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Verfahren zur Herstellung von Penicillinverbindungen mit verlängerter
Wirkung
Es ist bekannt. daß Penicillin, das in der Therapie in Form von Salzen, z.B.
des Natriums, Galciums, Kaliums, in wäßriger Lösung Verwendung findet, schnell im
Urin ausgeschieden wird, ein Umstand, der häufige Injektionen erforderlich macht.
Außerdem altern die wäßrigen Lösungen schnell, selbst wenn man sie bei tiefer Temperatur
aufbewahrt.
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Um diese großen Unzuträglichkeiten zu beheben, hat man die Verwendung
von Penicilli.nsuspensionen in verschiedenen Ölen (C o n n o w , L i n d -s t r
o m , O s p e c k , »Science«, Bd. 104, S. 414, Jahrg. I946) oder in einer Mischung
von Erdnußöl mit Bienenwachs (Romansky, M. J. Rittm a n n, G. E. B u l l , US. Army
Dept., Okt., 1944, 5. 43 iii Medical Newsletter, Nov. 1944) eml)-fohlen. Auch diese
Suspensionen weisen indessen verschiedene Unzuträglichkeiten auf. wie schwierige
und schmerzhafte Injektionen, schwierige Herstellung der Suspensionen, welche eine
voll-
kommene Homogenität und peinliche Sterilität besitzen müssen.
Es ist bereits ein Verfahren zur Darstellung einer neuen Penicillinform mit langdauernder
Wirkung, d. h. mit einem Verzögerungseffekt, beschrieben, die außerdem eine noch
größere Stabilität aufweist; dieses Verfahren besteht darin, daß man Penicillinrin
Form von Metallsalzen, des Kaliums, Natriums, Calciums u. dgl., in dem fl-Phenoxyätiliylalkohol
der Formel Co 1I5O C H2 C H2 O H auflöst.
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Dieses Präparat weist gegenüber den gebräuchlichen Verzögerungsformen
die folgenden Vorteile auf: Vollkommene Homogenität, leichte und nicht schmerzhafte
Injektion, absolute Sterilität und Möglichkeit, starke Dosen in einem kleinen Volumen'zu
injizieren.
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Es wurde nun festgestellt, daß man den Verzögerungseffekt von Penicillin
noch weiter dadurch verbessern kann, daß man zur Darstellung solcher Verbindungen
das nachfolgend beschriebene erfindungsgemäße Verfahren verwendet.
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Die erfindungsgemäße Darstellungsweise besteht darin, daß man eine
in Wasser und Blutserum wenig lösliche Verbindung von freiem Penicillin mit einer
organischen Base natürlichen oder synthetischen Ursprungs, welche in Wasser unlöslich,
in organischen Lösungsmitteln löslich ist, herstellt.
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Die auf diese Weise hergestellte amorphe oder kristallisierte Verbindung
kann in Suspension mit Öl von gewöhnlicher oder hoher Viskosität ohne Zusatz von
Wachs oder von einem anderen Vehikel, das auf physikalischem Wege wirksam ist, injiziert
werden Die organische Verbindung gibt von sich aus eine genügend viskose und stabile
Suspension.
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Die Verbindung kann auch in Lösung in einem injizierbaren Lösungsmittel
erfolgen, das eine höhere Viskosität besitzt als diejenige von Wasser und mit Wasser
und Blutserum wenig mischbar ist, wenn man den Verzögerungseffekt auf Grund des
chemischen Präparates und den Verzögerungseffekt auf Grund der physikalischen Wirkung
des Vehikels miteinander verbinden will. Die gemäß der Erfindung erhaltene Verbindung
kann aber nicht nur in Ölsuspension oder in Lösung in einem injizierbaren organischen
Mittel, sondern auch in wäßriger Suspension injiziert werden.
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Das hier in Frage kommende Herstellungsverfahren läßt sich unter
Verwendung der verschiedenen Qualitäten von Penicillin (amorphes Iiandelspenicillin,
reines Penicillin, kristallisiertes Penicillin), einer jeden für sich oder in Mischung
miteinander, durchführen.
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Die organische Base, welche man mit Penicillin verbindet, soll besonders
den Bedingungen genügen, in der oben beschriebenen Weise unlöslich zu sein. Man
benutzt vorzüglich Basen, welche dem Chinin oder anderen Alkaloiden verwandt sind,
und Pyrazolbasen, wie sie im nachfolgenden im einzelnen beschrieben werden.
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Diese Präparate, welche zu einer starken Konzentration führen (z.
B. 200 000 Oxfordeinheiten auf den Kubikzentimeter), besitzen auf Grund der geringeren
Löslichkeit der organischen Verbindung eine noch stärker verlängerte Wirksamkeit
als diejenigen der erwähnten älteren Veröffentlichung, ein Umstand, der sich in
der Praxis sehr vorteilhaft auswirkt.
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Beispiel 1 6,9 g Penicillin in Form des weißen Calciumsalzes mit
einem Gehalt von 10 Millionen Einheiten werden in 100 ccm doppelt destilliertem,
sterilisiertem Wasser aufgelöst.Die Lösung wird auf + 1° C abgekühlt und durch Zusatz
von 16,5 ccm Io°/oiger Phosphorsäure auf einen pt,-Wert von 2,8 angesäuert. Das
Gemisch wird viermal mit Chloroform extrahiert, wobei der pH-Gehalt von 2,8 und
die Temperatur auf + 10 C eingehalten werden.
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Die vereinigten Chloroformextrakte mit einem Volumen von I60 ccm,
welche das freie Penicillin enthalten, werden entwässert und allmählich mit einer
o,70°/oigen Lösung von [5 -Vinylchinuclidyl - (2)] - [6-methoxyc"ninolyl-(4) ]-carbinol
(Rase I 13 e i 1 5 t e i n, Bd. 23, S. 506) in Chloroform versetzt, wobei diese
Base in äquimolekularer Menge zugegeben wird, mit Hinsicht auf die freie Penicillinsäure,
die in der Chloroformlösung vorbanden ist. Die Reaktion wird bei einer Temperatur
von + 10 C durchgeführt.
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Die Zugabe von Petroläther ruft dann darin eine weiße, amorphe oder
kristallinische Fällung hervor, welche man während 3 Stunden bei derselben Temperatur
sich absetzen läßt und dann durch Zentrifugieren in der Kälte abtrennt. Nach dem
Trocknen im Vakuum, Waschen mit 50 cem wasserfreiem Äthyläther und erneuter Trocknung
erhält man 8,22 g eines organischen Penicillinsalzes, welches eine Aktivität von
7 400 ooo Einheiten aufweist.
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Das in Wasser unlösliche, in Blutserum sehr langsam lösliche organische
Salz ist für die Herstellung einer sehr feinen Ölsuspension, z.B. in Olivenöl oder
in einem Öl von noch höherer Viskosität, zu verwenden.
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Die verlängerte Wirkung der oben beschriebenen Penicillinverbindung
wurde experimentell wie folgt nachgewiesen: Die Verbindung wird in gereinigtem Colzaöl
mit einer Konzentration von 200 000 Einheiten je Kubikzentimeter (Suspension PQ)
suspendiert.
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Man injiziert hiervon auf einmal das Äquivalent von 300 ooo Oxfordeinheiten
und bestimmt dann im Blut den Gehalt an Penicillin nach I Stunde und nach 3, 6,
9, I2 und 15 Stunden. Man führt dieselbe Gehaltsbestimmung im Blut unter den gleichen
Bedingungen auch nach Injektion von gewöhnlichem Penicillin (Penicillincalcium in
wäßriger Lösung) durch. Die erhaltenen Resultate, welche in der nachfolgenden Tabelle
aufgeführt sind, zeigen klar, daß die Verbindung von Penicillin mit der organischen
Base nicht nur eine viel längere Wirkungsdauer besitzt als diejenige von Pemcillincalcium
in wäßriger Lösung, sondern auch eine ausgedehntere als selbst diejenige der Lösung
in Phenoxyäthylalkohol.
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T a b e l l e : Mengenbestimmungen von Penicillin im Blut (ausgedrückt
in Oxfordeinheiten je Kubikzentimeter)
| Calciumpenicillat in Calciumpenicillat gelost |
| Stunden der Entnahme Suspension PQ |
| wäßriger Lösung in Phenoxyalkohol |
| nach der Injektion |
| Einheiten Einheiten Einheiten |
| 1 5 1,45 1 |
| 3 0,10 0,75 0,39 |
| 6 0 0,32 0,28 |
| 9 0 0,10 0,28 |
| 12 0 0,04 0,15 |
| 15 0 0 0,10 |
Dasselbe Resultat wird z. B. auch mit den folgenden Basen erhalten: Base (II): 5-Vinylchinuclidyl-(2)-chinolyl-(4)-carbinol
(B e i l s t e i n, Bd. 23, S. 424), Base (III): 5-Vinylchinuclidyl-(2)-6-hydroxychinolyl-(4)-carbinol
(B e i l s t e i n, Bd. 23, S. 505) oder auch mit den natürlichen organischen Basen
vom Alkaloidtyp ebenso wie mit den Basen der Pyrazolsynthese, z. B. Phenyldimethylpyrazolon,
Phenyldimethylaminodimethylpyrazolon u. dgl.
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B e i s p i e l 2 Darstellung von Phenyldimethylpyrazolontt Man geht
von 1,6 g kristallisiertem Penicillinkalium aus, das man in 10 ccm steriliem Wasser
löst. Nach Entnahme von 0,5 ccm zur jodometrischen Titration enthält die Lösung
ungefähr 2 000 000 I. E. (internationale Einheiten). Durch Zugabe von ungefahr 3,25
ccm 20%iger Phosphorsäure säuert man auf pH 2,5 an und nimmt dann nacheinander Extraktionen
mit Chloroform vor, wobei man zunächst 2 ccm, dann 2,5 ccm, hierauf 1,5 ccm und
schließlich 1 ccm Chloroform anwendet. Nach jeder Extraktion prüft und bereichtigt
man den pH-Wert.
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Nach Entnahme von 0,5 ccm der Chloroformlösung zur jodometrischen
Titration enthält die Lösung noch ungefähr 1 900 000 I. E. Die Chloroformlösung
wird dann in einem Scheidetrichter durch aufeinanderfolgende Waschungen mit sterilem
Wasser unter Schütteln der Flüssigkeit gereinigt. Man verwendet zu diesem Zweck
zunächst 5 ccm, dann 2,5 ccni und scltließlich I ccm Wasser.
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Außerdem stellt man eine 20%ige Lösung von Phenyldi methylpyrazolon
in Chloroform her.
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Unter Außenkühlung mit zerstoßenem Eis fügt man zur frisch titrierten
Chloroformlösung des Penicillins das Phenyldimethyllpyrazolon mit 10% Überschuß
über die stöchiometrische Menge hinzu, wozu man ungefähr 4 ccm einer 20%igen Lösung
benötigt.
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Man erhält einen weißen, amorphen, gummiartigen Niederschlag. dett
mati zentrifugiert untl im Vakuum trocknet.
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Es werden ungefähr 800 mg Phenyldimethylpyrazolonpenicillat erhalten.
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Der Gewichtstiter beträgt bei Durchführung der Titration durch Jodometrie
(in Alkohol) 1,380 I. E./mg Die Ausbeute an internationalen Einheiten beträgt 55
bis 58 0/o.
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I)ie klinischen Studien und die Gehaltsbestim-Inungen an Penicillin
haben ferner gezeigt, daß unter den im vorangegangenen beschriebenen injizierbaren
Verbindungen die besten Resultate mit dem Penici llinsalz von [5-Vinylchinuclidyl-(2)]-[6-methoxychinolyl-(4)]-carbinol
(Chininpenicillinat) erhalten werden, das nach dem Vorstehenden durch Einwirkung
von Penicillinsäure auf das [5-Vinylchinuclidyl-(2)]-[6-methoxychinolyl-(4)]-carbinol
im Chloroform als Medium unter späterer Zugabe von Petroläther hergestellt wird.
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Die im nachfolgenden beschriebene weitere Ausbildung der Erfindung
hat zwei Abwandlungen in der Darstellung der im vorangegangenen beschriebenen Verbindung
zum Gegenstand, welche die Herstellung derselben in reinem Zustand auf wirtschaftliche
Weise und mit einer ausgezeichneten Ausbeute ermöglicht. L)ie eine der Abwandlungen
besteht darin, daß man Penicillinsäure auf die Chininbase in einem Lösungsmittel,
das teilweise in Wasser lislich ist, und die Auskristallisation des gewünschten
Salzes ermöglicht, z. 13 in Methyläthylketon, reagieren läßt. Die andere Abwandlung
besteht in einer doppelten Umsetzung eines gebräuchlichen Penicillinsalzes mit einem
geeigneten Chininsalz, z. 13. dem Formiat, in einem wäßrigen Medium, dem man ein
Lösungsmittel mit den oben beschriebenen Eigenschaften zugegeben hat. Diese beiden
Verfahren ermöglichen die Herstellung des gewünschten Salzes auf eine noch wirtschaftlichere
Weise und mit größtmöglichster Ausbeute, 13 e i s p i e 1 3 10 Millionen Penicillineinheiten
(ungefähr 6 i)is 7 g) in Form eines handelsüblichen kristallinischen Salzes (Natrium-
oder Kalium- oder Triäthylaminsalz od. dgl.) werden bei + 2° C in 50ccm destilliertem,
sterilem Wasser gelöst und die Lösung mit 50 ccm reinem Methyläthylketon versetzt.
Die auf + 20 C gehaltene Mischung wird unter ständiger Rührung durch Zugabe von
verdunnter 20%iger Phosphorsäure allmählich auf einen pn-Wert von 2,5 angesäuert.
Die wäßrige Phase wird abgegossen und bei demselben pH-Wert noch dreimal nacheittander
mit 15 ccm, 15 ccm und 10 ccm Methyläthylketon extrahiert. Die vier Extrakte werden
vereinigt und nacheinander mit
15 ccm, 10 ccm und 5 ccm destilliertem
Wasser gewaschen. Die auf diese Weise erhaltene Lösung von Penicillinsäure in Methyläthylketon
enthält 950/o der gesamten Aktivität des angewandten Penicillinsalzes. Sie wird
alsbald langsam und unter ständigem Bewegen bei einer Temperatur von + 2 °C mt einer
Lösung von reiner Chinin base versetzt, welche auf folgende Weise hergestellt worden
ist: Man verwendet eine solche Menge Chinin (reines Hydrat nach französischem Kodex
[PM 378j), die einem Gewicht an wasserfreiem Chinin (PM 324) entspricht, das der
Gewichtsmenge der angewandten Penicillinsäure (PM 334) gleichkommt. Dies stellt
einen 30/oigen Überschuß an Chinin dar, bezogen auf die theoretische, äquimonekulare
Reaktionsgleichung des Penicillins G auf [5-VinylchinucliQvl - (2)] - [6-methoxychinolyl-
(4) j -carbinol, um das basische Penicillat des Chinins zu erhalten.
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Die so bemessene Menge an Chinin wird in reinem, wasserfreiem Methyläthylketon
(Siedepunkt 78 bis 790) aufgelöst, wobei man 8 ccm Lösungsmittel auf 1 g wasserhaltiges
Chinin anwendet und auf 400 C erhitzt. Die Lösung wird, wenn nötig, durch eine leichte
Behandlung mit einem Gemisch von Adsorptionskohle und entfärbend wirkender Erde
(Bleicherde) gereinigt und filtriert. Die Umsetzung vollzieht sich durch Mischung
der beiden Lösungen bei einer Temperatur von + 20 C ohne Verlust an Aktivität.
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Die schließlich erhaltene Lösung wird unter verinindertem Druck (25
bis 30 mm Hg-Säule) in einem Destillierapparat, der mit einem bei - I50 C arbeitenden
Kondensator ausgestattet ist, konzentriert, wobei die Temperatur der Lösung während
der Konzentration nicht + 150 C überschreiten soll. Das Volumen der Lösung wird
auf diese Weise bis auf 30 ccm vermindert. Es wird sofort einer sterilisierenden
Filtration über eine Seitz-Alembran unterworfen und das Konzentrat bei + 20 C erkalten
gelassen und auf dieser Temperatur während 12 Stunden gehalten. Die Austsristallisation
der Verbindung ist dann beendet (Kristallmasse). Die kristallinische Masse kann
nach den üblichen Verfahren filtriert und unter vorinindertem Druck vollkommen getrocknet
werden. Die Ausbeute an vollkommen kristallisierter Substanz beträgt 85 bis go0
C der Aktivität des als . \ tt sgangsmaterial angewandten Penicillinsalzes.
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Beispiel 4 10 Millionen Penicillineinheiten in Form eines handelsüblichen
kristallisierten Salzes (Natrium-oder Kaliumsalz od. dgl.) werden in 19 ccm destilliertem,
sterilem, auf + 20 C abgekühltem Wasser aufgelöst. Man bestimmt durch quantitative
Analyse das Gewicht der in der Lösung in Salzform enthaltenen freien Penicillinsäure.
Gleichzeitig stellt man zwecks doppelter Umsetzung auf folgende Weise eine Chininlösung
her: Eine bestimmte Menge von Chinin (reines Hydrat gemäß Kodex), die einem Gewicht
von wasserfreiem Chinin entspricht, das dem um I00/o vermehrten Gewicht der Penicillinsäure
gleichkommt, eine Menge, welche einen Überschuß an Chininbase von I30/o gegenüber
der theoretischen äquimonekularen Reaktionsgleichung darstellt, die hasisches Chininpenicillat
liefert, wird in 75 com destillierten, sterilen Wassers suspendiert.
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Die Suspension wird nach und nach unter ständigem Rühren mit reiner,
auf 5o0/o verdünnter Ameisensäure bis zur vollständigen Auflösung des Chinins versetzt,
ohne daß hierbei das PH unterhalli von 5 fällt. Hierbei berichtigt man den p-Wert
der erhaltenen Lösung durch Zugabe von wenig reiner kaustischer Soda auf 5,3 bis
5,4. Die Lösung von Chininforntiat wird sofort auf 60t C erhitzt und bei dieser
Temperatur gehalten, um jede Kristallisation zu vermeiden. Falls nötig, wird sie
durch eine leichte Behandlung mit Adsorptionskohle und nachfolgender Filtration
in der Hitze gereinigt. Die Lösung des Chininformiats die ständig auf 600 C gehalten
wird, wird durch Filtration durch eine Seitz-Äfembran sterilisiert.
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Während dieser Zeit wird die wäßrige Lösung des Penicillinsalzes
gleichfalls über eine Seitz-Memibran bei einer Temperatur von + 20 C filtriert.
Sofort nach der Filtration läßt man auf das letztgenannte Filter 12,5 ccm reines,
auf + 20 C abgekühltes Methyläthylketon laufen, wobei das auf diese Weise sterilisierte
Lösungsmittel mit der sterilen Lösung des Penicillinsalzes vereinigt wird. Die Lösung
des Penicillins im Gemisch von Wasser und Methyläthylketon, die auf + 20 C abgekühlt
ist, wird nach und nach in einem gekühlten Mischer, welcher mit einem kräftig und
schnell arbeitenden Rührwerk versehen ist, mit der wäßrigen Lösung des auf 400 C
gehaltenen Chinin formiats versetzt. Die Kristallisation des Chininpenicillats setzt
schnell ein und erfolgt in feinen, sehr reinen Kristallen nach Maßgabe und in dem
Umfang des Mischens der beiden Lösungen, wobei sich der Vorgang der doppelten Umsetzung
augenblicklich vollzieht. Weim das Mischen beendet ist, wird das Rühren noch während
10 Minuten aufrechterhalten. Dann wird die Kristallisation durch Stehenlassen während
48 Stunden im geschlossenen Gefäß bei +2° C vervollständigt. Nach dieser Zeit wird
die kristallinische Masse auf einem Vakuumfilter abgesaugt. Die Kristalle werden
durch Suspension in 50 ccm destilliertem, sterilem Wasser gewaschen, abgesaugt und
mit 20 ccm sterilem Wasser nachgewaschen. Sie werden dann bei gewöhnlicher Temperatur
in Gegenwart eines ausgesprochenen Entwässerers im Vakuum getrocknet.
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Die Ausbeute an vollständig kristallisierter Verbindung beträgt go
bis 950in der Aktivität des angewandten Penicillinsalzes.
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Die charakteristischen Merkmale des auf diese Weise erhaltenen kristallisierten
Chininpenicillats sind folgende: Titer: goo I. E./mg.
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Stabilität: Verlust an Aktivität durch Erhitzen auf 100° C während
4 Tagen geringer als 200/0.
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Die Erfindung ist natürlich keineswegs auf die im obigen gegebenen
Einzelheiten ihrer Aus-
führung beschränkt. Insbesondere können
die angewandten Lösungsmittel und Konzentrationen geändert werden, desgleichen auch
die Bedingungen, unter denen gearbeitet wird, ohne daß man dabei den Bereich der
Erfindung überschreitet, die sich auch auf die verschiedensten Abwandlungen bekannter
Penicillinsorten anwenden läßt.