlagen, gungen, die in einem wäßrigen Pankreasextrakt ent- In der USA.-Patentschrift 2 878 159 ist ein Verhalten sind, bei ihrem isoelektrischen Punkt gefällt fahren zur Reinigung von Insulin durch Überleiten werden. Das Insulin verbleibt nach Entfernung der eines wäßrigen Pankreasextrakts über ein Kationen-Niederschläge in dem Extrakt. austauscherharz vom Carbonsäuretyp beschrieben.

In der USA.-Patentschrift 1 520 673 ist die isoelek- 4° In der USA.-Patentschrift 3 069 323 ist die Verwen-

trische Fällung von Insulin aus einem wäßrigen dung eines Aminocellulose-Anionenaustauscherharzes

Pankreasextrakt bei etwa pH 4 bis etwa pH 7, vor- in einem ähnlichen Verfahren angegeben,

zugsweise zwischen etwa pH 4,5 und pH 5,5, beschrie- Die Erfindung bezweckt ein Verfahren, mil dem

ben, ein Verfahren, das immer noch in der Technik Insulin in beträchtlich höheren Ausbeuten und in

zur Reinigung von Insulin angewandt wird. 45 reiner Form, verglichen mit bekannten Verfahren,

In der USA.-Patentschrift 1 866 569 ist ein Ver- erhalten wird.

fahren zur Reinigung von Insulin durch Behandlung Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur

eines praktisch wasserfreien insulinhaitigen Materials Reinigung von Insulin aus einem wäßrigen insulin-

mit wasserfreiem Ammoniak, Abfiltrieren der so er- haltigen Pankreasextrakt oder anderen wäßrigen

haltenen Lösung von dem unlöslichen Rückstand und 50 insulinhaltigen Lösungen, das dadurch gekennzeichnet

Verdampfen des Ammoniaks aus dem Filtrat beschrie- ist, daß man die Basizität der insulinhaltigen Lösung

ben, wodurch ein weißes amorphes Insulinprodukt auf pH 7,2 bis pH 10,0 und die Alkalikationen- oder

erhalten wird. Ammoniumkationenkonzentration auf eine 0,2 bis

Aus der Veröffentlichung von S c h 1 i c h t k r u 11, 1,0 m Konzentration dieser Kationen einstellt und

«Insulin Crystals«, Verlag Ejnar Munksgaard, Kopen- 55 dadurch die Kristallisation des Alkali· oder Amino·

hagen, Dänemark, 19S8, S. 54 bis 55, ist es bekannt, nium-Insulins veranlaßt.

zinkfreies Insulin in Gegenwart von 0,01 m-Natrium- Das Alkali· oder Ammonium-Insulin, das bei dem

acetat und 0,7 °/_e Natriumchlorid bei pH 7,0 zu kristal- erfindungsgemäOen Verfahren in hoher Ausbeute

lisieren. auskristallisiert, kann durch Filtrieren, Dekantieren

Aus der deutschen Patentschrift 876 143 (entspricht 60 oder Zentrifugieren abgetrennt werden. Das Salz

der USA.-Patentschrift 2 779 706) ist e3 bekannt, kristallisiert in der Octadecaeder* oder Dodecaeder-

Insulin aus einer 0,01 n-HCl-Lösung durch Einstellung kristallform und ist wasserlöslich. Die isolierte Kristall'

des pH auf 6 bis 8 auszufällen. form wird von der Insulinkonzentration und der

In der USA.-Patentschrift 1 547 SlS ist das erste Basi2ität der Mutterlauge sowie durch das Altern der Verfahren zum Aussalzen von Insulin aus einem 65 Kristalle vor der Abtrennung beeinflußt. Extrakttonslösungsmittel durch Zusatz von Natrium- Etwa 1 Kation pro InsulinmolekUl wird in die

chloric! beschrieben. Kristallstruktur eingebaut. Das kristalline Produkt

In der USA.-Patentschrift 2 449 076 ist ein difTeren- kann ohne weitere Reinigung zur Herstellung von

3 4

handelsüblichen Zink-Insulinpräparaten verwendet wird abgetrennt und in Säure gelöst, und das Kristallt-

werden. sationsverfahren wird zur Gewinnung weiterer Insulin-

Die Kristalle gehören offenbar dem isometrischen mengen wiederholt.

oder kubischen System an, wobei die zwölf Kanten Die isolierten Insulinkristalle, die etwa 90°/₀ des in eines Würfels während des Kristallwachstums abge- 5 der ursprünglichen Lösung enthaltenen Insulins ausstumpft werden. machen, können wieder in Wasser gelöst und ohne

In den Zeichnungen zeigt weitere Reinigung zur Herstellung von Zink-Insulin

F i g. 1 die Kristalle, die erhalten werden, wenn eine oder irgendeines anderen üblichen Insulinpräparats

Abstumpfung nur in sehr geringem Maß stattgefunden verwendet werden. Solche handelsüblichen Präparate

^¹*-· ίο sind beispielsweise PZI (Protamin-Zink-Insulin), die

F i g. 2 zeigt Kristalle, bei denen eine stärkere Lente-Insulin-Präparate und sogenanntes »reguläres

Abstumpfung erfolgt ist, und Insulin«. Alternativ können die Kristalle vor der

F i g. 3 zeigt Kristalle, bei denen die ursprünglichen Zink-Insulinkristallisation nach jeder anerkannten

Würfelflächen während der Kristallisation verschwun- Reinigungsmethode weiter gereinigt werden,

den sind. ,₅ rjj_{e na}ch dem erfindungsgemäßen Verfahren herge-

Die in f^; i g. 3 dargestellten Kristalle sind anschei- stellten Kristalle weisen entweder 12 oder 18 Flächen nend mit den Kristallen unbekannter Zusammen- auf und werden der isometrischen Kristallklasse zugesetzung identisch, die von S c h 1 i c h t k r u 11 an der ordnet. Isometrii^ie Kristalle weisen drei gleiche angeführten Stelle beschrieben wurden. Achsen auf, die aufeinander senkrecht stehen.

Bei einer typischen Anwendung des erfindungs- ao Normalerweise wird etwa 1 Kation pro Insulingemäßen Verfahrens wird der Insulin-Salzkuchcn, der molekül in die nach dem erfiniiungsgemäßen Verfahren die durch Aussalzen von Insulin aus einem neutrali- erhältlichen Kristalle eingebaut. Weitere Mengen von sierten Pankreasextrakt erhaltenen Feststoffe enthält, Kationen, die bei manchen Versuchschargen gefunden als Quelle für Insulin verwendet. Alternativ kann jede werden, scheinen aus dem Einbau von Natriumchlorid wäßrige saure Lösung mit einem Gehalt von etwa as in das Kristallgitter zu stammen. Diese Erscheinung 1 bis etwa 100 mg Insulin pro ml Lösung, die praktisch ist bei Kristallen allgemein bekannt,
frei von den zweiwertigen Ionen ist, welche bekannter- Im Gegensau zu den Insulinkristallen, die Zink, maßen mit Insulin kristallisieren, dem erfindungs- Kupfer, Cadmium, Mangan, Cobalt, Eisen, Nickel gemäßen Verfahren unterworfen werden. oder ähnliche mehrwertige Ionen enthalten, lösen sich

Es leuchtet ein, daß das erfiridungsgemäße Verfahren 30 die erfindungsgemäß erhältlichen Kristalle rasch in

auch mit einer basischen Insulinlösung durchgeführt Wasser auf. Die Kristalle sind jedoch nicht hygrosko-

werden kann. Wegen der Unbeständigkeit des Insulin- pisch oder zerfließen nicht, wenn sie mit feuchter Luft

moleküls unter basischen Bedingungen ist eine solche unter normalen atmesphärischen Bedingungen in

Arbeitsweise jedoch nicht das Verfahren der Wahl. Berührung kommen. Sie können mit Äther oder

Das erfindungsgemäße Verfahren, das von insulin- 35 Alkohol/Äther gewaschen ur.d an der Luft oder im haltigen Feststoffen oder wäßrig-sauren insulinhaltigen Vakuum getrocknet werden. Im trockenen Zustand Lösungen ausgeht, wird im folgenden näher beschrie- können sie in einem geschlossenen Behälter lange Zeit foen. Wenn das Ausgangsmaterial ein Feststoff ist, ohne Aktivitätsverlust gelagert werden,
wird dieser in einer wäßrigen Lösung mit einem pH- Die gute Löslichkeit der hierin beschriebenen Wert von etwa 1,5 bis etwa 4,5 gelöst, so daß eine 40 Kristalle ist für die Hersteilung von Insulinlösungen Endkonzentration von etwa 1 bis etwa 100 mg Fest- zur weiteren Reinigung nach typischen Herstellungsstoffe pro ml Lösung erzielt wird. Die wäßrige insulin- verfahren vorteilhaft. Diese weitere Reinigung kann haltige Lösung wird mit etwa 0,2 m bis etwa 1,0 m in einer Adsorption an Ionenaustauscherharzen mit wäßriger Alkalihydroxid- oder Ammoniumhydroxid- anschließender Elution oder in einer selektiven Filtralösung versetzt, bis ein pH-Wert von 7,2 bis 10,0, 45 tion durch ein Molekularsieb bestehen. Die gute vorzugsweise von etwa 7,8 bis 8,6, erreicht ist. Nötigen- Löslichkeit ist ferner für die Herstellung von Zubereifalls wird ein Salz des betreffenden Kations zugesetzt, tungen für die Verabreichung vorteilhaft. Das nach damit eine Kationenendkonzentration von 0,2 m bis dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Insulin 1,0 m, vorzugsweise etwa 0,5 m, erzielt wird. W&'.irsnd ist ebenso gut wirksam wie das zur 7eit handelsübliche der Zugabe der Base fällt das Insulin etwa beim iso- 50 Zink-Insulin.

elektrischen Punkt als Zwitterion aus und löst sich Wäßrige Lösungen, dir zum Auflösen von rohen anschließend oberhalb etwa pH 7 wieder auf. Die Insulinpräparaten vordem erfindungsgemäßen Kristalrnaximale Ausbeute an kristallinem Insulinsalz wird lisationsverfahren geeignet sind, können aus verdünnerzielt, wenn die Basizität etwa pH 8,2 nahekommt. Jen wäßrigen Lösungen von anorganischen Säuren, Die Ausbeute ist bei Raumtemperatur oder nahe bei 55 z. B. Salzsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure, Raumtemperatur liegenden Temperaturen optimal von organischen Säuren, z. B. Essigsäure, Zitronen- und nimmt bei niedrigeren Temperaturen ab. Die säure oder Propionsäure, oder von Mischungen der Kristallisation ist je nach den angewandten Bedingun- genannten Säuren mit pH-Werten zwischen etwa 1,5 gen und der Qualität und Quantität des Ausgangs- und 4,5 bestehen.

materials, wie noch näher erläutert wird, in etwa 60 Lite Basifizierung kann mit wäßrigen Lösungen von V₄ bis etwa 72 Stunden beendet. Das auskristallisierte Lithiumhydroxid, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Insulin wijd durch Dekantieren oder Filtrieren von Caesiumhydroxid, Rubidiumhydroxid oder Ammoder wäßrigen Mutterlauge abgetrennt. niumhydroxid mit den oben definierten Konzentra-

Nach Abtrennung des kristallinen Produkts wird tionen erfolgen.

die Mutterlauge mit etwa Vi0 Volumen Alkohol ver- 6s Salze oder deren wäßrige Lösungen, die zur Erdünnt und auf pH 5,2 eingestellt, um die isoelek- höhung der Kationenkonzentration bei Durchführung trische Ausfällung des in der Lösung verbliebenen des erfindungsgemäßen Verfahrens zugesetzt werden Insulins herbeizuführen. Der erhaltene Niederschlag können, sind lösliche organische und anorganische

Salze, die aus dem gleichen Kation, wie es zur Basifizierung verwendet wird, und irgendeinem geeigneten Anion bestehen. Vorzugsweise sind die Anionen die gleichen Anionen, die bereits in der Lösung enthalten sind, beispielsweise infolge der Auflösung des Insulinsalzkuchens in einer wäßrigen Säurelösung. Wenn also beispielsweise der Satzkuchen in Salzsäure gelöst wird und Natrium-Insulinkristalle gewünscht werden, kann die Basifizierung durch Zusatz einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung erfolgen und die Kationenkonzentration durch Zusatz von Natriumchlorid oder einer wäßrigen Lösung davon eingestellt werden. Wenn das Insulin in Essigsäure gelöst wird und Kalium-lnsulinkristalle gewünscht werden, kann die Basifizierung durch Zusatz einer wäßrigen Kaliumhydroxidlösung erfolgen und die Kationenkonzentration durch Zusatz von Kaliumacetat oder einer wäßrigen Lösung davon erhöht werden.

Konservierungsmittel, z. B. Phenol oder Methylp-hydroxybenzoat, Sequestriermittel, z. B. Tetranatriumäthylendiamintetraacetat, und kleine Volummengen organischer mit Wasser mischbarer Lösungsmittel verändern die Art oder Ausbeute des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Produkts nicht.

Die folgende Tabelle I zeigt den Einfluß des pH-Werts auf die Insulinausbeute bei dem erfindungsgemäOen Verfahren. Tn der Tabelle gibt Spalte 1 den pH-Wert der kristallisierenden Lösung, Spalte 2 die zur Erzielung einer maximalen Insulinkristallisation erforderliche Zeit und Spalte 3 die Insulinausbeute in mg Natrium-Insulin pro 0,45 kg extrahiertem Pankreas an. In allen Beispielen wurde das Natrium-Insulin durch Basifizierung aliquoter Teile einer wäßrigen Essigsäurelösung von Pankreasextrakt mit wäßriger 1 n-Natriumhydroxidlösung bis zu dem angegebenen ρ H-Wert und anschließende Aufbewahrung der basischen Lösung bei ungefähr Raumtemperatur während der angegebenen Zeit vor Isolierung des kristallinen Produkts hergestellt.

Tabelle I

und Spalte 3 die nach dem
erzielte Insiilinaiisbeute an.

Tabelle II

bekannten Verfahren

pH	Zur maximalen Kristalli sation erforderliche Zeit	Ausbeute in mg/0,45 kg Pankreas
7.0	2 Tage	11.3
7.4	ITag	32.8
7,8	75 Minuten	55,5
8,2	5 Minuten	46,9
8.6	5 bis 10 Minuten	43,7
9.0	ITag	41,7
9.4	2 Tage	32,5
9,8	4 bis 5 Tage	46,8
10.2	—	0,0

Die folgende Tabelle II zeigt die Ergebnisse von Vergleichsversuchen, bei denen die Insulinreinigung entweder nach dem erfindungsgemäßen Verfahren oder nach gegenwärtig üblichen Reinigungsmethoden mit isoelektrischer Fällung und Zinkkristallisation durchgeführt wurde. Die Vergleichsergebnisse stammen aus Versuchen, die mit aliquoten Insulinproben der gleichen wäßrigen Säurelösung von Pankreasextrakt durchgeführt wurden. In der Tabelle gibt Spalte I die Chargennummer und die Herkunft des Insulins, Spalte 2 die nach dem erfindungsgemlßen Verfahren cr/icllc Insulinausbeutc als Natrium-Insulin

Charge	Herkunft	Ausbeute in mg/0,45 kg Pankreas, neue Methode	Ausbeute in mg/0.45 kg Pankreas, bekannte Methode
IA	Schwein	45.9	48.7
IB	Schwein	48,2	48,7
IC	Schwein	63,1	48,7
2	Schwein	71,2	48,7
3	Schwein	62.3	48,7
4	Schwein	69,3	48,7
5	Rind	92,5	120
6	Rind	122	120

Durch die folgenden Beispiele wird das erfindungs so gemäße Verfahren näher erläutert.

Beispiel 1

Das feste Material, das durch Extraktion von etwa 148 kg !'Ahweinepankreas und Fällung der darin ent-

*5 haltenen insulinhaltigen Fraktion mit 2,2 I.U.Insulin/ mg erhalten wird, wird in 2 η wäßriger Salzsäure gelöst, so daß ein Gesamtvolumen von 27 I Lösung erhalten wird. Die Lösung wird filtriert, und der Rückstand wird verworfen. Das Filtrat wird mit 0,1 η wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 5,5 eingestellt, die Mischung wird durch Zentrifugieren getrennt, und die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Der Rückstand wird in 695 ml 0,5 η wäßriger Essigsäure gelöst, wodurch eine Lösung mit einem pH von 3,6 und einem Gehalt von 4,8·/, (Gewicht/Volumen) an Feststoffen mit 13,0I.U./mg erhalten wird. Dann wird wäßrige 1 n-Natriumhydroxidlösung bis pH 8,2 zugesetzt. Die Kristallisation beginnt in etwa 15 Minuten und ist nach etwa 18 Stunden langem Rühren der Lösung bei etwa Raumtemperatur beendet. Die Natrium-Insulinkristalle werden durch Zentrifugieren isoliert. Ausbeute: 51,1 mg/0,45 kg extrahiertem Pankreas. Die überstehende Flüssigkeit wird in Vw Volumteil Äthanol eingerührt, bis pH 5,2 angesäuert

und über Nacht in der Kälte aufbewahrt. Ρ-ϊγ entstandene Insulinniederschlag wird durch Zentrifu gieren abgetrennt und in 326 ml 0,5 η wäßriger Essigsäure gelöst (4,18 % [Gewicht/Volumen] Feststoffe). Durch Basifizierung bis pH 8,2 werden weitere 1L2 mg Natrium-Insulinkristalle pro 0,45 kg Pankreas in zwei Fraktionen erhalten. Gesamtausbeute: etwa 138 mg/kg extrahierter Pankreas.

Beispiele 2 bis 4

Das feste Material, das durch Extraktion von etwa 68 kg Schweinepankreas und Fällung der darin enthaltenen insulinhaltigen Fraktion erhalten wird, wird in 2 η wäßriger Salzsäure gelöst, so daß ein Gesamtvolurnen von 11,9 1 Lösung erhalten wird. Die Lösung

enthält 10,2 mg Feststoffe pro ml. Die Lösung wird mit Vio Volumteil Äthanol versetzt und mit 3 η wißriger Natriumhydroxidlösung auf pH 5,2 eingestellt. Der entstehende Niederschlag wird unter Verwendung von Diatomeenerde als Filterhilfe abfiltriert. Der Filterkuchen wird mit wäßriger Salzsäure vom pH 2 extrahiert, der Extrakt wird filtriert, und der Rückstand wird verworfen. Das Filtrat (165 ml) wird mit 1 η-Natriumhydroxid (Π,Ο mi erforderlich» auf nH X 1

eingestellt und mit 3,63 g Natriumchlorid versetzt. Die Natriumionengesamtkonzentration beträgt 0,45 m. Die Kristallisation beginnt sofort und ist in etwa 18 Stunden beendet. Die Kristalle werden abzentrifugiert, zweimal mit absolutem Alkohol und einmal mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: etwa 99 mg/kg extrahierter Pankreas. Gehalt: 24,3Oi 0,40l.U./mg.

Die vorstehend beschriebene Arbeitsweise wird mit verschiedenen Natriumionenkonzentrationen wiederholt, die durch Zugabe verschiedener Mengen festen Natriumchlorids eingestellt werden.

Bei einer 0,55 m Natriumionenkonzentration beträgt die Ausbeute etwa 114mg/kg Pankreas.Gehalt: 24,97 ±0,52 I. U./mg.

Bei einer 0,65 m Natriumionenkonzentration beträgt die Ausbeute etwa 117 mg/kg Pankreas. Gehalt: 23,60 I l.OOI.U./mg.

Beispiel 5

Die Arbeitsweise von Beispiel 2 wird mit der Ausnahme wiederholt, daß 0,5 n-Phosphorsäure zur Extraktion des Filterkuchens verwendet wird, der durch Filtrieren des bei pH 5,2 gefällten Niederschlags erhalten wird. Die Natriumionenendkonzentration in der kristallisierenden Lösung beträgt 0,46 m. Ausbeute: etwa 106 mg/kg Pankreas. Gehalt: 22,70f.U./mg.

Beispiel 6

Die Arbeitsweise von Beispiel 2 wird mit der Ausnahme wiederholt, daß 0,5 η-Schwefelsäure zur Extraktion des Filterkuchens verwendet wird, der durch Filtrieren des bei pH 5,2 gefällten Niederschlags erhalten wird. Die Natriumionenendkonzentration in der Kristallisationslösung beträgt 0,31 m. Ausbeute etwa 100 mg/kg Pankreas. Gehalt: 23,85 ± 0,15 I.U./mg.

Beispiel 7

Die Arbeitsweise πη Beispiel 1 wird mit der Ausnahme wiederholt, daß 1 η wäßrige Lithiumhydroxidlösung zur Einstellung der sauren Lösung, die durch Extraktion des bei pH 5,2 erhaltenen Niederschlags erhalten wird, auf pH 8,2 verwendet wird. Ausbeute: etwa 27,3 mg/kg Pankreas. Gehalt: 21,05 I.U./mg.

Beispiel 8

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wird mit der Ausnahme wiederholt, daß 1 η wäßrige Kaliumhydroxidlösung zur Einstellung der sauren Lösung, die durch Extraktion des bei pH 5.2 gefällten Niederschlags erhalten wird, auf pH 8,2 verwendet wird. Ausbeute: etwa 26.5 mg/kg Pankreas. Gehalt: 22,25 LU. mg.

Beispiel 9

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wird mit der Ausnahme wiederholt, daß 1 η wäßrige Ammoniumhydroxidlösung zur Einstellung der sauren Lösung, die durch Extraktion des bei pH 5.2 gefällten Niederschlags erhalten wird, auf pH 8.2 verwendet wird. Ausbeute: etwa 89 mg/kg Pankreas. Gehalt: 20,15 LU. mg.

Beispiele 10 bis 12

Die Arbeitsweise der Beispiele 1, 8 und 9 wird mit der Ausnahme wiederholt, daß festes Material verwendet wird, das durch Extraktion von Rinderpankreas statt von Schweinepankreas erhalten wurde. Die Insulinausbeute, die bei Basifizierung der wäßrigen Essigsäurelösung, die durch Extraktton des bei pH 5,2 gefällten Niederschlags erhalten wird, mit Natriuinhydroxid erzielt wird, beträgt etwa 202 mg/kg Pan kreas. Gehalt: 22,70 π 2,40 I.U./mg.

Die Insulinausbeute, die bei Basifizierung des sauren Extrakts mit Kaliumhydroxid erzielt wird, beträgt etwa 178 mg/kg Pankreas. Gehalt: 23.68 fc 1,39 I.U./ »5 mg.

Die Insulinausbeute, die bei Basifizierung des sauren Extrakts mit Ammoniumhydroxid erzielt wird, beträgt etwa 109 mg/kg Pankreas. Gehalt: 23,68 { 1.92 LU./ mg.

Beispiel 13

Das feste Material, das durch Extraktion von etwa 9 kg Rinderpankreas und Fällung der darin enthal tenen insulinhaltigen Fraktion erhalten wird, wird in 1,89 1 0,5 η wäßriger Essigsäure gelöst, so daß eine Lösung mit einem pH-Wert von 3,6 und einem Gehalt von 4,2°/_e (Gewicht/Volumen) Feststoffen mit 2.2 I. U./mg erhalten wird. Dann wird wäßrige 1 n- Natriumhydroxidlösung bis pH 8,2 zugegeben. Die

Lösung wird 1 Stunde lang gerührt und dann mit 60,0 g Natriumchlorid versetzt. Die Kristallisation beginnt in etwa 15 Minuten und ist nach etwa 18 Stunden langem Rühren der Lösung bei etwa Raumtemperatur beendet. Die Natrium-Insulinkristalle werden durch Zentrifugieren isoliert. Ausbeute: etwa 98,5 mg/ kg extrahierter Pankreas. Zur Erhöhung der Natriumionenkonzentration der überstehenden Flüssigkeit auf 1.0 m wird weiteres Natriumchlorid zugesetzt. Daraus kristallisieren weitere 11,2 mg Natrium-Insulinkristalle

pro 0,45 kg Pankreas aus. Gesamtausbeute: etwa 118 mg/kg extrahierter Pankreas.

Durch die Isolierung und Reinigung von Insulin durch Kristallisieren der Alkali- oder Ammonium-Insulinkristalle nach dem erfindungsgemäßen Ver-

fahren wird eine höhere Ausbeute an reinerem Insulin als nach bekannten Verfahren erzielt, bei denen eine isoelektrische Fällung oder Zink-Insulinkristallisation angewandt wird. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann ein rohes Insulinpräparat, das nur 2 bis

5 internationale Einheiten (LU.) Insulinaktivität pro mg Feststoffe enthält, in einem einzigen Fällungs-Filtrations-Arbeitsgang unter Gewinnung von 90 bus 95°/₀ des insulins aus einem wäßrig-sauren Pankreasextrakt zu einem Produkt mit einer Aktivität von etwa 22 bis 26 I. U./mg gereinigt werden.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Reinigung von Insulin aus einem wäßrigen insulinhaltigen Pankreasextrakt oder anderen wäßrigen insulinhaltigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Basizität der insulinhaltigen Lösung auf pH 7.2 bis 10.0 und die Alkalikationen- oder Ammoniumkationenkonzentration auf eine 0,2 bis 1.0 m Konzentration dieser Kationen einstellt und dadurch die Kristallisation des Alkali- oder Ammonium-Insulins veranlaßt.

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