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Verfahren zur Reinigung von rohen Penicillinsalzen Die vorliegende
Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von gereinigten Penicillinmetallsalzen.
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Der Ausdruck Penicillin ist mehrdeutig und bezeichnet manchmal die
aktive saure Substanz oder die Substanzen, die in der Nährlösung entstehen, auf
oder in welcher gewisse Schimmelpilze, insbesondere 1'enicillium notatum, gezüchtet
werden, und manchmal ein Metallsalz, im allgemeinen das Natrium- oder Calciumsalz
der genannten Substanz oder Substanzen, in welcher Form die Wirksubstanz normalerweise
hergestellt und verwendet wird. In dieser Beschreibung wird der Ausdruck Penicillin
in der ersteren dieser beiden Bedeutungen angewendet, während die Salze der Wirksubstanz
oder -substanzen als 1'enicillinsalze bezeichnet werden. Nach der üblichen Herstellungsmethode
wird das Penicillin mittels eines geeigneten, organischen Lösungsmittels aus der
Nährlösung extrahiert und das so extrahierte Penicillin in ein geeignetes Metallsalz,
im allgemeinen in das Natrium- oder Calciumsalz, umgewandelt. Zur Reinigung wird
die wäßrige Lösung meist angesäuert und das Penicillin erneut extrahiert und in
wäBriger Lösung in das gewünschte Salz übergeführt, aus welcher Lösung das feste
Salz gewonnen wird. Das auf diese Weise hergestellte Natrium- oder Calciumsalz des
Penicillins ist immer von zum Teil gefärbten Verunreinigungen begleitet, die bewirken,
daß das Präparat nicht nur eine geringere und veränderliche Stabilität aufweist,
sondern auch daB unangenehme Nebenwirkungen, z. B. Schmerzen beim Einspritzen, hervorgerufen
werden. Reine Penicillinnatrium
- oder -calciumsalze sind weiße
Verbindungen, die eine größere Stabilität aufweisen und beim Einspritzen weniger
Schmerzen verursachen als das oben erwähnte Rohprodukt.
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Die Reinigung von Penicillin oder dessen Metallsalzen, d. h. die Abtrennung
der aktiven Substanzen von den Verunreinigungen, welche diese im allgemeinen begleiten,
ist eine schwere und mühselige Operation. Die vorliegende Erfindung bringt ein neues
und verbessertes Verfahren zur Herstellung von gereinigten Penicillinsalzen.
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Es ist bereits ein Verfahren zur Herstellung von gereinigten Metallsalzen
des Penicillins beschrieben, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Lösung
von rohem Penicillin in einem Lösungsmittel mit einer oder mehreren geeigneten primären,
organischen Basen zur Reaktion gebracht wird, so daß Penicillinsalze dieser Basen
entstehen, welche in einem Zustand hoher Reinheit erhalten und leicht in die entsprechenden
Metallsalze, z. B. das Natrium- oder Calciumsalz, übergeführt werden können. Gemäß
einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wird eine wäßrige Lösung eines
rohen Natrium- oder Calciumsalzes des Penicillins angesäuert und das entstandene
Penicillin mittels eines geeigneten Lösungsmittels aus der wäßrigen Lösung extrahiert.
Das gewöhnlich verwendete Lösungsmittel ist Methylisobutylketon. Diese Lösung wird
dann für die Herstellung des Penicillinsalzes der primären Base verwendet.
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Im Verlaufe weiterer Untersuchungen wurde gefunden, daß die Überführung
von rohen Penicillinmetallsalzen, wie z. B. von Natrium- oder Calciumsalzen, in
im wesentlichen reine Salze von primären, nachstehend näher definierten Basen leicht
mittels eines einfachen Verfahrens durchgeführt werden kann, welches die Bildung
von freiem Penicillin umgeht, was zur Folge hat, daß die Verwendung von Lösungsmitteln,
wie z. B. Methylisobutylketon, vermieden werden kann. Die so erhaltenen Penicillinsalze
von primären, organischen Basen können leicht in die Metallsalze, z. B. in die Natrium-
oder Calciumsalze, übergeführt werden.
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Es wurde gefunden, daß bei der Behandlung einer wäßrigen Lösung eines
rohen Penicillinmetallsalzes (z. B. eines Natrium- oder Calciumsalzes), welche vorteilhafterweise,
aber nicht notwendigerweise eine aussalzende Substanz enthält, mit einem geeigneten
Salz einer primären, organischen Base eine doppelte Umsetzung eintritt, was die
Fällung des entsprechenden Penicillinsalzes der primären, organischen Base zur Folge
hat. Dieses Salz kann als solches isoliert werden. Es kann gewünschtenfalls gereinigt
werden und leicht in Penicillinmetallsalze (z. B. in Natrium- oder Calciumsalze),
die viel reiner als das ursprüngliche Penicillinmetallsalz sind, übergeführt werden.
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Der nachfolgend verwendete Ausdruck geeignete, primäre, organische
Base bezeichnet eine Verbindung der Formel R # NH2, worin R eine Cyclonexyl-oder
Alkylcyclonexylgruppe mit nicht mehr als 8 Kohlenstoffatomen bedeutet, welche Verbindung
einen pK"-Wert von nicht weniger als io,2 besitzt
| und welche das Penicillin unter den Bedingungen |
| des Verfahrens nicht rasch zerstört. Beispiele solcher |
| Basen sind Cyclohexvlamin und Nlethylcyclohexyl- |
| amin, von welchen beiden gegenwärtig die erstere |
| bevorzugt wird. |
| Der Ausdruck ein geeignetes Salz einer geeigne- |
| ten, primären, organischen Base bezeichnet ein Pro- |
| dukt, das durch Umsetzung einer primären, organi- |
| schen Base mit einer starken oder mäßig starken |
| Säure entsteht. Es versteht sich, daß weder die |
| Säure noch das Salz unter den Bedingungen des |
| Verfahrens eine zerstörende Wirkung auf das Peni- |
| cillin oder dessen Salze ausüben dürfen. Bevorzugt |
| sind Salze von geeigneten, primären, organischen |
| Basen mit starken Mineralsäuren, wie z. B. Salz- |
| säure. |
| Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist unter |
| anderem ein Verfahren zur Herstellung von Peni- |
| cillinsalzen, welches dadurch gekennzeichnet ist, |
| daß eine wäßrige Lösung eines Penicillinmetall- |
| salzes (z. B. eines Natrium- oder Calciumsalzes) |
| mit einem geeigneten Salz einer geeigneten, pri- |
| mären, organischen Base behandelt wird, so daß ein |
| Penicillinsalz der genannten Base ausgefällt wird. |
| Ein weiterer Zweck der vorliegenden Erfindung |
| ist die Schaffung eines Verfahrens für die Reini- |
| gung von rohen Penicillinmetallsalzen (z. B. |
| Natrium- oder Calciumsalzen), welches dadurch |
| gekennzeichnet ist, daß eine wäßrige Lösung des |
| rohen Metallsalzes mit einem geeigneten Salz einer |
| geeigneten, primären, organischen Base behandelt |
| wird, und daß das gefällte Salz der organischen |
| Base, wenn nötig, gereinigt und dann in ein Penicil- |
| linmetallsalz (z. B. in das Natrium- oder Calcium- |
| salz) zurückverwandelt wird. |
| Das Salz der primären, organischen Base kann |
| der wäßrigen Lösung entweder in Form der im |
| wesentlichem reinen Substanz oder in Form einer |
| konzentrierten, wäßrigen Lösung zugesetzt werden. |
| Das Reaktionsgemisch sollte auf ein pn von 6 bis 7 |
| eingestellt werden, indem eine Säure, wie z. B. |
| Phosphorsäure, oder eine anorganische Base, wie |
| z. B. Natriumhydroxyd, zugesetzt wird. Es wurde |
| gefunden, daß es vorzuziehen ist, die Fällung des |
| Penicillinsalzes der primären Base in Gegenwart |
| einer im folgenden zu beschreibenden, aussalzen- |
| den Substanz auszuführen. |
Beispiel
| Als Ausgangsmaterial wird eine gekühlte wäß- |
| rige Lösung des rohen Penicillinmetallsalzes (z. B,. |
| des Natrium- oder Calciumsalzes) verwendet. Die |
| Aktivität des Penicillins entspricht bevorzugter- |
| weise, aber nicht notwendigerweise, einem Wert, |
| der nicht kleiner als 400 Oxfordeinheiten pro mg |
| ist, und die Konzentration des Penicillins in der |
| wäßrigen Lösung beträgt bevorzugterweise 2 bis |
| ioo/o Gewicht/Volumen. |
| Diese Lösung sollte ferner eine aussalzende Sub- |
| stanz enthalten, d. h. ein Salz mit einer hohen Lös- |
| lichkeit in Wasser, dessen Lösung bevorzugterweise, |
| aber nicht notwendigerweise, neutral ist. Bevorzugt |
| wird die Verwendung von Substanzen wie z. B. |
Natriumclilorid, Natriumsulfat, Kaliümchlorid u. dgl. Animoniumsalze
sind nicht günstig. Salze, die auf das Penicillin oder dessen Salze eine zerstörende
Wirkung ausüben, sollten natürlich nicht verwendet werden. Die Menge der in der
Lösung vorhandenen Substanz sollte bevorzugterweise so bemessen sein, daB die Lösung
annähernd gesättigt ist.
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Wenn es erwünscht ist, das Calciumsalz zu verwenden, so muB das Salz
der Base vor dem gussalzenden Mittel zugesetzt werden, da sonst durch Aussalzung
ein (las Penicillin enthaltender Niederschlag entstehen könnte.
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Diese Lösung wird unter Rühren und Kühlen mit einer, dem vorhandenen
Penicillin mindestens äquivalenten Menge eines geeigneten Salzes einer geeigneten,
primären, organischen Base, entweder in Form der im wesentlichen reinen .Substanz
oder in Form einer konzentrierten Lösung, versetzt. Das Gemisch wird auf ein PH
von 6 bis 7 eingestellt, indem,unter Rühren vorsichtig eine Säure, wie z. B. Phosphorsäure,
oder eine anorganische Base, wie z. B. Natriumhydroxyd, zugesetzt wird. Dieses Gemisch
wird gerührt und gekühlt, bis keine weitere Fällung mehr eintritt. Das Reaktionsprodukt,
nämlich das rohe Penicillinsalz der verwendeten, primären, organischen Base, wird
durch Filtrieren oder Zentrifugieren isoliert. Es kann mit einer kleinen Menge einer
annähernd gesättigten Lösung einer atissalzenden Substanz gewaschen werden. In diesem
Fall sollte die letztere eine neutrale, wäßrige Lösung bilden. Das Reaktionsprodukt
wird durch fortgesetztes Filtrieren und Zentrifugieren so vollständig als möglich
vom Wasser befreit.
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Das feuchte Produkt kann auf verschiedene Arten behandelt werden.
Soviel zurückgehaltenes Wasser als möglich wird aus dem so erhaltenen Material entfernt,
indem dieses während mehreren Stunden über einem Trockenmittel, wie z. B. Phospliorpentoxyd,'in
einem evakuierten Exsikkator gehalten wird. Wenn (las Produkt trocken ist, so kann
es mit Aceton oder -,%lethyläthyl'keton gewaschen werden. Das auf diese Weise gewaschene
oder das auch nicht gewaschene Produkt kann hierauf in geeigneter `'eise, wie folgt,
umkristallisiert werden: Das getrocknete Produkt wird mit ewas mehr Chloroform erwärmt
als nötig ist, um bei 30° C das organische Material zu lösen. Das warme Gemisch
wird rasch abfiltriert um das ungelöste, anorganische Material zu entfernen. Das
Filtrat wird mit genügend Aceton oder Methyläthylketon versetzt. so daB beim Kühlen
das gereinigte Penicillinsalz der primären, organischen Base ausfällt.
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Das feuchte Material kann auf andere Weise sofort ohne vorheriges
Trocknen umkristallisiert werden. Das Material kann direkt in Chloroform gelöst
und die Lösung von den wenigen Tropfen der wäBrigen Phase abgetrennt werden. Beim
Verdünnen mit 2 oder 3 Volumina Aceton oder Methyläthylketon kristallisiert das
gereinigte Salz der primären Base aus. Es soll betont werden, daß die hier beschriebene,
spezielle Lösungsmittelkombination für Kristallisierzwecke natürlich keineswegs
das einzig mögliche Gemisch ist. Es kann im Laboratorium leicht festgestellt werden,
ob irgendein anderes Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch befriedigende Resultate
ergibt. Wenn das auf diese Weise erhaltene Produkt nicht den gewünschten Reinheitsgrad
aufweist, so kann der oben beschriebene ReinigungsprozeB wiederholt werden.
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Eine weitere Methode beruht darauf, daß das feuchte Material in einer
kleinen Menge Äthylalkohol gelöst wird, z. B. so, daB 3 bis 5 cm3 auf i Megaeinheit
des ursprünglich verwendeten Penicillins kommen. Nachdem eventuell vorhandene Spuren
des Aussalzungsmittels, wenn ein solches verwendet würde, durch Filtrieren entfernt
sind, kann das gereinigte Penicillinsalz der organischen Base gefällt werden, indem
die alkoholische Lösung mit der etwa drei- bis fünffachen Volumenmenge Diäthyl-,
Diisopropyl- oder Dibutyläther versetzt wird.
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Das gereinigte Produkt kann leicht mittels verschiedener Methoden
in reine Penicillinmetallsalze (z. B. in das Natrium- oder Calciumsalz) übergeführt
werden. Es kann beispielsweise unter raschem Rühren ein Gemisch aus Äther oder Chloroform
und wäßriger Phosphorsäure zugesetzt werden, welches Gemisch mindestens eine der
im umzuwandelnden Salz enthaltenen Menge der organischen Base äquivalente Menge
Phosphorsäure enthält. Der organische Extrakt wird abgetrennt, die wäB-rige Lösung
auf ein PH von 2,5 eingestellt und mit einer weiteren Menge des organischen Lösungsmittels
extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt, und dieses Gemisch wird mit einer wäßrigen
Lösung eines Metallhydroxyds (z. B. Natriumhydroxyd) extrahiert, welche Lösung eine
der im Salz der organischen Base vorhandenen Penicillinmenge (freie Säure) äquivalente
Menge an Metallhydroxyd enthält. Der wäBrige Extrakt wird im gefrorenen Zustand
getrocknet (Trockenverfahren, welches darauf beruht, daB eine gefrorene Lösung einem
Vakuum unterworfen wird, wobei das Eis unter Umgehung der flüssigen -Phase sich
direkt verflüchtigt).
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Die folgenden Beispiele dienen nur erläuternden Zwecken und beschreiben
die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines im wesentlichen
reinen Penicillinsalzes einer primären, organischen Base. Die in diesen Beispielen
verwendeten Abkürzungen haben folgende Bedeutung: ME = Megaeinheit, d. h. i ooo
ooo Oxfordeinheiten, und 0E = Oxfordeinheit. Beispiel i 2,5 ME Penicillinnatrium
(9io OE/mg) werden in 32 cm3 bei o° C mit Natriumnitrat gesättigtem Wasser gelöst.
Es wird eine 5oo/oige wäßrige Lösung von Cyclohexylaminhydrochlorid in einer der
doppelten Menge an vorhandenem Penicillin äquivalenten Menge zugesetzt. Die Lösung
wird auf ein pH von 6 eingestellt und vor dem Filtrieren etwa eine halbe Stunde
stehengelassen. Die Fällung wird mit einigen cms gesättigter Natriumnitratlösung
gewaschen.
Das feuchte Produkt wird zusammen mit 25 cm3 Chloroform
leicht erwärmt und die Lösung durch ein trocknes Filter filtriert, um einige Tropfen
noch vorhandener, wäßriger Lösung zu entfernen. Das Filtrat wird mit 75 cm3 Aceton
versetzt. Das Gemisch wird etwa i Stunde im Kühlschrank stehengelassen und dann
filtriert. Eine "-eitere ?eienge wird durch Einengen des Filtrates unter vermindertem
Druck und durch Kristallisierenlassen erhalten. Die Ausbeute beträgt 1,53 g (erste
Fraktion) und o,i g (zweite Fraktion) im wesentlichen reines Penicillincyclohexylaminsalz.
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Dieses Salz wird in Penicillinnatrium übergeführt, indem es mit Eiswasser
(i Volumenanteil) und Chloroform (2 Volumenteile) verrührt wird. Es wird genügend
io0/0ige Phosphorsäure unter Rühren zugesetzt, um das pH auf 2,1 zu bringen. Das
Chloroformextrakt wird mit Wasser und n-i Natriumhydroxydlösung gerührt, um das
pH auf 5,9 zu bringen. Nach der Trennung wird das Chloroform mit einer weiteren
kleinen Menge Wasser und Natriumhydroxydlösung gerührt, um das pH auf 7,4 einzustellen.
Die wäßrigen Lösungen werden vereinigt und in gefrorenem Zustand getrocknet. Der
entstandene feste Körper wird aus Aceton umkristallisiert, wobei reines Penicillinnatrium
rasch auskristallisiert. Beispiel e 2 ME Penicillin (i ioo OE/mg) werden in bei
J C mit Natriumnitrat gesättigtem Wasser gelöst. Diese Lösung wird mit i cm3 Methylcyclohexylamin,
welches vorher mit starker Salzsäure neutralisiert wird, versetzt. Das Gemisch,
welches ein pK von 6,3 aufweist, wird während 2 Stunden im Kühlschrank stehengelassen,
bevor es filtriert wird. Das feste Produkt wird getrocknet, indem es über Nacht
in einem Vakuumexsik'kator gehalten wird. Hierauf wird es mit Aceton gewaschen und
erneut getrocknet. Das Gewicht dieses Produktes beträgt 0,85 g. Es wird in
15 cm3 warmem Chloroform gelöst, die Lösung filtriert und mit 45 cm3 Methyläthylketon
versetzt. Das Gemisch wird während einer halben Stunde im Kühlschrank gekühlt und
dann filtriert. Der feste Körper wird mit wenig Methyläthylketon gewaschen und hierauf
getrocknet. Das umkristallisierte 11-Iethylcyclohexylaminsalz des Penicillins wiegt
0,45 g. _ Beispiel 3 Die Lösung. von 2o ME Penicillinnatrium (ioo OE/mg) in 2i5
cm3 Wasser wird bei etwa o° C mit Natriumchlorid gesättigt. Das Gemisch wird mit
2o cm3 5o%iger, wäßriger Lösung von Cyclohexylaminhydrochlorid versetzt, so daß
es ein p" von 6,2 aufweist, und wird dann bei o° C während i Stunde stehengelassen.
Das Gemisch wird hierauf im Vakuum filtriert und das feste Produkt durch Absaugen
möglichst gut getrocknet. Das Produkt wird in ioo cm3 Äthylalkohol gelöst und die
Lösung durch Filtrieren von Natriumchloridspuren befreit. 4oo cm3 Isopropylätlier
werden zugesetzt, worauf das Penicillincyclohexylaminsalz rasch in feinen Nadeln
auskristallisiert. Nach halbstündigem Stehen bei etwa -io° C werden die Kristalle
abfiltriert. Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in
30 cm3 Chloroform gelöst und die Lösung mit 8o cm3 Methyläthylketon versetzt.
Das Gemisch wird in einer Kältemischung abgekühlt und hierauf filtriert. Das Salz
wird mit 1l ethyläthy lketon gewaschen. Die Ausbeute an reinem Penicillincyclohexylaminsalz
beträgt 11,2 g bei der ersten Fraktion und 2,85 g bei der zweiten Fraktion. 24%
des ursprünglichen Penicillins bleiben in der wäßrigen Mutterlauge zurück.