BG64289B1

BG64289B1 - М...'од за пол"-аван... на hmg-coa р...д"к'азни инхиби'ори ' ви'ока -и''о'а

Info

Publication number: BG64289B1
Application number: BG104696A
Authority: BG
Inventors: Zlatko Pflaum; Dusan Milivojevic; David Senica
Original assignee: Lek Pharmaceutical And Chemical Company D.D
Priority date: 1998-02-18
Filing date: 2000-08-17
Publication date: 2004-08-31
Also published as: CZ20002856A3; EP1054993B1; SI9800046A; CZ297093B6; WO1999042601A1; CN1206363C; SI1054993T1; KR20010041024A; HRP20000541A2; RU2235130C2; HUP0100820A2; SK11852000A3; ATE296357T1; AU743619B2; US6825015B1; HUP0100820A3; SK285074B6; EP1054993A1; PL193510B1; AU3438499A

Description

Предшестващо състояние на техниката

Ловастатин, правастатин, мевастатин, симвастатин, техни производни и аналози са известни като HMG-CoA редуктазни инхибитори и се използват като антихиперхолестеролни средства. Те се получават чрез ферментация, като се използват микроорганизми на различни видове, идентифицирани като видове, принадлежащи към родовете Aspergillus, Monascus, Nocarbia, Amycolatopsis, Mucor или Penicillium.

Чистотата на активния компонент е важен фактор за производството на безвреден и ефективен фармацевтичен препарат. Възможната висока чистота на продукта е особено важен показател, ако фармацевтичният продукт трябва да се взима за по-дълъг период, както при лечението или предотвратяването на високоплазмен холестерол. Акумулирането на примесите от фармацевтичните препарати с по-ниска чистота може да причини много странични ефекти по време на лечението.

Методите за изолирането и пречистването на антихиперхолостеролните средства са описани в по-ранни патентни описания, включващи различни комбинации от екстракционни, хроматографски, лактонизационни и кристализационни методи. Чистотата на получения краен продукт чрез тези методи е по-ниска от 99.6 % . Получаване на продукта с по-висока чистота чрез използване на тези методи е възможно, но добивът на желания продукт след това е неприемливо нисък за използването на тези методи в голям индустриален мащаб.

Методът за изолиране, разкрит в патентно описание WO 92/16276, осигурява разтвор, за получаване на HMG-CoA редуктазни инхибитори с чистота, по-висока от 99.5 %, но се изисква използването на много сложно промишлено оборудване за високо ефективна течна хроматография (HPLC). Съгласно WO 92/16276 суровият HMG-CoA редуктазен инхибитор с приблизително 85 % или по-висока чистота се разтваря в органичен разтворител или в разтвор на органичен разтворител и вода. След това сместа се буферира до pH между 2 и 9 и се поставя в HPLC колона. След това HMG-CoA редуктазен инхибитор се събира, част от разтворителя се отделя и след това се добавя вода или алтернативно две трети от сместа се отделя, за да кристализира HMG-CoA редуктазният инхибитор. Накрая чистотата на продукта реално е по-малка от 99.5% при добив приблизително 90%.

Същност на изобретението

Настоящото изобретение се отнася до нов промишлен метод за изолиране и пречистване на HMG-CoA редуктазни инхибитори с чистота, по-висока от 99.6 % и за предпочитане по-висока от 99.7 %, от ферментационна хранителна среда за микроорганизми. За да се постигне тази цел се е осъществено обширно изучаване на химическите съединения, получени по време на ферментацията, при която се използват различни видове микроорганизми, принадлежащи към родовете Aspergillus, Monascus, Nocardia, Mucor, Amycolatopsis или Penicillium, техните химически свойства и тяхното поведение в различните разтворители при различна pH. Посочената цел се постига с метода на настоящото изобретение, който включва следните етапи:

- избистряне на хранителната среда на мицела и концентриране на пречистената хранителна среда до по-малък обем;

- подкисляване на концентрата до pH стойност в обхвата от 4.5 до 7.5 , последвано от екстракция на HMG-CoA редуктазния инхибитор с етилов ацетат;

- изпълнение по желание на лактонизация;

- кристализация на HMG-CoA редуктазния инхибитор от водосмесваем или водоразтворим органичен разтворител;

- кристализация на HMG-CoA редуктазния инхибитор от органичен разтворител с ограничена смесваемост или разтворимост с вода.

Описание на приложените фигури фиг. 1 показва зависимостта от pH на коефициента на разпределение на HMG-CoA редуктазния инхибитор (ловастатин) и нежелателните примеси, съответно, в етапа на екстракция с етилов ацетат.

Фигурите 2, 3 и 4 показват HPLC диаграми на примеси на HMG-CoA редуктазния инхибитор след екстракцията с етилов ацетат като суров състав, след кристализация от водосмесваем или водоразтворим органичен разтворител, и след кристализация от органичен разтворител с ограничена смесваемост или разтворимост с вода, съответно.

Тъй като HMG-CoA редуктазните инхибитори обикновено са както вътре-, така и извънклетъчни продукти, не е задължително, но е за предпочитане, да се разтворят ефективно от мицела във ферментационната течност. Методът за разтваряне, описан в патентно описание WO 97/20834, включва обработване на ферментационната хранителна среда за микроорганизми с алкална база до pH 11.5 и разбъркване за три часа. В WO 97/06128 се изследва възможността, при която разтварянето може да бъде направено чрез алкализиране на ферментационната хранителна среда до pH между 10 и 13. Прилага се температура между 60 до 95°С. HMG-CoA редуктазните инхибитори могат да бъдат много ефективно разтворени от мицела при pH, по-високо от 9, но също продължителното излагане на въздействие на сурови условия причинява разпадането на естерната връзка между хидроксилната група на нафталеновата структура и карбоновата киселина. Равновесието между HMG-CoA редуктазните инхибитори и деацилираните HMG-CoA редуктазни инхибитори се премества при по-сурови условия към деацилирани продукти. Установено е, че ефикасността на разтварянето, постигната при температура в обхвата от 10 до 40°С, за предпочитане в обхвата от 18 до 25°С, като стайна температура, за по-малко от един час, за предпочитане за по-малко от половин час, например за около 10 min, при pH между 9.5 до 13, повече се предпочита от 9.5 до 1.5, е равна на ефикасността, постигната чрез по-малко средства и повече време, в сравнение с методите, осъществени при по-високи температури, описани в по-ранни патентни описания. Разтварянето може да бъде осъществено също при pH, по ниско от 9.5, по-специално по-ниско от 6, но в този случай е необходимо използването на “много голямо количество органични разтворители.

Ако бъде осъществен този предпочитан вариант за разтваряне на HMG-CoA редуктазния инхибитор, ферментационната хранителна среда за микроорганизми след това се обработва с подкисляващо средство, подходящо е с минерална киселина, за да се доведе pH стойността между 7.5 и 8.5. Подходящи минерални киселини са фосфорна, сярна и солна киселина. HMG-CoA редуктазните инхибитори са стабилни в този обхват на pH и ферментационната хранителна среда за микроорганизмите може също да бъде съхранена във времето след този етап, ако това е необходимо или желано.

Мицелът се отделя от ферментационната хранителна среда чрез подходящи етапи на разделяне, като филтруване и/или центрофугиране. Филтруването се предпочита, а като техника на филтруване е подходящо да бъдат използвани класическото филтруване, също микро-, ултра- и диафилтруването. Избистрената хранителна среда след това се концентрира до по-малък обем, повече се предпочита пет до десет пъти посредством обратна осмоза или някои други методи за намаляване на обема.

Подкисляването и етапа на екстракция с етилов ацетат, описани по-нататък, са важна задача на метода за пречистване.

Посоченият концентрат се подкислява чрез подкисляващо средство, подходящо е с минерална киселина, до pH стойност между

4.5 и 7.5 . Могат да бъдат използвани минерални киселини, вече споменати по-горе. След това HMG-CoA редуктазният инхибитор се екстрахира от рН-регулирания концентрат с етилов ацетат. Подходящо е екстракцията да се направи чрез използване на противоточна екстракционна колона. Съотношението между коефициентите на разпределение на HMG-CoA редуктазните инхибитори и етилацетатните разтворими примеси е по-високо при pH стойност от 5.5 до

7.5 и по-специално при pH стойност от 6.0 до 7.0 , и част от полярните примеси вече е отделена при този етап. Екстракцията, осъществена при pH стойност, по-ниска от 5.0, специално по-ниска от 4, е по-ефикасна, по ради по-високия коефициент на разпределение на HMG-CoA редуктазните инхибитори, но това повишава нивото на полярните примеси. Коефициентите на разпределение на етилацетатните разтворими примеси са също високи при тази pH стойност, както е показано на фиг. 1 . Екстракцията в етилов ацетат се осъществява при pH стойност между 4.5 и 7.5, по-специално над 5.0 и в частност над 5.5, като се достига по-ниско ниво на полярните примеси, поради техните ниски коефициенти на разпределение. По-лошото разпределение на HMG-CoA редуктазни инхибитори от концентрата в етиловия ацетат при тази рн стойност може да бъде компенсирано с по-дълга противоточна екстракционна колона.

Ако се желае, полученият етил ацетатен екстракт след това се концентрира и HMG-CoA редуктазният инхибитор се лактонизира по желание в този етап на метода. При pH между 5.5 и 7.5 главната част на HMG-CoA редуктазния инхибитор е в свободна кисела форма. Затова, концентрирането и лактонизирането могат да бъдат пропуснати, ако HMG-CoA редуктазният инхибитор не се използва във фармацевтичния препарат като лактон. Подходящо е лактонизацията да се направи чрез контактуване на HMG-CoA редуктазния инхибитор с каталитично количество минерална или органична киселина, повече се предпочита трифлуорооцетна киселина (TFA). HMG-CoA редуктазният инхибитор, който по желание се лактонизира, след това може директно да бъде кристализиран от етилов ацетат, както ще бъде описано по-нататък. Алтернативно, етиловият ацетат се отделя, подходящо чрез изпаряване, и се получава суров продукт на HMG-CoA редуктазния инхибитор, който при желание се лактонизира.

Така полученият суров HMG-CoA редуктазен инхибитор след това може по желание да бъде подложен на адсорбционна хроматография, за предпочитане на реверсирана фазова хроматография. Като подвижна фаза за адсорбционна хроматография е подходящо да бъде използван ацетонитрил или нисши алиохоли, такива като метанол, етанол или пропанол, или смеси на тези разтворители с вода. За предпочитане е суровият HMG-CoA редуктазен инхибитор да се раз тваря в чист ацетонитрил или смес ацетонитрил/вода при най-малко 30 % об./об. (v/v) ацетонитрил, и полученият разтвор се поставя в адсорбционна хроматографска колона. Пълнежът на колоната включва, но не се ограничава до стационарни фази, базирани на октилсилан, диметилсилан, октадецилсилан, циано-силан, полистирендивинилбензенов кополимер или акрилов полимер. Други типични стационарни фазови материали също могат да бъдат използвани, например силициев диоксид, двуалуминиев триоксид или други подобни. Адсорбираните съединения се елуират с подходяща подвижна фаза, такава като градиент на ацетонитрил/вода. От максимално значение е да се събере HMG-CoA редуктазният инхибитор и подвижната фаза да се отстрани, за да кристализира HMG-CoA редуктазният инхибитор. Чистотата на кристализиралия суров HMG-CoA редуктазен инхибитор е между 80 % и 92 % и зависи от профила на замърсяването във ферментационната хранителна среда. По желание адсорбционната хроматография може да бъде заместена с нормална хроматография, флаш хроматография, промишлена HPLC, или с методи на екстракция или кристализация.

Комбинираното обработване при кристализацията съгласно изобретението се състои в следното. То включва кристализация на HMG-CoA редуктазния инхибитор от органичен разтворител, водосмесваем или водоразтворим, и кристализация на HMG-CoA редуктазния инхибитор от органичен разтворител с ограничена смесваемост или разтворимост с вода. Редът на двете кристализации може също да бъде обратен. Свойството на органичния разтворител, наличен, като водосмесваем или водоразтворим, или притежаващ ограничена смесваемост или разтворимост с вода, известно е и е описано в Ullmann’s Encyclopedia of Inndustrial Chemistry”, vol A24, 5^th edition (1993), pp. 437-505.

Съгласно настоящото изобретение терминът “водосмесваем или водоразтворим” се отнася до органични разтворители, които показват по същество неограничена, за предпочитане 100 % смесваемост или разтворимост с вода, и терминът “ограничена смесваемост или разтворимост с вода” също включва водонесмесваеми или водонеразтво рими органични разтворители. По-нататък, концепцията за кристализация съгласно изобретението в даден случай също включва утаяване.

Примери за водосмесваеми или водоразтворими органични разтворители са нисши алкилови алкохоли, като метанол, етанол, пропанол и изопропилов алкохол, нисши алкилови кетони, като ацетон и метил етил катон, нисши алкил гликолови етери, като метил гликол, етил гликол, пропил гликол и етил дигликол, и диполярни апротонни разтворители, като Ν,Ν-диметил-формамид (DMF), Ν,Ν-диметилацетамид (DMA) и диметилсулфоксид (DMSO), включително смеси на тези разтворители. Като специално предпочитани примери за водосмесваем органичен разтворител са ацетон и нисши алкилови алкохоли. Примери за органичен разтворител, притежаващ ограничена смесваемост или разтворимост с вода, са: висши алкилови алкохоли, като бутанол, изобутанол амил алкохол, хексанол, 2-етилхексанол, бензилов алкохол и циклохексанол, висши алкилови кетони, като метилбутил кетон, метил изобутил кетон и циклохексанон, естери, като метил ацетат, етил ацетат, п-пропил (и изопропил) ацетат, n-бутил (и изобутил или сек-бутил) ацетат и амилов ацетат, етери, като диетилов етер и диизопропилов етер, хлорирани въглеводороди, като метилен хлорид и хлороформ, ацетонитрил и други подобни, включително смеси на тези разтворители. Специално предпочитан като разтворител с ограничена смесваемост или разтворимост с вода е етиловият ацетат.

Установено е, че кристализацията на HMG-CoA редуктазни инхибитори от водосмесваем органичен разтворител, като ацетон или нисш алкилов алкохол, последвана от по-нататъшни рекристализации със същия разтворител, могат да отделят само малка част от неполярните и по-голямата част от полярните примеси, и кристализацията от органичен разтворител с ограничена смесваемост с вода, като етилов ацетат, последвана от по-нататъшни рекристализации от същия разтворител, отделя само главните неполярни примеси. Последният факт е очевиден от HPLC диаграмите на суровия HMGСоА редуктазен инхибитор (фиг.2, HMG-CoA редуктазния инхибитор след кристализация та из ацетон (фиг.З) и HMG-CoA редуктазния инхибитор, получен чрез кристализацията из ацетон и по-нататъшно рекристализиране из етилов ацетат (фиг.4). В съответствие с това неочаквано разпознаване, последният етап от настоящото изобретение, включващ комбинирана кристализация от водосмесваем или водоразтворим органичен разтворител и от органичен разтворител притежаващ ограничена смесваемост или разтворимост с вода, не може да бъде пропуснат при метода за постигане на HMG-CoA редуктазни инхибитори с висока чистота.

Чрез обработването с прилагане на комбинираната кристализация съгласно изобретението може да се въздейства, както следва. Първо, кристалите на суровия HMG-CoA редуктазен инхибитор се разтварят в посочения по същество (за предпочитане 100 %) водосмесваем или водоразтворим органичен разтворител, в частност ацетон или нсш алкохол, и след това се добавя вода, за да се позволи на HMG-CoA редуктазния инхибитор да кристализира или се утаи. Алтернативно, суровият HMG-CoA редуктазен инхибитор, разтворен в по същество водосмесваемия или водоразтворим органичен разтворител, се добавя към вода, за да кристализира или се утаи. Тези процедури могат да бъдат повторени отново със същия или друг водосмесваем или водоразтворим органичен разтворител, ако е необходимо, например от един до четири пъти, в зависимост от чистотата на изходния суров материал.

Затова получените кристали се разтварят в посочения разтворител с ограничена смесваемост или разтворимост с вода, като етилов ацетат, до подходяща концентрация, която за предпочитане е от 10 до 35 g/1, повече се предпочита в границата от 15 до 25 g/Ι. След отделянето на една трета до три четвърти от разтворителя, HMG-CoA редуктазният инхибитор кристализира. Кристализирането от същия или друг органичен разтворител с ограничена смесваемост или разтворимост с вода може да бъде повторено, ако е необходимо, например един до три пъти, в зависимост от чистотата на продукта, получен чрез кристализация от водосмесваем или водоразтворим органичен разтворител. След това кристализиралият HMGCoA редуктазен инхибитор се филтрува и изсушава, за да се получи продукт с чистота, най-малко 99.6 %.

Както е посочено, редът на кристализациите може да бъде обратен, т.е. първо да се осъществи кристализация от органичния разтворител с ограничена смесваемост или разтворимост с вода и след това - кристализация от водосмесваем или водоразтворим органичен разтворител. В предпочитан случай от изобретението първо се провежда кристализация от етилов ацетат, като органичният разтворител с ограничена смесваемост или разтворимост с вода може подходящо да бъде ефективен директно след етапа на екстракцията с етилов ацетат, или по желание след етапа на лактонизация, описан по-горе.

С метода съгласно настоящото изобретението се получават продукти с чистота наймалко 99.6 %, и дори най-малко 99.7%.

При друг алтернативен вариант за изпълнение различните видове кристализации могат да бъдат проведени повторно, чрез редуване.

В друг аспект от изобретението, в описания метод на комбинирани етапи на кристализация от водосмесваем или водоразтворим органичен разтворител и от органичен разтворител с ограничена смесваемост или разтворимост с вода се използват като краен изглаждащ етап на всеки процес за изолиране и/или пречистване на HMG-CoA редуктазни инхибитори. Такъв краен, изглаждащ етап, може също да бъде приложен към сурови материали от HMG-CoA редуктазен инхибитор, който би могъл да бъде конвенционално получен. Така постижимата чистота на HMG-CoA редуктазен инхибитор е наймалко 99.6 % и други е най-малко 99.7 %.

Методът съгласно изобретението е специално подходящ, когато ловастатин е избран като HMG-CoA редуктазен инхибитор. Съгласно друг аспект от изобретението, методът, описан по-горе, се използва за изолиране и/или пречистване на ловастатин.

По същество чисти HMG-CoA редуктазни инхибитори, получени по метода съгласно изобретението, като ловастатин, мевастатин, правастатин и симвастатин, както и техните производни аналози, могат да бъдат използвани за получаването на фармацевтичен препарат за предотвратяване и/или лечение на заболявания. Получените инхи битори и фармацевтични препарати са полезни по-специално като медикаменти или превантивни препарати за намаляване на риска от удар, състояние на исхемична атака, атеросклероза и инфаркт на миокарда.

Следващите примери поясняват метода от изобретението, като не го ограничават.

Примери за изпълнение на изобретението

Пример 1. Ферментационна хранителна среда (160 1) с концентрация на ловастатин 1 g/Ι, получена чрез ферментация с Aspergillus terreus ATCC 20542, се поставя в съд (4001) и се довежда до pH 10 с 1 М воден разтвор на натриев хидроксид. След min интензивно разбъркване при стайна температура хранителната среда се довежда до pH 9 с 1 М разтвор на сярна киселина и биомасата се филтрува. След това филтратът се подкислява с 1 М разтвор на сярна киселина до pH 6.5. Към филтрата се добавя 160 1 етилов ацетат и получената смес се разбърква 20 min. Водната и етилацетатна фаза се разделят чрез екстракционно центрофугиране. Етилацетатният екстракт се концентрира в изпарител до обем 14 1. Концентрацията на ловастатина в свободна кисела форма в етил ацетатния концентрат се равнява на 10 g/1.

След това етил ацетатният концентрат (14 1) се поставя в реактор ( 40 1) и се лаетонизира. Лактонизацията се предизвиква от каталитично количество TFA ( 0.5 ml TFA/ концентрат).

Лактонизационната процедура продължава 2 h при 40°С. След лактонизациятаконцентратът се промива два пъти с 14 1 5 % воден разтвор на амониев бикарбонат. Водната фаза се отделя, органичната фаза понататък се концентрира до сухо в ротационен изпарител. Полученият маслообразен продукт (1.51) съдържа 133 g ловастатин.

Полученият маслообразен продукт (161 ml) се разтваря в 80 ml ацетонитрил и се зарежда в хроматографска колона ( 80 cm, 3.6 cm), напълнена с XAD - 16 ( XAD-16 е търговското наименование на компанията Rohm & Hass, 20 - 50 mesh). Колоната се елюира първо с 40:60 ацетонитрил/вода ( pH 3, доведено със солна киселина) при скорост 75 ml/min. Елуирането се наблюдава чрез UV детектор (236 nm ) и след първата капка при абсорбцията се започва елуирането на колоната с 55:45 ацетонитрил/вода (pH 3, нагласено със солна киселина). Главната фракция се събира и след затихване на абсорбцията колоната се промива с 80:20 ацетонитрил/ вода (pH 3, нагласено със солна киселина). Ацетоншприлът се отделя от главната фракция чрез ротационен изпарител (50°С, 150 mbar) и получените кристали се филтруват. Масата на кристалите е 24.5 g и съдържанието на ловастатин е 50% тегл. (w/w) HPLC чистотата е 92.5 %.

Получените кристали (24 g) се разтварят в 350 ml ацетон и се добавят 700 ml вода при продължително разбъркване. Сместа се поставя при 4°С за 30 min. Получените кристали се филтруват и изсушават под вакуум при стайна температура. Масата на кристалите е 12.7 g със съдържание на ловастатин 90 % . HPLC чистотата е 98.8 %. Кристализацията от ацетон се повтаря при същото условие и се получават 11.3 g кристали с 97% (w/w) ловастатин. HPLC чистота е 99.4 %.

Получените кристали (11.3 g ) след втората кристализация от ацетон се разтварят в 700 ml етилов ацетат и етиловият ацетат се изпарява под вакуум до концентрация на ловастатин 70 g/ΐ. Концентратът се поставя при 8°С за един час. Получените кристали от ловастатин се филтруват и след това се изсушават под вакуум. Масата на кристалите е 9.4 g със съдържание на ловастатин 99.6 % w/w. HPLC чистотата е 99.7 %.

Пример 2. Ловастатинови кристали (3 g), изолирани след XAD-адсорбционна хроматография, както е описано в пример 1, се разтварят в 170 ml етилов ацетат. Етиловият ацетат се изпарява под вакуум (200 mbar) при 50°С до 35 ml. Концентратът се поставя при 10°С за един час. Получените кристали от лавастатин се филтруват и след това се изсушават под вакуум. Масата на кристалите е 2.1 g със съдържание на ловастатин 96 % w/w. HPLC чистотата е 99.0 %.

Получените кристали (2.1 g) се разтварят в 50 ml ацетон и се добавят 85 ml вода. След това сместа се поставя при 10°С за 30 min и кристалите се филтруват и изсушават под вакуум при 40°С. Масата на получените кристали е 1.9 g с 99% w/w ловастатин. HPLC чистотата е 99.8 %.

Пример 3. Ферментационна хранителна среда за микроорганизми ( 30 1 в 50 1 ферментатор), съдържаща правастатин (690 g на kg ферментационна хранителна среда, HPLC чистотата на правастатина е 48.7%), се филтрува и полученият мицел се промива с вода. Филтратът (51 1) се подкислява до pH 5.0 с 10 % воден разтвор на фосфорна киселина. Активната субстанция (правастатин) след това се екстрахира в екстракционна колона от филтрата в 70 1 етилов ацетат. Водната фаза (50 1) с по-малко от 2 g правастатин и с главната част от примеси се излива. Етил ацетатната фаза се изпарява до 800 ml и се използва по-нататък в процеса за изолиране. HPLC чистотата на правастатина в етил ацетатния екстракт е 70.3 %. За по-нататъшно изолиране, маслообразният продукт се подлага на адсорбционна хроматография и етапи на комбинирана кристализация в съответствие с пример 1.

Пример 4. Суров симвастатин (2.3 g) в лактонова форма се разтваря в ацетон (7 ml) и се добавят 15 ml вода. Резултатът е маслообразен продукт, който кристализира за 10 min. Получените кристали се филтруват, промиват с вода и се изсушават при 4СРС за 60 min. Получените кристали (2.2 g) с HPLC чистота 99.51 след това се разтварят в етилов ацетат (8 ml). Полученият разтвор се концентрира до 4 ml, и симвастатинът се оставя да кристализира за 60 min при 8°С. Продуктът се филтрува и се промива с вода. След това кристалите се изсушават при 40 Сза 60 min. Чистотата на получения симвастатин (1.7 g) е 99.73 % .

Пример 5. Суров мевастатин (2.0 g) в лактонова форма с HPLC чистота 98.5 % се разтваря в ацетон (7 ml) и се добавя 20 ml вода. Резултатът е маслообразен продукт, който кристализира за 10 min. Получените кристали след това се филтруват, промиват се с вода и се изсушават при 40°С за 60 min. Получените кристали (1.8 g) с HPLC чистота 99.33 % се разтварят в етилов ацетат (8 ml). Полученият разтвор се концентрира до 4 ml, и мевастатинът се оставя да кристализира за 60 min при 8°С. Продуктът се филтрува и се промива с вода. След това кристалите се изсушават при 40°С за 60 min. Чистотата на получения мевастатин (1.3 g) е 99.72%

Claims

Патентни претенции

1. Метод за изолиране и пречистване на HMG-CoA редуктазни инхибитори от мицелна биомаса, характеризиращ се с това, че включва:

- избистряне на мицелната хранителна среда и концентриране на избистрената хранителна среда до по-малък обем,

- подкисляване на концентрата до pH стойност в обхвата от 4.5 до 7.5, последвано от екстрахиране на HMG-CoA редуктазния инхибитор с етилов ацетат,

- по желание извършване на лактонизация,

- кристализация на HMG-CoA редуктазния инхибитор от водосмесваем или водоразтворим органичен разтворител, и

- кристализация на HMG-CoA редуктазния инхибитор от органичен разтворител с ограничена смесваемост или разтворимост с вода.
2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че включва, преди да се избистри хранителната среда на мицелната биомаса, етапите на разтваряне на HMG-CoA редуктазния инхибитор от мицелната биомаса при pH стойност между 9.5 и 13 на ферментационната течност и промяна на pH на хранителната среда до стойност от 7.5 и 8.5.
3. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че етапът на разтваряне се осъществява при температура от 10 до 40°С за по-малко от един час.
4. Метод съгласно всяка от предходните претенции, характеризиращ се с това, че избистрянето на мицелната хранителна среда се осъществява чрез отделяне на мицела от хранителната среда чрез филтруване.
5. Метод съгласно всяка от предходните претенции, характеризиращ се с това, че избистрената хранителна среда се концентрира чрез обратна осмоза.
6. Метод съгласно всяка от предходните претенции, характеризиращ се с това, че концентратът се подкислява до pH от 5.5 до 7.5.
7. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че концентратът се подкислява до pH от 6.0 до 7.0.
8. Метод съгласно всяка от предходните претенции, характеризиращ се с това, че HMG-CoA редуктазният инхибитор, който се екстрахира из етилов ацетат и по желание се лактонизира, се подлага на етап на пречиставне чрез адсорбционна хроматография.
9. Метод съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че смес от ацетонитрил и вода се използва като подвижна фаза за адсорбционната хроматография.
10. Метод съгласно всяка от предходните претенции, характеризиращ се с това, че редът на етапите на кристализация е обратен.
11. Метод съгласно всяка от предходните претенции, характеризиращ се с това, че водосмесваемият или водоразтворимият органичен разтворител, използван в етапа на кристализация, е ацетон или нисш алкилов алкохол.
12. Метод съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че етапът на кристализация включва разтваряне на HMG-CoA редуктазния инхибитор в ацетон, и след това - добавяне на вода.
13. Метод съгласно всяка от предходните претенции, характеризиращ се с това, че етапът на кристализация от органичен разтворител с ограничена смесваемост или разтворимост с вода включва разтваряне на HMG-CoA редуктазния инхибитор в органичния разтворител при концентрация от 10 до 35 g/Ι, и отстраняване на една трета до три четвърти от органичния разтворител.
14. Метод съгласно всяка от предходните претенции, характеризиращ се с това, че органичният разтворител с ограничена смесваемост или разтворимост с вода, използван в етапа на кристализацията, е етилов ацетат.
15. Метод съгласно всяка от предходните претенции, характеризиращ се с това, че се получават HMG-CoA редуктазни инхибитори с чистота, по-висока от 99.6%.
16. Метод съгласно всяка от предходните претенции, характеризиращ се с това, че избраният HMG-CoA реудктазен инхибитор е ловастатин.
17. Метод за пречистване на HMGCoA редуктазен инхибитор, характеризиращ се с това, че включва подлагане на HMGCoA редуктазния инхибитор на комбинирани етапи на кристализация, които включват кристализация из водосмесваем или во доразтворим разтворител и кристализация из органичен разтворител с ограничена смесваемост или разтворимост с вода, като крайните изглаждащи етапи осигуряват HMGCoA редуктазни инхибитори с чистота, повисока от 99.6%.
18. Метод съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че получените HMGCoA редуктазни инхибитори имат чистота, по-висока от 99.7%.
19. Метод съгласно претенция 1 или 18, характеризиращ се с това, че ацетон или нисш алкилов алкохол се използва като водосмесваем или водоразтворим органичен разтворител.
20. Метод съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че посочената кристализация включва разтваряне на HMG-CoA редуктазния инхибитор в ацетон и след това добавяне на вода.
21. Метод съгласно всяка от претенциите от 17 до 20, характеризиращ се с това, че кристализацията из органичния разтворител с ограничена смесваемост или разтворимост с вода включва разтваряне на HMG-CoA редуктазния инхибитор в посочения органичен разтворител при концентрация от 10 до 35 g/Ι и отстраняване на една трета до три четвърти от органичния разтворител.
22. Метод съгласно всяка от претенциите от 17 до 21, характеризиращ се с това, че използваният етилов ацетат като органичен разтворител има ограничена смесваемост или разтворимост с вода.
23. Използване на метода съгласно претенция 1 или метода съгласно претенция 17 за изолиране и/или пречистване на ловастатин.