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Verfahren zur Reinigung von Penicillinsalzen Die vorliegende Erfindung
betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Penicillinsalzen von großem
Reinheitsgrad.
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Der Ausdruck Penicillin wird in seineiii weiteren Sinne verwendet
und bezeichnet sowohl die aktive saure Substanz bzw. Substanzen, gewonnen aus der
Nährlösung, auf oder in welcher gewisse Pilze, vorzugsweise Penicillium notatum,
wachsen, als auch die Metallsalze, im allgemeinen die Natrium- und Calciumsalze,
in «-elch letzterer Form das aktive Material normalerweise hergestellt und verwendet
wird. In dieser Beschreibung wird der Ausdruck Penicillin ini Sinne der ersteren
Angabe verwendet, während die Salze der aktiven Verbindung oder Verbindungen als
Penicillinsalze bezeichnet werden.
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Nach der bekannten Methode zur Herstellung von Penicillin wird dieses
aus den Nährlösungen mittels eines organischen Lösungsmittels extrahiert. Das auf
diese Weise extrahierte Penicillin wird in ein geeignetes Metallsalz, im allgemeinen
in (las Natrium- oder das Calciumsalz, übergeführt. Zur Reinigung wird die wäßrige
Lösung des Salzes meist angesäuert und das Penicillin erneut extraliiert und in
wäßriger Lösung in das gewünschte Salz übergeführt, aus welcher (las feste Salz
hergestellt wird.
Penicillinnatrium oder -calcium, das in dieser
Weise hergestellt wird, ist immer von meist gefärbten Verunreinigungen begleitet,
welche den Präparaten eine geringe und veränderliche Stabilität erteilen und die
auch bei Injektion Nebenwirkungen, wie z. B. Schmerzen, hervorrufen. Reines Penicillinnatrium-
oder -calciumsalz sind weiße Verbindungen von viel größerer Stabilität als die vorstehend
erwähnten Rohprodukte und verursachen viel weniger Schmerzen bei der Injektion.
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Die Reinigung von Penicillin oder seinen Metallsalzen, z. B. die Abtrennung
der aktiven Substanzen von den Verunreinigungen, welche diese im allgemeinen begleiten,
ist eine sehr heikle und beschwerliche Operation. Die vorliegende Erfindung betrifft
nun ein neues und verbessertes Verfahren zur Herstellung von gereinigten Penicillinsalzen.
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Es wurde gefunden, daß rohes Penicillin oder seine Metallsalze leicht
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigt werden können, indem das oder die
Penicillinsalze in Salze einer oder mehrerer primärer, organischer Basen übergeführt
werden, wie sie nachstehend beschrieben sind. Zu diesem Zweck wird freies Penicillin
in einem oder mehreren geeigneten Lösungsmitteln gelöst, welche nachstehend beschrieben
werden, und werden darin mit einer oder mehreren der besagten primären organischen
Basen versetzt. Der entstehende Niederschlag des Salzes mit der primären Base wird
abfiltriert und ist von größerer Reinheit als das ursprüngliche Penicillin. Er kann
durch Waschen und/oder durch weiteres Umkristallisieren gereinigt werden. Gewünschtenfalls
kann das Salz mit der primären, organischen Base in ein Penicillinmetallsalz oder
in -metallsalze von hohem Reinheitsgrad übergeführt werden.
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Durch den obenerwähnten Ausdruck eine geeignete primäre, organische
Base wird eine Verbindung der allgemeinen Formel R N H, bezeichnet, worin R einen
Kohlenwasserstoffrest bezeichnet, der im Falle einer Alkyl- oder Alkenylgruppe nicht
mehr als vier Kohlenstoffatome und in anderen Fällen nicht mehr als acht Kohlenstoffatome
besitzt, welche Verbindung einen pKH-Wert von nicht weniger als io,2 aufweist und
die im erfindungsgemäßen Verfahren das Penicillin nicht schnell zerstört. Beispiele
solcher Basen sind Cyclohexylamin, Methylcyclohexylamin, Monoäthylamin, Isopropylamin
und n-Butylamin. pim = i4-prb, wobei pgb der Logarithmus der reziproken Dissoziationskonstante
der in Frage kommenden Base ist.
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Nach dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren können auch Penicillinsalze
von großer Reinheit hergestellt werden, indem rohes Penicillin oder seine Metallsalze
in ein Salz oder in Salze mit einer oder mehreren der obengenannten primären, organischen
Basen übergeführt werden.
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Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können auch Penicillinsalze
von großer Reinheit hergestellt werden, indem Lösungen von rohem Penicillin in einem
nachstehend beschriebenen geeigneten Lösungsmittel gelöst und mit einer oder mehreren
der oben beschriebenen geeigneten primären, organischen Basen behandelt werden;
so daß ein oder mehrere feste Salze von Penicillin mit primären, organischen Basen
gebildet werden, die von der verbleibenden Lösung abgetrennt werden.
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Nach dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren können die Penicillinsalze
mit primären, organischen Basen leicht in Penicillinmetallsalze von großer Reinheit
übergeführt werden.
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Es wurde ferner gefunden, daß es wünschenswert ist, wenn die obengenannten
Lösungen von rohem Penicillin in einem geeigneten Lösungsmittel auch noch eine gewisse
Menge eines sekundären Lösungsmittels enthalten, das hierin beschrieben wird, bevor
die geeignete primäre, organische Base zugegeben wird.
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Es ist vorteilhaft, die Salze der primären, organischen Basen durch
Waschen und/oder durch Umkristallisieren zu reinigen, bevor sie in die Metallsalze
übergeführt werden.
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Im allgemeinen wird ein rohes Metallsalz, z. B. das Natrium- oder
Calciumsalz des Penicillins, zur Verwendung gelangen, wie es nach den üblichen Methoden
bei der Extraktion des Penicillins aus den Nährlösungen erhalten wird, oder es wird
die wäßrige Lösung eines solchen Salzes verwendet, dann die wäßrige Lösung mit Phosphorsäure
bis zum PH 2,5 angesäuert und anschließend das Penicillin durch Extraktion in einem
geeigneten Lösungsmittel aufgenommen.
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Der in dieser Beschreibung verwendete Ausdruck ein geeignetes Lösungsmittel
bezeichnet ein Lösungsmittel, mit welchem das Penicillin leicht aus der angesäuerten,
wäßrigen Lösung aufgenommen werden kann, welches gegenüber Penicillin inert ist
und in welchem die obengenannten Salze des Penicillins mit primären, organischen
Basen relativ schwer löslich sind. Ein solches Lösungsmittel ist Diäthyläther. Es
können aber auch andere Lösungsmittel, wie Amylacetat oder Methylisobutylketon,
verwendet werden. Im allgemeinen sind halogenierte Kohlenwasserstoffe ungeeignet.
Immerhin ist es aber möglich, nach einer etwas modifizierten Technik Chloroform
zu verwenden. Wird zur Extraktion des Penicillins aus der angesäuerten, wäßrigen
Lösung Chloroform verwendet und dieser Extrakt mit einer geeigneten organischen
Base versetzt, so wird deren Penicillinsalz im allgemeinen in Lösung verbleiben.
Es kann jedoch zur Kristallisation gebracht werden, entweder durch Zugabe von mehreren
Volumen eines geeigneten sekundären, organischen Lösungsmittels, wie z. B. Aceton
oder Methyläthylketon, oder aber vorzugsweise durch Zugabe einer geringen Menge
eines solchen sekundären Lösungsmittels und mehrerer Volumen eines relativ inerten
Lösungsmittels, wie z. B. Kohlenstofftetrachlorid oder Äther.
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Der in dieser Beschreibung verwendete Ausdruck ein geeignetes sekundäres
Lösungsmittel bezeichnet ein Lösungsmittel, in welchem die Penicillinsalze der primären,
organischen Basen relativ unlöslich sind, in welchem aber die normalerweise vorhandenen
Verunreinigungen des Penicillins löslich sind. In Abwesenheit dieser sekundären
Lösungsmittel
besteht die Möglichkeit, (laß die Salze dieser N"erunreinigungen
zusammen mit dem Penicillin ausgeschieden «erden. Gegenwärtig wird vorzugsweise
.Iethylisobutylketon als Hauptlösungsmittel verwendet und mit 2 bis io % Äthylalkohol
als sekundärem Lösungsmittel \,ersetzt. Im Hinblick auf die Natur und die relativen
Mengen der verwendeten Lösungsmittel bestehen jedoch die verschiedensten Kombinationsmöglichkeiten
zwischenHauptlösungsmittel und sekundärem Lösungsmittel. 0l) sich ein bestimmtes
Lösungsmittel als sekundäres Lösungsmittel eignet und «-elche Mengen optimale Resultate
liefern, kann leicht durch den Fachmann in Laboratoriumsversuchen bestimmt werden.
Solche Versuche dienen auch dazu, die optimalen Konzentrationen festzustellen, welche
in den einzelnen Kombinationen von Haupt- und sekundärem Lösungsmittel zur Anwendung
gelangen sollen. Im folgenden wird allgemein angegeben, wie das erfindungsgemäße
Verfahren am besten durchgeführt wird.
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Zuerst wird eine Lösung von rohem Penicillin in einem der obengenannten
Lösungsmittel hergestellt. Als Ausgangsmaterial wird ein rohes Metallsalz, vorzugsweise
das Natrium- oder Calciumsalz des Penicillins, das nach Möglichkeit nicht weniger
als 20 % des besagten Salzes enthält, oder aber eine wäßrige Lösung eines solchen
Salzes, die vorzugsweise, aber nicht unbedingt bis zu ungefähr j 0/0 Penicillin,
bezogen auf Zoo 0i"0 reines Penicillin, enthält, verwendet. Es kann auch eine Penicillinmetallsalzlösung
verwendet werden, «-elche bei der Extraktion des Penicillins aus der Nährlösung
nach der üblichen Art erhalten wird. Wird eine solche Lösung durch Zugabe einer
starken Säure, z. B. Phosphorsäure, unter Rühren auf ungefähr pH 2,5 angesäuert,
so entsteht Penicillin, welches zusammen mit einer gewissen Menge Verunreinigungen
durch Extraktion in ein ofengenanntes Lösungsmittel übergeführt werden kann. Zur
Zeit wird dazu Methylisobutvlketon oder Diäth_vliitlier verwendet. Damit eine solche
Extraktion ausgiebiger wird, ist es vorteilhaft, wenn in der wäßrigen Lösung noch
eine Substanz, wie z. B. Natriumchlorid, vorhanden ist.
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Anschließend wird vorzugsweise unter Rühren eine bestimmte Quantität
eines hierin beschriebenen geeigneten sekundären Lösungsmittels zugegeben. Zur Zeit
wird zwischen 5 und 3o Volumprozetit Aceton oder llethylätlivlketon als sekundäres
Lösungsmittel verwendet, wenn Diäthvläther als Hauptlösungsmittel zur An -,vendung
gelangt.
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Des weiteren wird meist unter Rühren die gewünschte primäre, organische
Base zugesetzt. Die Menge der zuzusetzenden Base soll wenigstens einem Moläquivalent
des Penicillins entsprechen. Es ist aber nicht gesagt, daß das exakte Moläquivalent
optimalen Bedingungen entspricht. Die für die einzelnen Fälle geeignete Menge läßt
sich jedoch leicht im Laboratorium an Probelösungen bestimmen, die aus dem verwendeten
rohen Penicillinsalz hergestellt werden. In der Praxis wurde gefunden, daß es genügt,
werni so viel der organischen Base zugesetzt wird, bis kein weiterer Niederschlag
mehr gebildet wird. Es ist jedoch vorteilhaft, wenn im allgemeinen die Menge an
primärer, organischer Base die äquivalente Menge der gesamten Acidität der rohen
Penicillinlösung nicht überschreitet.
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Bei dieser Reaktion wird eine makro-oder mikrokristalline feste Substanz,
bestehend aus dem Salz des Penicillins mit der organischen Base, ausgeschieden,
welche gegebenenfalls von schmierigen Verunreinigungen begleitet sein kann.
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Diese feste Substanz, die in guter Ausbeute entsteht, wird durch Filtration
getrennt und kann gewünschtenfalls durch Waschen oder durch Umkristallisieren nach
der weiter unten beschriebenen Methode gereinigt werden.
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Wird das Salz des Penicillins mit der primären, organischen Base aus
einer Lösung des rohen Penicillins in einem geeigneten Lösungsmittel ausgefällt,
ohne daß ein oben definiertes sekundäres Lösungsmittel zugegen ist, so wird der
Niederschlag je nach der anfänglichen Reinheit des rohen Penicillins, je nach der
Kombination derReagenzien und je nach der Natur der Lösungsmittel entweder eine
feste Substanz, ein 01 oder ein Gemisch beider sein.
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In jedem Fall kann aber das gewünschte Salz durch Waschen oder durch
Verreiben dieser Produkte mit einem obengenannten geeigneten sekundären Lösungsmittel
und einem ebenfalls schon genannten Hauptlösungsmittel in einen verhältnismäßig
reinen Zustand übergeführt werden. Gewünschtenfalls kann das Salz des Penicillins
mit der primären, organischen Base durch Umkristallisieren noch weiter gereinigt
werden. Dies wird am besten durch Lösen in einer minimalen Menge von warmem Äthylalkohol,
Zusetzen von drei Volumen Dil)utyläther, langsames Abkühlenlassen auf o° C und Filtrieren
durchgeführt.
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Das auf diese Weise gereinigte Salz des Penicillins mit der organischen
Base kann nach verschiedenen Methoden leicht in die Metallsalze, z. B. in das Natrium-
oder Calciumsalz, übergeführt werden, welches viel reiner als die Ausgangsmaterialien
sind.
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Nach einer dieser Methoden wird diese Umsetzung so durchgeführt, daß
das Salz des Penicillins mit der primären, organischen Base unter kräftigem Rühren
zu einer Mischung von Äther oder Chloroform und wäßriger Phosphorsäure zugegeben
wird, welche wenigstens eine der dem verwendeten Salz entsprechende äquivalente
Menge Phosphorsäure enthält. Anschließend wird der organische Extrakt abgetrennt,
die wäßrige Lösung schnell auf ph 2,5 eingestellt und mit weiteren Mengen des organischen
Lösungsmittels extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und mit einer wäßrigen
Lösung von Metallhydroxyd, z. B. Natriumhydroxyd, extrahiert, die eine dem in der
organischen Phase vorhandenen Penicillin äquivalente Menge .hletallliydroxyd enthält.
Der wäßrige Extrakt wird aus dem gefrorenen Zustand getrocknet.
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Zur Erleichterung des Verständnisses des vorliegenden erfindungsgemäßen
Verfahrens werden die nachstehenden Beispiele angeführt. In diesen Beispielen
bedeuten
die Abkürzungen ME Megaeinheit, d. h. 1 ooo ooo Oxfordeinheiten, und 0E Oxfordeinheiten.
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Beispiel 1 5,3 SIE Penicillincalcium (78o OE/mg) werden in 25o cm3
25°/oiger Natriumchloridlösung gelöst. Die Lösung wird mit Phosphorsäure auf PH
2,5 eingestellt und zweimal mit Äther extrahiert. Der Ätherextrakt wird durch Einstellen
in festes Kohlendioxyd-Aceton-Gemisch abgekühlt und abfiltriert. Die trockene Ätherlösung
wird mit 1,5 g Entfärbungskohle geschüttelt und filtriert. Der feste Niederschlag
wird gut mit Äther gewaschen. Zu den vereinigten Filtraten und Waschflüssigkeiten
(9oo cm3) fügt man 45 cm3 Aceton und io cm3 einer iovolumprozentigen ätherischen
Lösung von Cyclohexylamin. Nach einigen Minuten Stehen bei Zimmertemperatur wird
abfiltriert und der feste Niederschlag viermal durch Verrühren mit trockenem Aceton
und durch anschließendes Abfiltrieren gewaschen. Die Ausbeute an cremegelbem Niederschlag
nach dem Trocknen beträgt 2,82 g.
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Das Produkt wird in 6o cm3 warmem Chloroform gelöst und mit
180 cm3 Aceton versetzt. Dabei kristallisiert langsam das Cyclohexylaminsalz
des Penicillins aus. Vor dem Abfiltrieren wird das Gemisch auf ungefähr -2o° C abgekühlt.
Die Mutterlaugen werden auf io cm3 eingedampft und nochmals mit 30 cm3 Aceton
zur Ausfällung einer weiteren Menge des gewünschten Salzes versetzt. Die Ausbeute
an weißem Niederschlag setzt sich zusammen aus 2,12 g aus der ersten und
0,30 g aus der zweiten Kristallisation. Sie weisen einen Gehalt von 166o
OE/mg auf.
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2,2 g gereinigtes Penicillincyclohexylaminsalz werden in 5o cm3 Eiswasser
und Zoo cm3 Chloroform eingerührt, während gleichzeitig 6 cm3 i oo/oige Phosphorsäure
zugerührt werden, so daß das pH auf 2,1 fällt. Der Chloroformextrakt wird mit 35
cm3 Wasser und 4,6 cm3 n-Natriumhydroxydlösung verrührt. Dabei steigt das pH auf
5,9. Nach dem Abtrennen wird die Chloroformschicht mit 15 cm3 Wasser und 0,2 cm3
n-Natriumhydroxydlösung verrührt und dadurch das PH auf 7,4 gebracht. Die vereinigten
wäßrigen Lösungen werden aus dem gefrorenen Zustand getrocknet. Der feste Rückstand
wird in 4o cm3 Aceton aufgenommen und daraus reines Penicillinnatriumsalz in kristallisiertem
Zustand gewonnen. Die Ausbeute beträgt 1,57 g mit einem Gehalt von 1640 OE/mg.
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Beispiel e i ME Penicillincalciumsalz (78o OE/mg) wird in Wasser gelöst.
Die Lösung wird bis zum PH 4 angesäuert und mit Methylisobutylketon extrahiert.
Der Extrakt wird durch Tiefkühlung in einem Gemisch von festem Kohlendioxyd und
Aceton getrocknet und anschließend abfiltriert. Zu dieser getrockneten Penicillinlösung
(75 cm3) fügt man 2 cm3 einer iovolumprozentigen Lösung von Cyclohexylamin in Methylisobutylketon.
Nach 1/2 Stunde wird der Niederschlag abfiltriert, mit Methylisoblltylketon und
dann mit Aceton gewaschen. Der feste Niederschlag entspricht ungefähr
70 Ü/o des ursprünglich eingesetzten Penicillins. In der Mutterlauge finden
sich noch weitere 15 %.
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Beispiel 3 o,45 ME Penicillincalcium (78o OE/mg) werden in Wasser
gelöst und, wie in Beispiel i beschrieben, mit Äther extrahiert. Zu dieser Lösung
(5o cm3) gibt man 5 cm3 Aceton und o,6 cm3 einer iovolumprozentigen Lösung von Isopropylamin
in Äther. Der flockige Niederschlag wird nach einigen Minuten abfiltriert und mit
Aceton gewaschen. Die Ausbeute beträgt 0,22 g mit einem Gehalt von 1520 OE/mg.
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Beispiel 4 2,5 ME Penicillinnatriumsalz (445 OE/mg) werden, wie in
Beispiel 1 beschrieben, in Äther übergeführt. Die verwendete Menge Tierkohle wird
aber gegenüber Beispiel i verdoppelt. Die Lösung wird, wie in Beispiel i, mit Cyclohexylamin
behandelt. Das cremegefärbte Cyclohexylaminsalz des Penicillins wird, wie in Beispiel
i beschrieben, umkristallisiert. Das rohe bzw. umkristallisierte Salz enthält 6o
bzw. 50 % der ursprünglich vorhandenen Menge Penicillins.