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Verfahren zur Gewinnung von Insulin aus einem Wasser und ein mit Wasser
mischbares organisches Lösungsmittel enthaltenden Pankreasextrakt Bekanntlich wird
Insulin aus gemahlenem Pankreas, z. B. von Pferden, Schweinen oder Rindern, gewöhnlich
mittels eines angesäuerten Gemisches aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel,
z. 3. einem Alkohol - Äthanol, Methanol - oder Aceton, extrahiert. Zwar kann die
Extraktion auch mittels Wasser durchgeführt werden, aber dabei tritt eine sehr starke
Zersetzung des Insulins auf, da die proteolytischen Enzyme aus dem Pankreas in aktiver
Form auch in den Extrakt aufgenommen werden. Einerseits wird diese Zersetzung von
Insulin durch die Verwendung von Alkohol oder Aceton auf ein Mindestmaß herabgesetzt,
andererseits bringt gerade die Verwendung dieser organischen Flüssigkeiten wieder
Schwierigkeiten mit sich. Aus der Extraktionsflüssigkeit wird nämlich nach etwaiger
Reinigung der erste das Insulin enthaltende Niederschlag durch Aussalzen, gegewöhnlich
durch Zusatz von Natriumchlorid bis zu einer
eigen Konzentration,
erhalten, wobei ein Aussalzkuchen erhalten wird, der aus einer Proteinfraktion besteht,
die lediglich dann, wenn die Extraktionsflüssigkeit hinreichend frei von organischen
Lösungsmitteln wie Alkohol oder Aceton ist, die ganze oder nahezu ganze Menge an
extrahiertem Insulin enthält. Alkoholkonzentrationen von etwa 2 5t setzen die Ausbeute
an Insulin bei diesem Aussalzverfahren bereits erheblich herab. Es ist daher notwendig,
bevor das Insulin aus der Extraktionsflüssigkeit auf übliche Weise gesammelt werden
kann, zunächst das organische Lösungsmittel zu entfernen, was gewöhnlich durch Destillation
bei niedriger Temperatur und niedrigerem Druck erfolgt. Dieser Vorgang erfordert
eine teure Apparatur und führt dennoch, sogar bei der größten Sorgfalt in der Durchführung,
eine partielle Denaturierung des Insulins herbei.
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Außerdem lösen sich in diesen organischen Lösungsmitteln fettartige
Stoffe aus den Drüsen, die sich bei Verringerung der Alkohol- oder Acetonkonzentration
wieder ablagern. Zum Entfernen dieser fettartigen Bestandteile aus dem Extrakt muß
die Destillation unterbrochen werden, nicht nur, weil das Abdestillieren des organischen
Lösungsmittels bei Anwesenheit dieser ungelösten fettartigen Stoffe erschwert wird,
sondern besonders auch, weil dieses Gemisch fremder Bestandteile auch Stoffe enthält,
die bei einer niedrigen Alkohol- oder Acetonkonzentration in wässerigem Milieu eine
zersetzende Wirkung auf das Insulin ausüben.
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In der britischen Patentschrift 566 351 wird ein Verfahren beschrieben,
bei dem die vorgenannten Schwierigkeiten vermieden werden sollen. Dabei werden aus
einem alkoholischen Pankreasextrakt zunächst die fett artigen Stoffe durch Herabsetzung
des Alkoholgehalts ausgefällt, was entweder durch Hinzufügen von Wasser oder durch
Abdestillieren von Alkohol
erfolgen kann. Aus diesem so vorgereinigten
Extrakt wird dann das Insulin durch Zusatz von Pikrinsäure ausgefällt. Diese Ausfällung
ist jedoch sehr abhängig von dem Alkoholgehalt der Insulinlösung. So kann z. B.
das Insulin nur dann nahezu quantitativ aus einer 1% igen Lösung gefällt werden,
wenn diese höchstens 33 bis 94 ffi Alkohol enthält. Schon eine Erhöhung des Alkoholgehalts
um 1 % führt zu einer unvollständigen Insulinfällung, während weiterhin bei einem
Gehalt von 36,8 % Alkohol in der Insulinlösung nur noch 38 ffi des Insulingehalts
ausgefällt werden. Als weiterer Nachteil ergibt sich bei dem vorstehend beschriebenen
Verfahren der britischen Patentschrift, daß das ausgefällte Pikrat nur schwierig
und mit großen Verlusten wieder in Lösung gebracht werden kann.
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Es wurde nunmehr gefunden, daß die vorstehend geschilderten Nachteile
vermieden werden bei einem Verfahren zur Gewinnung von Insulin aus einem Wasser
und ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel enthaltenden Pankreasextrakt
durch Fällung des Insulins mit Metallionen derjenigen Gruppen von Metallen, welche
die Kristallisierung von Insulin fördern, wie Zn, Cd, Fe, Ni, Co, Cu und Mn, besonders
mit Zinkionen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Fällung durch Alkalizugabe
in der gegebenenfalls entfetteten Lösung vornimmt, die in bekannter Weise durch
Extraktion der Drüsen mit einem sauren Gemisch von Wasser und mit Wasser mischbarem
organischem Lösungsmittel erhalten worden ist, den Niederschlag in verdünnter Säure
aufnimmt und aus dieser Säurelösung das Insulin nach bekannten Verfahren gewinnt.
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Der Extrakt wird in üblicher Weise dadurch erhalten, daß gemahlenes
Pankreas innig, vorzugsweise mehrmals, mit einer Extraktionsflüssigkeit vermischt
wird. Gemäß den bekannten Extraktionsverfahren wird dabei Äthanol als organisches
Lösungsmittel verwendet und die Flüssigkeit wird zweckmäßig mit Salzsäure angesäuert.
Es können aber auch andere Säuren, wie z. B.
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Essigsäure ; Oxalsäure oder Zitronensäure, und andere organische Lösungsmittel,
wie z. B. ethanol oder Aceton, verwendet werden. Die Konzentrationen des organischen
Lösungsmittels und der zugesetzten Säure werden meistens so gewählt, daß eine Extraktionsflüssigkeit
erhalten wird, die einen Gehalt von 60 bis 80 ffi des organischen Lösungsmittels
und einen pH-Wert von 2 bis 3,5 hat. Bei Verwendung von Alkohol können jedoch auch
niedrigere Konzentrationen verwendet werden. Die Menge der Extraktionsflüssigkeit
schwankt gewöhnlich zwischen der weil bis siebenfachen Gewichtsmenge des verwendeten
Pankreas. Wird ein wenig selektives Extraktionsverfahren durchgeführt, wie z. B.
das Verfahren mit Alkohol-Salzsäure, so wird gewöhnlich zunächst ein Teil des Ballastproteins
dadurch entfernt, daß der Extrakt, z. B. durch Zusatz von Ammoniak, neutralisiert
oder alkalisch gemacht und der erhaltene Niederschlag abfiltriert wird.
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Das Pankreas, von dem ausgegangen wird, enthält gewöhnlich 65 bis
75 ffi Wasser, während der Trockenstoff, in Abhängigkeit von der Tierart und von
der Güte des Pankreas, eine größere oder kleinere Menge Fette oder fettartige Stoffe
enthält. Bei Verwendung von Rinderpankreas können pro Kilogramm verwendetem Pankreas
etwa 20 bis 50 g dieser fettartigen Stoffe, die im wesentlichen aus Fettsäuren und
Lipoiden bestehen, in den Extrakt gelangen; bei Schweinepankreas können diese Mengen
erheblich höher sein.
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Wenn diese fettartigen Stoffe nicht vorher aus dem Extrakt entfernt
werden, werden sie bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mit der Proteinfraktion in
Form von Seifen niedergeschlagen, da diejenigen Metalle, die bekanntlich die Kristallisation
von Insulin fördern können, außerdem unlösliche fettsaure Salze liefern. Dies muß
bei der Wahl der zuzusetzenden Metallionen berücksichtigt werden. Aus den erhaltenen
Niederschlag von Proteinen und fettsauren Salzen kann die insulinhaltige
Fraktion
mit angesäuertem Wasser, z. B. verdünnter Salzsäure, gelöst werden.
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Mit Rücksicht auf die schwierige Filtrierbarkeit dieser fettsauren
Salze ist es jedoch vorzuziehen, bei dem erficdungsgemäßen Verfahren zunächst, d.
h. vor dem Niederschlagen der Proteinfraktion, die fettartigen Stoffe aus dem Extrakt
zu entfernen. Dieses Entfernen des Fettes kann durch bekannte Verfahren, durch Erniedrigung
der Konzentration des organischen Lösungsmittels, durch Destillation oder durch
Verdünnung mit Wasser und darauffolgende Filtration des Extraktes durchgeführt werden.
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Es ist einer der überraschenden Aspekte der vorliegenden Erfindung,
daß auch aus einer äußerst verdünnten Insulinlösung die insulinhaltige Proteinfraktion
quantitativ niedergeschlagen werden kann, wodurch es möglich ist, in diesem Falle
zum Entfernen des Fettes das sehr einfache Verfahren der Verdünnung des organischen
Lösungsmittels mit Wasser durchzufuhren. Es wird z. B. dem annähernd eigen äthanolischen
Extrakt eine gleiche Menge Wasser zugesetzt, worauf die ausgeschiedenen fettartigen
Stoffe durch Piltration entfernt werden.
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Außerdem wurde gefunden, daß die fettartigen Stoffe auch sehr zweckdienlich
aus dem Extrakt entfernt werden können, indem Ca- oder Mg-Ionen zugesetzt werden,
wobei nur die fettartigen Stoffe und nicht die insulinhaltigen Proteine niedergeschlagen
werden. Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß das Volumen der Extraktionsflüssigkeit
nicht vergrößert zu werden braucht, während im Gegensatz zu dem Verfahren, bei dem
Fettsäure und insulinhaltige Proteine gleichzeitig niedergeechlagen werden, nur
einmal ein Seifenniederschlag abfiltriert zu werden braucht.
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Im aligemeinen wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren von einer
Flüssigkeit ausgegangen, die pro Kilogramm Pankreas etwa 2 bis 10 1 organisches
Lösungsmittel enthält und in der etwa 5 bis 25 g proteinartige Stoffe gelöst sind.
Aus dieser Proteinfraktion können in Abhängigkeit von der Güte des Pankreas 2000
bis 5000 I. E., d. h. 80 bis 200 mg, reines Insulin gewonnen werden, wobei diese
Flüssigkeit gegebenenfalls auf eine der vorstehend beschriebenen Weisen von den
fettartigen Stoffen befreit worden ist.
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Aus dieser Fliissigkeit wird durch Zusatz von Metallionen derjenigen
Gruppe von Metallen, welche die Kristallisierung von Insulin fördern, eine Proteinfraktion
(gegebenenfalls gemischt mit Metallsalzen der Fettsäuren der gelösten fettartigen
Bestandteile des Pankreas) niedergeschlagen, welche Proteinfraktion etwa die Hälfte
bis ein Fünftel der Gesamtmenge des Proteins der Lösung enthält, aus der dennoch
das gesamte Insulin gewonnen wird. Auf diese Weise wird bereits eine erste Anreicherung
an Insulin in der aufzuarbeitenden Proteinfraktion erzielt.
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Es ist bekaIlnt, unter Zusatz eines der Metalle Zn, Cd, Co, Ni, Fe,
Cu oder Mn die Kristallisation von Insulin aus einer Lösung ZU fördern. Diese Metalle
müssen dabei in einer gegenüber dem vorhandenen Insulin geringen Menge, z. B. von
0,5 bis 50 Gewichtsprozent, der konzentrierten Insulinlösung zugesetzt werden.
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Es werden z. B. sauren, wässerigen Lösungen von Insulin, die mindestens
0,5 g Insulin pro Liter enthalten, Salzlösungen der vorerwähnten Metalle zugesetzt,
wobei diese Metalle in zweiwertiger Form vorhanden sind, worauf der pH-Wert der
Lösung durch Zusatz von Lauge oder Ammoniak auf 5 bis 6 erhöht wird. Auf diese Weise
werden Insulinkristalle erhalten,
die etwa 0,4 % des Metalles enthalten.
Es werden auch zur Herstellung von Insulinkristallen mit einem höheren Metallgehalt
größere Metallmengen dem in Wasser aufgenommenen Insulin zugesetzt, z. B. bis 500
Gewichtsprozent in Bezug auf die Insulinmenge. Wie jedoch auch in der niederländischen
Patentschrift 84 723 beschrieben ist, hängt die Ausbeute an kristallinem Insulin
bei diesem Kristallisationsverfahren von der Reinheit des gelösten Insulins ab,
und Insulinlösungen, bei denen die gelöste Proteinmenge eine biologische Aktivität
von weniger als 50 I.E. pro mg hat, ergeben gewöhnlich eine weniger zufriedenstellende
Ausbeute.
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Diese bekannte Ausnutzung der die Kristallisation von Insulin fördernden
Metalle erfolgt daher lediglich am Ende der bekannten Insulinherstellungsverfahren,
z. B. nach der isoelektrischen Präzipitation von Insulin aus einer Lösung einer
durch wiederholte fraktionierte Aussalzung praktisch vollkommen von Ballastproteinen
befreiten Proteinfraktion.
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Es ist daher äußerst überraschend, daß aus einer Pankreasextraktionsflüssigkeit,
aus der maximal 200 mg, unter normalen Verhältnissen 5 bis 20 mg Insulin pro Liter
gewonnen werden kann, in der wenigstens die fünffache, meistens mindestens die zwanzigfache
Menge an Eiweißen und eiweißartigen Bestandteilen gelöst ist, mittels dieser Metallionen
die insulinhaltige Fraktion quantitativ niedergeschlagen werden konnte.
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Die Metallionen können auf aede geeignete Weise in die Lösung gebracht
werden, z. B. auch bei Verwendung der sich leicht in Säure lösenden Metalle wie
Zink und Cadmium, durch Zusatz des Metalles zum sauren Extrakt oder durch Zusatz
von Oxyden oder Hydroxyden. Vorzugsweise werden Jedoch in dem Extrakt lösliche Salze
der Metalle verwendet, wobei von den Metallen Eisen, Kobalt, Nickel, Kupfer und
Mangan diejenigen Salze verwendet
werden müssen, in denen diese
Metalle in zweiwertiger Form vorhanden sind. Diese Salze können z. B. Salze der
Salzsäure, Schwefelsäure oder Essigsäure sein. Nach Zusatz des Metalles zum sauren
Extrakt wird durch Zusatz von Lauge, von Ammoniak oder von einer Pufferflüssigkeit
der pH-Wert auf 5 bis 7,5 erhöht. Die minimal erforderliche Menge des zugesetzten
Metalles ändert sich mit dem Atomgewicht des Metalles und mit dem Protein- und gegebenenfalls
dem Fettsäuregehalt der Lösung. Für jeden Einsatz kann gegebenenfalls festgestellt
werden, ob eine hinreichende Menge Metall zugesetzt worden ist, indem das Filtrat
des Niederschlags wieder angesäuert wird, wieder Metall zugesetzt und der pH-Wert
wieder auf 5 bis 6 gebracht wird.
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Bei Rinderpankreasextraktionsflüssigkeit, die durch Verwendung von
mit Salzsäure angesäuertem Alkohol erhalten ist, wobei vorher durch alkalische Lagerung
ein Teil der Ballastproteine entfernt und das Fett durch Verdünnung, Destillation
oder Zusatz von Ca- oder Mg-Salz abgeschieden worden ist, ergibt sich, daß pro Kilogramm
eingesetztem Pankreas etwa 1 g Zink oder etwa 2 g Zinkchlorid ausreicht. Da ein
Uberschuß an Metallionen nicht störend wirkt, wird vorzugsweise eine größere Menge
zugesetzt, z. B. 3 g Zn", Co", Ni", Fet', Cu" oder Mm11 oder 5 bis 6 g Cd. Wird
nicht vorher entfettet, so sind bedeutend größere Metallmengen erforderlich, z.
B. 10 bis 30 g Zink pro Kilogramm eingesetztem Pankreas.
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Ähnlich wie bei der Kristallisation von Insulin wird bei dieser Proteinablagerung
vorzugsweise Zinksalz verwendet, da Zink ein im Pankreas natürlicherweise vorkommendes
Metall ist und somit im allgemeinen bei der Insulinkristallisation üblicherweise
benutzt wird und sehr gute Ergebnisse liefert.
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531 ernaltene Niederschlag wird auf bekannte Weise, z. B. durch Zentrifugieren
oder Siltrieren, gesammelt und dann in verdünnte Säure aufgenommen. Der Niederschlag
wird z. 3. zunächst unter Rühren in Wasser suspendiert, worauf, ebenfalls unter
Rühren, eine Saure zugesetzt wird, bis der ptI-Wert 2 bis 3 beträgt. Ist das Fett
vorher entfernt wor-Qen, so wird eine nahezu klare Lösung erhalten. Wenn nicht,
so wird aus dem Gemisch von fettsauren Salzen und Proteinen die Proteinfraktion
gelöst und. durch Filtration gereinigt.
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Aus der sauren, wasser gen Lösung der Proteinfraktion kann durch bekannte
Verfahren das insulin in reiner Form gewonnen werden.
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Beispiel I 100 kg gefrorener, gemahlener Rinderpankreas wird mit 250
1 Alkohol und Salzsäure derart extrahiert, da# während der L'xtraktionszeit von
4 Stunden die Alkoholkonzentration (thanool) auf 65 Zo und der pH-Wert auf etwa
2,5 eingestellt wird.
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Nach Ausscheidung des Extraktes wurde das Pankreasresiduum mit 250
1 65%igem Alkohol gewaschen und mit Salzsäure ebenfalls auf einen pH-Wert von 2,5
gebracht. Nach Abscheidung des zweiten Extraktes wurden die beiden Extrakte vereinigt.
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Durch Zusatz von Ammoniak wurde der pH-Wert der Flüssigkeit auf 7,5
bis 8,5 gebracht und darauf wurde der erhaltene Niederechlag abfiltriert. Dem Extrakt
wurde, nachdem er wieder mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,5 gebracht worden
wsr, ein annähernd gleiches Volumen Wasser zugesetzt, worauf die irei gewordenen
fett artigen Stoffe von der Lösung abfiltriert wurden.
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In der Extraktionsflüssigkeit von etwa 1000 1 mit einem Äthanolgehalt
von 30 bis 35 % ergab eine Sticketoffanalyse einen Proteingehalt von schätzungsweise
etwa 400 g.
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Diesem sauren Extrakt wurde eine mit Salzsäure angesäuerte Lösung
von 625 g Zinkchlorid in 1,5 1 Wasser zugesetzt. Darauf wurde mittels Ammoniak der
pH-Wert der Flüssigkeit auf 6 erhht. Es lagerte sioh eine Proteinfraktion von etwa
160 g ab. Nach Abfiltrieren wurde dieser Niederschlag in 20 1 Wasser aufgenommen,
worauf der Suspension so lange konzentrierte Salzsäure zugesetzt wurde, bis der
gesamte Niederschlag gelöst und der pH-Wert 2,5 bis 3 betrug. Aus dieser Fltissigkeit
konnte auf bekannte Weise, z. 3. durch fraktioniertes Aussalzen durch isoelektrische
Präzipitation und Kristallisierung mittels Zink, 17 g Insulin mit einer biologischen
Aktivität von 25 I. E. pro mg gewonnen werden.
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Beispiel II Durch Extraktion von 1 kg gefrorenem, gemahlenem Rind
erpankreas mittels Aceton wurden 5 1 einer Extraktionsflüssigkeit erhalten die 60
% Aceton enthielt und mit Eesigsäure auf einen pH-Wert von 4 angesäuert wurde und
in der etwa 30 g fettartige Substanz aus dem Pankreas und etwa 20 g Protein gelöst
war. Dieser Flüssigkeit wurde 40 g Cadmiumchlorid in 200 ml mit Salzsäure angeoäuertem
Wasser zugesetzt, worauf der pH-Wert durch Natronlauge auf 7 gebracht wurde. Der
Niedereohlag wurde filtriert und darauf unter Rühren in 1 1 Wasser aufgenommen.
Der suspension wurde, ebenfalls unter RUhrcn, langsam Salzsäure zugesetzt, bis der
pH-Wert der Lösung 3 betrug. Das Gemisch wurde darauf wieder filtriert, und durch
Aussalsen mit Natriumchlorid und weiter durch bekannte Verfahren wurde 150 mg Insulin
mit einer biologischen Aktivität von 25 I. B. pro mg gewonnen.
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Beispiel III Aus 1 kg Schweinepankreas wurde mittels eines mit Salzsäure
angesäuerten Äthanol-Wasser-Gemisches 5 1 eines Extraktes erhalten, der 60 % Äthanol
enthielt, einen pH-Wert von 2,5 hatte und in dem außer etwa 15 g Protein auch 35
g fettartige Substanz aus dem Pankreas gelöst war.
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Dieser Flüssigkeit wurde Calciumchlorid und eine solche Menge Ammoniak
zugesetzt, daß der pH-Wert etwa 8 betrug, worauf der erhaltene Niederschlag abfiltriert
wurde. Das Filtrat wurde mit Salzsäure wieder auf einen pH-Wert von 2,5 gebracht.
Dem Filtrat wurde eine mit Salzsäure angesäuerte Lösung von 10 g Cuprichlorid in
50 ml Wasser zugesetzt, und die Flüssigkeit wurde durch Zusatz von Ammoniak auf
einen pH-Wert von 5,9 gebracht. Der Niederschlag wurde abfiltriert und darauf in
600 ml 0,01 n Salzsäure aufgenommen. Aus dieser Lösung konnten nach Aussalzen mittels
Natriumchlorid 144 mg reines Insulin durch bekannte Verfahren hergestellt werden.
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Patentanßpruch: