DE2842358C2

DE2842358C2 -

Info

Publication number: DE2842358C2
Application number: DE2842358A
Authority: DE
Inventors: Peter John Redhill Surrey Gb O'hanlon; Maurice Charles Ilford Billingshurst Sussex Gb Woodford; Norman Harold Rudgwick Sussex Gb Rogers
Original assignee: BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Current assignee: BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Priority date: 1977-09-30
Filing date: 1978-09-28
Publication date: 1989-05-24
Also published as: AU4030478A; NZ188559A; IT7851285A0; IE47386B1; AU531316B2; DK152126B; FR2404638A1; CA1103264A; NL7809859A; JPS5459281A; IE781955L; BE870855A; ZA785515B; CH642366A5; IT1157197B; DE2842358A1; JPH032867B2; DK433878A; FR2404638B1; ES473837A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Pseudomonsäure.

Pseudomonsäure besitzt die nachstehende Formel (I)

Diese Verbindung zeigt eine antibakterielle Wirksamkeit und ist deshalb besonders wertvoll zur Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Menschen und Tieren, insbesondere von Infektionen der oberen Atemwege.

Diese Verbindung und ein Verfahren zu ihrer Herstellung sind in der GB-PS 13 95 907 beschrieben. Dieses Verfahren sieht im wesentlichen eine Gewinnung eines Gemisches mit einem Gehalt an den aktiven hauptsächlichen Säurebestandteilen aus einer Kulturflüssigkeit vor, in der Pseudomonas fluorescens unter aeroben Bedingungen gezüchtet wurde, und ein anschließendes Abtrennen der Säure aus dem Gemisch mittels Chromatographie. Ein derartiges Verfahren ist auch in der JA-OS Nr. 70083/77 beschrieben, bei dem von Kulturflüssigkeit von der Züchtung von Pseudomonas fluorescens Y-11633 (FERM-P 3323) ausgegangen ist.

Zur Isolierung von Pseudomonsäure aus Kulturflüssigkeit wird das Verfahren am zweckmäßigsten wie folgt durchgeführt: Ein Pseudomonsäure erzeugendes Bakterium, im allgemeinen ein Stamm eines Bakteriums der Familie Pseudomonas, wird nach Standardverfahren unter aeroben Bedingungen in oder auf einer geeigneten Kulturflüssigkeit gezüchtet. Solche Kulturflüssigkeiten sind allgemein bekannt und enthalten anorganische Salze und assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen. Das geeignetste Bakterium für diesen Zweck ist Pseudomonas fluorescens. Ein zweckmäßiger öffentlich erhältlicher Stamm ist Pseudomonas fluorescens NCIB 10586. Man läßt den Mikroorganismus solange wachsen, bis in der Kulturflüssigkeit eine geeignete Menge Pseudomonsäure vorliegt. Feste Teilchen werden anschließend aus der Kulturflüssigkeit abfiltriert oder durch Zentrifugieren entfernt, um eine klare Flüssigkeit zu erhalten. Anschließend wird der pH-Wert der klaren Flüssigkeit auf 4,0 bis 5,0 eingestellt, wobei ein pH-Wert von 4,5 optimal ist. Dann wird die klare Lösung mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für die Aktivbestandteile extrahiert.

Geeignete Lösungsmittel kann man durch Ausprobieren finden, doch ist festgestellt worden, daß Methyl-isobutylketon besonders zweckmäßig ist. Andere Lösungsmittel sind halogenierte Kohlenwasserstoffester und Äther mit einem Gehalt von 5% Äthanol.

Im Anschluß daran werden die sauren Bestandteile in eine wäßrige Phase extrahiert, die einen pH-Wert im Bereich von 7 bis 9, vorzugsweise 8,5, aufweist, wobei die neutralen Verunreinigungen in der organischen Phase verbleiben. Der wäßrige Extrakt wird dann auf einen pH-Wert von 4,0 bis 5,0, vorzugsweise 4,5, angesäuert und mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel extrahiert, wodurch man einen Extrakt der sauren Hauptbestandteile in einem polaren organischen Lösungsmittel erhält, das frei von neutralen Substanzen ist.

Vorliegender Erfindung lag nun die Aufgabe zugrunde, das Verfahren zur Gewinnung der Pseudomonsäure aus derartigen Gemischen zu vereinfachen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Gewinnung von Pseudomonsäure aus einem diese Säure enthaltenden Rohprodukt, das praktisch frei von neutralen Substanzen ist, in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel gelöst, welches das kennzeichnende Merkmal aufweist, daß man entweder als das mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel einen Dialkyläther mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen in den Alkylresten einsetzt oder daß man als mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel Alkanone mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Alkylester von Alkansäuren mit jeweils 1 bis 6 Kohlenstoffatomen im Alkyl- und Alkanrest oder halogenierte Kohlenwasserstoffe einsetzt und die Polarität der Lösung durch Zugabe eines Alkans mit 5 bis 12 Kohlenstoffatomen reduziert und daß man die Pseudomonsäure aus der Lösung kristallisiert und danach die Kristalle isoliert.

Geeignete polare, mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel sind Alkylester von Alkansäuren, die sowohl im Alkylrest als auch im Alkanrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen, mit Wasser nicht mischbare Alkanone mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, z. B. Methyl-isobutylketon, und schließlich halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Methylenchlorid und Äthylenchlorid.

Die Lösung kann dann vorteilhafterweise mit Wasser gewaschen werden. Vorzugsweise sollte die Lösung getrocknet werden. Zum Trocknen eigenen sich übliche Mittel, wie wasserfreies Calciumchlorid, Natriumsulfat oder Magnesiumsulfat.

Die Polarität der Lösung wird dann durch Zugabe eines nichtpolaren Verdünnungsmittels herabgesetzt. Dadurch wird die Pseudomonsäure zum Kristallisieren veranlaßt.

Demzufolge wird zu der Lösung des Rohprodukts in einem polaren, mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel ein nichtpolares Verdünnungsmittel zugesetzt, das mit dem polaren, mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel mischbar ist.

Die bei dieser Ausführungsform verwendbaren polaren Lösungsmittel sind weiter oben besprochen worden.

Geeignete nichtpolare Verdünnungsmittel sind Alkane mit 5 bis 12 Kohlenstoffatomen, insbesondere mit 5 bis 9 Kohlenstoffatomen. Ein bevorzugtes nichtpolares Verdünnungsmittel ist n-Heptan.

Vorzugsweise läßt man die verdünnte Lösung einige Zeit stehen, bevor man den Feststoff gewinnt, wobei man die Kristallisation durch Zugabe eines früher erhaltenen Impfkristalls der Pseudomonsäure fördert.

Die Temperatur, bei der die Verdünnung und die Kristallisation durchgeführt werden, ist nicht kritisch, doch wurde gefunden, daß man am zweckmäßigsten bei Raumtemperatur arbeitet. Um ein vollständiges Kristallisieren zu erreichen, ist es vorteilhaft, die verdünnte Lösung zu kühlen.

Nach einer anderen Ausführungsform wird das Verfahren vorliegender Erfindung derart durchgeführt, daß man eine Lösung der sauren Bestandteile eines rohen Pseudomonsäurepräparats in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel einer solchen Polarität herstellt, daß die Pseudomonsäure vorzugsweise ohne das Erfordernis einer Zugabe eines nichtpolaren Verdünnungsmittels zur Herabsetzung der Polarität kristallisiert. Für diesen Zweck sind Dialkyläther mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen in den Alkylresten, insbesondere Diäthyläther, geeignet.

Wenn diese Ausführungsform der Erfindung zur Gewinnung von Pseudomonsäure aus Kulturflüssigkeiten angewendet wird, ist es am zweckmäßigsten, zuerste eine Lösung der sauren Bestandteile in einem polaren organischen Lösungsmittel wie vorstehend beschrieben herzustellen und dann das Lösungsmittel zu entfernen, worauf man den Rückstand in dem gewählten Äther löst und die Kristallisation einsetzen läßt.

Die Kristallisation erfolgt vorzugsweise bei einer getrockneten Lösung. Dies wird im allgemeinen dadurch erreicht, daß man die Lösung der sauren Bestandteile - wie vorstehend beschrieben - vor einem Entfernen des Lösungsmittels trocknet. Es ist als ausreichend befunden worden, die Lösung über üblichen Trocknungsmitteln, wie wasserfreiem Magnesiumsulfat oder Natriumsulfat, zu trocknen, doch erhält man bessere Ergebnisse, wenn man ein stärker wirkendes Trocknungsmittel, wie Molekularsiebe, und/oder wenn man ein Lösungsmittel, wie Methyl-isobutylketon, anwendet, das mit dem restlichen Wasser ein azeotropes Gemisch bildet, wodurch man ein zusätzliches Trocknen erreicht, da das Lösungsmittel mitverdampft wird. Ferner ist es ausreichend, eine ätherische Lösung über beispielsweise wasserfreiem Magnesium- oder Natriumsulfat zu trocknen, doch erhält man bessere Ergebnisse mit über Natrium getrocknetem Äther.

Die Temperatur, bei der die Kristallisation stattfindet, ist nicht kritisch, doch wurde gefunden, daß man zweckmäßigerweise bei Raumtemperatur arbeitet. Um eine vollständige Kristallisation zu erreichen, ist es vorteilhaft, die Lösung zu kühlen. Auch in diesem Falle ist es vorteilhaft, zur Lösung Impfkristalle von Pseudomonsäure zuzusetzen.

Das erfindungsgemäße Verfahren arbeitet am erfolgreichsten, wenn man solche Rohprodukte verwendet, die wesentliche Anteile an Pseudomonsäure enthalten. Wenn dagegen das Rohprodukt nur geringe Mengen an der gewünschten Verbindung enthält, muß das erfindungsgemäße Verfahren mehrere Male wiederholt werden.

Zur Verwendung als antibakterielles Mittel kann die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Pseudomonsäure nach den Standardverfahren in der Veterinär- oder pharmazeutischen Praxis formuliert werden.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

1500 Liter Kulturflüssigkeit, die 408 g Pseudomonsäure enthält, werden auf einem Hilfsschichtdrehfilter teilweise geklärt und anschließend durch Zentrifugieren vollständig geklärt, so daß man 1285 Liter einer klaren Flüssigkeit mit einem Gehalt von 372 g Pseudomonsäure erhält. Diese Flüssigkeit wird unter Verwendung von 50prozentiger Chlorwasserstoffsäure auf pH 4,5 angesäuert und dann mit 300 Liter Methyl-isobutylketon extrahiert, indem man die Flüssigkeit mit einer Geschwindigkeit von 8 Liter/Minute und das Lösungsmittel mit einer Geschwindigkeit von 2 Liter/Minute in einen statischen Rohrleitungsmischer einleitet.

Die beiden nicht miteinander mischbaren Phasen werden durch Zentrifugieren getrennt. Der Lösungsmittelextrakt mit einem Gehalt von 226 g Pseudomonsäure wird mit 60 Liter einer zuvor auf pH 8,5 eingestellten 2prozentigen Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die Phasen werden durch Zentrifugieren getrennt. Dann versetzt man den wäßrigen Extrakt mit 12 Liter Methyl-isobutylketon und säuert die wäßrige Phase unter Verwendung von 50prozentiger Chlorwasserstoffsäure auf pH 4,5 an. Dann trennt man die organische Phase ab und wäscht sie mit 6 Liter vollentsalztem Wasser, engt die Lösung auf 1,5 Liter ein und trocknet sie über wasserfreiem Magnesiumsulfat. Nach dem Abfiltrieren versetzt man die getrocknete Lösung mit 750 ml n-Heptan. Anschließend läßt man das Gemisch 12 Stunden bei 5°C stehen. Die gebildeten Kristalle werden abfiltriert und mit 1 Liter eines Gemisches aus 1 Teil Methyl-isobutylketon und 1 Teil n-Heptan und anschließend mit 1 Liter n-Heptan gewaschen und unter vermindertem Druck bei 25°C getrocknet. Man erhält 125 g Pseudomonsäure mit einem Reinheitsgrad von 92 bis 93%.

UV-Spektrum in Äthanol: 222 nm (ε _max = 14 500).
IR-Spektrum: λ _max (KBr) = 3470, 1728, 1720, 1712, 1650 cm^-1.
NMR-Spektrum: δ _H (d₆-DMSO) =
5,61 (1H, s, CH=C);

1,04 (3H, d, J=6,5 Hz, <CHCH ₃);
0,80 (3H, d, J=6,5 Hz, <CHCH ₃).
δ _C (d₆-DMSO) = 174,3, 165, 7, 116,6, 74,5, 69,4, 68,2, 67,7, 64,6, 62,9, 59,0, 54,6, 42,5, 41,8, 40,0, 33,6, 31,5, 28,5, 28,1, 25,4, 24,4, 20,0 18,5, 116.

Beispiel 2

Ein wie in Beispiel 1 hergestellter Lösungsmittelextrakt mit einem Gehalt von 226 g Pseudomonsäure wird mit 60 Liter einer zuvor auf pH 8,5 eingestellten 2prozentigen Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die Phasen werden durch Zentrifugieren getrennt. Ein Teil der Natriumbicarbonatlösung (12 Liter) wird mit 3 Liter Methyl-isobutylketon gewaschen. Das Methyl-isobutylketon wird verworfen. Zum wäßrigen Extrakt wird anschließend 1 Liter Methyl-isobutylketon gegeben, und die wäßrige Phase wird unter Verwendung von 50prozentiger Chlorwasserstoffsäure auf pH 4,5 angesäuert. Die organische Phase wird abgetrennt und dreimal mit je 3 Liter vollentsalztem Wasser gewaschen. Die organische Phase wird anschließend abgetrennt und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Abfiltrieren des Magnesiumsulfats wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Das erhaltene Öl wird mit 800 ml über Natrium getrocknetem Diäthyläther versetzt. Dann rührt man das Gemisch und dekantiert die Lösung von einer geringen Menge unlöslichen Rückstandes. Die Lösung wird mit Kristallen der reinen Pseudomonsäure beimpft, dann 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend über Nacht im Kühlschrank bei 5°C stehengelassen. Der abgeschiedene Feststoff wird abfiltriert, mit 100 ml wasserfreiem Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute: 38,4 g. Fp. 77-78°C.

[α] = -19,3° (c = l in Methanol).
Analyse für C₂₆H₄₄O₉:
ber.:
C 62,38, H 8,86%
gef.:
C 62,62, H 8,70%

Beispiel 3

In analoger Weise wie in Beispiel 1 wird ein wäßriger Extrakt der Pseudomonsäure in Natriumbicarbonatlösung gebildet. Dann wird zu jeweils einer Probe des wäßrigen Extrakts ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel, wie es nachstehend aufgeführt ist, zugegeben und das erhaltene Gemisch mit 50prozentiger Chlorwasserstoffsäure auf pH 4,5 angesäuert. Wie in Beispiel 1 angegeben, wird die organische Phase abgetrennt, gewaschen, eingeengt, getrocknet und filtriert. Zu der getrockneten organischen Phase fügt man anschließend n-Heptan zu und läßt die Pseudomonsäure auskristallisieren.

Die Reinheit der Pseudomonsäure wird durch Messen des Hauptmaximums nach der Dünnschicht-Chromatographie bestimmt. Die Werte sind Durchschnittswerte aus 2 bzw. 3 Ansätzen:

a) Methyl-isobutylketon: die Pseudomonsäure fällt anfänglich als Öl aus, das sich nach dem Impfen verfestigt. Reinheit: 90,5% (3 Ansätze);
b) Essigsäure-amylester: die Pseudomonsäure fällt anfänglich als gummiartige Substanz aus, die sich beim Rühren ohne Zusatz von Impfkristallen verfestigt. Reinheit: 89,4% (2 Ansätze);
c) Methylendichlorid: die Peudomonsäure fällt anfänglich wiederum als gummiartige Substanz aus, die sich beim Rühren ohne Zusatz von Impfkristallen verfestigt. Reinheit: 89,3% (3 Ansätze);
d) Essigsäure-äthylester: die Pseudomonsäure fällt bei langsamer Zugabe des n-Heptans als weißer Farbstoff aus, ohne eine gummiartige Substanz oder ein Öl zu bilden. Reinheit: 89,3% (3 Ansätze).

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von Pseudomonsäure aus einem diese Säure enthaltenden Rohprodukt durch Herstellen einer Lösung der sauren Bestandteile des Rohprodukts, das praktisch frei von neutralen Substanzen ist, in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß man entweder als mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel einen Dialkyläther mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen in den Alkylresten einsetzt oder daß man als mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel Alkanone mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Alkylester von Alkansäuren mit jeweils 1 bis 6 Kohlenstoffatomen im Alkyl- und Alkanrest oder halogenierte Kohlenwasserstoffe einsetzt und die Polarität der Lösung durch Zugabe eines Alkans mit 5 bis 12 Kohlenstoffatomen reduziert, und daß man die Pseudomonsäure aus der Lösung kristallisiert und danach die Kristalle isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Rohprodukt diejenige Kulturflüssigkeit einsetzt, in der Pseudomonsäure durch Bakterien erzeugt worden ist.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zu der Lösung des Rohprodukts Impfkristalle der Pseudomonsäure gibt.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösung vor der Kristallisation trocknet.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als polares, mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel Methyl-isobutylketon einsetzt und anschließend zur Reduzierung der Polarität Alkane mit 5 bis 9 Kohlenstoffatomen als nichtpolares Verdünnungsmittel zusetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als nichtpolares Verdünnungsmittel n-Heptan einsetzt.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Zugabe des nichtpolaren Verdünnungsmittels die Lösung durch azeotropes Entfernen des Wassers während des Verdampfens des Methyl-isobutylketons trocknet.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als polares, mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel Diäthyläther einsetzt.