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Verfahren zur Gewinnung von Aureomycin Die Erfindung betrifft eine
weitere Ausbildung der Gewinnung von Aureomycin aus Aureomycin enthaltendem Material
nach Patent 869 679.
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Ein Ziel der Erfindung ist die Abtrennung des Aureomycins von jeglichen
Verunreinigungen, mit welchen es in Berührung kommen kann und besonders von Mycelen,
Nährlösungen, Stoffwechselprodukten, Filterhilfen usw. Das Aureomycin kann mit diesen
Stoffen zusammen vorkommen oder im Verlaufe seiner Erzeugung durch Fermentation
oder bei der Reinigung oder Herstellung mit diesen verunreinigt sein bzw. in Berührung
kommen.
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Es ist ein Ziel der Erfindung, das Aureomycin von jeglichen Stoffen,
mit welchen es zusammen vorkommen kann, abzutrennen, insbesondere von solchen, die
in angesäuerten niedrigeren aliphatischen Alkoholen nicht löslich sind. Viele Verunreinigungen,
welche bisher schwierig vom Aureomycin abzutrennen waren, sind in angesäuerten niedrigen
aliphatischen Alkoholen nicht löslich. Dies gilt für Aureomycin, unabhängig davon,
ob es als Salz einer Säure oder als freies Aureomycin oder als Salz eines Metalls
mit Verunreinigungen behaftet gefunden wurde. Das Aureomycin existiert wahrscheinlich
in der Lösung von angesäuertem niedrigem aliphatischem Alkohol als Salz mit einer
Säure; es kann jedoch während des Trennverfahrens vom Lösungsmittel oder später
in irgendeine geeignete Form umgewandelt werden.
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Erfindungsgemäß wird das Aureomycin aus Aureomycin enthaltendem Material
gewonnen, indem dieses Material wenigstens einmal mit einem niedrigeren ali-I phatischen
Alkohol bei einem pH-Wert von weniger
als etwa q. extrahiert wird,
der Extrakt von den zurückbleibenden Stoffen abgetrennt und das Aureomycin aus dem
Extrakt gewonnen wird.
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Bevorzugt sind Alkohole mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen. Von den niedrigeren
aliphatischen Alkoholen besitzt n-Butanol sowohl günstige Flüchtigkeits- als auch
Löslichkeitseigenschaften und ein spezifisches Gewicht, die es zur Verwendung als
Extraktionslösungsmittel besonders geeignet machen. Hinzu kommt, daß Aureomycin
in angesäuertem n-Butanol verhältnismäßig löslich ist und daß viele Verunreinigungen,
welche früher als mit Aureomycin zusammen vorkommend festgestellt wurden, in dem
angesäuerten Butanol verhältnismäßig unlöslich sind.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann in Verbindung mit irgendeinem
oder allen der verschiedenen anderen Reinigungsmethoden angewandt werden, wobei
durch jedes dieser Verfahren bestimmte unerwünschte Bestandteile, mit denen das
Aureomycin verunreinigt sein kann, abgetrennt werden.
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Unter anderem ist ein Ausgangsmaterial des unreinen Aureomycins ein
alkalischer Kuchen, der aus der Fermentationsmaische abgetrennt wurde. Viele der
üblicherweise angewandten Fermentationsmethoden resultieren in der Bildung einer
Maischeflüssigkeit, in der das Aureomycin teilweise in Lösung und teilweise als
Niederschlag vorhanden ist. Bei Anwesenheit von Calcium kann der Niederschlag das
Calciumsalz des Aureomycins sein. Andere übliche Salze umfassen die Barium-, Strontium-
oder Magnesiumsalze, die einzeln oder alle anwesend sein können. Bei Anwesenheit
eines Überschusses irgendeines dieser Metallionen fällt ein großer Anteil des Aureomycins
aus, insbesondere wenn das p$ der Fermentationsflüssigkeit innerhalb des Bereichs
von 6 bis zo liegt. Die besten Ausbeuten treten üblicherweise auf, wenn die Abtrennung
bei einem pa-Bereich von etwa 7 bis 8,5 durchgeführt wird. Das ausgefällte Aureomycin
kann dann von den löslichen Materialien abgetrennt werden, und diese Abtrennung
kann . durch Verwendung einer Filterhilfe unterstützt werden. Die so abgetrennten
Stoffe zeigen den Aureomycin enthaltenden Kuchen in alkalischem Zustand.
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Ein Aureomycin enthaltendes festes Material kann erhalten werden,
indem das Aureomycin aus einer dasselbe enthaltenden wäßrigen Lösung durch Verschiebung
des pH-Wertes in den Bereich von etwa 5 bis 7 ausgefällt wird, wobei es als neutrales
Aureomycin ausfällt, das natürlich gewisse Verunreinigungen enthalten kann.
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Andere Aureomycin enthaltende feste Stoffe entstehen bei der Verdampfung
einer Aureomycin enthaltenden Lösung.
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Irgendeiner dieser festen Stoffe oder Kuchen kann dann erfindungsgemäß
behandelt werden, indem er in einem niedrigeren aliphatischen Alkohol bei einem
pH-Wert von weniger als etwa q. suspendiert wird, wobei das Aureomycin gelöst wird
und der größere Teil der Verunreinigungen als unlösliches Material zurückbleibt.
Die Säuremenge zur Steuerung des pH-Wertes variiert in hohem Grad mit der Zusammensetzung
des Kuchens. Besonders wenn Kalk anwesend ist, können verhältnismäßig große Mengen
erforderlich sein.. Die Extraktion kann wiederholt werden. Es können Gegenstrom-
oder Mehrfachextraktionen ebenso wie viele verschiedene Arten von Extraktionskolonnen
und -vorrichtungen angewandt werden. Die Extraktion kann mit den festen Stoffen,
solange sie noch feucht sind, bewirkt werden. Die Extraktion kann auch an einem
trockenen Kuchen mit trockenem Butanol vorgenommen werden. Es werden bessere Ausbeuten
erzielt, wenn entweder der Kuchen oder das Butanol feucht ist. In trockenem Butanol
ist Aureomycinhydrochlorid bis etwa 5oo Gamma/ccm löslich. In feuchtem Butanol ist
es bis etwa 7ooo Gamma/ccm löslich. Deshalb tritt die überraschende Tatsache auf,
daß bei Verwendung eines feuchten Kuchens nicht nur das Verfahren vereinfacht wird,
da es nicht notwendig ist, den Kuchen zu trocknen, sondern. es wird darüber hinaus
ein wirksameres Verfahren erzielt. Besonders zweckmäßig ist es, die feuchten Substanzen
zu verwenden, wenn diese von den wäßrigen Lösungen abgetrennt wurden, so daß die
Trocknungskosten erspart werden. Die Extraktion kann bei irgendeiner geeigneten
Temperatur durchgeführt werden. Es ist zweckmäßig, zwischen zo und 55° zu arbeiten.
Wenn die Extraktion in der Hitze durchgeführt wird, kann eine kleinere Lösungsmittelmenge
verwendet werden, und die Lösung ist weniger viskos, so daß die Abtrennung leichter
ist. Die Extraktion kann indessen auch wirksam bei Zimmertemperatur durchgeführt
werden, wodurch die für das Arbeiten mit heißen Lösungsmitteln notwendige Vorrichtung
erspart werden kann.
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Es können verschiedene Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure
und Essigsäure, zur Steuerung des pH-Wertes verwendet werden. Am wirtschaftlichsten
sind Salzsäure und Schwefelsäure. Die Verwendung von Salzsäure ist vorteilhaft,
da hierbei das Aureomycin leichter als Hydrochloridsalz gewonnen werden kann. Aber
auch Schwefelsäure ist sehr wirtschaftlich, insbesondere wenn große Kalkmengen neutralisiert
werden müssen. Das Sulfatsalz des Aureomycins kann während der folgenden Behandlung
gewünschtenfalls leicht in das Hydrochlorid umgewandelt werden.
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Vorzugsweise wird in dem pH-Bereich von etwa 0,5
bis 2,5 extrahiert.
Noch saurere Lösungen erfordern die Verwendung von größeren Säuremengen und eine
korrosionsfestere Vorrichtung, ohne daß dabei eine entsprechende höhere Ausbeute
erzielt würde. Wenn der pH-Wert oberhalb von etwa 2,5 liegt, so ist die Extraktion
nicht so vollständig und vollzieht sich langsamer als in dem bevorzugten Bereich.
Es kann irgendeiner der niedrigeren aliphatischen Alkohole verwendet werden. n-Butanol
zeigt jedoch in den sauren Bereichen für Aureomycin gute Lösungseigenschaften. n-Butanol
ist billig, vom Standpunkt der Feuergefährlichkeit und der Toxizität weniger gefährlich
als einige der anderen Alkohole und wird leicht zurückgewonnen. Es ist erwünscht,
daß ein solcher Alkohol verwendet wird, der aus dem Extrakt bei einer nicht viel
über etwa 55° gelegenen Temperatur entfernt werden kann, und ferner, daß ein Lösungsmittel
verwendet wird, in dem die mit dem Aureomycin aauftretenden Verunreinigungen verhältnismäßig
unlöslich sind.
Es ist auch vorteilhaft, ein Lösungsmittel zu verwenden,
das mit Wasser verhältnismäßig nicht mischbar ist und von dem etwa zurückbleibendes
Wasser vorzugsweise während der Destillation entfernt wird. n-Butanol weist alle
diese Eigenschaften auf.
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Die Lösungsmittelmenge variiert mit dem pH und der Wirksamkeit des
Lösungsmittels. Bei einem pH in dem bevorzugten Bereich ergibt n-Butanol ausgezeichnete
Ausbeuten, wenn zwei Extraktionen durchgeführt werden. Bei der Gewinnung von Aureomycin
aus dem Fermentationskuchen stellen Volumina von etwa 2o°/0 des ursprünglichen Maischevolumens
bei jeder Extraktion eine wirksame Extraktion dar. Das genau verwendete Volumen
und die Anzahl der Extraktionen können in weiten Grenzen variiert werden.
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Die verschiedenen, das Aureomycin enthaltenden Extrakte können dann
vereinigt und das Aureomycin daraus gewonnen werden. Dies erfolgt leicht, wenn der
Alkohol durch Destillation entfernt wird. Um eine Zerstörung des Aureomycins zu
vermeiden, ist es vorzuziehen, die Destillation unterhalb einer maximalen Temperatur
von etwa 55° durchzuführen. Der überdestillierte Alkohol kann selbstverständlich
wieder verwendet werden. Die zurückbleibende Wassermenge variiert natürlich mit
dem verwendeten Alkohol. Mit n-Butanol destilliert das Wasser als azeotropes Gemisch
über, wobei als Rückstand trockenes Butanol zurückbleibt. Die Azidität des Rückstandes
hängt zum Teil von der verwendeten Säure ab. Bei Verwendung von Salzsäure kann etwas
Säure überdestillieren, und es kann zusätzliche Säure erforderlich werden, um die
Kristallisation des Aureomycins zu unterstützen.
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Im allgemeinen wird das Lösungsmittel abdestilliert, bis das Aureomycin
wenigstens hinreichend konzentriert ist, so daß es beim Abkühlen des Konzentrates
ausfällt. Es wurde gefunden, daß man verbesserte Ausbeuten erzielen kann, wenn das
Lösungsmittel so lange abdestilliert wird, bis das Aureomycin in der Hitze auszufallen
beginnt. Die Destillation kann fortgesetzt werden, bis eine ziemlich dicke Aufschlämmung
gebildet ist. Aus arbeitstechnischen Gründen wurde es als zweckmäßig gefunden; das
Lösungsmittel bis auf etwa 1/2o seines ursprünglichen Volumens zu konzentrieren.
Die Aufschlämmung kann dann abgekühlt und das Aureomycin abgetrennt werden. Zur
Erzielung guter Ergebnisse scheint es erwünscht, daß die Aufschlämmung stärker sauer
ist, und sie kann durch Zugabe von Salzsäure auf ein pH von etwa o,8 eingestellt
werden.
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Nach dem Abkühlen können die Kristalle abgetrennt, dann gewaschen
und getrocknet werden. Die Waschflüssigkeit für die Kristalle soll wenigstens eine
aus der Gruppe n-Butanol, Äthylenglykoläthyläther, Äthylalkohol oder Wasser sein.
Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn wenigstens zwei dieser genannten Lösungsmittel
nacheinander zum Waschen der Kristalle verwendet werden. Es ist gewöhnlich erwünscht,
daß das anschließende Waschen ausgeführt wird, bevor die Kristalle getrocknet werden.
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Wenn bei der ursprünglichen Extraktion eine andere Säure als Salzsäure
zum Ansäuern verwendet wird, so kann das Säureradikal durch Schütteln des Extraktes
mit einem geeigneten Salz ausgetauscht werden. Wenn bei der ursprünglichen Extraktion
Schwefelsäure verwendet wird und das angewandte Lösungsmittel Butanol ist, kann
eine gesättigte Natriumchloridwaschflüssigkeit mit dem Lösungsmittel geschüttelt
werden, wobei ein Austausch des in Lösung befindlichen Aureomycins vom Sulfat zum
Hydrochloridsalz eintritt. Falls erwünscht, können andere Austauschreaktionen vorgenommen
werden. Das Aureomycin wird gewöhnlich als Hydrochlorid gewünscht.
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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Beispiel
i Ein Aureomycin enthaltender Kuchen von der Filtration mit alkalischer Fermentationsflüssigkeit
wurde mit 2o Volumprozent der ursprünglichen Maischeflüssigkeit an n-Butanol bei
Zimmertemperatur bei einem pli von 1,4 behandelt, wobei mit g n-Schwefelsäure sauer
gemacht wurde. Der Butanolkuchen und die Säure wurden io Minuten zusammen aufgeschlämmt,
wonach das gewünschte pu erreicht war. Dann wurde der Kuchen filtriert. Der entstehende
Kuchen wurde wieder mit 2o Volumprozent Butanol io Minuten lang bei einem pH von
1,4 aufgeschlämmt und das Butanol und der Kuchen getrennt. Der erste Extrakt enthielt
64,8 °/o des ursprünglich vorhandenen Aureomycins und die zweite Extraktion 18 °/o.
Die Butanolextrakte wurden vereinigt und mit 3o°/oiger Natriumchloridlösung geschüttelt.
Die obere Lösungsmittelphase wurde abgetrennt und die Mischung unter Vakuum konzentriert,
bis das Aureomycin auszufallen begann, wonach es abgekühlt, auf pH o,8 mit Salzsäure
eingestellt und das Aureomycin durch Filtrieren abgetrennt wurde. Das entstehende
Produkt war das Hydrochloridsalz des Aureomycins. Beispiel 2 Zu g,51 einer Aureomycin-Fermentationsmaische,
welche laut Analyse 1185 Gamma/ccm enthielt, wurde i Gewichtsprozent Diatomeenerde,
bezogen auf Volumenbasis, gegeben. Die Maische wurde filtriert und ergab etwa i
kg eines feuchten Kuchens. Der Kuchen wurde mit 1,9 1 wasserfreiem Butanol extrahiert,
das Butanol abgetrennt und der Rückstand wieder mit 1,9 1 feuchtem Butanol extrahiert.
Diese letzte Extraktion wurde wiederholt. Die erste Extraktion wurde bei einem pH
von 1,30 durchgeführt, was die Zugabe von etwa 17o ccm 6 n-Salzsäure erforderte.
Die zweite und dritte Extraktion wurde nach der Zugabe von 13 ccm 6 n-Salzsäure
bei pH-Werten von 1,46 bzw. 1,35 durchgeführt. Die Aureomycin-Analyse bei den drei
Chargen betrug für die erste Extraktion 176o ccm Extrakt mit 569o Gamma/ccm, für
die zweite ig2o ccm mit gio Gamma/ccm und für die dritte 1929 ccm mit 22o Gamma/ccm.
(Infolge von Unsicherheiten in den Analysen wird kein genauer Wert erhalten.) Die
Butanolextrakte wurden vereinigt und das Butanol bei einer Temperatur zwischen 45
und 55° unter Vakuum bis etwa 5 % des ursprünglichen Butanolvolumens entfernt. Zu
dem Konzentrat
wurden =,1o ccm Äthylenglykoläthyläther und 13 ccm
. 6 n-Salzsäure zugegeben. Das Konzentrat wurde 18 Stunden bei Zimmertemperatur
und 7 Stunden bei 4° stehengelassen. Das Material wurde filtriert, mit 15 ccm Äthylenglykoläthyläther,
12 ccm Wasser, 12 ccm wasserfreiem Alkohol gewaschen und dann getrocknet. Beispiel
3 Zu 121 Maische wurden bei. pH 7,2 24 ccm =o n-Natriumhydroxyd und =8o g Kieselerde
gegeben. Die entstehende Aufschlämmung wurde filtriert und ergab 1350 g eines feuchten
Mycelkuchens. Zoo g dieses Kuchens wurden zweimal mit 36o ccm Butanol extrahiert,
wobei der erste Extrakt mit trockenem und der zweite Extrakt mit feuchtem Butanol
hergestellt wurde. Die erste Extraktion wurde bei einem pÄ von 0,38 durchgeführt,
was durch Zugabe von 65 ccm konzentrierter Salzsäure ' erhalten wurde. Die zweite
Extraktion erfolgte bei pH 0,32, was durch Zugabe von 30 ccm konzentrierter
Salzsäure hergestellt wurde. Die Extrakte wurden vereinigt, die wäßrige Schicht
verworfen und der Extrakt auf 40 ccm unter Vakuum bei einer Temperatur zwischen
45 und 55° konzentriert. Zu dem Konzentrat wurden 16 ccm Äthylenglykoläthyläther
zugegeben und die Mischung 18 Stunden bei Zimmertemperatur und dann 4 Stunden bei
4° stehengelassen. Die Kristalle wurden abgetrennt und mit 4 ccm Äthylenglykoläthyläther,
3 ccm Wasser und 3 ccm wasserfreiem Alkohol gewaschen und getrocknet. Beispiel 4
1,9 1 einer Maische, welche 94o Gamma/ccm enthielt, wurden mit =o n-kaustischer
Soda auf pH 8,6 eingestellt. * Dazu wurden 28 g Diatomeenerde gegeben und die Mischung
filtriert. Der Kuchen wurde mit 52 ccm 6 n-Salzsäure angesäuert und einmal mit 45o
ccm Isopropylalkohol extrahiert. Die feste Substanz wurde nochmals mit 45o ccm Isopropylalkohol
nach Zugabe von 7 ccm 6 n-Salzsäure extrahiert. Beide Extraktionen wurden bei 55°
durchgeführt. Die entstandenen Extrakte wurden vereinigt und auf 10 °/o ihres ursprünglichen
Volumens im Vakuum bei 35° konzentriert. Zu dem Konzentrat wurden 1/5 seines Volumens
an Äthylenglykoläthyläther und das gleiche Volumen des Konzentrats wasserfreier
Alkohol zugegeben. Das pH wurde mit 6 izcm 6n-Salzsäure auf o,69 eingestellt. Das
Konzentrat wurde 6o Stunden bei Zimmertemperatur und 4 Stunden bei 4° stehengelassen.
Das Material wurde filtriert, einmal mit 4 ccm Äthylenglykoläthyläther, dann mit
4 ccm Wasser und schließlich mit 4 ccm wasserfreiem Äthylalkohol gewaschen. Die
Kristalle wurden im Vakuum getrocknet. Es wurde eine Ausbeute von =,o6 g Aureomycinhydrochlorid
erhalten, was bei der Analyse 72o Gamma/mg ergab. Dies bedeutet eine Ausbeute von
38,4 %. Beispiel 5 401 Maische, die bei der Analyse ==2o Gamma/ccm enthält, wurden
mit 53 ccm ion-Natriumhydroxyd auf ein ' pu von 8,45 eingestellt. Es wurden 8oo
g Filterhilfe zugegeben und die Mischung filtriert, was 5147g eines Aureomycinkuchens
ergab.
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25o g des obigen feuchten Kuchens, was 1945 ccm Maische entsprach,
wurden mit 350 ccm sek.-Butanol extrahiert, nachdem 40 ccm 6n-Salzsäure zugegeben
worden waren. Die Extraktion fand bei einem ph von 1,21 statt, und es wurden 366
g eines Extraktes erhalten, der 431o Gamma/ccm laut Analyse enthielt. Es wurde eine
zweite Extraktion unter Verwendung von 485 ccm sek.-Butanol und 3 ccm 6 n-Salzsäure
bei einem pK von 1,43 durchgeführt, wobei 398 ccm eines Extraktes gebildet wurden,
der laut Analyse 69o Gamma/ccm enthielt. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt und
die Butanolextrakte vereinigt. Das Material wurde äuf 5 °/o seines ursprünglichen
Volumens im Vakuum bei einer Temperatur von 35 bis 40° konzentriert. Zu dem Konzentrat
wurden o,5 ccm 6 n-Salzsäure zugegeben, was einen pH-Wert von o,5o ergab. Das Konzentrat
wurde 18 Stunden bei Zimmertemperatur und 24 Stunden bei 4° stehengelassen. Die
Kristalle wurden filtriert, mit 4 ccm Äthylenglykoläthyläther, 4 ccm Wasser und
4 ccm wasserfreiem Alkohol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Beispiel 6 Zu 121
Aureomycin-Fermentationsmaische wurde so viel Calciumhydroxyd zugegeben, daß der
pH-Wert auf 7,5 stieg und die Mischung filtriert. Der Kuchen wurde in 2,q.1 n-Butanol
bei einem pH von etwa i,4 suspendiert. Zur Erzielung des genannten pH-Wertes wurden
etwa 16o ccm 6 n-Salzsäure verwendet. Die Aufschlämmung des Kuchens in Butanol wurde
=o Minuten gerührt, wonach das gewünschte pu erhalten wurde, und dann filtriert.
Der entstandene Kuchen wurde wieder in 2,41 n-Butanol bei demselben pH aufgeschlämmt.
Man benötigte etwa 2o ccm Salzsäure zur Aufrechterhaltung des gewünschten pH-Wertes.
Eine wäßrige Schicht, welche von der ersten Extraktion stammte, wurde von dem Butariol
abgetrennt und verworfen, da sie nur eine kleine Menge Aureomycin enthielt. Die
Butanolextrakte wurden vereinigt und das Butanol daraus teilweise im Vakuumdestillationskolben
entfernt. Es blieben etwa 450 ccm zurück. Die Temperatur in dem Kolben wurde während
der gesamten Dauer der Konzentrierung unter 55° gehalten. Die konzentrierte Mischung,
in der das Aureomycin auszufallen begann, wurde mit :i-: i-Salzsäure auf ein pH
von etwa o,8 eingestellt. Hierzu waren etwa 40 ccm erforderlich. Das konzentrierte
Butanol wurde 12 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen und dann 6 Stunden
gekühlt. Die Kristalle wurden durch Filtration entfernt, aufgeschlämmt und sowohl
von Äthylenglykoläthyläther als auch von Wasser und wasserfreiem Äthylalkohol entfernt.
Die Kristalle wurden bei -40' getrocknet. Beispiel 7 7I5 1 Aureomycinmaische wurden
bei pH 6,=g mit 8,4 ccm =o n-Natriumhydroxyd behandelt und 215 g Filterhilfe zugegeben.
Die Maische wurde filtriert und ergab 786 g eines feuchten alkalischen Kuchens.
Dieser
Kuchen wurde zweimal mit je 257o ccm trockenem n-Butanol jedesmal bei pu 1,26 extrahiert.
Die erste Extraktion erforderte 113 ccm 6n-Salzsäure und die zweite 5 ccm 6 n-Salzsäure.
Die Butanolschichten wurden von den wäßrigen Schichten abgetrennt, vereinigt und
im Vakuum bei einer Höchsttemperatur von 6o° auf 25o ccm konzentriert. Es wurden
250 ccm wasserfreies Äthanol und 5o ccm Äthylenglykoläthyläther zugegeben
und die Kristalle 2 Stunden beiZimmertemperatur und über Nacht bei 4° stehengelassen,
filtriert und zuerst mit 5 ccm Butanol, dreimal mit je 5 ccm Äthylenglykoläthyläther
und dann mit 5 ccm Wasser und schließlich mit io ccm Äthylalkohol gewaschen. Die
Kristalle wurden getrocknet und ergaben 6,i2 g Aureomycinhydrochlorid in einer Reinheit
von 58o Gamma/mg. Ausbeute = 55,2°%, bezogen auf die Wirksamkeit der Maische.