DE2505308C2

DE2505308C2 -

Info

Publication number: DE2505308C2
Application number: DE19752505308
Authority: DE
Inventors: Richard Lee Indianapolis Ind. Us Jackson
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1975-02-07
Filing date: 1975-02-07
Publication date: 1987-06-19
Also published as: DE2505308A1

Description

Gegenstand der Erfindung ist das in den voranstehenden Ansprüchen angegebene Verfahren.

Kurz nach der Entdeckung von Insulin im Jahre 1921 durch Banting und Best wurde von mehreren Forschern (Murlin et al., J. Biol. Chem. 56, 252 [1953] und Kimball and Murlin, J. Biol. Chem. 58, 337 [1924]) festgestellt, daß bestimmte Pankreasextrakte von Insulin hyperglykämisch wirken. Der für diese hyperglykämische Wirkung verantwortliche Faktor wurde als Glucagon bezeichnet.

Zur Zeit besteht die wichtigste Verwendungsart von Glucagon in der Behandlung von durch Insulin induzierter Hypoglykämie. Nachdem die Anzahl der Diabetiker auf der Welt zunimmt, steigt auch der Bedarf an Glucagon. Darüber hinaus untersucht man augenblicklich den Einsatz von Glucagon bei kardialen Störungen. Diese beiden Anwendungen stellen daher erhöhte Anforderungen an die Produktion von Glucagon, und der hierdurch bedingte erhöhte Bedarf wird am besten durch Verbesserung der Ausbeute an Glucagon aus natürlichen Quellen gedeckt.

Über die erste Gewinnung von kristallinem Glucagon wurde im Jahre 1953 berichtet (Staub et al., Science, 117, 628 [1953] und Staub et al., J. Biol. Chem. 214, 619 [1955]). Als Ausgangsmaterial wurde dabei eine amorphe Fraktion verwendet, die man bei der technischen Gewinnung von Insulin erhält, die in einer Säure-Alkohol-Extraktion von Pankreasgewebe, Konzentration des Extraktes, Ausfällung mit Natriumchlorid, isoelektrische Ausfällung, mehrmaligem Fraktionieren mit Alkohol, Entfärben, Kristallisieren mit Zink aus Acetatpuffer, Waschen zum Entfernen der amorphen Fraktion und Trocknen des dabei erhaltenen Zinkinsulins bestand. Die amorphe Fraktion enthielt etwa 4 Gewichtsprozent Glucagon und etwa 7 Gewichtsprozent Insulin. Die Ausbeute an amorphem Material lag normalerweise zwischen etwa 10 und etwa 20 Milligramm pro Kilogrann Pankreas. Die Glucagonpräparation mußte selbst wiederum gegebenenfalls bei pH 6,7 fraktioniert, mit Aceton fraktioniert, bei pH 4,3 fraktioniert gefällt, zweimal bei pH 2,5 fraktioniert gefällt und zweimal aus Harnstoff-Glycin-Puffer bei pH 8,6 umkristallisiert werden. Die Ausbeute an kristallinem Glucagon betrug etwa 20 Gewichtsprozent des in dem trockenen amorphen Material enthaltenen Glucagons, was einer Ausbeute von etwa 0,08 bis etwa 0,16 mg Glucagon pro Kilogramm Pankreas entsprach.

Der Einbau einer dazwischenliegenden Kristallisation des Zinkinsulins aus Citratpuffer, wie dies in US-PS 26 26 228 beschrieben wird, führte insgesamt zu einer Erniedrigung der bei der Gewinnung von Insulin aus Rinderpankreas erforderlichen Anzahl von Verfahrensstufen. Man erhielt dabei zwar während des Waschverfahrens etwa die gleiche Menge an amorpher Fraktion wie beim früheren Verfahren, doch erniedrigte sich hierbei der Glucagongehalt der amorphen Fraktion auf nur etwa 0,2 Gewichtsprozent. Es wurde schließlich festgestellt, daß das Glucagon bei der dazwischengeschalteten Kristallisation im Citratpuffer zurückgehalten wurde. Zur Gewinnung von Glucagon aus dem Citratpuffer war eie Ausfällung mit überschüssigem Zink, anschließende Salzfällung und schließlich zweimalige Ausfällung bei pH 5,1 bis 5,6 erforderlich, um das Zink zu entfernen. Die Ausbeute an Rohglucagon aus dem Citratpuffer entsprach etwa 1,6 bis 1,8 Milligramm pro Kilogramm Pankreas, und man hielt hieraus eine etwa 0,2 bis 0,6 Milligramm pro Kilogramm Pankreas entsprechende Ausbeute an reinem Glucagon. Der Einsatz von Zink als Fällungsmittel erschwerte eine vollständige Entfernung von Zink und erhöhte die Insulinmenge, die in das schließlich erhaltene gereinigte Glucagon mitgeschleppt wurde.

Untersuchungen von Pankreasextraktionen zeigten, daß die normalerweise zur Gewinnung von Insulin verwendeten verschiedenen Säure-Alkohol-Extrakte 8 bis 12 mg Glucagon pro Kilogramm Pankreas enthielten. Nach Einengen und Entfetten der Extrakte fiel der Glucagongehalt auf 3,0 bis 4,0 mg pro Kilogramm. Wie oben erwähnt, sind jedoch nur etwa 25 bis 50 Gewichtsprozent dieser Menge für eine Reinigung verfügbar, was vom jeweiligen Ausgangsmaterial abhängt.

Die Zeichnung zeigt ein Fließschema einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung. Aus der Zeichnung wird ferner die Beziehung zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren und der Stufe der alkalischen Kristallisation beim Verfahren der Insulinherstellung ersichtlich.

Als Glucagonquelle wird für das erfindungsgemäße Verfahren die überstehende Flüssigkeit verwendet, die man bei der Gewinnung von Insulin bei der Stufe der alkalischen Kristallisation erhält, wie dies in US-PS 37 19 655 beschrieben ist. Diese überstehende Flüssigkeit ist eine wäßrige Lösung mit einem pH-Wert von 7,2 bis 10,0 und einer 0,2- bis 1,0molaren Kationenkonzentration, und in ihr ist Protein gelöst, das etwa 1 bis 10% Insulin und etwa 0,2 bis 1,5% Glucagon enthält, und zwar je nach der bei der Gewinnung von Insulin verwendeten Pankreasquelle. Geht man beispielsweise von Rinderpankreas aus, dann enthält das dabei bei der alkalischen Kristallisation in der überstehenden Flüssigkeit enthaltene Protein normalerweise etwa 5 bis 10% Insulin und 1,0 bis 1,5% Glucagon. Verwendet man Schweinepankreas, dann enthält das überstehende Protein normalerweise etwa 1 bis 2% Insulin und etwa 0,2 bis 0,3% Glucagon. Zu beachten ist jedoch, daß die tatsächlichen Ausbeuten an Glucagon von Charge zu Charge ziemlich stark verschieden sein können, da das Glucagon enzymatisch abgebaut werden kann.

Die Abtrennung des glucagonhaltigen Proteins aus der bei der alkalischen Kristallisation anfallenden überstehenden Flüssigkeit stellt die erste Stufe dieses Verfahrens dar. Sie ist durch Einsatz einer isoelektrischen Fällung gekennzeichnet.

Die isoelektrische Fällung macht einen pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit im Bereich von etwa 4,2 bis etwa 6,6 erforderlich. Bevorzugt wird dabei ein pH-Wert im Bereich von etwa 4,6 bis etwa 5,2, und insbesondere ein pH-Wert im Bereich von etwa 4,7 bis etwa 5,0.

Da die bei der alkalischen Kristallisation erhaltene überstehende Flüssigkeit ein pH-Wert von etwa 7,2 bis etwa 10 hat, muß die überstehende Flüssigkeit auf den gewünschten pH-Wert angesäuert werden. Eine solche Ansäuerung läßt sich normalerweise durch einfachen Zusatz einer verdünnten Lösung einer anorganischen oder organischen Säure erreichen, die das Glucagon nicht abbaut oder stört. Beispiele geeigneter Säuren sind Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Ameisensäure, Essigsäure und Propionsäure, Chlorwasserstoffsäure wird bevorzugt.

Zur Erniedrigung der Löslichkeit des glucagonhaltigen Proteins in der alkalischen Kristallisationsflüssigkeit werden wahlweise und vorzugsweise bis zu etwa 20 Volumprozent eines Alkohols zugegeben. Unter Alkohol wird dabei ein gesättigter aliphatischer Monoalkohol mit weniger als etwa 6 Kohlenstoffatomen verstanden. Der zu verwendende Alkohol hat vorzugsweise weniger als etwa 4 Kohlenstoffatome und ist vorzugsweise Methylalkohol, Äthylalkohol, Propylalkohol oder Isopropylalkohol. Insbesondere wird Äthylalkohol bevorzugt. Falls man in Gegenwart eines solchen Alkohols arbeitet, dann wird dieser der überstehenden Flüssigkeit normalerweise vor dem Ansäuern zugesetzt.

Nach Ansäuern der überstehenden Flüssigkeit auf den gewünschten pH-Wert fängt die Ausfällung des gewünschten glucagonhaltigen Proteins rasch an, und zwar normalerweise innerhalb von Minuten. Für eine sichere vollständige Ausfällung läßt man die Lösung stehen, und zwar normalerweise bei nicht über Umgebungstemperatur liegende Temperaturen. Die Lösung wird vorzugsweise auf eine Temperatur von etwa 3 bis etwa 10°C abgeschreckt. Die Ausfällung ist im allgemeinen zwar nach etwa 24 Stunden beendet, man kann das Gemisch jedoch ohne nachteilige Wirkungen unbegrenzt stehenlassen.

Nach beendeter Ausfällung wird die Ausfällung, die man im folgenden als isoelektrische Ausfällung bezeichnet, in irgendeiner bekannten Weise isoliert, beispielsweise durch Zentrifugieren oder Filtrieren, wobei man normalerweise eine Filtration bevorzugt. Die auf diese Weise erhaltene isoelektrische Ausfällung braucht weder gewaschen noch getrocknet zu werden, solche Verfahren können jedoch gewünschtenfalls angeschlossen werden.

Das durch isoelektrische erhaltene glucagonhaltige Protein löst man in einem sauren wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von unter 2,7. Der pH- Wert reicht hierbei von etwa 1,5 bis etwa 2,7, bevorzugt wird jedoch ein pH-Bereich von etwa 2,0 bis etwa 2,5. Hierzu kann man jede geeignete Säure verwenden, doch wird auch hier Chlorwasserstoffsäure bevorzugt. Bei Einsatz von Chlorwasserstoffsäure sollte jedoch auch ein Konservierungsmittel, wie Phenol, mitverwendet werden, und zwar normalerweise in einer Konzentration von etwa 0,2%, auf Gewicht pro Volumen bezogen. Das glucagonhaltige Protein wird am besten in 0,01 n-Chlorwasserstoffsäure gelöst, die 0,2% Phenol enthält, und zwar bezogen auf Gewicht pro Volumen.

Die Konzentration des glucagonhaltigen Proteins in der Lösung kann im allgemeinen im Bereich von etwa 2,5 bis etwa 30 mg pro Millimeter liegen. Der bevorzugte Bereich beträgt etwa 5 bis etwa 20 mg/ml, und er liegt insbesondere bei etwa 5 bis etwa 10 mg/ml.

Zur Einleitung der Fibrillenbildung versetzt man die saure glucagonhaltige Proteinlösung mit einem wasserlöslichen anorganischen Salz. Unter wasserlöslich versteht man dabei anorganische Salze, die sich bei den oben beschiebenen Konzentration in Wasser lösen. Da angenommen wird, daß das anorganische Salz in bezug auf die Einleitung der Fibrillenbildung vorwiegend einen Aussalzeffekt hat, ist die Wahl eines entsprechenden anorganischen Salzes nicht kritisch.

Der Temperaturbereich, bei dem es zur Bildung von Glucagonfibrillen kommt, reicht von etwa 20 bis etwa 30°C. Bevorzugt wird ein Temperaturbereich von etwa 24 bis etwa 26°C und insbesondere eine Temperatur von 25°C.

Die Fibrillenbildung, die durch Rühren unterstützt wird, beginnt normalerweise innerhalb von etwa 3 bis 4 Stunden von dem Zeitpunkt an, zu dem die Herstellung der sauren wäßrigen Glucagonlösung beendet ist, und sie ist innerhalb von etwa 48 Stunden beendet. Bildungszeiten von über 48 Stunden sind normalerweise nicht erforderlich.

Nach beendeter Fibrillenbildung kann man die Glucagonfibrillen in jeder bekannten Weise sammeln, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, wobei letzteres bevorzugt wird. Die Glucagonfibrillen können gewünschtenfalls gewaschen werden, indem man die Fibrillen in einem wäßrigen sauren Medium suspendiert, das ein anorganisches Salz enthalten kann oder auch nicht. Die Temperatur des Waschmediums kann im Bereich von etwa 20 bis etwa 30°C liegen, wobei eine Temperatur von 25°C bevorzugt wird. Die Fibrillen werden dann wie vorher gesammelt und in der Kälte aufgehoben, normalerweise bei einer Temperatur von unter etwa 10°C, falls man nicht unmittelbar zur nächsten Verfahrensstufe übergeht.

Dem fibrillenbildenden Medium kann gewünschtenfalls auch ein chelatbildendes Mittel zugesetzt werden, wie Äthylendiamintetraessigsäure. Die Konzentration eines derartigen chelatbildenden Mittels liegt normalerweise bei unter etwa 0,01 Mol, wobei eine Konzentration von 0,004 Mol bevorzugt wird. Der Einsatz eines chelatbildenden Mittels ist jedoch nicht bevorzugt, es sei denn, man weiß, daß Zink- oder sonstige zweiwertige Metallionen vorhanden sind.

Die zur Reinigung des in der zweiten Verfahrensstufe erhaltenen Glucagons angewandte Kristallisation wird im allgemeinen ausgeführt, indem man das Glucagon in einem alkalisch wäßrigen Medium löst und die Lösung dann zum Starten der Kristallisation auf einen leicht alkalischen oder sauren pH-Wert ansäuert, d. h. auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 4,5 bis etwa 8,5 bringt.

Das Glucagon kann auf zwei verschiedenen Wegen aufgelöst werden. Man kann es nämlich entweder direkt in einem alkalisch wäßrigen Medium lösen, oder man kann das Glucagon in destilliertem Wasser suspendieren und den pH-Wert durch Zugabe von wäßriger Base entsprechend einstellen. Geeignete Basen hierfür sind im allgemeinen die Alkali- oder Ammoniumhydroxide, wobei Kaliumhydroxid bevorzugt wird.

Die dabei erhaltene Glucagonlösung kann im allgemeinen einen pH-Wert im Bereich von etwa 9,0 bis etwa 11,5 haben, wobei ein pH-Bereich von etwa 9,5 bis etwa 10,5 bevorzugt wird.

Die Glucagonkonzentration in der alkalischen Lösung sollte im Bereich von etwa 2 bis etwa 10 mg/ml liegen. Bevorzugt wird ein Konzentrationsbereich von etwa 4 bis etwa 8 mg/ml, und insbesondere eine Konzentration von etwa 5 mg/ml.

Da es durch Ansäuern häufig zu einer sofortigen Ausfällung einer kleinen Menge von Nichtglucagonprotein kommt, wird das folgende Verfahren zum Ansäuern bevorzugt, was jedoch nicht wesentlich ist.

Die alkalische Glucagonlösung wird auf eine Temperatur von etwa 55 bis etwa 65°C erhitzt. Die Lösung säuert man dann mit 10prozentiger Phosphorsäure auf einen pH-Wert von etwa 4,5 bis etwa 6 an. Das Ansäuern kann zwar mit allen in den vorhergehenden Stufen als geeignet empfundenen Säuren erfolgen, der Einsatz von Phosphorsäure wird jedoch bevorzugt. Die dabei erhaltene Lösung wird dann bei der anfänglich erhöhten Temperatur filtriert. Diese Filtration ist nicht notwendig, und sie kann häufig unterlassen werden, wenn sich beim Ansäuern nur ein minimaler Niederschlag bildet. Anstelle der Filtration kann man gewünschtenfalls auch eine Zentrifugation vornehmen.

Falls die Glucagonlösung gefärbt ist, dann kann man sie zum Entfärben nach oder vorzugsweise vor dem Ansäuern mit Aktivkohle versetzen.

Nach dem Ansäuern und eventueller Filtration läßt man die Glucagonlösung bei einer Temperatur im Bereich von etwa 2 bis etwa 10°C und über eine Kristallisationszeit von etwa 24 bis etwa 120 Stunden stehen. Bevorzugt wird hierbei eine Temperatur von 4°C. Die Kristallisationszeit liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 72 bis etwa 120 Stunden, und sie beträgt insbesondere 72 Stunden.

Die Hauptmenge der überstehenden Flüssigkeit wird von den erhaltenen Glucagonkristallen dekantiert, was normalerweise durch einen Filter erfolgt. Die restliche überstehende Flüssigkeit entfernt man von den Glucagonkristallen normalerweise durch Zentrifugieren. Das gereinigte Glucagon wird dann der Reihe nach mit verdünnter Salzsäure (die normalerweise 0,001prozentig ist) und Wasser gewaschen. Anschließend wird das Glucagon lyophylisiert und in der Kälte gelagert.

Je nach der Reinheit des bei der zweiten Verfahrensstufe erhaltenen Glucagons und der für das fertige gereinigte Glucagon gewünschten Reinheit können eine oder mehrere weitere Kristallisationen eingeschaltet werden. Es zeigte sich jedoch, daß normalerweise insgesamt zwei Kristallisationen ausreichen, damit man ein Glucagon mit einer Reinheit von wenigstens 80% erhält, was sich durch einen Bioversuch an Katzen ergibt.

Arbeitet man mit zwei Kristallisationen, dann wird folgendes Vorgehen bevorzugt: Die erste Kristallisation wird in der oben beschriebene Weise durchgeführt, und die Kristalle werden in einer alkalischen Lösung gelöst. Zur zweiten Kristallisation säuert man auf einen pH-Wert von etwa 7,0 bis etwa 8,5, vorzugsweise etwa 7,3 bis etwa 7,5, und insbesondere 7,4, an. Auflösen und ein eventuelles Filtrationsverfahren werden vorzugsweise bei Temperaturen von etwa 35 bis etwa 45°C, und insbesondere bei einer Temperatur von 40°C, vorgenommen. Die Glucagonkonzentration beträgt vorzugsweise etwa 10 mg/ml.

Gewünschtenfalls kann man die überstehenden Flüssigkeiten von irgendeinem oder allen Kristallisationsverfahren rückleiten. Hierzu kann beispielsweise das gesamte in irgendeiner überstehenden Flüssigkeit gelöste Protein ausgefällt werden, indem man den pH-Wert mit verdünnter Salzsäure auf pH 2,5 bis 3,0 einstellt und dann 20 Gewichtsprozent Natriumchlorid, auf Gewicht pro Volumen bezogen, zugibt. Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag kann entweder getrennt oder gelöst in einer alkalischen Kristallisationsflüssigkeit in die erste Verfahrensstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens eingeführt werden.

Wie bereits oben erwähnt, enthält die bei der alkalischen Kristallisation erhaltene überstehende Flüssigkeit normalerweise wesentlich mehr Insulin als Glucagon in Lösung. Dieses Insulin ist eine Komponente des glucagonhaltigen Proteins, das man durch isoelektrische Fällung erhält. Die zweite Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens, d. h. die Abtrennung von Glucagon von anderen Proteinen, ergibt zwar eine wirksame Trennung des Glucagons vom Insulin, doch kann sich dieses Trennverfahren auf die Insulinkomponente des Proteingemisches nachteilig auswirken. Infolgedessen bedient man sich in der ersten Verfahrensstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens oft einer Arbeitsweise, die ebenfalls zu einer Trennung des Insulins vom Glucagon führt. Eine derartige Arbeitsweise besteht, kurz gesagt, in einem Aussalzen des Glucagons aus einem leicht alkalischen phenolischen wäßrigen Medium, wie in der obenerwähnten Arbeit von Staub et al. beschrieben. Die insulinhaltige überstehende Flüssigkeit wird in das Insulinherstellungsverfahren rückgeleitet, und das ausgefallene Rohglucagon setzt man in die zweite Verfahrensstufe (B₂) des erfindungsgemäßen Verfahrens ein.

Die überstehende Flüssigkeit aus der Verfahrensstufe der Fibrillenbildung wird vorzugsweise in das Insulinherstellungsverfahren rückgeleitet, und zwar normalerweise zu Beginn der in US-PS 37 19 655 beschriebenen alkalischen Kristallisation. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist eine derartige Maßnahme jedoch nicht wesentlich. Eine derartige Rückleitung ist natürlich auch nicht erforderlich, wenn das Insulin vor der Fibrillenbildung in der oben beschriebenen Weise vom Glucagon getrennt wurde. In einem derartigen Fall würde das so abgetrennte Insulin jedoch in das Insulinherstellungsverfahren rückgeleitet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren und seine Beziehung zum Insulinherstellungsverfahren lassen sich anhand der Zeichnung möglicherweise besser verstehen, die in Fließbild einer erfindungsgemäßen Ausbildungsform darstellt. Der Einfachheit halber ist dieses Fließbild so gezeichnet, als ob die bei der ersten und bei der dritten Verfahrensstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen überstehenden Flüssigkeiten verworfen würden. Diese überstehenden Flüssigkeiten können jedoch selbstverständlich auch in der oben beschriebenen Weise rückgeleitet werden.

Am Kopf der Zeichnung ist das alkalische Kristallisationsverfahren nach US-PS 37 19 655 gezeigt. Dieses alkalische Kristallisationsverfahren führt in der gezeigten Weise zu Alkali- oder Ammoniuminsulin. Da das alkalische Kristallisationsverfahren und das dabei erhaltene Alkali- und Ammoniuminsulin Teil des Insulinherstellungsverfahrens sind, sind die das Verfahren und das Insulin betreffenden Blöcke von einer gestrichelten Linie eingeschlossen und werden als Insulinverfahren bezeichnet. Alles außerhalb dieser gestrichelten Linie Liegende ist daher Teil des erfindungsgemäßen Verfahrens und wird als Glucagonverfahren bezeichnet.

Das erfindungsgemäße Verfahren beginnt, wie gezeigt, mit der überstehenden Flüssigkeit aus der alkalischen Kristallisation. Im Anschluß daran werden die Verfahrensstufen des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt, die, wie gezeigt, zu einem isoelektrischen Niederschlag, Glucagonfibrillen und kristallisiertem Glucagon führen. In der Zeichnung ist ferner die Rückführung der überstehenden Flüssigkeit aus der Stufe der Fibrillenbildung in das Insulinverfahren angegeben.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

14,75 Liter einer bei einer alkalischen Kristallisation anfallenden überstehenden Flüssigkeit aus der Verarbeitung von 5900 kg Rinder-Schweine-Pankreas, die über einen Feststoffgehalt von 40,7 mg/ml verfügt, werden mit 1,45 Liter absolutem Äthanol verdünnt. Den pH-Wert der erhaltenen Lösung stellt man mit 3 n-Chlorwasserstoffsäure auf pH 5,2 ein. Die Lösung wird über Nacht auf 5°C gekühlt. Der dabei entstandene Niederschlag wird abfiltriert, in 11,28 Liter 0,01 n-Chlorwasserstoffsäure, die 0,2% Phenol enthält, bezogen auf Gewicht pro Volumen (was man im folgenden als Säure-Phenol-Wasser bezeichnet) gelöst, und die dabei erhaltene Lösung wird untersucht:

Gesamtfeststoffe:512,6 g (45,4 mg/ml) Insulin:87,43 Einheiten/ml (1,93 Einheiten/mg Feststoffe) Glucagon:463,7 mg/ml (1,02 Prozent der Gesamtfeststoffe)

Eine Teilmenge von 870 ml dieser Lösung wird zur Untersuchung entfernt, so daß 10,4 Liter hiervon mit einem Feststoffgehalt von etwa 473 g zurückbleiben.

Zur Durchführung einer hyperglykämischen Faktorfraktionierung verdünnt man die obige Lösung mit 111,8 Liter Säure-Phenol- Wasser, wodurch man ein Gesamtvolumen von 122,2 Liter erhält, das über einen Feststoffgehalt von 0,387% verfügt. Die verdünnte Lösung wird mit 245,8 ml verflüssigtem Phenol, 941 g Natriumchlorid und so viel 40prozentigem wäßrigem Natriumhydroxid versetzt, daß die Lösung einen pH-Wert von 9,0 erhält, wodurch die Auflösung aller Feststoffe erleichtert wird. Der pH-Wert wird anschließend mit 3 n-Chlorwasserstoffsäure auf pH 7,5 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird dann 1 bis 2 Tage auf 5°C gekühlt, und während dieser Zeit bildet sich ein Niederschlag. Die überstehende Lösung wird anschließend dekantiert und durch Absaugen filtriert. Der ausgefallene Niederschlag wird abzentrifugiert. Die durch Filtrieren und Zentrifugieren erhaltenen Feststoffe werden vereinigt und in 10 Liter Säure-Phenol-Wasser gelöst, und die Untersuchung der erhaltenen Lösung ergibt folgende Werte:

Gesamtfeststoffe:75,0 g (7,5 mg/ml) Insulin:6,33 Einheiten/ml Glucagon:275 mg/ml (5,01 Prozent der Gesamtfeststoffe)

Die obige Lösung wird durch Zugabe von weiteren 5 Liter Säure-Phenol-Wasser auf eine Feststoffkonzentration von 5,0 mg/ml verdünnt. Eine Menge von 5,0 Liter der erhaltenen Lösung wird zur Untersuchung abgetrennt, so daß 10,0 Liter Lösung mit einem Gehalt von etwa 50 g Feststoffen zurückbleiben.

Die Restlösung versetzt man unter Rühren mit 8,0 ml 0,5m wäßriger Äthylendiamintetraessigsäure (als Tetranatriumsalz) und 60 ml 50prozentigem wäßrigem Ammoniumsulfat. Bei Umgebungstemperatur wird 16 Stunden weiter gerührt. Die dabei entstandenen Glucagonfibrillen werden durch Zentrifugieren gesammelt und zweimal mit Säure-Phenol-Wasser gewaschen, das wie vorher Äthylendiamintetraessigsäure und Ammoniumsulfat enthält.

Die Glucagonfibrillen werden in 10 Liter Wasser, das 0,2% Phenol, bezogen auf Gewicht pro Volumen, enthält, suspendiert. Das erhaltene Gemisch wird dann auf 40°C erhitzt, und anschließend stellt man den pH-Wert durch Zugabe von 150 ml 10prozentigem wäßrigem Kaliumhydroxid auf pH 10,5 ein. Anschließend wird die Lösung auf 60°C erhitzt, und man stellt den pH-Wert durch Zusatz von 68 ml 10prozentiger Phosphorsäure auf pH 7,8 ein. Nachdem die Temperatur der Lösung auf 60°C gestiegen ist, stellt man ihren pH-Wert durch Zugabe von weiteren 68 ml 10prozentiger Phosphorsäure auf pH 5,0 ein. Die Lösung wird dann in noch heißem Zustand einfach filtriert, und das erhaltene Filtrat kühlt man 72 Stunden unter Rühren auf 5°C. Das dabei ausgefallene Glucagon wird durch Filtrieren isoliert. Den so erhaltenen Feststoff löst man in der oben für die Glucagonfibrillen beschriebenen Weise. Nach Einstellen des pH-Wertes auf 10,5 liegt das Gesamtvolumen jedoch bei 870 ml. Die Lösung wird dann auf 60°C erhitzt, worauf man den pH-Wert mit 10prozentiger Phosphorsäure auf 5,0 einstellt, und die dabei erhaltene Lösung dann in noch heißem Zustand einfach filtriert. Das Filtrat wird wie oben beschrieben gekühlt und gerührt. Das ausgefallene Glucagon wird durch Zentrifugieren gesammelt und dann lyophylisiert, wodurch man1,84 g gereinigtes Glucagon erhält. Dies entspricht 74% des vor der Fibrillenbildung verfügbaren Glucagons und 39% des nach Ausfällung des Proteins aus der überstehenden Flüssigkeit der alkalischen Kristallisation erhaltenen Glucagons (die Werte für die abgezogenen Proben sind dabei berücksichtigt).

Beispiel 2

Die alkalischen Kristallisationsmutterlaugen aus drei Kristallisationen von Insulin, die man aus 29 627 kg, 37 231 kg und 49 212 kg eines 2 : 1-Gemisches aus Rinder-Schweine-Pankreas erhält, werden durch Zentrifugation von den Insulinkristallen befreit. Bei diesen Mutterlaugen handelt es sich um Mengen von 460 Liter, 515 Liter und 680 Liter, und hierzu werden jeweils 51 Liter, 57,2 Liter und 75,5 Liter absoluter Alkohol gegeben, worauf man jeden Ansatz mit 3 n-Salzsäure auf pH 5,0 einstellt, 15 Minuten rührt und wenigstens 24 Stunden kühlt. Entsprechende Untersuchungen der Mutterlaugen vor der Fällung und von Lösungen der Niederschläge ergeben für die einzelnen Ansätze folgende Werte:

(1) 502 mg Glucagon und 104 Einheiten Insulin/kg ursprünglichem Pankreas (U.P.) in der Mutterlauge
381 mg Glucagon und 132 Einheiten/kg U.P., 27,1 mg Feststoffe/kg U.P. in der Lösung des Niederschlags, 158 Liter
(2) 334 mg Glucagon und 63 Einheiten Insulin/U.P. in der Mutterlauge
157 mg Glucagon und 56 Einheiten Insulin/kg U.P. sowie 12,6 mg Feststoffe/kg U.P. in der Lösung des Niederschlags, 150 Liter
(3) 551 mg Glucagon und 99 Einheiten Insulin/U.P. in der Mutterlauge
429 mg Glucagon und 97 Einheiten Insulin/kg U.P. sowie 26,8 mg Feststoffe/kg U.P. in der Lösung des Niederschlags, 156 Liter

Die Niederschläge werden durch Filtrieren gesammelt und in Säure-Phenol-Wasser gelöst (das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wird).

Die Lösungen der Niederschläge mit einem pH-Wert von 5,0 werden vereinigt, wodurch man insgesamt 464 Liter Lösung erhält (12 570 g Feststoffe), und dann mit Säure-Phenol-Wasser zur Einstellung der Lösung auf einen Feststoffgehalt von 2,0 auf 630 Liter verdünnt, worauf man das Ganze mit weiterer 3 n-Salzsäure auf pH 2,1 einstellt. Die so erhaltene Lösung wird mit 0,3% Ammoniumsulfat behandelt, das in Form einer 50prozentigen Lösung (6 ml pro Liter, 3780 ml) zugegeben wird, worauf man das Ganze bis zur Fibrillenbildung bei 25°C 24 Stunden langsam rührt und dann 48 Stunden bei 15°C stehen läßt. Die Glucagonfibrillen werden von der Restlösung durch Zentrifugieren abgetrennt. Die überstehende Lösung wird untersucht (sie enthält 101 mg Glucagon und 51,7 Einheiten Insulin/kg U.P.) und zur Insulingewinnung rückgeleitet. Die Glucagonfibrillen werden in 450 Liter kaltem Wasser, das 0,2% Phenol enthält, suspendiert, worauf man 2700 ml 50prozentige Ammoniumsulfatlösung zugibt und das Gemisch zum Waschen der Fibrillen 30 Minuten langsam rührt. Die Fibrillen werden dann erneut durch Zentrifugieren gesammelt, und die Waschlauge wird verworfen. Die Glucagonfibrillen werden anschließend in 275 Liter Wasser, das 0,2% Phenol enthält, suspendiert, worauf man das Ganze mit 10prozentiger Phosphorsäure auf pH 3,85 einstellt und anschließend untersucht. Hierbei ergibt sich ein Feststoffgehalt von 2,49 mg/kg U.P. (0,52%, 637 g aus 116 070 kg U.P.), und eine Glucagonmenge von 96,2 mg/kg U.P. (54,2 g).

Die Suspension der Glucagonfibrillen, nämlich 275 Liter hiervon, teilt man für die erste Kristallisation in zwei Mengen auf, und zwar in (1) 135 Liter und in (2) 140 Liter. Die erste Menge wird mit 0,2prozentigem Phenol-Wasser auf 140 Liter verdünnt, wodurch sich eine Feststoffkonzentration von 0,5% ergibt. Die zweite Menge beläßt man bei der Feststoffkonzentration von 0,52%. Jede Fibrillensuspension wird auf 60°C erwärmt und mit 10prozentigem Kaliumhydroxid auf pH 9,0 bis 11,0 [(1) pH 9,9, (2) pH 9,7] eingestellt, wodurch man eine klare Lösung erhält. Hierzu werden dann 281 g Norit® A (0,4 g/g Feststoffe) gegeben, und nach 10 Minuten langem Rühren stellt man die Lösung unter Verwendung von 10prozentiger Phosphorsäure auf pH 5,0 ein und filtriert sie in noch heißem Zustand über eine Nutsche mit einem Filterpapier ED Nr. 613. Das Filtrat (Kristallisationslösung) wird 16 bis 20 Stunden unter Kühlen auf 4°C langsam weiter gerührt, wodurch eine gleichförmgie Glucagonkristallisation gefördert wird. Der durch Filtration bei pH 5,0 und 60°C abgetrennte Niederschlag wird zur Gewinnung zusätzlicher Glucagonkristalle weiter verarbeitet, indem man ihn in 120 Liter 0,2prozentigem Phenol-Wasser in einer Feststoffkonzentration von 0,5% löst (Feststoffversuch, 8,0 g), die Lösung auf 60°C erwärmt, den pH-Wert zum Lösen der Feststoffe auf 10,0 einstellt, anschließend 10 Minuten lang rührt, den pH-Wert dann mit 10prozentiger Phosphorsäure auf 5,0 einstellt und das Ganze schließlich in noch heißem Zustand normal filtriert. Die Filtrate werden 16 bis 20 Stunden unter Kühlen auf 4°C langsam gerührt. Die Kristallisation ist normalerweise nach 72 bis 120 Stunden beendet. Die zweite Ausfällung bei einem pH-Wert von 5,0 wird verworfen. Die Hauptmenge der Kristallisationsmutterlaugen aus dem ersten und dem zweiten Kristallisationsgemisch wird dekantiert und durch Absaugen filtriert. Die erste Mutterlauge behandelt man in jedem Fall mit 20prozentigem Natriumchlorid (Gewicht/Volumen), um auf diese Weise irgendwelches nicht auskristallisiertes Glucagon zu fällen. Die dabei erhaltenen Niederschläge werden zu den anderen Mengen gegeben und nach erneuter Fällung bei pH 4,6 wiederum kristallisiert, wodurch man eine weitere Ausbeute an Glucagonkristallen erhält. Die Glucagonkristalle aus den ersten Mengen, die zur ersten Ausbeute führen und die bei der Aufarbeitung der vereinigten Niederschläge von pH 5,0 aus den ersten Kristallisationen, die die zweite Ausbeute ergeben, erhaltenen Kristalle, werden durch drei Minuten langes Zentrifugieren gesammelt, von den Mutterlaugen getrennt, unter Verwendung von kaltem Wasser als Suspendiermedium in Lyophilisierbehälter übertragen und gefriergetrocknet. Die Glucagonkristalle aus der Zwischenkristallisation werden gewogen, und die dabei erhaltenen Proben werden untersucht.

Glucagonkristalle bei der Zwischenkristallisation

Ausbeute (erste Ernte): (1) 41,0 g (91,7 Prozent rein) und (2) 44,0 g (86,8 Prozent rein) auf 85,0 g (89,1 Prozent rein), 75,8 g Glucagon, 132,5 mg/kg U.P. (rein) oder 151 mg/kg (als solches)

Kristalle der ersten Aufarbeitung (zweite Ernte)

Ausbeute: 19,0 g (100,0 Prozent rein), 34 mg/kg U.P. (rein und als solches)

Kristalle aus der zweiten Aufarbeitung (erste Mutterlaugen)

Ausbeute: 22,0 g (46,0 Prozent rein) oder 9,9 g, 17,7 mg/kg U.P. (rein) oder 38,6 mg/kg (als solches)

Gesamtausbeute:

126,0 Feststoffe (216 mg/kg U.P.) mit 83,1prozentiger Reinheit oder 104,7 Glucagon (186 mg/kg U.P.)

Die Umkristallisation wird in Verbindung mit anderen angesammelten Zwischenkristallen vorgenommen. Die schließlich erhaltenen Glucagonkristalle machen 85% des in den Zwischenkristallen vorhandenen Glucagongewichts aus. Die Umkristallisation erfolgt bei pH 7,5 nach Lösen der Zwischenkristalle bei pH 8,0 bis 10,0 mit 10prozentigem Kaliumhydroxid bei 40°C und einer Feststoffkonzentration von 1,0 sowie durch Einstellen des pH-Wertes mit 10prozentiger Phosphorsäure auf pH 7,5, anschließendes Filtrieren und Abkühlen. Die dabei erhaltenen Kristalle werden durch Zentrifugieren gesammelt, nachdem man die Hauptmenge der Mutterlauge (die hinsichtlich einer weiteren Ausbeute aufgearbeitet wird) dekantiert hat, und man wäscht sie anschließend zweimal mit 0,001prozentiger Natriumchloridlösung, sowie einmal mit kaltem destilliertem Wasser, worauf man das Ganze gefriertrocknet. Die berechnete Ausbeute beträgt 89,0 g oder 158 mg/kg U.P., und die Gewinnung aus der Mutterlauge der alkalischen Kristallisation liegt bei 33,2%.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von Glucagon aus einer alkalischen Kristallisation von Insulin anfallenden überstehenden wäßrigen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der Glucagon, Insulin und Proteine enthaltenden Flüssigkeit entweder

A₁) Glucagon enthaltende Proteine durch isoelektrische Fällung bei einem pH-Wert von etwa 4,2 bis etwa 6,6 isoliert,
B₁) das gemäß Verfahrensstufe A₁) erhaltene glucagonhaltige Protein in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert im Bereich von etwa 1,5 bis etwa 2,7 löst, die Lösung mit einem wasserlöslichen anorganischen Salz versetzt und die bei etwa 20 bis etwa 30°C gebildeten Glucagonfibrillen von anderen Proteinen abtrennt und
C₁) das gemäß Verfahrensstufe B₁) erhaltene Glucagon durch Kristallisation bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,5 bis etwa 8,5 reinigt oder
A₂) Glucagon enthaltende Proteine durch isoelektrische Fällung bei einem pH-Wert von 5,2 und anschließendes, in bekannter Weise durchgeführtes Aussalzen aus einem phenolischen wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von 7,5 isoliert,
B₂) das gemäß Verfahrensstufe A₂) erhaltene glucagonhaltige Protein in 0,01 n-Salzsäure, die 0,2% Phenol enthält, bezogen auf Gewicht pro Volumen, löst und in Gegenwart von Ethylendiamintetraessigsäure und Ammoniumsulfat die gebildeten Glucagonfibrillen von anderen Proteinen abtrennt und
C₂) das gemäß Verfahrensstufe B₂) erhaltene Glucagon durh Kristallisation bei dem pH-Wert von 5,0 reinigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kristallisation in Stufe C₁ bei einer Glucagonkonzentration von etwa 2 bis etwa 10 mg Glucagon pro ml Lösung durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zwei aufeinanderfolgende Kristallisationen durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die erste Kristallisation bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,5 bis etwa 8,5 durchführt und die zweite Kristallisation bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 7,0 bis etwa 8,5 vornimmt.