DK152126B - Fremgangsmaade til isolering af pseudomonsyre - Google Patents

Description

DK 152126 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til isolering af pseudomonsyre.

Pseudomonsyre er en forbindelse med formlen I

OH

H

H° / ?H rx I i dC\

I C00 (CH01 nCOOH

CH3“CH-CH“CH-CH-CH2 * * CH3

2 DK 152126 B

Forbindelsen har antibakteriel virkning og er derfor værdifuld ved behandlingen af bakterielle infektioner i mennesker og dyr, især infektioner i det øvre respirationssystem.

Pseudomonsyre er beskrevet i britisk patentskrift nr. 1.395.907, som også beskriver forbindelsens fremstilling ved dyrkning af Pseudomonas fluorescens under aerobe betingelser og efterfølgende isolering af pseudomonsyre ud fra det således vundne rå præparat.

Ved denne isolationsmetode blev de aktive syrehovedkomponenter isoleret fra dyrkningsmediet ved først at behandle dyrkningsvæsken med barium-chlorid for at udfælde forskellige inaktive komponenter efterfulgt af successive og gentagne ekstraktioner over i et organisk opløsningsmiddel (såsom methylisobutylketon) ved surt pH og i vand ved alkalisk pH. Dette var medvirkende til at skille de sure komponenter fra de neutrale urenheder. Ekstraktionsprocessen afsluttedes i en vandig fase, som derefter blev frysetørret, hvilket gav et råt pseudomonsyresalt.

Det således vundne pseudomonsyresalt kunne til en vis grad oprenses ved chromatografi, men det resulterende produkt var stadigvæk urent (jfr. britisk patentskrift nr. 1.395.907, eksempel 5). Oprensning kunne alternativt eller som en yderligere foranstaltning udføres ved omdannelse af saltet til syren, esterificering til en lavere alkylester, fraskillelse af esteren og efterfølgende hydrolyse, hvilket gav den fri syre eller et salt.

En sådan proces var yderst besværlig og tidskrævende.

Det er tydeligt, at britisk patentskrift nr. 1.395.907 ikke forudser direkte isolering af den frie syre ved ekstraktionsproceduren. Faktisk har det vist sig, at den frie syre eksisterer i form af en olie, og at pseudomonsyre under sure betingelser i almindelighed var temmelig ustabil i en sådan grad, at den ikke kunne opbevares natten over.

Det har nu overraskende vist sig, at det er muligt at få pseudomonsyre i krystallinsk form direkte fra en sur organisk fase. Dette er især overraskende på grund af pseudomonsyres ustabilitet under sure betingelser, og fordi tidligere isolationsforsøg kun har givet en ustabil olie. Evnen til at vinde produktet direkte i krystallinsk form ved en relativt simpel isolationsprocedure har indlysende renheds- og andre fordele fremfor den

3 DK 152126B

tidligere beskrevne chromatografiske procedure (som endda kun gav et urent salt) og den komplicerede esterificeringsprocedure.

Den foreliggende opfindelse angår følgelig en fremgangsmåde til isolering af pseudomonsyre fra et råprodukt deraf, hvilken fremgangsmåde omfatter, at der i et med vand ikke-blandbart organisk opløsningsmiddel fremstilles en opløsning af de sure bestanddele i råproduktet, i det væsentlige fri for eventuelle neutrale bestanddele, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at det med vand ikke-blandbare organiske opløsningsmiddel enten selv har en sådan polaritet, at pseudomonsyre vil krystallisere fra opløsningen, eller polariteten bagefter reduceres til en sådan polaritet ved tilsætning af et ikke-polært fortyndingsmiddel, som er blandbart med det polære, og at pseudomonsyren bringes til at krystallisere fra opløsningen, og den krystallinske pseudomonsyre derefter udvindes.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er særlig egnet til rensning af de pseudomonsyreråprodukter, der er fremstillet ved isolering af de antibakterielt aktive sure bestanddele fra et kulturmedium, hvori eller hvorpå pseudomonsyreproducerende bakteriestammer er dyrket, men fremgangsmåden kan også anvendes til fremstilling af pseudomonsyre ud fra råprodukter fremstillet ved kemisk syntese.

Når den her omhandlede fremgangsmåde anvendes til at isolere pseudomonsyre fra kulturmedier, udføres fremgangsmåden mest hensigtsmæssigt som følger: En pseudomonsyreproducerende bakterie, sædvanligvis en bakteriestamme af slægten Pseudomonas, dyrkes ved en standardmetode under aerobe betingelser i eller på et egnet dyrkningsmedium. Sådanne dyrkningsmedier er generelt kendte og indeholder uorganiske salte og kilder for assimilerbart nitrogen og carbon. Der anvendes mest hensigtsmæssigt bakterien Pseudomonas fluorescens. En egnet offentligt tilgængelig stamme er Pseudomonas fluorescens NCIB 10586. Mikroorganismen lades vokse, indtil der er en passende mængde pseudomonsyre til stede i dyrkningsmediet. Faste partikler fjernes derpå fra mediet ved filtrering eller centrifugering til dannelse af en klar væske. Den klare væskes pH-værdi indstilles til 4,0 - 5,0, hvorhos pH-værdi 4,5 er optimal, og derpå ekstraheres de aktive bestanddele med et med vand ikke-blandbart

4 DK 152126B

Egnede opløsningsmidler kan findes ved "trial and error"-metoden, men det har vist sig, at isobutylmethylketon (MIBK) er tilfredsstillende. Andre opløsningsmidler er f.eks. halogenerede carbon-hydrides tere og ether, som indeholder 5% ethanol.

De sure bestanddele ekstraheres derpå over i en vandig fase, som har en pH-værdi i området 7-9, hvorhos pH-værdi 8,5 er optimal, idet de neutrale forureninger forbliver i den organiske fase.

Den vandige ekstrakt syrnes derpå til en pH-værdi i området 4,0 - 5,0, hvorhos pH-værdi 4,5 er optimal, og ekstraheres med et med vand ikke-blandbart polært organisk opløsningsmiddel, hvorved fås ekstrakten af de vigtigste sure bestanddele i et polært organisk opløsningsmiddel, fri for enhver neutral bestanddel. Egnede polære, med vand ikke-blandbare organiske opløsningsmidler er f.eks. alkylestere af alkansyrer, f.eks. C^_g-alkyl-C^_g-alkanoater, methyl- og ethyl-Cg_^Q-alkanoater, cg_^Q-alkylacetater, med vand ikke-bland-bare ketoner såsom Cg_^Q-alkanoner, f.eks. MIBK, med vand ikke--blandbare alkoholer såsom Cg^Q-alkanoler eller halogenerede car-bonhydrider såsom chloroform, methylenchlorid eller ethylenchlorid.

Opløsningen kan derpå eventuelt vaskes med vand. Det foretrækkes, at opløsningen tørres. Tørring ved hjælp af sædvanlige tørringsmidler såsom calciumchlorid, natriumsulfat eller magnesiumsulfat er tilstrækkelig.

Som anført ovenfor kan opløsningens polaritet reduceres ved at tilsætte et ikke-polært fortyndingsmiddel, som får pseudomonsyren til at krystallisere.

Egnede ikke-polære fortyndingsmidler er f.eks. alkaner, toluen, benzen eller di-D^_g-alkylethere.’ Mest hensigtsmæssigt er sådanne kortkædede alkaner, som er flydende ved stuetemperatur (ca. 20°C), f.eks. Cg_-^2“aHcaner/ hensigtsmæssigt C^_g-alkaner. Et foretrukket ikke-polært opløsningsmiddel er n-heptan.

Det foretrækkes, at den fortyndede opløsning lades henstå i nogen tid, før det faste stof udvindes, og krystallisationen kan bringes til at ske ved at tilsætte en tidligere vundet podekrystal af pseudo-monsyre.

5 DK 152126B

Den temperatur, ved hvilken fortyndingen og krystallisationen udføres, er ikke kritisk, men det har vist sig, at stuetemperatur er mest hensigtsmæssig. Det er imidlertid nyttigt at afkøle den fortyndede opløsning for at sikre en fuldstændig krystallisation.

Det er alternativt muligt at udføre fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse ved at fremstille en opløsning af de sure bestanddele af det rå pseudomonsyrepræparat i en med vand ikke-bland-bar organisk væske med en sådan polaritet, at pseudomonsyren fortrinsvis udkrystalliserer, uden at det er nødvendigt at tilsætte et ikke-polært fortyndingsmiddel for at reducere polariteten.

Til dette formål er di-C^_g-alkyletherne, især diethylether, egnede.

Et andet aspekt af den foreliggende opfindelse er en fremgangsmåde til isolering af pseudomonsyre fra et råprodukt deraf, ved hvilken fremgangsmåde der i en di-C^_g-alkylether fremstilles en opløsning af råproduktets sure bestanddele, i det væsentlige fri for neutrale bestanddele, pseudomonsyren lades krystallisere fra opløsningen, og krystallerne udvindes.

Når denne udførelsesform for den foreliggende opfindelse anvendes til at isolere pseudomonsyre fra et dyrkningsmedium, er det mest hensigtsmæssigt først at fremstille en opløsning af de sure bestanddele i et polært organisk opløsningsmiddel som beskrevet ovenfor og derpå at fjerne opløsningsmidlet, hvorved der fås en remanens, som derpå kan opløses i den valgte ether og lades krystallisere.

Krystallisationen udføres fortrinsvis fra en tør opløsning. Dette opnås sædvanligvis ved at tørre opløsningen af de sure bestanddele som beskrevet ovenfor før afdampningen af opløsningsmidlet. Det har vist sig, at det er tilstrækkeligt at tørre opløsningen over sædvanlige tørringsmidler såsom magnesiumsulfat eller natriumsulfat, men der opnås bedre resultater, når der anvendes et mere kraftigt tørringsmiddel såsom en molekylarsi, og/eller når der anvendes et opløsningsmiddel såsom MIBK, som danner en azeotrop med eventuelt tilbageværende vand og derved bevirker en yderligere tørring, når opløsningsmidlet afdampes. Det er tilstrækkeligt at tørre etheren over f.eks. magnesium- eller natriumsulfat, men der opnås bedre resultater med na tr ΐ nmtMr-ret afhor

6 DK 152126B

Den temperatur, ved hvilken krystallisationen sker, er ikke kritisk, men det har vist sig, at stuetemperatur er hensigtsmæssig. Det er nyttigt at afkøle opløsningen for at sikre fuldstændig krystallisation. Også her foretrækkes det at pode opløsningen ved at tilsætte en pseudomonsyrekrystal til opløsningen.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse giver de bedste resultater, når den anvendes på råprodukter, som indeholder væsentlige mængder pseudomonsyre. Når råprodukterne indeholder små mængder af den ønskede forbindelse, kan det være nødvendigt at gentage fremgangsmåden et antal gange.

Til anvendelse som et antibakterielt middel kan den ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede pseudomonsyre formuleres i overensstemmelse med veterinær eller farmaceutisk standardprocedure.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse belyses nærmere ved følgende eksempler:

Eksempel 1.

1500 liter dyrkningsmedium, som indeholder 408 g pseudomonsyre, klares delvis på et roterende, forud overtrukket filter og klares yderligere ved centrifugering, hvorved fås 1285 liter klaret Væske, som indeholder 372 g pseudomonsyre. Denne væske syrnes til pH-værdi 4,5 under anvendelse af 50%'s saltsyre og ekstraheres med 300 liter methylisobutylketon ved tilsætning af væsken med en hastighed på 8 liter pr. minut og opløsningsmiddel.med en hastighed på 2 liter pr. minut på en in-line statisk blander.

De to ikke-blandbare faser adskilles ved centrifugering. Opløsningsmiddelekstrakten, som indeholder 226 g pseudomonsyre, ekstraheres med 60 liter 2% w/v natriumbicarbonatopløsning, som er forudindstillet til pH-værdi 8,5. Faserne adskilles ved centrifugering. Til den vandige ekstrakt sættes 12 liter methylisobutyl-keton, og den vandige fase syrnes til pH-værdi 4,5 med 50%’s salt-

7 DK 152126B

syre. Den organiske fase fraskilles og vaskes med 6 liter deionise-ret vand, opløsningen inddampes til 1,5 liter og tørres med magnesiumsulfat. Magnesiumsulfatet fjernes ved filtrering, og der tilsættes 750 ml n-heptan til den tørre opløsning. Den således fremstillede blanding lades henstå ved 5°C i 12 timer. Produktet filtreres og vaskes med 1 liter methylisobutylketon/hexan (50:50) og derpå med 1 liter heptan og tørres i vakuum ved 25°C. Udbytte 125 g, renhed 92 - 93%.

UV-Spektrum (ethanol): λ (nm) = 222, (E = 14.500).

ΙΪΙαΧ ITlciX

IR-Spektrum (KBr): v = 3470, 1728, 1720, 1712 og 1650 cm 1.

ΠΙαΧ NMR-Spektrum (dg-DMSO): 6^, ppm = 5,61 (IH, s, CH=C), 2,06 (3H, s, C=C), 1,04 (3H, d, J = 6,5Hz, >CHCH,), 0,80 (3H, d, J = 6,5Hz, i ~3 CH3 >CHCH3).

NMR-Spektrum (dg-DMS.O) : ^13 ppm = 174,3, 165,7, 116,6, 74,5, 69.4, 68,2, 67,7, 64,6, 62,9, 59,0, 54,6, 42,5, 41,8, 40,0, 33,6, 31.5, 28,5, 28,1, 25,4, 24,4, 20,0, 18,5 og 11,6.

Eksempel 2.

En opløsningsmiddelekstrakt fremstillet som i eksempel 1 med et indhold på 226 g pseudomonsyre ekstraheres med 60 liter 2%'s w/v natrium-bicarbonatopløsning, som er forudindstillet til pH-værdi 8,5.

Faserne adskilles ved centrifugering. En del af natriumbicarbonat-opløsningen (12 liter) vaskes med 3 liter methylisobutylketon, og methylisobutylketonen kasseres. Til den vandige ekstrakt sættes 3 liter methylisobutylketon, og den vandige fase syrnes til pH-værdi 4,5 med 50%‘s saltsyre. Den organiske fase fraskilles og vaskes tre gange med hver gang 3 liter deioniseret vand, og derpå fraskilles den organiske fase og tørres med magnesiumsulfat. Magnesiumsulfatet fjernes ved filtrering, og opløsningsmidlet afdampes i vakuum, hvorved fås en olie. Til olien sættes 800 ml natriumtørret diethylether, blandingen omrøres, og opløsningen dekanteres fra en lille mængde uopløselig remanens. Opløsningen podes med en krystal af

Claims (10)

1. Fremgangsmåde til isolering af pseudomonsyre fra et råprodukt deraf, hvilken fremgangsmåde omfatter, at der i et med vand ikke-blandbart organisk opløsningsmiddel fremstilles en opløsning af de sure bestanddele i råproduktet, i det væsentlige fri for neutrale bestanddele, kendetegnet ved, at det med vand ikke-blandbare organiske opløsningsmiddel enten selv har en sådan polaritet, at pseudomonsyre vil krystallisere fra opløsningen, eller polariteten bagefter reduceres til en sådan polaritet ved tilsætning af et ikke-polært fortyndingsmiddel, som er blandbart med det polære, og at pseudomonsyren bringes til at krystallisere fra opløsningen, og den krystallinske pseudomonsyre derefter udvindes.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at råproduktet er et dyrkningsmedium, hvori pseudomonsyren er fremstillet ud fra en bakterie.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at krystallisationen fremkaldes ved tilsætning af en pseudomonsyrekrystal til opløsningen.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at opløsningen tørres før krystallisation.

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at det med vand ikke-blandbare organiske opløsningsmiddel er methylisobutylketon, og at et ikke-polært fortyndingsmiddel, der er blandbart dermed, derefter sættes dertil for at reducere opløsningsmidlets polaritet.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det ikke-polære fortyndingsmiddel er en C^_g-alkan.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det ikke-polære fortyndingsmiddel er n-heptan.

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 5-7, kendetegnet ved, at opløsningen før tilsætning af det ikke-polære fortyndingsmiddel tørres ved azeotropisk fjernelse af vandet under afdampning af methylisobutylketonen.

8 DK 1521266 ren syre og omrøres ved stuetemperatur i 2 timer og hensættes derpå i et koldt rum (5°C) natten over. Det faste stof, som er udfældet, frafiltreres, vaskes med 100 ml tør ether og tørres i vakuum. Udbytte 38,4 g, smeltepunkt 77 - 78°C. [a]^ = -19,3 (c = 1 i methanol). Analyse: Beregnet for C26H44°9: C 62,38 H 8,86 Fundet: C 62,62 H 8,70.

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at opløsningsmidlet er en di-C^_g-alkylether, og at pseudomonsyren bringes til at krystallisere derfra uden tilsætning af et ikke-polært fortyndingsmiddel.

9 DK 152126B

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at di-C^g-alkyletheren er diethylether.